2 Células-Tronco, Terapia Gênica e Farmacogenética

15/11/2023, 20:25 Células-tronco, terapia gênica e farmacogenética
Células-tronco,
terapia gênica e
farmacogenética
Prof. Ivson Cassiano de Oliveira Santos
Descrição
Células-tronco, terapia gênica e
farmacogenética: suas aplicações e
contribuições no diagnóstico e o tratamento
de doenças.
Propósito
Reconhecer a importância das células-
tronco, da edição gênica e da terapia
individualizada, por meio da
farmacogenética, na melhora da qualidade
de vida de muitos pacientes.
Objetivos
Módulo 1
Células-tronco
Reconhecer as aplicações das células-tronco.
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Módulo 2
Farmacogenética
Reconhecer as práticas da farmacogenética.

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Módulo 3
Terapia gênica
Reconhecer o processo de terapia gênica.
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meeting_room
Introdução
Muito se tem falado sobre testes moleculares, sequenciamento
de DNA, transgênicos, vacinas, mas você sabia que todos esses
produtos são frutos da Biotecnologia? Pois é, a Biotecnologia é
uma área multidisciplinar que busca soluções para diversos
problemas da humanidade pelo uso de organismos vivos ou
partes destes. Suas aplicações na agropecuária, na área
ambiental, industrial e alimentícia são bem reportadas. Você
sabia que a Biotecnologia já salvou muitas vidas?
Na Saúde, a Biotecnologia tem contribuído para o entendimento

de diversas doenças, bem como seu diagnóstico rápido, formas
de prevenção e terapias mais adequadas e eficientes. Algumas
das suas vertentes englobam os testes moleculares, como o
sequenciamento de DNA para o diagnóstico de doenças
genéticas, o uso e obtenção de células-tronco, capazes de se
transformar em outras células no tratamento de doenças, a
terapia gênica e a edição genômica, que permitem consertar
defeitos genéticos em nossas células, e a farmacogenética, que
possibilita o uso mais preciso de fármacos, de acordo com a
capacidade de metabolização do nosso organismo, gerando uma
otimização do tratamento.
Com essas e outras aplicações da Biotecnologia, a medicina

tradicional tem sido revolucionada e a compreensão do material
genético humano tem aberto novas possibilidades para o
tratamento de doenças. Agora, vamos dar uma olhada nas
metodologias mais inovadoras, como a utilização das células-
tronco, a terapia gênica e a farmacogenética que são utilizadas
nesta área.
Células-tronco
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer as aplicações das células-tronco.
Introdução ao uso das células-tronco
Terapia com células-tronco
O organismo humano é formado por diversos órgãos, como o coração,

pulmão e rim, que desempenham funções determinadas. Cada órgão é
formado por um conjunto de células que formam os tecidos. Há
diversos tipos de tecidos com diferentes propriedades e características.
Somos formados basicamente por células especializadas em
determinados tecidos que, juntos, formam os órgãos. Doenças podem
gerar danos nesses tecidos.
Uma das formas de curar danos ou traumas aos tecidos/membros ou

órgãos é pelo uso de células-tronco. As células-tronco são células
capazes de se diferenciar em outros tipos de células, restaurando
aquele tecido.
Além disso, muitas doenças ocorrem em tecidos que não possuem a

capacidade de se regenerar, como o tecido nervoso, os neurônios, e o
tecido muscular cardíaco. Danos nesses tecidos são irreversíveis e o
uso de células-tronco para restaurá-los (e consequente, o órgão
também) tem sido promissor.
Células-tronco e sua capacidade de se transformar em tecidos para restituir órgãos.
O uso de células-tronco como terapia vai muito além. Podemos usar

para restaurar traumas, reconstruir membros, testar novos
medicamentos e entender como doenças se desenvolvem.
Agora, vamos ver o uso de células-tronco para tratamento.
Tipos de células-tronco
As células-tronco são consideradas células indiferenciadas, capazes de

se diferenciar em outros tipos de tecidos e, portanto, de se transformar
e de restaurar um tecido danificado. Seu uso tem ajudado a restaurar
órgãos em que o transplante não é possível, a tratar órgãos de pacientes
que poderiam morrer na fila de espera por um transplante e na
compatibilidade da célula/tecido, uma vez que são retiradas células-
tronco do próprio paciente, não tendo risco de rejeição.
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Curiosidade
Também tem sido demonstrada a

capacidade de transformação das células-
tronco em diversos tecidos, por exemplo:
células cardíacas, células nervosas, células
produtoras de insulina, da medula óssea,
entre diversos outros tipos de tecidos.
As células-tronco são a base para a formação dos tecidos e órgãos do

nosso organismo. Todas elas possuem a capacidade de autorrenovação
e de se diferenciar (formar outros tecidos). Podem ter origem
embrionária, de tecidos adultos ou ainda serem induzidas. A seguir,
vamos compreender melhor cada uma dessa origens:
Células-tronco embrionárias expand_more
Células-tronco adultas expand_more
Células-tronco pluripotentes induzidas (IPS) expand_more
Além da origem dessas células-tronco, elas também podem ser

classificadas de acordo com a sua capacidade de transformação.
Células-tronco totipotentes
São aquelas células capazes de se transformar em todos os

tipos de células, incluindo a placenta. Surgem logo após a
fecundação e são as células-tronco com a maior capacidade
de diferenciação que podemos ter.
Células-tronco multipotentes
São aquelas com capacidade de se diferenciar em uma família

ou grupo de células relacionadas como, por exemplo, as
células-tronco hematopoéticas.
Células-tronco pluripotentes
São aquelas com capacidade de se diferenciar em todos os
tipos de tecidos com exceção da placenta.
Células-tronco onipotentes
São aquelas com capacidade de se transformar em um único

tipo de célula.
O que de fato acontece é que, durante a fecundação, os primeiros

estágios do embrião dão origem a um conjunto de células, chamado
blastocisto, que vai se diferenciar em todos os tipos de tecidos para
formar um ser vivo. São ditas células-tronco embrionárias totipotentes,
devido à sua capacidade de se transformar em todos os tipos de
células. Conforme o desenvolvimento do embrião, essas células vão
perdendo a capacidade de totipotência ao irem se transformando em
células de diferentes tecidos, o que dará origem às células-tronco
adultas, com capacidade menor de transformação.
Diferenciação entre as células conforme a capacidade de transformação.
Nos dias atuais, pesquisadores e cientistas têm utilizado células adultas

para transformar em células pluripotentes, com capacidade de se
transformar em todas as células novamente, mas não são células
embrionárias.
Aplicações das células-tronco
Substituição de tecidos, órgãos ou membros (medicina

regenerativa)
As células-tronco podem ser usadas para substituir órgãos ou tecidos

danificados, restaurar a função do tecido/órgão e serem estimuladas a
gerar células saudáveis para substituir as doentes ou mortas. Essa
aplicação tem sido bem-sucedida para o tratamento de diferentes
doenças, como:
Doenças hematopoiéticas, como leucemia, linfomas, síndrome

mielodisplásica, anemia falciforme, beta talassemia,
imunodeficiências;
Distúrbios metabólicos, como diabetes tipo 1;
Doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson,

esclerose múltipla, doença de Alzheimer;
Diversas doenças cardíacas, como infarto e insuficiência cardíaca;

queimaduras; câncer, entre outras.
Na imagem a seguir podemos ver uma aplicação das células-tronco em

tratamento de doença crônica:
Terapia com o uso de células-tronco coletadas da medula óssea ou de tecido adiposo para tratar
osteoartrite.
As células-tronco também podem ser estimuladas a formarem

membros inteiros, tendo grande potencial em transplantes e na
medicina regenerativa.
Essa última área surgiu como resposta ao uso de células-tronco para
regenerar ou restituir tecidos/órgãos danificados.
Para o sucesso do tratamento, as células-tronco devem ser coletadas,

sobreviver e se multiplicar in vitro, para então serem estimuladas a se
transformar no tecido específico que vai ser colocado.
Nos dias atuais, a medicina regenerativa avançou e adicionou novos

conceitos para além das células-tronco. É possível combinar a
engenharia de tecidos, a engenharia de materiais e a microengenharia
para o desenvolvimento de organoides.
Mas o que são organoides?
É o nome dado ao cultivo, em laboratório, de células-tronco para gerar

um miniórgão, que embora não complete totalmente o órgão, ajuda a
modular e reestruturar a sua função.
Para isso, são usadas culturas celulares 3D com células-tronco

pluripotentes de origem embrionária ou induzidas (iPS), ou células
adultas do órgão em questão, em que são fornecidos artificialmente
todos os nutrientes e condições de crescimento celular.
Na cultura 3D, as células podem crescer em todas as direções, similar a

