UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Diferenciação dos processos inflamatórios em processos alérgicos

envolvendo alimentos: um estudo sobre leite de vaca e amendoim como
alérgenos

Proponentes: Alunos

João Pessoa
2022
1- IDENTIFICAÇÃO DA PROPOSTA

Título: Diferenciação dos processos inflamatórios em processos alérgicos

envolvendo alimentos: um estudo sobre leite de vaca e amendoim como alérgenos

CHAMADA UNIVERSAL – MCTI/CNPq N º 14/2022

Valor do financiamento: R$ 50.000,00 (Cinquenta mil reais)
Coordenadora: Tatjana Keesen de Souza Lima

2- RESUMO

A alergia alimentar é uma resposta imunológica, que é desencadeada por

antígenos de proteínas alimentares.Os casos de alergias alimentares está aumentando e
o padrão de tratamento não é assertivo, tendo em vista que a maior estratégia é evitar
alérgenos alimentares, usar bióticos (prebióticos, probióticos, simbióticos e pós-bióticos)
como ferramentas dietéticas suplementares e tratar com adrenalina as reações
sistêmicas que ocorrem devido o alérgenos. è válido ressaltar que a eliminação de
alguns alimentos na dieta do indivíduo pode acarretar em perda de fontes importantes de
nutrientes, como o cálcio, portanto, estratégias novas devem ser desenvolvidas e a
diferença entres as alergias deve ser revelada para um tratamento mais assertivo e
específico. Assim, entender a diferença entre as alergias, um diagnóstico preciso, a
prevenção e o tratamento são necessidades urgentes, cuja pesquisa tem sido pelos
avanços tecnológicos que permitem uma compreensão mecanicista da alergia alimentar
nos níveis celular e molecular. A proposta apresentada empregara estratégias para
compreender os mecanismos e as diferenças entre as RAA (Reações Adversas
Alimentícias) de leite de vaca e amendoim podendo ajudar na fabricação de novos
fármacos e tratamentos mais especializados.

