UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE ODONTOLOGIA

BRENDA ZULIAN DE LIMA

VANESSA RODRIGUES FERNANDES

ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR

DE UMA CHALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM
CALOTA CRANIANA DE RATOS

Itajaí, (SC) 2011.

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BRENDA ZULIAN DE LIMA

VANESSA RODRIGUES FERNANDES

ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR

DE UMA CHALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM
CALOTA CRANIANA DE RATOS

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

como requisito parcial para obtenção do título
de cirurgião-dentista do Curso de Odontologia
da Universidade do Vale do Itajaí.

Orientador: Prof. David Rivero Tames

Itajaí, (SC) 2011.

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BRENDA ZULIAN DE LIMA

VANESSA RODRIGUES FERNANDES

ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR DE

UMA CHALCONA SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM
CALOTA CRANIANA DE RATOS

O presente Trabalho de Conclusão de

Curso apresentado como requisito parcial
para obtenção do título de cirurgião-
dentista do Curso de Odontologia da
Universidade do Vale do Itajaí, aos 20
dias do mês de setembro do ano de dois
mil e onze, é considerado aprovado.

1. Prof. Dr. David Rivero Tames___________________________

Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)

2. Prof. Dr. Telmo José Mezadri ___________________________

Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)

3. Prof. Msc. João Carlos Müller Filho ______________________

Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
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citação do
AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais em primeiro lugar, que se doaram inteiros e

abdicaram dos seus sonhos para tornar realidade os meus, pelo amor, carinho,
dedicação e compreensão em alguns momentos, por terem me dado o dom da
vida e me ensinado tudo o que precisei para estar aqui hoje, vencendo mais
uma batalha, conquistando um sonho.
A minha irmã Bêtania Zulian de Lima por me ensinar outra forma de
amor, que jamais imaginei sentir.
Aos meus dindos Elisa e Raphael Deluchi, aos meus primos Leonardo e
Rafaele Deluchi pelo carinho, amizade, pelos momentos de alegria
proporcionado e por estarem ao meu lado durante esta jornada.
Ao professor David Rivero Tames por sua paciência, dedicação,
empenho, e pela orientação durante todo o trabalho.
As funcionárias do laboratório Beatriz, Maria e Vanessa, pela ajuda,
momentos de risada, por tornarem minhas idas ao laboratório mais felizes.
Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, me ajudando,
apoiando, escutando e dando forças para a conclusão deste trabalho.
Muito obrigada a todos.
Brenda Zulian de Lima

Agradeço á minha família pelo apoio e perseverança em todos os

momentos.
Agradeço ao professor David Tames pela pessoa extraordinária que é.
Aos amigos e colegas que tornaram o convívio diário mais alegre.
As funcionárias do laboratório pela dedicação e ajuda no nosso trabalho.
A todos àqueles professores que passaram seus ensinamentos com
amor e dedicação.
Vanessa Rodrigues Fernandes
 4

“Sonhe com o que você quiser. Vá para onde você queira ir.
Seja o que você quer ser, porque você possui apenas uma vida
e nela só temos uma chance de fazer aquilo que queremos.
Tenha felicidade bastante para fazê-la doce. Dificuldades
para fazê-la forte. Tristeza para fazê-la humana. E
esperança suficiente para fazê-la feliz."
Clarice Lispector
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ESTUDO MICROSCÓPICO DO POTENCIAL REPARADOR DE UMA CHALCONA