um órgão no organismo.
Foto de um organoide intestinal criado a partir de células-tronco pluripotentes.
A medicina regenerativa também tem sido utilizada na estética para

tratamentos rejuvenescedores e prevenção do envelhecimento dos
tecidos.
Compreensão de doenças
Como as células-tronco se diferenciam para diversos tecidos, podendo

formar até órgãos e membros, pesquisas têm sido desenvolvidas para
entendimento de doenças. Nessa aplicação, é possível desenvolver em
laboratório células humanas de determinado tecido e estudá-las. Os
resultados com a compreensão de doenças ajudam a entender como
elas ocorrem e, assim, se determinar formas de prevenção e tratamento.
Esses avanços têm levado a uma melhor compreensão dos
mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento de diversas
doenças. Essa aplicação das células-tronco tem sido associada a
metodologias de reprogramação celular e de edição de genes.
Esquema ilustrando as etapas para a utilização das células-tronco para a compreensão de

doenças.
Muitas pesquisas necessitam das células e dos tecidos doentes para

estudo, o que vem de pacientes e, nem sempre, eles estão disponíveis.
As células-tronco têm ajudado a contornar esse problema, ao permitir
que tecidos sejam formados e estimulados a desenvolver doenças para
estudo, os chamados modelos de doenças.
Reprogramação das iPS para transformação em células-tronco e posterior transformação no

tipo de tecido de interesse.
A compreensão de como as células se diferenciam em outras células

especializadas permitiu a reprogramação e o surgimento das células-
tronco induzidas (iPS).
As iPS são células adultas reprogramadas para se tornarem células-

tronco, e depois transformadas no tipo de tecido de interesse.
Qualquer tipo de célula pode ser reprogramada e o uso dessas células

também contribui para o entendimento de doenças, uma vez que são
usadas as células do paciente para se recriar a doença em laboratório.
Assim, essas células têm sido utilizadas para entender como ficamos
doentes. Diversas doenças neurológicas e distúrbios hematológicos são
estudados por esses modelos.
Testes de medicamentos
O desenvolvimento de novos medicamentos leva tempo, pois diversos

testes devem ser realizados para comprovar a sua eficácia, segurança e
possíveis efeitos colaterais.
As células-tronco têm se mostrado aliadas nesse desenvolvimento, uma
vez que podem ser transformadas nas células do tecido que o novo
medicamento atua e, assim, verificar a sua eficácia em tecidos humanos
antes de ser utilizada para tratamento.
Os testes com células-tronco também são importantes para se medir a

toxicidade dos medicamentos, principalmente, sobre o tecido cardíaco e
neurológico. Também permitem avaliar como o medicamento pode agir
em diferentes pessoas, ao utilizar as células de diferentes indivíduos
para mimetizar os tecidos e órgãos de cada um.
Novos medicamentos podem ser testado em células-tronco diferenciadas.
Nesse tipo de aplicação, podemos ter o uso de células-tronco para se

obter tecidos específicos para triagem de novos compostos com ação
farmacológica, eficácia e segurança de novos medicamentos, toxicidade
dos compostos e entender como o medicamento age sobre as células.
Testes de medicamentos a partir das células-tronco.
O uso de animais para descoberta de novos medicamentos, muitas

vezes, não corresponde ao efeito esperado em humanos. Já as células-
tronco podem indicar de início esses problemas por se tratar de células
humanas. Além disso, novas moléculas terapêuticas produzidas pelas
próprias células daquele tecido cultivado em laboratório têm sido
utilizadas para se reparar um tecido danificado.
Algumas limitações no uso de células-tronco incluem:
Sua obtenção;
Sua diferenciação em tecidos específicos (o que envolve o uso de

moléculas estimulantes);
O controle de qualidade para se evitar a contaminação com outras

células;
O crescimento em um número adequado para se realizar os testes.
No futuro, espera-se criar modelos de estudos com diferentes tipos de

células que interajam entre si, formando sistemas; e assim, medir a
ação do medicamento sobre diferentes interações, mimetizando um
organismo.
A seguir vemos um esquema mostrando que a partir de organoides é

possível recriar um ambiente imitando todas as condições fisiológicas
para o seu funcionamento, como por exemplo, oferecer o aporte
sanguíneo necessário. Dessa forma, conseguimos, por exemplo, criar
um modelo in vitro que mimetizem a fisiologia de muitos órgãos,
chegando mais perto da realidade de um organismo e compreendendo
como acontece o desenvolvimento de uma determinada patologia ou
então a ação de algum fármaco.
chevron_left chevron_right
Nas culturas 2D, as células crescem sobre

as placas, fazendo com que elas
expressem proteínas de adesão, cresçam
horizontalmente e tenham uma interação
limitada entre as células.
chevron_left 1 de 4
chevron_right
Legislação e aspectos éticos no uso

das células-tronco
O uso de células-tronco embrionárias levantou uma série de

questionamentos, principalmente, pela forma como são obtidas: a partir
de embriões, logo após a fecundação, gerando uma discussão ética
quanto ao seu uso. O ponto principal gira em torno do questionamento
sobre em que momento se inicia a vida, tema que apresenta dois pontos
de vista distintos:
Acredita-se que o Por outro lado, acredita-

embrião é um ser se que os embriões, no
humano vivo e que deve início da formação,
ter seus direitos à vida close ainda não são seres
protegidos. humanos e que seu uso
teria consentimento do
casal doador.
A Biotecnologia trouxe à tona diversas questões éticas e de segurança

que deram origem a áreas como:
Bioética
Visa indicar os limites e finalidades do que é permitido realizar

na medicina ou ciências biotecnológicas. Muitas vezes, referida
como “ética da vida”.
Biossegurança
Visa à segurança do trabalhador, da população e do meio

ambiente, referente às atividades de pesquisa, produção e
desenvolvimento laboratorial.
Biodireito
Visa o cumprimento da bioética e biossegurança por meio da

criação de normas e sanções para o seu descumprimento.
A obtenção de células-tronco embrionárias é polêmica e gera muita

discussão em diversos países, nos quais cada um regulamenta leis e
diretrizes para o seu uso com base nos princípios de cada sociedade.
As questões bioéticas que envolvem o uso de células-tronco

embrionárias geram um conflito de valores entre aspectos culturais,
econômicos, políticos, sociais, genéticos, antropológicos etc. Diante de
todo esse dilema, existem países que permitem a pesquisa e o uso de
células-tronco para tratamento e outros que proíbem essa técnica.
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Curiosidade
No Brasil, a Lei de Biossegurança nº. 11.105,
de 2005, permite o uso de embriões obtidos
por fertilização in vitro congelados por pelo
menos três anos ou embriões inviáveis, com
consentimento dos genitores, para fins de
pesquisas, sendo proibida a sua
comercialização.
Esses embriões são obtidos de clínicas de

fertilização. Somente pessoas jurídicas
podem ter autorização para trabalhar com
qualquer tipo de célula-tronco e todo projeto
precisa ser aprovado por comitês e órgãos
antes de ser iniciado, tendo ainda um
acompanhamento quanto às pesquisas.
Uma alternativa à questão ética do uso de embriões está no uso de

células-tronco adultas e as iPS. Apesar disso, as células-tronco
embrionárias são as de maior capacidade de diferenciação. Existem
hoje, no Brasil, clínicas que coletam e congelam por criopreservação as
células-tronco do cordão umbilical de recém-nascidos para possíveis
tratamentos futuros.
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O que são organoides?
Neste vídeo, o especialista apresenta as culturas de células-tronco
chamadas organoides e suas funcionalidades.
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Vem que eu te explico!
Os vídeos a seguir abordam os assuntos mais relevantes do conteúdo
que você acabou de estudar.
Módulo 1 - Vem que eu te explico!
Terapias com células-tronco
Tipos de células-tronco
Aplicações das células-tronco
emoji_events
Falta pouco para

atingir seus
objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
As células-tronco são células com capacidade de se transformar

em outros tipos de células. De acordo com a sua origem, podemos
ter células-tronco embrionárias, células-tronco adultas e células-
tronco induzidas. As células-tronco embrionárias são as que
possuem a maior capacidade de diferenciação, sendo capazes de
gerar qualquer tipo de células/tecidos, incluindo as da placenta e
anexos embrionários. Essas células são denominadas:
A Totipotentes
B Pluripotentes
C Multipotentes
D Oligopotentes
E Onipotentes
Responder
Questão 2
No mundo, existe uma enorme discussão ética quanto ao uso de

células-tronco embrionárias, pela forma que são obtidas. No Brasil,
a Lei de Biossegurança nº. 11.105, de 2005, estabelece as diretrizes
para se trabalhar com este tipo de célula, o que determina:
O uso de células-tronco embrionárias obtidas por