3- QUALIFICAÇÃO DO PRINCIPAL PROBLEMA A SER ABORDADO

Doenças atópicas geralmente ocorrem em progressão, que pode ser chamada de

marcha atópica, que, se ocorrida na infância, é geralmente ligada a dermatites e pode
ser escalonada para o desenvolvimento de rinite alérgica, asma e RAA.
As RAA é uma reação patológica do sistema imunológico que é desencadeada
devido a ingestão de um antígeno protéico alimentar, uma pequena ingestão da
substância alergênica pode desencadear sintomas clínicos, como gastrointestinais,
urticárias e inflamação das vias aéreas, que pode variar em gravidade, podendo ser um
risco a vida ou não. As RAA distingue-se da da intolerância alimentar, no sentido que a
intolerância não ocorre uma desregulação no sistema imunológico, um exemplo é que a
intolerância à lactose, ocorre pois há uma má absorção da lactose, por causa da
deficiência de lactase, não havendo fatores imunes (Wong Yu et al., 2016).
Ademais, as RAA tem um impacto socioeconômico significativo, e há preocupação
no seu aumento, a importância de um diagnóstico correto, diminui consequências
adversas para o indivíduo e família, evitando tratamentos ineficazes, a correta
identificação facilita o crescimento e o desenvolvimento normal da criança, sabendo que
com a eliminação de alimentos como o leite de vaca e o amendoim, o organismo acaba
perdendo fontes importantes de nutrientes, como o cálcio e a vitamina E que deve ser
substituída adequadamente (Dardengo, 2018; Burbosa et al., 2022).
A alergia advinda de alimentos é uma problemática que está crescendo em
incidência e gravidade, tornando-se um problema de saúde pública. Atualmente, não há
avanços terapêuticos aprovados que previnam reações alérgicas ou que alterariam a
imunidade celular que é polarizada pelo TH2 e as citocinas que causam a inflamação
alérgica. A alergia ao leite afeta crianças e adultos em todo mundo, pacientes alérgicos
ao leite de vaca que pode acarretar em uma sensibilização apresentando imunoglobulina
(Ig) específicas para inúmeras proteínas, principalmente b-lactoglobulina (BLG) e
caseína. mesmo que grande parte dos afetados pela alergia ao leite de vaca tenham sua
alergia anulada aos 3 anos em média; a alergia ao leite de vaca mediada por IgE pode-
se tornar uma alergia a outros alimentos e pode desenvolver surtos de asma no futuro
(Martins et al., 2017; Adel-Patient et al., 2005). Diferente da alergia ao leite bovino, a
alergia ao amendoim não é facilmente superada e pode acarretar em reações
anafiláticas. Dois estudos feitos no Reino Unido mostram que a sensibilização ao
amendoim está escalonando. Os alérgenos apresentados no amendoim são Ara h1
(vicilina) e Ara h2 (conglutinin-like protein), que foram identificadas em mais de 65% dos
pacientes alérgicos ao amendoim, além da Ara h3/4 (glicina) que foi identificada como
um alérgeno de 44% a 53% dos pacientes alérgicos ao amendoim.
O fenótipo das respostas imunes resulta de eventos únicos que envolve a
apresentação de antígenos que ativam diferentes vias de sinalização de linfócitos. A
indução de respostas imunes de TH2, os eventos de sinalização específicos que levam
ao desenvolvimento de um distúrbio alérgico associado à imunidade com viés de TH2
não são claros. Mais importante, uma vez formada, a plasticidade dessas respostas
imunes não foi determinada. A maioria das abordagens que tentam tratar doenças
alérgicas uma exposição progressiva a alérgenos na pele ou superfícies mucosas; no
entanto, esses métodos simplesmente reduziram as reações ao antígeno, causando
dessensibilização temporária ao alérgeno.

4- OBJETIVOS E METAS A SEREM ALCANÇADOS

Objetivo Geral:

Identificar os processos inflamatórios provenientes de reações alérgicas

alimentares envolvendo leite de vaca e amendoim e avaliar a resposta imune do
organismo em frente à ingestão de alimentos com grande potencial alérgeno.
Este projeto foi dividido em três grupos de objetivos específicos:
Objetivo específico 1: Identificar quais células pró-inflamatórias são ativadas durante o
processo alérgico proveniente de alimentos e as cascatas de sinalização respectivas
Objetivo específico 2: Identificar se há algum tipo de resposta imune em indivíduos
sem alergia
Objetivo específico 3: Comparar as respostas imunes entre os grupos e identificar
similaridades

Metas e Atividades:
Atividade Meta

Administrar soluções de Toxina Colérica Induzir hipersensibilidade a leite e a amendoim

misturadas com leite e com amendoim nos camundongos

Análise de soro sanguíneo e fezes dos Averiguar o estado imunológico dos indivíduos e
camundongos conferir se a hipersensibilização foi um sucesso

Alimentar os grupos com leite e amendoim Provocar reações alérgicas nos grupos
alérgicos às substâncias designadas e introduzir
os alimentos ao grupo controle

Análise de soro sanguíneo, estômago, intestino
e fígado
Identificar cadeias de sinalização para citocinas
e/ou marcadores específicos de inflamação;
analisar a resposta imunológica do controle
negativo ao entrar em contato com as
substâncias