SINTÉTICA EM FERIDAS CRÍTICAS EM CALOTA CRANIANA DE RATOS

Brenda Zulian De LIMA e Vanessa Rodrigues FERNANDES

Orientador: Prof. Dr. David Rivero TAMES
Data de defesa: Setembro de 2011

Resumo:
Com o objetivo de acrescentar dados ao estudo prévio que sugeriu a existência de
potencial osteogênico da Chalcona em feridas críticas de calota craniana de ratos,
este estudo foi conduzido para observar a possibilidade do reparo completo da ferida
crítica no mesmo modelo de estudo. Com esta finalidade foram realizadas feridas
críticas de 5mm de diâmetro, no osso parietal direito de 20 ratos fêmeas. Dentre estas,
10 foram tratadas com aplicação única de Chalcona sintética (grupo experimental) e
as outras 10 feridas não foram tratadas (grupo controle). Após 48 dias os ratos foram
sacrificados para posterior confecção das lâminas para análise em microscopia de luz
transmitida da área da ferida craniana, a fim de se observar a morfologia tecidual. Na
análise microscópica, o grupo tratado com Chalcona mostrou em 9 feridas reparo total
e em um caso uma pequena área remanescente da ferida. No grupo controle o reparo
não foi significativo em todas as feridas. Os dados obtidos permitiram concluir que a
Chalcona possui potencial osteogênico capaz de promover o reparo total de feridas
críticas. Entretanto é necessário mais estudos com a finalidade de indicar seu uso
clínico.

Palavras- chave: Chalcona, Ferida crítica, Plantas medicinais, Reparo ósseo.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 07
2 REVISAO DE LITERATURA.................................................................. 08
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 20
3.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS.................................................... 20
3.2 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS................................................ 21
3.3 ANÁLISE QUANTITATIVA................................................................. 21
3.4 ANÁLISE QUALITATIVA.................................................................... 22
4 APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS............................................... 23
5 DISCUSSÃO.......................................................................................... 27

6 CONCLUSÃO........................................................................................ 32
7 REFERÊNCIAS .................................................................................... 33
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1 INTRODUÇÃO

O ganho de volume ósseo ou reparo de feridas traumáticas extensas

com impossibilidade de reparo espontâneo, tem sido uma das preocupações
de especialidades odontológicas como periodontia, implantodontia e cirurgia
bucomaxilofacial.
Com esta finalidade são realizados inúmeros procedimentos, tais como
homeotransplante, heterotransplante, implantes de substâncias químicas
inorgânicas e/ou orgânicas. Apesar da existência de investigações com plantas
medicinais, relatando sua capacidade indutora de reparo tecidual, se conhece
pouco sobre seu uso no reparo de feridas ósseas. Neste contexto, as
propriedades antibacterianas, antioxidantes, antitumorais, e antiinflamatórias já
divulgadas da Chalcona, que são compostos da via de biossíntese dos
flavonóides extraídos de caules e de todos os tipos de flores, permitem sugerir
uma possível ação no reparo tecidual (BANDGAR, et al 2010; CHIARADIA, et
al 2008; KIM, et al 2007); entretanto, a literatura não relata dados sobre seu
potencial indutor de osteogênese e, portanto, se faz necessário a realização de
experimentos que confirmem ou não esta indicação (TRAN, et al 2009).
Um dos modelos mais utilizados para estudar o potencial indutor de
reparo ósseo é o da ferida crítica, que consiste em promover uma ferida cujas
dimensões não permitem seu reparo espontâneo e completo (HONMA , et al
2009), assim, o modelo permite estudar, com relativa segurança, a capacidade
de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas de induzir o reparo ósseo quando
implantadas dentro delas.
Desta forma, o estudo do potencial indutor de reparo ósseo em feridas
críticas de calota craniana em ratos, poderá fornecer dados importantes para
várias especialidades da área de conhecimento da Odontologia. Por isso, o
objetivo deste trabalho foi estudar o potencial osteogênico indutor e condutor
da Chalcona e verificar o comportamento celular, a qualidade do tecido ósseo
formado e a provável redução total do tamanho da ferida.
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2 REVISÃO DE LITERATURA