A fertilização in vitro de qualquer genitor que não as
quiser.
O uso de células-tronco embrionárias obtidas de

clínicas de fertilização após 3 anos congelados ou
B
embriões inviáveis, com consentimento dos genitores
e para fins comerciais.
O Brasil não possui diretrizes quanto ao uso de

células-tronco embrionárias, cabendo a cada
C
instituição privada ou particular determinar como
deve obter e utilizar este tipo de célula.
O uso de células-tronco embrionárias obtidas de

clínicas de fertilização após 3 anos congelados ou
D
embriões inviáveis, com consentimento dos genitores
e para fins de pesquisa.
O Brasil proíbe o uso de células-tronco embrionárias

E
para quaisquer fins.
Responder
Farmacogenética
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer as práticas da Farmacogenética.
Introdução à Farmacogenética/
Farmacogenômica
Conceitos iniciais
Com as metodologias de sequenciamento de DNA e seu

aperfeiçoamento, muitos genes foram sequenciados e seu papel
determinado em diversas doenças. Neste contexto, destaca-se a
farmacogenética/farmacogênomica, uma ciência que se baseia na
sequência do gene de cada indivíduo para se determinar qual opção
terapêutica e a dose mais eficazes. A associação da farmacologia com
dados genômicos é primordial para a escolha e o sucesso terapêutico,
principalmente, para o tratamento do câncer.
Você lembra o que é sequenciamento de DNA?
Primeiro precisamos lembrar que o DNA é composto por duas fitas

complementares de nucleotídeos, formados por uma molécula de
fosfato, um açúcar de 5 carbonos, também chamado de pentose, no
caso do DNA esse açúcar é do tipo desoxirribose, e uma base
nitrogenada.
Existem quatro tipos de bases nitrogenadas e que dão nome aos

nucleotídeos, são elas: Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) e Guanina
(G), que se enrolam e formam uma estrutura de hélice, por isso dizemos
que o DNA é uma dupla hélice.
Esse processo é possível devido às ligações que os nucleotídeos fazem

entre si para formar essa molécula.
Sabemos que os nucleotídeos encontrados são ligados entre si através

de ligações de hidrogênio que ocorrem entre as bases nitrogenadas,
onde:
A se liga a T, por meio de duas ligações de
hidrogênio.
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chevron_right
Assim, se sabemos que uma fita de DNA é formada por ATCCGATTT, a

fita complementar será composta por TAGGCTAAA, uma vez que o DNA
é dupla fita e complementar. Além das ligações entre as bases
nitrogenadas para formar a dupla fita do DNA, os nucleotídeos também
são ligados uns aos outros por meio de ligações fosfodiéster, que
ocorrem entre o açúcar do nucleotídeo anterior e o grupo fosfato do
próximo nucleotídeo.
Relembrando como é a estrutura do DNA, conseguimos compreender
que o sequenciamento dessa molécula é a determinação da sequência
exata de nucleotídeos de um indivíduo, os componentes básicos do
DNA.
post_add
Saiba mais
Com o projeto do genoma humano, foi

possível sequenciar 3,1 milhões de
nucleotídeos que compõem o nosso material
genético, permitindo a compreensão de
como falhas ou alterações no DNA causam
doenças. O sequenciamento de DNA tem
sido utilizado para estudos evolutivos,
filogenéticos, clonagem gênica, reprodução,
diagnóstico, desenvolvimento de
tratamentos e obtenção de conhecimentos.
A primeira metodologia de sequenciamento de DNA descrita, em 1977,

foi chamada de método de Sanger, método didesoxi ou método de
terminação de cadeia.
O nome deste método se deve ao pesquisador Frederick Sanger, do

laboratório de biologia molecular da Universidade de Cambridge, no
Reino Unido. Seus achados foram tão importantes para a humanidade
que renderam dois prêmios Nobel de química (em 1958 e em 1980,
juntamente com o físico e bioquímico Walter Gilbert).
Frederick Sanger (1918 -2013).
Como ocorre o sequenciamento?
Para entendermos como ocorre o processo de sequenciamento de DNA

desenvolvido por Sanger, precisamos entender como essa informação é
passada adiante para as células. Assim, podemos dizer que a replicação
celular está diretamente associada à replicação do DNA, sendo
fundamental para o correto funcionamento de qualquer célula. A
replicação de DNA requer uma série de enzimas e o próprio DNA como
molde. Assim como uma célula surge de outra pré-existente, o DNA
também surge de outro preexistente.
Ilustração de mecanismo de replicação do DNA.
Uma das enzimas que participam do processo de replicação é a DNA

polimerase, responsável por formar a ligação fosfodiéster pela adição
de novos nucleotídeos na cadeia que está sendo formada. Dizemos que
a replicação de DNA é semiconservativa, pois metade do DNA é recém-
sintetizado ou polimerizado, e a outra metade é antiga, que serve como
molde para adição de novos nucleotídeos com base na
complementariedade (A-T e C-G).
Tanto in vivo quanto in vitro, vamos precisar de todos esses

componentes para replicação do DNA: condições ideais, os quatro
nucleotídeos e a DNA polimerase.
Como falado anteriormente, a DNA polimerase desenvolve um papel

importante nesse processo e na ligação fosfodiéster entre os
nucleotídeos, e para entender como o sequenciamento de DNA ocorre,
vamos precisar compreender melhor o papel dessa enzima. A DNA
polimerase é capaz de:
Adicionar nucleotídeos à fita crescente de DNA, com base nos

nucleotídeos do DNA da fita molde.
Adicionar novos nucleotídeos sempre no sentido 5’-3’.
Além disso, requer um pequeno seguimento de DNA na cadeia molde

para poder realizar a ligação fosfodiéster. Esses pequenos seguimentos
de DNA são chamados de primers ou iniciadores. A DNA polimerase tem
ação exonucleotídica e gasta energia proveniente dos próprios
nucleotídeos soltos.
A ligação fosfodiester ocorre no sentido 5’-3’, mas o que quer dizer isso?
Ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos da mesma fita.
A DNA polimerase não consegue reconhecer apenas o molde de DNA e

realizar a fita complementar. Para que a reação ocorra, é necessário
adicionar pequenos seguimentos de DNA ou RNA (ácido ribonucleico)
na fita a ser sintetizada para servir de ponto de partida para a reação
fosfodiéster.
A DNA polimerase vai reconhecer o grupamento hidroxila (-OH) presente

no carbono 3’ da desoxirribose e realizar a ligação com o fosfato
presente no carbono 5’ na desoxirribose do nucleotídeo a ser
adicionado. Assim, dizemos que o DNA “cresce” no sentido 5’ para o 3’.
Com base nesses conhecimentos, o pesquisador Frederick Sanger e

seus colaboradores fizeram uma alteração química nos nucleotídeos do
DNA. Podemos ter quatro tipos de nucleotídeos (A, T, C, G), que também
podem ser chamados de desoxinucleotídeos (dNTP), por possuírem um
açúcar do tipo desoxirribose. O que ele fez foi alterar este açúcar,
retirando o grupamento hidroxila (-OH), importante na ligação
fosfodiéster pela DNA polimerase, e gerando os nucleotídeos chamados
de dideoxinucleotídeos (ddNTP). Diferentemente dos dNTPs, os
ddNTPs não possuem o grupamento hidroxila no carbono 3’ do açúcar.
Nas imagens a seguir, podemos ver a diferença entre estes
nucleotídeos.
Desoxinucleotídeos (dNTP).
Dideoxinucleotídeos (ddNTP).
Sequenciamento de Sanger manual
O sequenciamento de Sanger manual foi o primeiro a ser desenvolvido,

utilizando como bases os princípios da composição do DNA (A, T, C, G) e
a forma como é copiado/replicado. O sequenciamento de Sanger
permite sequenciar pequenos pedaços de DNA, geralmente em torno de
900 nucleotídeos. A reação de sequenciamento, que vai permitir saber a
ordem exata de nucleotídeos, é bem similar a uma reação de
amplificação de DNA em laboratório, conhecida como reação em cadeia
da polimearase (PCR).
O que vamos precisar para realizar esse sequenciamento?
1 2
A DNA polimerase, enzima Primers ou iniciadores, que são

responsável pela ligação pequenos seguimentos de DNA
fosfodiéster para adição de ou RNA complementar à região a
novos nucleotídeos na cadeia de ser sequenciada, servindo de
DNA que está sendo formada. ponto de partida para a DNA
polimerase atuar.
Inicialmente, preparamos quatro tubos, com os seguintes componentes