Comparação entre grupos Identificar similaridades e diferenças nas

respostas imunes dos indivíduos
5- METODOLOGIA

Camundongos

Serão utilizados camundongos Swiss com idade entre seis e doze semanas, com
peso oscilando entre 25g e 30 g. Os animais devem ser mantidos em gaiolas de
polipropileno a uma temperatura de 25 ± 1ºC sob ciclos claro/escuro de 12 horas com
livre acesso à água e ração durante todo o período de experimentação. O fornecimento
dos camundongos será feito pelo biotério Professor Thomas George do Instituto de
Pesquisa em Fármacos e Medicamentos da Universidade Federal da Paraíba/UFPB. Os
protocolos experimentais foram submetidos à Comissão de Ética no Uso de Animais da
UFPB.
Esses camundongos serão divididos em grupos de acordo com sua dieta e com
as RAA que eles irão adquirir: o supergrupo C (contendo os grupos C0, C1 e C2); o
supergrupo L (contendo os grupos L1 e L2); o supergrupo A (contendo os grupos A1 e
A2). O supergrupo C irá incluir camundongos que não possuem alergias, portanto
nenhum tratamento para induzir alergia será necessário. Os supergrupos L e A
receberão tratamento com TC assimilada com os alimentos selecionados (os
camundongos L receberão uma mistura de 4µL de toxina colérica com 0,1mL de leite de
vaca e 96µL de PBS, e os camundongos A receberão uma mistura de 4µL toxina colérica
com 0,1mg de farinha de amendoim e 96µL de PBS), esse tratamento servirá para
estimular hipersensibilidade aos alimentos relacionados a cada supergrupo e deverá ser
administrado em intervalos de uma semana de dieta continuada para uma semana sem
alimentação com as misturas, o tratamento durará por 6 semanas, sendo 3 semanas de
dieta com toxina colérica associada e 3 semanas intercaladas sem a dieta (Proust et al.,
2009).
Durante todo o processo de tratamento (as 6 semanas), os camundongos terão
suas fezes e seu sangue coletados em intervalos de 5 em 5 dias e analisados por ELISA
para averiguar o progresso da hipersensibilização, o processo de coleta continuará por
mais 10 dias, para verificar se a condição se estabilizou. Ao fim desses 10 dias, a água
dos camundongos pertencentes aos grupos C1, L1 e A1 será substituída por leite de
vaca, e todos e quaisquer sintomas visíveis deverão ser registrados. Do mesmo modo,
os camundongos dos grupos C2, L2 e A2 serão alimentados com farinha de amendoim e
observados e registrados da mesma maneira acima citada. O grupo C0 não será
alimentado com leite de vaca e nem com amendoim, ele servirá como grupo controle
negativo. Em caso de reações similares a choque anafilático, os camundongos devem
ser imediatamente removidos e então, após passar por um processo de eutanásia, ter
uma amostra de seu sangue retirada, assim como seus pulmões, intestinos, estômagos
e fígados coletados e analisados em ELISA e na citometria de fluxo.
No caso de camundongos que não apresentaram choque anafilático, inclusive os
camundongos C0, o processo de coleta de sangue e órgãos acontecerá após um
período de 24h após a inserção dos alimentos com potencial alergênico.