Ripamont e Reddi (1992) explicaram que a matriz óssea

desmineralizada possui potencial na neoformação óssea. Este estudo procurou
descobrir novos agentes reguladores e com potencial terapêutico. Foram
usados 48 babuínos adultos machos, com uma ferida crítica de 25mm de
diâmetro no crânio. Foram feitos enxertos autógenos provenientes do ilíaco
incluindo matriz extracelular e a proteína osteogênica isolada e purificada da
matriz óssea. Os autores concluíram que a proteína osteogênica tem potencial
para diferenciação em osso endocondral, o que evidencia sua aplicação
terapêutica para reconstrução de osso humano.
Peng et al. (2002) analisaram a interação entre o fator angiogênico
VEGF e o fator osteogênico BMP4 durante os processos de regeneração e
formação óssea utilizando células tronco derivados de tecido muscular e
geneticamente manipulados para expressar BMP4 e VEGF. Para tanto usaram
feridas críticas na calota craniana de 24 camundongos machos com 12
semanas de idade, divididos em 3 grupos: Feridas tratadas com células tronco
expressando somente BMP4 (N=8), expressando BMP4 e VEGF (N-8) e
controle tratado com VEGF acoplado a um inibidor específico (N=8). Seis
semanas após o implante, as observações radiológicas mostraram que as
feridas tratadas somente com BMP4 e BMP4 + VEGF estavam totalmente
fechadas sendo que o volume e a densidade óssea foram maior no grupo
tratado com BMP4+VEGF; no grupo controle não houve nenhuma formação
óssea. Estes resultados foram confirmados pelas análises histológicas que
mostraram uma união completa dos defeitos ósseos e nenhum reparo ósseo
no grupo controle. Este estudo abre caminhos para pesquisa de novas
estratégias de estimulação de cicatrização óssea baseado na terapia celular e
genética.
Balooch et al. (2005) com a finalidade de identificar fatores que regulam
a massa óssea e a arquitetura da matriz óssea, com métodos de alta resolução
para propriedades biomecânicas e de imagem, investigaram o papel das
sinalizações do TGF-β na regulação da composição e propriedades mecânicas
da matriz óssea independentemente de seus efeitos sobre massa óssea e
arquitetura . Essas propriedades da matriz óssea foram avaliadas utilizando
 9

camundongos transgênicos (3 por grupo estudado) com alterações na

sinalização de TGF em seus osteoblastos. Os fenótipos utilizados foram D4,
D5, DNTβRII. Neste modelo de estudo os autores observaram que a redução
dos níveis de sinalização do TGF-β, através do seu efetor intracelular Smad3,
aumenta as propriedades mecânicas e a concentração de mineral da matriz
óssea, bem como a massa óssea, melhorando a resistência do osso à fraturas.
Assim, com os resultados obtidos concluíram que as propriedades da matriz
óssea são controladas pela sinalização de fatores de crescimento.
Gómez et al. (2006) avaliaram o reparo ósseo em feridas críticas de
6mm em calotas cranianas de 18 ratos, usando Fator de Crescimento derivado
de Fibroblastos (FGF-1) contido numa membrana biodegradável de poly-L/D-
lactide (PLDLA). Os animais foram divididos em três grupos: 1) grupo controle
sem tratamento, 2) só a membrana e 3) membrana com FGF-1.
Radiograficamente, a forma da ferida do grupo controle mudou da forma
redonda para oval e nos demais grupos esta se apresentou redonda com
bordas irregulares. Histologicamente, após 8 semanas, os exames revelaram
que nos grupos 1 e 2 houve pouco ou nenhum pré-osso, enquanto que no
grupo 3 houve pouca ou moderada formação de osso. Concluíram, portanto,
que não houve benefícios no reparo ósseo com a combinação do FGF-1 e
poly-L/D-lactide (PLDLA).
Kneser et al. (2006) com a finalidade de estudar o potencial osteogênico
do osso esponjoso bovino processado (PBCB), em feridas críticas de calota
craniana de ratos, implantaram discos de osso esponjoso bovino recobertos
com complexo de gel de fibrina e osteoblastos (N=40), ou sem osteoblastos
(N=28). Feridas não tratadas serviram como controle (N=28). As análises
histológica e morfométrica mostraram que um mês após os implantes a
formação óssea esteve limitada a pequenas áreas periféricas. Dois e quatro
meses após houve formação expressiva de osso nas feridas que receberam os
implantes, bem como reabsorção de matriz e integração do implante com o
tecido receptor. No grupo controle não houve regeneração significante nas
feridas críticas. A análise morfométrica não evidenciou diferenças na formação
de osso entre os grupos que receberam implantes (com e sem osteoblastos).
Sugerindo que o osso esponjoso bovino é um biomaterial com potencial indutor
de reparo de feridas críticas de calota craniana.
 10