em cada um:
Tubo 1
DNA polimerase, DNA molde, dNTPs (A, T, C e G),

solução tampão, primers, ddNTP do tipo adenina.
Tubo 2

solução tampão, primers, ddNTP do tipo timina.
Tubo 3

solução tampão, primers, ddNTP do tipo citosina.
Tubo 4

solução tampão, primers, ddNTP do tipo guanina.
Os quatro tubos são, então, submetidos à variação de temperatura para

que ocorra a reação de amplificação do DNA no tubo. São utilizadas três
temperaturas:
Desnaturação Anelamento Extensão
Temperatura elevada para que o DNA dupla fita se abra e se

torne fita simples. Em torno de 95°C, temperatura suficiente para
quebrar as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas.
Essas três temperaturas formam um ciclo que se repete de 25 a 35

vezes, de forma que, a cada ciclo, a DNA polimerase aumente a
quantidade de DNA em cada tubo de forma exponencial, ou seja, de 2
para 4, de 4 para 16, de 16 para 256, e assim por diante.
Após a reação, o resultado é visualizado por meio de uma eletroforese

em gel de poliacrilamida. A eletroforese é uma técnica de separação de
moléculas com base no seu tamanho e carga. O DNA tem carga
negativa e será submetido a uma voltagem para que corra no sentido
positivo (cargas opostas se atraem). Ao final da corrida eletroforética, o
resultado é revelado e analisado. Os fragmentos menores vão
migrar/correr mais rápido no gel, pela facilidade de locomoção, do que
fragmentos maiores. Assim, de acordo com cada seguimento gerado
pela reação, em cada tubo, podemos montar a sequência exata de
nucleotídeos do DNA de interesse.
Eletroforese para separação dos fragmentos de DNA gerados pelo sequenciamento de Sanger.
Lembra que, em cada tubo, colocamos os quatro nucleotídeos normais,

dNTP, e um para cada nucleotídeo alterado, ddNTPs?
Pois bem, a DNA polimerase vai adicionar novos nucleotídeos e parar de

adicionar toda vez que ela encontrar um nucleotídeo alterado (ddNTP),
gerando fragmentos de determinado tamanho, que vai ser visualizado
posteriormente por eletroforese. Só que a reação não vai gerar um
fragmento só, com determinado tamanho, porque também temos
nucleotídeos normais na reação. Assim, teremos vários fragmentos de
DNA amplificado que a reação parou toda vez que adicionou um ddNTP.
Após a corrida, é só observar onde cada fragmento parou e juntar todas
as quatro reações como um quebra-cabeça!
Sequenciamento de Sanger
automatizado
Sequenciamento manual x automatizado
Com os avanços científicos, a técnica inicial de sequenciamento de

Sanger sofreu alterações para melhorar a qualidade do sequenciamento
e torná-lo mais fácil. Atualmente, utilizamos o sequenciamento de
Sanger automatizado. Ele surgiu por volta dos anos 1980-1990 e ajudou
no sequenciamento do genoma humano.
O processo de sequenciamento é bem semelhante ao manual, utilizando

a DNA polimerase, a solução tampão, os primers ou iniciadores, os
quatro nucleotídeos dNTPs (A, T, C e G) e os quatro ddNTP, ddATP,
ddTTP, ddCTP e ddGTP. A diferença é que cada tipo de ddNTP é
associado a uma molécula fluorescente com cor diferente. Isso permite
colocar todos os componentes na mesma reação, uma vez que
conseguimos diferenciar pela cor emitida qual dos quatro ddNTP está
sendo adicionado ao DNA pela DNA polimerase. Este processo respeita
as seguintes etapas:
O único tubo com todos os componentes é

submetido ao equipamento que realizará a
variação de temperatura: desnaturação,
chevron_left anelamento e extensão, formando um ciclo chevron_right
que se repete em torno de 30x.
chevron_left 1 de 5
chevron_right
Na hora de obter o resultado, no sequenciamento manual, cada tubo é

submetido a uma eletroforese para separação dos diferentes
fragmentos, de acordo com cada ddNTP adicionado. No
sequenciamento automatizado, também será realizada uma eletroforese
para separação dos fragmentos gerados, porém, em um único tubo, e a
eletroforese ocorre no próprio equipamento de sequenciamento, dita
eletroforese capilar em gel de poliacrilamida.
A eletroforese capilar, assim como a eletroforese, tem como objetivo

separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho e massa.
Contudo, a eletroforese ocorre em um capilar, um fio muito fino por onde
o gel de poliacrilamida e o DNA vão passar. Ao final deste capilar, existe
um laser (que vai excitar o DNA que está passando naquele momento) e
um detector de fluorescência (após a excitação, o detector vai captar a
cor do ddNTP que está sendo emitida).
O equipamento é ligado a um computador, que converterá o sinal gerado

em um gráfico com picos de fluorescência, chamado de cromatograma.
O primeiro fragmento de DNA a passar é o menor fragmento e o último,

o maior. Assim, se os marcadores dos ddNTPs forem adenina verde,
timina vermelho, citosina azul e guanina preto, a sequência de DNA:
AATGCT será lida pelo equipamento da seguinte forma: vermelho,
vermelho, verde, azul, preto, verde. O computador converte esse sinal
então aos nucleotídeos correspondentes TTACGA.
Sequenciamento de Sanger automatizado: leitura dos picos de fluorescência para cada ddNTP
pelo equipamento.
Na imagem a seguir, demonstramos as etapas do sequenciamento de

Sanger automatizado:
Representação ilustrativa do processo de sequenciamento automatizado.
Repare que a DNA polimerase adicionará nucleotídeos complementares

à fita molde e o equipamento vai ler somente os ddNTPs que forem
adicionados à fita nova. Por isso, o que vemos no exemplo é o DNA
complementar de AATGCT, que é TTACGA.
Análise de dados
O sequenciamento de Sanger, também é chamado de sequenciamento

de primeira geração, e todos os novos tipos e metodologias que vieram
após o de Sanger são chamados de sequenciamentos de nova geração
(NGS ‒ do inglês Next-Generation Sequencing ). Apesar das novas
metodologias de sequenciamento de DNA, o método de Sanger
automatizado é amplamente utilizado para sequenciar pequenos
seguimentos de DNA ( <900 pb) e permite o diagnóstico de muitas
doenças genéticas.
O caso mais famoso de aplicação do sequenciamento de Sanger é o da

atriz internacional Angelina Jolie. Há alguns anos, a atriz retirou os seios
como forma de prevenção ao câncer de mama ao descobrir que possuía
cerca de 90% de chances de desenvolver este tipo de câncer. Isso só foi
possível por meio do sequenciamento genético dos genes BRAC1 e
BRAC2 associados a este tipo de câncer. Ao se obter a exata sequência
de nucleotídeos, foram descobertas mutações (alterações no DNA) que
levavam a uma alta propensão ao câncer de mama.
O sequenciamento de DNA tem sido utilizado para diagnóstico de

câncer e de doenças genéticas raras que possuem tratamento. Além
disso, utilizado para determinar o melhor tratamento para aquele tipo de
câncer, com base nas alterações genéticas (DNA) encontradas, a
chamada farmacogenética/farmacogenômica.
O que, para nós, parece uma repetição de letras (A, T, C, G) sem sentido,
para as nossas células é a ordem em que se apresentam os
nucleotídeos que ditam todas as características. Sabemos hoje que, se
alguma ordem desses nucleotídeos está errada ou gera uma informação
defeituosa, pode-se ter o surgimento de doenças. Isso torna o
sequenciamento de DNA uma ferramenta de diagnóstico.
E como é feito esse processo?
É necessário realizar uma análise detalhada e comparativa do resultado,

para buscar alterações que possam ter sentido em alguma doença.
Para isso, é preciso baixar o cromatograma com as quatro cores dos

nucleotídeos sequenciados, observar a qualidade do sequenciamento e,
com auxílio de um software, realizar a análise.
A análise inicial envolve a qualidade do sequenciamento, visto pelos

picos gerados pela fluorescência emitida. Os picos com qualidade
aceitável para análise envolvem picos bem definidos, uniformes e
espaçados.
A sobreposição de mais de um pico pode significar um sequenciamento

de baixa qualidade e a amostra precisa ser repetida.
Representação das cores dos nucleotídeos.
A comparação envolve a procura por alterações no DNA que possam

significar alguma doença ou propensão a determinadas doenças. Tais
alterações são chamadas de mutações. As mutações que podemos
encontrar no DNA são dos seguintes tipos:
Deleção
Deleção de um ou mais nucleotídeos.
chevron_left 1 de 5
chevron_right
Essas mutações são determinadas comparando as sequências dos