Imunofluorescência para análise de células Treg

Serão utilizadas placas estéreis de 96 poços, serão adicionados 25 μL da

suspensão de células, ou seja, 2,5 x 105 , células em cada poço junto com 175 μl de
RPMI suplementado. Será adicionado, aos poços, brefeldina A (1mg/ml) e a visando agir
por quatro horas em estufa de CO2. A brefeldina A age sobre a estrutura do complexo de
Golgi impedindo, deste modo, que ocorra a transferência de proteínas para o meio
externo da célula. Ao final das quatro horas, será retirada a placa da estufa e
centrifugada por 10 minutos (200 x g, 4 ºC). Ocorrerá o descarte do sobrenadante e as
células ficarão suspensas por agitação. Em seguida serão adicionados os anticorpos
antimarcadores de superfície, após diluídos, conforme titulação padronizada na fase de
padronização dos reagentes, num volume final de 40μL. Após adição dos anticorpos, a
placa será incubada a 4ºC por 15 minutos ao abrigo da luz. Terminado o período de
incubação, a lavagem das células será realizada e no decorrer será adicionado 150 μL
de PBS gelado em cada poço. A placa será centrifugada durante 10 minutos (200 x g, 4
ºC). No fim da centrifugação, o líquido sobrenadante será retirado da placa e, em
seguida, a placa será agitada visando suspender as células. Assim que as células já
estiverem suspendidas, será adicionado, 100 μL de PBS e 100 μL de solução de
formaldeído 4%, para a fixação por 20 minutos à temperatura ambiente.
Após remover a solução de fixação por centrifugação e lavar as células com 150
μL de PBS, será realizada a permeabilização celular, incubando as células por 10
minutos com solução de saponina 0,5% à temperatura ambiente. Ao final do tempo de
incubação, a placa será centrifugada por 10 minutos (200 x g, 4 ºC). O sobrenadante
será desprezado e a placa será agitada. Em seguida, será adicionada sobre as células,
40 μL da solução de anticorpos anticitocinas que estarão diluídos em solução de
saponina 0,5%. As amostras após incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente,
serão lavadas, por centrifugação, adicionando a cada poço, 150 μL da solução de
saponina. por fim isto será repetido duas vezes, contudo, na última vez, às células serão
lavadas com PBS/BSA e após serão desprezados o sobrenadante e agitarão a placa, as
células serão diluídas em 100 μL de PBS e 100 μL de solução de formaldeído 4%. O
volume final de 200 μL de solução contendo as células marcadas será transferido para
tubos próprios para leitura.

Anticorpos monoclonais (Mabs)

Os anticorpos que serão utilizados para a marcação de moléculas de superfície

serão: controles de Isotipo marcados (FITC, PE e PERCP), anti- PD1, anti-HLA-DR, anti-
CCR6, anti-CD4, anti-CD25, antiCD127, anti-CD45RA, anti-CD39 e anti-CD73. Para
ocorrer as marcações intracelulares os seguintes anticorpos serão utilizados: anti-CTLA-
4, anti-IL-17, anti-FOXP3, anti-IL-10 e anti- TGF. Os anticorpos utilizados serão
adquiridos das companhias BD PharmigenTM (CA, USA) ou Ebioscience (San Diego,
CA, USA).

Aquisição e análise dos dados por citometria de fluxo

As preparações celulares marcadas com os anticorpos monoclonais fluorescentes

serão avaliadas em citômetro de fluxo - FACSCANTOII (Becton & Dickinson)
imediatamente após a marcação, já descrita. Durante a aquisição dos dados serão
coletados 100.000 eventos. Os dados serão analisados usando o programa Flowjo (Tree
Star)

Análise estatística

As análises estatísticas serão realizadas utilizando o software JMP (SAS Institute

Inc.). Para análise comparativa entre os diferentes grupos será utilizado o teste Mann-
Whitney, visando detectar diferenças entre os grupos de indivíduos não infectados, e os
camundongos swiss infectados com a toxina colérica, no intuito de realizar análises
pareadas. Para as análises de correlação dos parâmetros clínicos será empregado o
teste de Spearmans (rS) Rank que são dados não paramétricos ou de Pearson (dados
paramétricos). As diferenças estatisticamente significativas serão consideradas quando p
≤ 0.05

6- PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES CIENTÍFICAS OU TECNOLÓGICAS DA

PROPOSTA

O entendimento do processo alérgico e inflamatório causado por ingestão de

produtos alimentícios pode gerar uma nova gama de possibilidades farmacológicas
para o tratamento e possivelmente prevenção de situações de hipersensibilidade
relacionadas a esses tipos de substância. Com bases nos dados expostos e na
literatura base, estima-se que o projeto possa fornecer um melhor entendimento dos
mecanismos inflamatórios relacionados a alergias e agentes com alto potencial
alérgeno, dado que as proteínas do leite de vaca e do amendoim fazem parte dos
oito alérgenos alimentares com a maior taxa de ocorrência de alergia alimentar
(Silva et al, 2018).
Os dados obtidos serão úteis ainda para suportar futuras pesquisas
relacionadas aos processos alérgicos, visto que a hipersensibilidade alérgica a uma
determinada proteína não se restringe a ela apenas, mas também às proteínas com
conformação e estrutura similares. Desse modo, o presente projeto espera realizar
não apenas um avanço no entendimento do funcionamento dos processos alérgicos
alimentares sob uma ótica específica (leite de vaca e amendoim), como também
uma compreensão mais ampla sobre processos de RAA no geral e como indivíduos
sem alergia respondem ao estímulo desses alérgenos. (Silva et al, 2018).
O entendimento das informações obtidas durante esse projeto fornece
benefícios que se manifestam em diversas frentes, trazendo avanços sociais,
econômicos, científicos e acadêmicos:

(1) Analisando por uma ótica social, as dificuldades causadas pela

impossibilidade de se alimentar desses produtos podem ser reduzidas ou até
anuladas, trazendo de volta alimentos importantes para o desenvolvimento infanto-
juvenil e também trazendo benefícios à terceira idade. Sem a preocupação exclusiva
de evitar tais alimentos, provocando uma sensação de integração à parcela da
comunidade que não é afetada pelas RAA;
 (2) Quando se trata de impactos econômicos, o sucesso do projeto e suas
possíveis decorrências ocasionará em uma melhoria significativa no comércio de
alimentos que possuem substâncias alérgenas em sua composição. A industria
farmacêutica também apresentará novas opções de produtos para auxiliar no
tratamento, e possivelmente prevenção, das RAA;

(3) Dentro do âmbito científico, a compreensão de mecanismos e processos

biológicos em que os seres vivos estão inseridos é de fundamental aprofundamento,
aproveitando-se da biotecnologia em sua forma mais literal podemos então
compreender os métodos e ferramentas envolvidas pelos seres vivos para combater
uma situação de hipersensibilidade alérgica.

(4) Ainda dentro do âmbito científico, porém de acordo com uma ótica mais
didática e tendo em vista a formação acadêmica, o presente projeto auxilia no
processo de treinamento estudantil dentro de laboratório, além de estimular o
pensamento direcionado aos outros âmbitos aqui citados, permitindo o
desenvolvimento de um núcleo de formação e capacitação de recursos humanos.

7- ORÇAMENTO DETALHADO

MATERIAL DE CONSUMO

DESCRIÇÃO FINALIDADE UNID QTD VALOR TOTAL (R$)

UNITÁRIO

1) Ponteiras com barreira 0- Material utilizado no 100 2 72,35 144,70

10µL processamento das
amostras

2) Ponteiras com barreira 1- Material utilizado no 100 2 49,90 98,80

250µL processamento das
amostras

3) Ponteiras com barreira 100- Material utilizado no 100 2 42,41 84,82

1000µL processamento das
amostras

4) Pacotes de avental Utilizado na realização dos 10 4 92,86 185,72

descartável TNT manga longa experimentos

5) Caixas de luva de Utilizado em 100 1 37,90 37,90

procedimento tamanhos P, M e procedimentos
G – Caixa com 100 unidades. laboratoriais de uma forma
 geral

6) Reagentes para citometria Material utilizado para 1 1 1.300,00 1.300,00

(Tubos de citometria, soluções leitura das amostras de
para FACSCanto II) citometria

7) CST beads Material utilizado no 1 1 3.848,08 3.848,08

Citômetro de Fluxo para
ajuste de leitura das
amostras

8) Meios de cultura e PBS Material utilizado para 1 1 1.500,00 1.500,00

experimentos com
citometria de fluxo

9) BD GolgiStop Aumentar a capacidade de 1 1 364,00 364,00

detecção de células
produtoras de citocinas
com coloração
imunofluorescente e
análise citométrica de fluxo

10) Seringa Descartável BD Material para coleta de 10 20 44,80 896,00

ULTRAFINE amostras

11) Material plástico e Material utilizado para 1 1 2.000,00 2.000,00

descartável (frascos de coleta, experimentos de citometria
papel de filtro)