Mankani et al. (2006) estudaram o potencial osteogênico de células da

medula óssea, previamente cultivadas, transplantadas em feridas críticas na
calota craniana de cães. Para tanto realizaram duas feridas críticas com 35 mm
de diâmetro na calota craniana de cada um dos 6 cães, numa das feridas foi
implantado uma mistura de células e partículas de hidroxiapatita e fostato
tricálcico e na outra as mesmas partículas misturados com o meio de cultura
utilizado para as células. Dois e três meses após os transplantes, de três cães
em cada período, foram obtidas biópsias e processadas pela técnica
histológica para análise histomorfométrica em microscópio. Os resultados
mostraram que as feridas tratadas com a mistura de células do estroma da
medula e partículas de hidroxiapatita e fosfato tricálcico tiveram formação de
quantidades significativas de osso novo enquanto que as tratadas somente
com as partículas mostraram tecido fibro-vascular rodeando estas partículas e
sem formação de osso novo.
Werkman et al. ( 2006) estudaram feridas críticas de tíbias de ratos com
osteoporose (1 mês após castração). Foram utilizados 4 grupos de 21 animais,
sendo 3 grupos submetidos à castração e um grupo a falsa cirurgia. Os animais
foram tratados com risedronato (medicamento alopático) e com calcárea
fosfórica 6CH (medicamento homeopático). Aos 7, 14 e 28 dias após iniciado o
tratamento medicamentoso os ratos foram sacrificados e as tíbias foram
removidas. Radiografias digitais foram realizadas e avaliadas para obter a
densidade óptica na área do defeito. Em seguida, foram descalcificadas e
processadas para análise histológica e histomorfométrica. Os resultados
mostraram que, no 7º dia em todos os grupos, um grande calo ósseo de osso
trabeculado foi formado; no 14º dia a reabsorção do calo foi menor nos animais
tratados com risedronato e calcárea fosfórica e no grupo controle não castrado
foi mais intenso; no 28º dia o risedronato promoveu um reparo com muito osso
trabecular estendendo-se para a medula; o grupo tratado com calcárea
fosfórica mostrou um reparo formado por delgada camada de osso compacto;
os animais controle mostraram um reparo com osso esponjoso contendo
pequenas áreas de osso compacto. Os autores concluíram que os tratamentos
com medicamentos alopáticos e homeopáticos conduzem reparos com
qualidade diferente de osso.
 11

Chu et al. ( 2007) concluíram que o tratamento de defeitos ósseos

provenientes de traumas ou outras injúrias tem sido um desafio clinicamente
importante, pois o osso não cicatriza espontaneamente, necessitando de
enxerto. Devido às limitações encontradas nos enxertos ósseos autólogos e
alogênicos, há necessidade de alternativas para o tratamento de defeitos
ósseos, como técnicas de engenharia tecidual. Sabendo da capacidade
osteoindutora da BMP-2 pelo processo endocondral, observaram a
necessidade de uma estrutura biocompatível e reabsorvível onde possa ser
facilitada a retenção da BMP-2 no local de tratamento e, assim, reduzir rejeição
tecidual e exposição. Este estudo propõe uma estratégia de engenharia
tecidual usando a rhBMP-2 contida numa matriz biodegradável. Com esta
finalidade foram confeccionadas matrizes com um compósito de polipropileno
fumarato + fosfato tricálcico e adicionadas de rhBMP-2 + dicálcio fosfato
desidratado (DCPD) para o grupo experimental e matrizes semelhantes
adicionadas somente com dicálcio fosfato desidratada (DCPD) para o grupo
controle. As matrizes foram implantadas e estabilizadas em defeitos ósseos no
fêmur de 24 ratos machos divididos em dois grupos, radiografados e
sacrificados após 6 e 15 semanas. Avaliação histológica e tomografia
computadorizada foram realizadas. O grupo com BMP mostrou efetividade na
regeneração óssea; já o grupo controle, após 15 semanas, não mostrou reparo
ósseo significante. Os autores concluíram que as matrizes contendo BMP-2
promoveram reparo significantemente maior.
Marzouk et al. (2007) estudaram o potencial osteogênico de
microesferas de vinil estireno como agente carregador de fator de crescimento
derivado de plaquetas. Para tanto, feridas críticas na calota craniana de 73
ratos foram realizados e os animais foram divididos em quatro grupos: grupo
controle, grupo com microesferas de vinil estireno (VSM), grupo com fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB), e grupo com VSM e PDGF-BB.
Os animais foram sacrificados 2, 4 e 16 semanas após a cirurgia. Nas feridas
tratadas somente com as microesferas ou misturadas com fator de crescimento
derivado de plaquetas, houve um preenchimento estatisticamente maior da
ferida do que os grupos sem VSM em todos os tempos pós-cirurgia. Nas
análises radiográficas, o grupo VSM/PDGF mostrou menor volume ósseo
quando comparado com os outros grupos, exceto quando comparada com a
 12