pacientes com sequências de DNA de células saudáveis e seu papel
determinado com base em estudos clínicos e associação com doenças.
A partir de uma quantidade cada vez maior de dados fornecidos pelos

sequenciamentos e de necessidades de armazenamento e análises, um
novo campo surgiu: a bioinformática.
A capacidade e a diminuição dos custos do sequenciamento têm aberto

diversas novas possibilidades, inclusive de atuação profissional, sendo
uma importante ferramenta aplicada para melhoramento da qualidade
de vida.
video_library
Sequenciamento de Sanger
Neste vídeo, o especialista Ivson Cassiano apresenta maiores detalhes
sobre o processo de sequenciamento de Sanger e de sua aplicabilidade.
Farmacogenética/ Farmacogenômica
Juntamente à popularização do sequenciamento de DNA, que

possibilitou um melhor diagnóstico de câncer e de doenças genéticas,
há também o surgimento e crescimento da farmacologia, que é a
ciência que investiga os medicamentos e suas interações com os
organismos. De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), fármaco é o composto químico ativo do medicamento, obtido
por extração, purificação, síntese ou semi-síntese. Com isso, existem
diversos tipos de fármacos usados pela população para tratar doenças
com base em exames e observações clínicas.
Quando administramos medicamentos para uma população, é comum

ouvirmos que o medicamento não fez efeito, que teve efeitos colaterais,
apresentaram toxicidade, alergias, ou que tiveram os sintomas tratados,
com o efeito farmacológico esperado.
Existem diversos fatores que podem explicar a variabilidade individual

da resposta do fármaco no nosso organismo, como a idade, fatores
imunológicos, fatores patológicos, interações farmacológicas
(medicamentos) e fatores genéticos.
Com o grande número de dados obtidos do sequenciamento de DNA

humano, hoje, conseguimos associar os fatores genéticos aos fatores
farmacológicos, o que deu origem a duas novas áreas de estudo: a
farmacogenética e a farmacogenômica.
Ambas estudam a influência das variações genéticas (DNA) de um

paciente sobre o tratamento com medicamentos. Isso pode determinar
qual a melhor opção terapêutica e a dose com base na sua informação
genética. Esse campo de estudo combina a farmacologia com a
genética ou genômica para determinar a eficácia e a segurança do
fármaco. No entanto, existe uma diferença básica no enfoque de cada
uma destas áreas em relação aos genes:
Farmacogenética Farmacogenômica
Preocupa-se em Preocupa-se em
compreender a compreender a
interação de um gene close interação de todos os
com o fármaco. genes, o genoma, com o
fármaco.
E você sabe por que é importante a compreensão dessas interações?
forum
Resposta
Todo fármaco atua em algum alvo no nosso

organismo e vai ser metabolizado por
proteínas e enzimas, e todas as proteínas e
enzimas vêm de uma informação genética,
ou seja, a informação para tudo que somos
está contida no DNA. Assim, temos a
associação do fármaco com o DNA, com os
genes, pois dependendo da sequência de
DNA, a proteína ou enzima que interage com
o fármaco pode ter mais afinidade ou menos
afinidade, ou ainda, ser tóxica para aquele
indivíduo.
Nem sempre uma mutação na sequência de DNA é prejudicial. São as

mutações que garantem toda a diversidade que temos hoje, incluindo no
metabolismo de fármacos.
O genoma humano apresenta cerca 99,9% de similaridade, o que

significa que se compararmos o DNA de todos nós, ele seria 99,9%
idêntico entre os indivíduos, tirando os defeitos genéticos que geram as
doenças genéticas raras, claro. A maioria das diferenças do nosso de
DNA se dá pela variação de um único nucleotídeo (A, T, C, G), e quando
presente em pelo menos 1% da população é chamado de polimorfismo
de nucleotídeo único (PNU, em inglês SNP). A presença de PNU não é
anormal, nem prejudicial, pelo contrário. É esta variação que garante a
diversidade de indivíduos que nós temos.
Polimorfismo de nucleotídeo único entre a população.
Os PNU acontecem no DNA de todo indivíduo, garantindo uma

diversidade de formas, metabolismos, características e fenótipos. Dessa
forma, se um PNU ocorre na sequência do gene que codifica uma
proteína ou enzima que participa do processamento de determinado
fármaco, pode haver variações no seu metabolismo.
Todo medicamento, quando administrado, deve estar dentro do intervalo

terapêutico para realizar sua função, cuja concentração do fármaco
deve ser relativamente constante e dentro da dose esperada na corrente
sanguínea. Quando tomamos um medicamento, podemos ter as
seguintes respostas com base na variação genética:
Metabolizadores rápidos expand_more
Metabolizadores intermediários ou normais expand_more
Metabolizadores lentos expand_more
A prescrição atual de medicamentos é baseada no diagnóstico,

informações do paciente e possíveis efeitos colaterais do medicamento,
com informação das características genéticas dos indivíduos, obtidas
pelo sequenciamento de DNA. Com isso, espera-se realizar um
tratamento mais específico para cada doença, evitando os efeitos
colaterais.
A imagem a seguir ilustra o tipo de resposta farmacológica com base no

tipo de metabolismo do indivíduo.
Ação farmacológica sobre uma população e as variabilidades de respostas encontradas de

acordo com o perfil genético de cada indivíduo.
Vale ressaltar que a farmacogenética/farmacogenômica também se

dedica à descoberta de novos alvos terapêuticos.
post_add
Saiba mais
Os medicamentos que mais se beneficiariam

com a farmacogenética/farmacogenômica
seriam os antidepressivos, fármacos para
asma, diabetes, artrites, Alzheimer e câncer.
Assim, o enfoque tradicional de tratamento
visa o mesmo medicamento para a mesma
doença em diferentes indivíduos, enquanto a
medicina personalizada visa um tratamento
individualizado para cada indivíduo com
base no perfil genético.
playlist_play
Farmacogenética/Farmacogenômica
emoji_events
Falta pouco para

atingir seus
objetivos.
Questão 1
No sequenciamento de DNA pelo método de Sanger automatizado,

são usados dois tipos de nucleotídeos: deoxinucleotídeo (dNTP) e
os dideoxinucleotídeo (ddNTP). Qual a diferença entre os dNTP e os
ddNTP?
Os dNTPs possuem um grupamento fosfato que está

A
ausente nos ddNTPs.
Os ddNTPs possuem um açúcar a mais o que não

B
permite sua adição ao DNA pela DNA polimerase.
Os ddNTPs possuem moléculas fluorescentes

C acopladas, que por si só permitem o sequenciamento
de DNA.
Os ddNTPs não possuem o grupamento hidroxila (-

OH) no carbono 3’ do açúcar, o que não permite a DNA
D
polimerase realizar a ligação fosfodiéster, gerando
fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
Os dNTPs não possuem o grupamento hidroxila (-OH)

no carbono 3’ do açúcar, o que não permite a DNA
E
polimerase realizar a ligação fosfodiéster, gerando
fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
Responder
Questão 2
Com os avanços na área de genômica e das técnicas de

sequenciamento de DNA, cada vez mais genomas humanos estão
sendo sequenciados e as informações sobre o DNA decifradas.
Inúmeras novas áreas da ciência foram beneficiadas, entre elas a
farmacogenética. Diante disso, qual a melhor definição de
Farmacogenética?
Estudo sobre a descoberta e o desenvolvimento de

A novas estruturas celulares para alvo de
medicamentos.
Estudo de nanopartículas para o encapsulamento de

B fármacos e melhoramento da sua concentração no
tecido de ação.
O uso da informação genética do paciente para se

C
determinar qual o melhor medicamento e dose.
O tratamento de determinada doença com o mesmo

D
fármaco para todos que a possuem.
Determinar os pacientes que metabolizam o

E medicamento de forma mais lenta e assim evitar os
efeitos colaterais.
Responder
Terapia gênica
Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer o processo de terapia gênica.
Introdução e tipos da terapia gênica
Introdução à terapia gênica
Com o entendimento de como o DNA mutado leva a expressão de

proteínas defeituosas, surgiu uma possibilidade de tratamento dessas
doenças: a terapia gênica ou genética.
A terapia gênica visa fornecer às células do paciente o

gene normal para que a proteína associada à doença
volte a ser produzida e, assim, a doença será diminuída
ou curada. São as tecnologias experimentais mais
promissoras no tratamento de muitas doenças. Além
da terapia gênica, a grande quantidade de dados
genéticos (DNA) disponíveis abriu a opção de
otimização do tratamento.
Apesar de toda polêmica em torno dessa terapia, a ciência tem

avançado a pontos nunca imagináveis. Hoje, é possível curar um defeito
genético e realizar uma terapia específica para determinada doença.
Vamos detalhar o que a Biotecnologia tem feito nesses campos de

pesquisa.
Tipos de terapia genética
Somos formados por trilhões de células que se conectam, se

diferenciam, se comunicam e formam o organismo. O centro de
comando de cada uma dessas células está dentro do núcleo,
especificamente no DNA. Todas as nossas características, bem como a
função que cada célula exerce, vêm de informações que estão contidas
no DNA de cada indivíduo. Se uma dessas informações é passada
errada, podemos ter um gene errado ou defeituoso, que pode então
gerar uma doença. Um câncer, por exemplo, surge de uma única célula
que teve seu DNA alterado para genes defeituosos.
Sabendo disso, e juntando o conhecimento sobre a sequência de DNA

presente em cada gene, pesquisadores de todo o mundo têm
investigado formas de tornar o gene saudável novamente, fornecendo
para as células sequências do gene normal.
A substituição de um gene defeituoso por um gene normal