12) Toxina colérica Material para 1 10 1.404,50 14.045,00

hipersensibilização das
cobaias

13) Insumos alimentícios Material para testes 1 5 25,00 125,00

alergênicos

14) Anticorpos monoclonais Material para experimento 1 9 1.200,00 10.800,00

para citometria de fluxo com citometria de fluxo

15) Brefeldin A Material utilizado para 1 1 1.000,00 1.000,00

experimentos de marcação
intracelular
Total do Elemento de Despesa (Mat. Consumo) (R$) 39.621,84

8- CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

O cronograma a seguir refere-se às atividades que pretendemos realizar com

a implantação do projeto. Estas atividades se referem ao período de 12 meses de
 acompanhamento do experimento proposto, tempo que julgamos necessário para
realizá-lo. Qualquer alteração no tempo esperado de acompanhamento será
previamente informada aos envolvidos neste trabalho, bem como serão realizadas
alterações no cronograma para melhor entendimento e organização. O material
designado para consumo e utilização no projeto será adquirido ao longo do mesmo,
principalmente nos três primeiros meses. A partir do terceiro mês será iniciada a
coleta das amostras de indivíduos para assegurar que a hipersensibilidade foi
atingida. A partir do quinto mês serão realizados os experimentos de citometria de
fluxo e ELISA para avaliar citocinas pró-inflamatórias e resposta de imunoglobulinas.
Os dados serão recolhidos durante todo o período dos experimentos, para que
possam ser integrados à análise estatística e, posteriormente, possam ser
comparados a fim de gerar os dados finais da pesquisa.

Atividades Meses
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º

Aquisição dos materiais X X X

Hipersensibilização dos indivíduos X X X
Coleta de amostras de sangue e fezes X X X X
Dieta e manejo dos indivíduos X X X
Coleta de amostras de sangue e tecidos X X
Processamento dos tecidos para análise X X X
usando ELISA e citometria de fluxo

Marcação de moléculas de superfície X X

usando anticorpos

Aquisição e análise dos dados por X X X

citometria de fluxo

Análise estatística X X X X X X X X X X X
Análise comparativa e discussão de X X X X
resultados

9- IDENTIFICAÇÃO DOS DEMAIS PARTICIPANTES DO PROJETO

 Nome Titularidade/Instituição Atividades

Dra. Tatjana Keesen de Professora adjunto do Coordenadora dos

Souza Lima departamento de Biologia experimentos, análise dos
Celular e Molecular do resultados, discussão de
Centro de Biotecnologia da resultados, elaboração de
UFPB artigos científicos e
relatórios

Arthur Henrique Araújo Aluno de Iniciação Científica Colaboração na parte

Martins experimental, manejo
animal e análise de dados

Filipe Martins Aluno de Iniciação Científica Colaboração na parte

experimental, manejo
animal e análise de dados

10- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DARDENGO, Raíssa. Food allergies: a review focusing on milk protein, effects on

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Faculty of Sinop.

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MARTINS, Carmen Lívia Faria da Silva, et al. Asma e alergia alimentar. In: OLIVEIRA,
Alessandra Ribeiro Ventura, et al. Manual: alergia alimentar. Liga de Alergia e Imunologia
da Universidade Católica de Brasília - UCB, série LAI, 2017.

NISHISAKA, Nobuyasy; MORSE, Philo; JONES, Richard F.; WANG, Ching Y.; HAAS,
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O’KONEK, Jessica J.; LANDERS, Jeffrey J; JANCZAK, Katarzyna; GOEL, Rishi;

MONDRUSOV, Anna; WONG, Pamela; BAKER, James. Nanoemulsion adjuvant–
driven redirection of TH2 immunity inhibits allergic reactions in murine models of
peanut allergy.

SILVA, Elisiane Beatriz et al., Alergia Alimentar: Principais Alimentos

Envolvidos – uma Revisão International Journal of Nutrology, Thieme Revinter
Publicações Ltda, 03: 71-111. Set, 2018