quarta semana do grupo VSM. E o grupo PDGF mostrou possuir o maior

volume ósseo, menos quando comparado com a quarta semana do grupo
VSM, mostrando que o VSM com PDGF não é capaz de melhorar a
capacidade de regeneração óssea quando comparada com o VSM sozinho.
Por et al. ( 2007) estudaram a melhor combinação de biomateriais com
potencial osteogênico já conhecido na reconstrução óssea em feridas críticas
em calota craniana de cães. Foram utilizados 6 grupos de 3 cães com a ferida
crítica de 6x2 cm na calota craniana. O material biológico utilizado no estudo
foi: biópsias de matriz óssea submetidas à desmineralização (DBM), rhBMP2
(proteína morfogenética óssea recombinante humana) e plasma autólogo
enriquecido com plaquetas (PRP); também foram utilizadas placas de cromo-
cobalto e material reabsorvível para fixação óssea comercialmente obtidas. As
misturas de biomateriais colocadas nas feridas críticas foram: DBM+metal,
DBM + PRP + metal, DBM + PRP + placa reabsorvível, DBM + rhBMP2 +
metal, DBM + rhBMP2 +PRP + metal, DMB + rhBMP2 + placa reabsorvível. Os
animais foram sacrificados 3 meses após a cirurgia. Os resultados foram
obtidos por meio de análises macroscópicas, histológicas e com tomografia
computadorizada. Somente no grupo com rhBMP2 foi observada uma completa
regeneração óssea. O grupo livre de rhBMP2 teve mínimo crescimento ósseo
na borda do defeito e na duramáter, o que foi confirmado pela tomografia
computadorizada e histologicamente. No grupo PRP não teve regeneração
óssea. Os autores chegaram à conclusão que o rhBMP2 promoveu reparo
mais acelerado do que o PRP, e o DMB misturado com rhBMP2 foi substituído
por novo osso trabeculado.
Kamakura et al. (2007) implantaram discos de fosfato octacálcio +
esponja colágena porcina (OCP/Col), fosfato beta-tricálcio + compósito
colágeno (beta-TCP/Col) e hidroxiapatita + compósito colágeno (HA/Col) em
feridas críticas em calotas cranianas de ratos que foram sacrificados 4 e 12
semanas depois da implantação destes. Através de análises
histomorfométricas, histológicas e radiográficas relataram que a formação de
osso novo foi mais significante no grupo com OCP/Col do que nos grupos beta-
TCP/Col ou HA/Col. Em contrapartida, os grânulos remanescentes em
OCP/Col foram significantemente menores do que nos grupos com beta-
TCP/Col ou HA/Col. A regeneração óssea pelo OCP/Col foi baseada em
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colágeno calcificado, enquanto isso a regeneração óssea induzida por beta-