é chamada de terapia gênica.
As alterações no DNA podem acontecer por mutações, que geram uma

proteína defeituosa, ou pela ausência do gene, que não gera a proteína.
Essas alterações podem estar presentes desde o nascimento ou ser
desenvolvidas ao longo da vida. A introdução de genes nas células
como tratamento tem duas funções principais: substituir genes
defeituosos ou adicionar genes que vão ajudar o organismo a lutar
contra a doença.
A primeira etapa da terapia gênica é identificar quais os tipos de células

que estão alterados. Podemos ter dois tipos de células, de acordo com a
quantidade de material genético que possuem:
Células somáticas
Possuem 46 (2n) cromossomos, no caso dos seres humanos.

Estão presentes nos tecidos e órgãos, exceto as células
germinativas.
Celulas germinativas
Possuem metade do número de cromossomos, 23 (n). Nos

seres humanos, são o espermatozoide e o óvulo, responsáveis
pela formação do embrião. Ao se juntarem, formam as células
somáticas, que originarão os órgãos e tecidos.
Assim, a terapia gênica pode ser dividida em terapia das células

somáticas de um paciente ou terapia das células germinativas, sendo
que essa última pode ser passada para as gerações futuras, enquanto
as somáticas não.
A terapia gênica com células germinativas pode ser útil para eliminar
doenças genéticas de uma família, porém, eticamente, menos aceita e
sem o real conhecimento das consequências nas futuras gerações. Já a
terapia gênica em células somáticas pode ser realizada em qualquer
indivíduo, em qualquer tipo de célula, e essas alterações não são
passadas para gerações futuras, sendo considerada mais segura.
post_add
Saiba mais
Por essas questões, a maior parte dos

estudos e das terapias disponíveis são
voltadas para as células somáticas e o efeito
de curta duração, uma vez que as células
tratadas morrem e são substituídas por
outras células; logo, o tratamento precisa ser
realizado frequentemente para se manter o
efeito.
Métodos para terapia gênica
Utilizando vetores para a transferência de genes
Após a determinação da doença, o paciente pode ser tratado de duas

formas:
Ex vivo
Onde as células são coletadas, tratadas com genes e depois

inseridas novamente no paciente.
In vivo
Onde o tratamento com os genes ocorre dentro do organismo
do paciente. As células são tratadas no paciente, com o gene
de interesse sendo inserido direto no paciente.
A forma mais comum tem sido a ex vivo, na qual as células do paciente

são coletadas, geralmente, são priorizadas as células-tronco daquele
tecido, tratadas e inseridas por injeção no paciente.
O gene normal ou de interesse é preparado e, para ser colocado dentro

da célula-alvo, é necessário ser posto em um vetor. O vetor funciona
como um veículo para que o gene seja transportado/transferido para
dentro da célula-alvo. Existem dois tipos de vetores: os vetores de
clonagem e os vetores de transporte. Vamos conhecê-los melhor?
Vetores de clonagem
São utilizados para se inserir o gene de interesse, e são compostos

também de DNA. Os mais utilizados têm sido os vetores plasmidiais. Os
plasmídeos são moléculas de DNA extracromossômico circular,
isolados de bactérias, que podem ser alterados para conter qualquer
gene de interesse. Isso já é realizado em muitos processos da
Biotecnologia. Os plasmídeos podem ser inseridos diretamente na
célula-alvo ou associado a um vetor de transporte. Podemos ver este
processo na imagem a seguir
Vetor de clonagem e inserção do gene de interesse no plasmídeo.
Vetores de transporte
Podem ser classificados em vetores biológicos, como os vírus, vetores

químicos, como os polímeros, lipossomas e outras moléculas, e os
vetores físicos, como microinjeção, bombardeamento, entre outros.
Vamos conhecer melhor os tipos de vetores de transporte:
Vetores virais
Os vírus são um dos principais vetores de transporte gênico para as

células-alvo, porque ele infecta naturalmente uma célula e coloca o seu
material genético para dentro. Os vírus utilizados como vetores são
alterados em laboratório, seu poder de virulência é retirado, o material
genético natural do vírus alterado e o gene de interesse inserido. Os
vírus são então colocados em contato com a célula-alvo para que
infectem e coloquem o gene de interesse para dentro da célula. Existe
uma variedade de vírus desenvolvidos para esse propósito, em que os
principais incluem os adenovírus e os retrovírus.
Adenovírus
São vírus de DNA dupla fita, que não inserem o DNA no

DNA da célula. Ao infectar e inserir o seu DNA no núcleo
da célula, esta, por sua vez, passa a produzir as
informações contidas no DNA viral, mas não transfere
essas informações adiante quando a célula se replica.
Retrovírus
São vírus de RNA que possuem a enzima transcriptase

reversa, capaz de transformar RNA em DNA. Esse tipo
de vírus é capaz de integrar esse DNA no DNA da célula
hospedeira. Passando a informação adicionada para
todas as células filhas.
A escolha dos vírus é realizada com base no seu poder de infecção,

tamanho do gene e se a alteração é permanente ou temporária na
célula.
Injeção de DNA
O DNA pode ser preparado, geralmente inserido em plasmídeos, e

injetado no paciente por injeção intramuscular. Essas são as chamadas
vacinas de DNA. Os plasmídeos conseguem se inserir nas células,
porém, com baixa eficiência. Essa é a principal forma de terapia gênica
in vivo e estudos combinam este tipo de terapia com a terapia ex vivo
para aumentar a eficiência da entrega do gene e produção da proteína.
A técnica tem se mostrado simples e de fácil aplicação, porém, as

células alteradas ficam restritas à região da injeção.
Microinjeção de DNA
Esta metodologia envolve a inserção do DNA de interesse direto no

núcleo da célula-alvo com auxílio de uma microagulha.
Processo de microinjeção de DNA no núcleo da célula.
Imagine você inserir um pedaço de DNA direto no núcleo de uma célula;

pois é, não é nada fácil. Esse processo é realizado em um equipamento
denominado micromanipulador e, apesar da alta eficiência, apresenta
poucas células alteradas para conter o DNA, uma vez que é feito célula
por célula. Essas células são então colocadas de volta no paciente.
Polímeros catiônicos
São moléculas que possuem carga positiva. Como o DNA tem carga
negativa, o DNA de interesse e os polímeros catiônicos são atraídos. Os
polímeros interagem com o DNA, ajudam na compactação do DNA e na
sua entrega à célula-alvo. Por possuírem carga positiva, os polímeros
interagem com estruturas com carga negativa da membrana plasmática
celular, facilitando a endocitose, colocando então o DNA dentro dela.
Muitos polímeros têm sido desenvolvidos com estas propriedades.
post_add
Saiba mais
A nanotecnologia tem contribuído bastante

para a medicina e terapia gênica pelo
encapsulamento do DNA e por ajudar a guiar
e direcionar o tipo de célula que o DNA deve
ser entregue.
Lipossomas
São vesículas formadas espontaneamente por lipídeos. Devido à sua

característica anfifílica em meio aquoso, os lipídeos tendem a “se juntar
para fugir da água”, formando uma bicamada lipídica. O DNA de
interesse (muitas vezes, presente no plasmídeo) é colocado na solução
aquosa e, logo após, são colocados os lipídeos, que formarão a vesícula
com bicamada lipídica para “fugir da água,” os chamados lipossomas, e
prender tudo que está no meio.
Representação 3D da estrutura de um lipossoma.
O uso de lipossomas catiônicos (com carga positiva) também ajuda a

captar o DNA com carga negativa do meio. Os lipossomas são então
colocados em contato com a célula-alvo e devido às propriedades
semelhantes da membrana plasmática e dos lipossomos, eles se
fundem colocando o DNA dentro da célula-alvo.
Bombardeamento de partículas
O gene de interesse pode ser transferido para a célula-alvo por meio do

bombardeamento, no qual o gene é associado a partículas esféricas
bem pequenas de ouro ou tungstênio, que interagem com o DNA pela
carga, e são lançadas em alta pressão e velocidade sobre as células-
alvo, atravessando as membranas celulares. Quando o gene de
interesse entra na célula do paciente, a célula começa a produzir a
proteína normal por meio da sua maquinaria celular, levando ao
tratamento da doença.
report_problem
Atenção!
Estudos apontam que esta técnica tem

menos eficiência na entrega do gene às
células, pois muitas células acabam
morrendo.
Agora que já conhecemos os tipos de terapia gênica, vamos a um

exemplo?
Após a coleta de células tronco da medula óssea por punção, a amostra

é levada para o laboratório, onde são cultivadas, crescidas em meios de
cultivo específicos para estas células. O vetor contendo o gene normal
ou o gene de interesse é preparado, em um plasmídeo, colocado em
uma forma de entrega para as células alvo. As células captam o vetor e
colocam o gene alvo para dentro e, em seguida, as células são injetadas
no paciente.
Essa terapia já foi realizada como ensaio clínico em pacientes graves e

tem apresentado melhor prognóstico para doenças como
imunodeficiência grave, hemofilia, cegueira causada por retinite
pigmentosa, leucemia e diversos tipos de câncer agressivos.
Linfócitos T, tratados por terapia gênica, para conter células carcinogênicas.
A terapia gênica possui algumas limitações, dentre as quais:
O risco de reação imunológica contra o vetor que está sendo

inserido, uma vez que pode ser reconhecido como um corpo
estranho;
O risco do gene ser inserido em células normais, não defeituosas

para o gene, o que pode alterar o funcionamento destas células;
O gene inserido pode ser colocado em lugares errados dentro do

genoma da célula, o que pode levar ao desenvolvimento de câncer;
Se esse DNA for inserido, por acidente, em células germinativas,

as alterações podem ser passadas para os descendentes.
Pesquisadores tem buscado resolver tais problemas para que a terapia

gênica seja feita com mais segurança e eficácia.
Edição genética
Nos últimos anos, uma nova alternativa para terapia gênica surgiu: a
edição genética.
Diferente da terapia gênica, que leva à adição de um gene inteiro nas

células-alvo, a edição permite alterar diretamente uma sequência de
DNA na célula. Assim, a edição gênica é mais uma alternativa que
permite realizar alterações nos genes ou regiões específicas do genoma
com fins terapêuticos. Na edição de genes, podemos realizar
modificações no genoma da célula pela deleção de sequências de DNA,
inserção de DNA ou consertar um gene defeituoso.
A técnica mais utilizada para este fim tem sido o CRISPR-Cas9, ou

simplesmente CRISPR, que vem do inglês Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats, que traduzido significa
Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente
Interespaçadas.
sms_failed
Curiosidade
O CRISP foi descoberto nas bactérias,

durante a análise do genoma bacteriano, em
1993. No entanto, anos depois, cientistas
entenderam que o CRISP fazia parte do
sistema imunológico bacteriano para defesa
de material genético estranho que entrasse
na bactéria (DNA ou RNA), como o de
bacteriófagos, que são os vírus que infectam
bactérias. Até as bactérias precisam se
proteger contra seus agressores, e o CRISPR
é um desses mecanismos de defesa para
sobrevivência bacteriana.
O CRISPR é composto por uma endonuclease (um grupo de enzimas

responsáveis por cortar/clivar/quebrar DNA que funcionam como
“tesouras moleculares”, capazes de cortar DNA), mais uma sequência
de RNA guia, também chamado de iniciador ou primers (semelhantes ao
usado na Reação em Cadeia da Polimerase – PCR). No genoma
bacteriano, foram encontrados genes para endonucleases e regiões
com sequências palindrômicas repetidas que eram espaçadas com
sequências de DNA complementares a bacteriófagos, daí, o nome.
Assim, quando a bactéria precisa se proteger da infecção viral, ela

produz a endonuclease mais as sequências RNA-guia, complementares
às do vírus. A endonuclease encontrada no CRISPR utilizado como
ferramenta biotecnológica é do tipo Cas e, por isso, o CRISPR-Cas9,
sendo Cas9 um tipo específico de uma endonuclease. A imagem a
seguir mostra a representação do genoma bacteriano com os genes
para endonucleases do tipo CAS; a sequência promotora, que promove a
expressão dos genes; sequências palindrômicas repetidas (SP); e as
sequências interespaçadas que são complementares a de
bacteriófagos.
Sequência do sistema CRISPR encontrado no genoma bacteriano.
Mas você sabe como o sistema CRISPR funciona para a bactéria?
forum
Resposta
Quando a bactéria é infectada por um
bacteriófago, ela pode reconhecer a infecção
e criar um mecanismo de memória contra
este vírus, que é o CRISPR. Esse sistema é
composto por uma enzima chamada de
endonuclease (enzimas que cortam DNA ou
RNA) e um iniciador ou primers, que ajuda a
direcionar a endonuclease para sequências
de material genético do vírus que está
infectando. Assim, com uma endonuclease e
uma sequência de RNA guia (gRNA) para
direcionar a enzima para sequências
complementares, a bactéria acaba cortando
todo material genético que é complementar
ao gRNA e se protegendo da infecção.
Como o CRISPR é usado como ferramenta de edição genética?
Em 2012, duas pesquisadoras, Emmanuelle Charpentier e Jennifer
Doudna, utilizaram o sistema CRISPR como ferramenta de edição
gênica, o que lhes rendeu o prêmio Nobel de química de 2020. A
ferramenta é relativamente simples, comparada a outras metodologias
de edição genética, barata e com boa precisão e especificidade. A
ferramenta utiliza a endonuclease do tipo Cas9 associada a um RNA
guia; a Cas9 é ligada ao RNA guia e só vai cortar o DNA quando o RNA
guia se ligar firmemente a uma sequência que seja complementar a ele.
Emmanuelle Charpentier, pesquisadora francesa, professora e pesquisadora da Universidade de

Viena.
Jennifer Doudna, pesquisadora americana, professora da Universidade da Califórnia em Berkeley.
O que tem sido feito é desenhar em laboratório um RNA guia para o

gene defeituoso ou que se quer alterar e associar a Cas9. Assim, o RNA
guia vai se ligar por complementariedade às bases nitrogenadas
presentes no DN e quando isso acontece, a Cas9 corta o DNA,
eliminando aquela sequência alterada. A edição genética tem sido
realizada para deletar genes defeituosos, consertar genes defeituosos e
inserir novos genes, tudo isso com base na complementariedade das
bases nitrogenadas do DNA e do RNA.
O CRISPR pode ser utilizado para edição genética de qualquer ser vivo,
uma vez que o DNA é o material genético de todos.
CRISPR-Cas9 utilizado na engenharia genética para edição de genomas.
A edição genética já foi realizada em humanos, primeiro, para tratar um

paciente com câncer de pulmão agressivo, onde as células foram
retiradas do paciente, cultivadas em laboratórios e o CRISPR utilizado
para cortar e silenciar o gene PD-1, responsável por frear a resposta
imunológica contra o câncer. As células foram depois injetadas
novamente no paciente, que apresentou melhoras.
O caso mais impressionante e chocante para toda a humanidade

aconteceu em 2018, quando um pesquisador chinês anunciou ter
editado o genoma humano de um embrião in vitro e o seu
desenvolvimento, originando gêmeas. O caso teve uma enorme
repercussão mundial e o pesquisador foi condenado à prisão e multa
milionária, além de estar impedido de exercer a profissão. As gêmeas
possuem sua identidade preservada e são acompanhadas por médicos
e pesquisadores.
E por que isso aconteceu? expand_more
Apesar de toda a repercussão, não se tem dados suficientes para se

editar um embrião humano. Os estudos são promissores, porém são
necessários mais dados sobre a eficácia da edição e de possíveis
efeitos colaterais. Novamente, a Biotecnologia traz junto questões sobre
biossegurança e de bioética quanto ao uso de suas técnicas em seres
humanos.
sms_failed
Curiosidade
O CRISPR tem proporcionado diversos

avanços na agricultura, agropecuária,
melhoramento genético de animais e
plantas. Na saúde humana, tem
proporcionado conhecimentos e terapias
para doenças genéticas hereditárias,
tratamento de doenças infecciosas, como a
cura para o HIV, tratamento de diversos tipos
de câncer, tratamento de diabetes, edição de
RNA, entre outras possibilidades.
video_library
CRISPR-Cas9: a ferramenta de edição
gênica
Neste vídeo, explicamos o funcionamento do CRISPR, sua aplicação em
diversos estudos e a polêmica envolvida na utilização de células
humanas.
playlist_play
Terapia genética
Métodos para terapia gênica
Tipos de vetores de transporte
emoji_events
Falta pouco para

atingir seus
objetivos.
Questão 1
Para se inserir um material genético em uma célula cujo DNA está

mutado ou defeituoso, é necessário colocar o material genético
normal em um vetor, que vai funcionar como veículo, para que o
material genético chegue até a célula-alvo. Sobre os vetores analise
as afirmativas a seguir:
I. Os vírus são um dos principais vetores de transporte gênico para

a célula-alvo.
II. Os polímeros aniônicos interagem com o DNA, ajudam na sua
compactação e na sua entrega à célula-alvo, sendo assim vetores
de clonagem.
III. O gene de interesse pode ser transferido para a célula-alvo pelo
bombardeamento, onde o gene é associado a partículas esféricas
bem pequenas de ouro ou tungstênio, que interagem com o DNA
pela carga, e são lançados em alta pressão e velocidade sobre as
células-alvo, atravessando as membranas celulares.
IV. Recentemente, as células-tronco têm sido relatadas como um
excelente vetor de transporte pela sua capacidade de
autorrenovação e crescimento.
É correto o que se afirma em:
A I e II.
B I e III.
C I e IV.
D II e III.
E III e IV.
Responder
Questão 2
Todo organismo vivo é formado por células e, dentro delas, estão as

informações genéticas para o funcionamento correto de todo o
organismo. Quando uma célula apresenta um defeito genético, uma
opção de tratamento seria a terapia gênica. Do que se trata esse
tipo de terapia?
Determinar a sequência de DNA de genes associados

A ao tratamento para se determinar a melhor opção
terapêutica.
Realizar a infusão de células-tronco do paciente na

B
área danificada pela doença.
Realizar a correção do gene defeituoso pela adição de

C
um gene normal ou pela edição gênica.
Analisar os dados genéticos do paciente e aumentar a

D
dose do fármaco.
Usar células-tronco embrionárias para regenerar toda

E
a área afetada.
Responder
Considerações finais
A Biotecnologia tem aberto novas possibilidades e áreas de estudo,
principalmente na área da saúde, com o uso de células-tronco que surge
como opção de terapia para diversas doenças que causem danos a
tecidos e órgãos, e como a terapia gênica tem sido utilizada para
consertar defeitos no material genético.
Além da técnica revolucionária CRISPR, que, por meio de achados em

bactérias, tem permitido editar o genoma de qualquer ser vivo.
Tudo isso só tem sido possível com o conhecimento gerado acerca do

DNA, das proteínas e do funcionamento de uma célula. Os
sequenciamentos de DNA abriram novas possibilidades e trouxeram
consigo muitas respostas, soluções e muitos outros questionamentos.
Conhecendo a sequência de DNA de um indivíduo, é possível consertá-lo
ou, ainda, definir a melhor opção de tratamento por meio da
farmacogenética/farmacogenômica. Caminhamos para o que
especialistas chamam de medicina personalizada, na qual cada
indivíduo recebe um tratamento de acordo com o seu organismo. Bem-
vindos ao futuro!
headset
Podcast
Antes de finalizarmos, ouça este podcast, em que a
especialista propõe um debate sobre as questões regulatórias
e éticas da terapia gênica.
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Para aprofundar seus conhecimentos sobre o tema:
Assista ao vídeo Células-tronco - Primeiro transplante de células-

tronco adultas do tecido adiposo no Brasil, disponível no Youtube.
Assista ao vídeo Questões bioéticas acerca do uso de células-

tronco, disponível no Youtube.
Assista ao bate papo sobre a edição de genomas CRISPR em USP

Talks #26: Genética, também disponível no Youtube.
Leia o conteúdo sobre sequenciamento de DNA no site da Khan

Academy.
Referências
BARBOZA, C. M. S.; TERRA, M. M.; RIBEIRO, M. L. C.; SILVA, J. B. A
técnica de CRISPR-Cas9 na terapia gênica: uma revisão da literatura.
Revista Transformar, 2019. Consultado na internet em: 9 maio 2022.
BRITO, M. A farmacogenética e a medicina personalizada. Saúde &
tecnologia, n. 14, 2015. Consultado na internet em: 9 maio 2022.
CHRISTOFF, A. P. Genômica e sequenciamento de nova geração.

Marcadores moleculares na era genômica: metodologias e aplicações.
Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2017.
EITELVEN, T.; MENIN, R. P.; FUSIGER, K. C.; BENVENUTTI, V.; ZANINI, J.;
CAUMO, C. R.; BALESTRIN, R. C. Aplicações biológicas de células-
tronco: benefícios e restrições. Revista Interdisciplinar de Ciência
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Pesquisa com células-tronco no Brasil: a produção de um novo campo
científico. Hist. cienc. saúde-Manguinhos, v. 24, n 1, 2017. Consultado na
internet em: 9 maio 2022.
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2 Células-Tronco, Terapia Gênica e Farmacogenética

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15/11/2023, 20:25 Células-tronco, terapia gênica e farmacogenética

Reconhecer as aplicações das células-tronco.

Reconhecer as práticas da farmacogenética.

Reconhecer o processo de terapia gênica.

Na Saúde, a Biotecnologia tem contribuído para o entendimento

Com essas e outras aplicações da Biotecnologia, a medicina

Introdução ao uso das células-tronco

Terapia com células-tronco

O organismo humano é formado por diversos órgãos, como o coração,

Uma das formas de curar danos ou traumas aos tecidos/membros ou

Além disso, muitas doenças ocorrem em tecidos que não possuem a

Células-tronco e sua capacidade de se transformar em tecidos para restituir órgãos.

O uso de células-tronco como terapia vai muito além. Podemos usar

Agora, vamos ver o uso de células-tronco para tratamento.

As células-tronco são consideradas células indiferenciadas, capazes de

Também tem sido demonstrada a

As células-tronco são a base para a formação dos tecidos e órgãos do

Células-tronco embrionárias expand_more

Células-tronco adultas expand_more

Células-tronco pluripotentes induzidas (IPS) expand_more

Além da origem dessas células-tronco, elas também podem ser

São aquelas células capazes de se transformar em todos os

São aquelas com capacidade de se diferenciar em uma família

São aquelas com capacidade de se transformar em um único

O que de fato acontece é que, durante a fecundação, os primeiros

Diferenciação entre as células conforme a capacidade de transformação.

Nos dias atuais, pesquisadores e cientistas têm utilizado células adultas

Aplicações das células-tronco

Substituição de tecidos, órgãos ou membros (medicina

As células-tronco podem ser usadas para substituir órgãos ou tecidos

Doenças hematopoiéticas, como leucemia, linfomas, síndrome

Distúrbios metabólicos, como diabetes tipo 1;

Doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson,

Diversas doenças cardíacas, como infarto e insuficiência cardíaca;

Na imagem a seguir podemos ver uma aplicação das células-tronco em

As células-tronco também podem ser estimuladas a formarem

Para o sucesso do tratamento, as células-tronco devem ser coletadas,

Nos dias atuais, a medicina regenerativa avançou e adicionou novos

Mas o que são organoides?

É o nome dado ao cultivo, em laboratório, de células-tronco para gerar

Para isso, são usadas culturas celulares 3D com células-tronco

Na cultura 3D, as células podem crescer em todas as direções, similar a

Foto de um organoide intestinal criado a partir de células-tronco pluripotentes.

A medicina regenerativa também tem sido utilizada na estética para

Como as células-tronco se diferenciam para diversos tecidos, podendo

Esquema ilustrando as etapas para a utilização das células-tronco para a compreensão de

Muitas pesquisas necessitam das células e dos tecidos doentes para

Reprogramação das iPS para transformação em células-tronco e posterior transformação no

A compreensão de como as células se diferenciam em outras células

As iPS são células adultas reprogramadas para se tornarem células-

Qualquer tipo de célula pode ser reprogramada e o uso dessas células

O desenvolvimento de novos medicamentos leva tempo, pois diversos

Os testes com células-tronco também são importantes para se medir a

Nesse tipo de aplicação, podemos ter o uso de células-tronco para se

Testes de medicamentos a partir das células-tronco.

O uso de animais para descoberta de novos medicamentos, muitas

Algumas limitações no uso de células-tronco incluem:

Sua diferenciação em tecidos específicos (o que envolve o uso de

O controle de qualidade para se evitar a contaminação com outras

O crescimento em um número adequado para se realizar os testes.

No futuro, espera-se criar modelos de estudos com diferentes tipos de

A seguir vemos um esquema mostrando que a partir de organoides é

Nas culturas 2D, as células crescem sobre