TCP/Col ou HA/Col foi iniciada por colágeno pobremente calcificado e
osteoconduzida pelo beta-TCP ou HA. Com esses resultados concluíram que o
OCP/Col regenerou mais osso do que o beta-TCP/Col e HA/Col.
Pripatnanont et al. ( 2007) avaliaram o potencial osteocondutivo de 3
hidroxiapatitas bovinas (HA) sintetizadas em 3 temperaturas diferentes (800ºC,
1200ºC e 1350ºC). Foram preparados 2 defeitos críticos em cada calota
craniana de 10 coelhos. Nos animais controle (N=04), os defeitos foram
preenchidos com osso autógeno numa ferida e a contralateral ficou sem
preenchimento; nos outros 6 coelhos, com um total de 12 feridas, 4 foram
preenchidas com HA 800, 4 com HA 1200 e 4 com HA1350. Todos os animais
foram sacrificados 8 semanas após o implante. A neoformação óssea foi
analisada com densitometria radiográfica e histomorfometria. Os resultados da
densitometria óptica e histomorfometria indicaram que a síntese da
hidroxiapatita em temperaturas altas, aumenta o reparo ósseo, e a sintetizada
a 1200°C tende a proporcionar maior formação óssea quando comparada com
as outras duas hidroxiapatitas.
Buzzi et al. (2007) compararam a atividade analgésica das chalconas
sintéticas com a do ácido acetilsalicílico e acetaminofen, drogas analgésicas
tradicionais no uso da medicação contra dores e foi observado que as
chalconas inibiram as manifestações de dor em níveis de 84 a 94% contra 35 e
38% das drogas conhecidas.
Estudando o mecanismo da atividade antiinflamatória de Chalconas
sintéticas, Kim et al. (2007) identificaram que muitas delas, inibem a atividade
do óxido nítrico sintetizado durante a produção do óxido nítrico sugerindo a
possibilidade da utilização destas Chalconas, no desenvolvimento de novas
fórmulas medicamentosas antiinflamatórias.
Chiaradia et al. (2007) comparando a atividade inibitória do óxido nítrico
sintetizado induzido de algumas Chalconas sintéticas, com o composto 1400W,
um inibidor altamente seletivo desta enzima, constataram que o potencial
inibitório foi igual ou superior ao do composto 1400W.
Honma et al. (2008) explicaram que uma ferida óssea que não é
reparada completamente é denominada de defeito sem união ou defeito de
tamanho crítico sendo que o mecanismo biológico que regula este processo
 14

não é conhecido e que por isto, estudos realizados com este modelo,
comparando o comportamento celular osteoblástico e de osteócitos, podem
proporcionar dados importantes para a pesquisa clínica sobre reparo ósseo.
Neste modelo estudaram o reparo em feridas críticas (8,8mm diâmetro) e não-
críticas (3,8mm diâmetro), em calota craniana de ratos e observaram que a
formação de osso reparador cessa dentro de 24 semanas em ambas as feridas
(críticas e não-críticas), ou seja, osteoblastos e osteócitos cessam a formação
óssea, bem como a diferenciação dos osteoblastos de células progenitoras.
Além disso, a reparação óssea procede do periósteo, localizado em ambos os
lados do osso parietal, mas não a partir da superfície do rebordo ósseo ao
redor do defeito original.
Intini et al. (2008) usou 25 ratos que foram divididos em cinco grupos,
cujas feridas críticas foram tratadas com: osso descalcificado e liofilizado
(DFDBA); proteínas derivadas de matriz de esmalte (EMD); rhBMP-2 carregado
em colágeno (controle positivo); sem nenhum material implantado (controle
negativo); e um grupo com a calota intacta. Todos os animais foram
sacrificados 8 semanas após a cirurgia e as feridas avaliadas
microscopicamente. O grupo negativo e o grupo EMD não mostraram formação
óssea no centro do buraco, mas mostraram reparação na margem da ferida.
No grupo DFDBA, grãos do DFDBA ainda estavam presentes na oitava
semana, e uma pequena quantidade de osteoindução foi vista no centro do
defeito. Diferente do rhBMP-2 que mostrou regeneração óssea por todo o
buraco, o DFDBA e EMD mostraram ter uma habilidade limitada para formar
osso, não sendo portanto, efetivos na regeneração óssea.
KHOJASTEH; ESLAMINEJAD; NAZARIAN (2008) estudaram o efeito
das células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (MSCs) na
regeneração óssea e comparam com o plasma rico em plaquetas (PRP),
quando usados juntamente com osso natural mineral (Bio-Oss) e B-TCP
(Kasios), no reparo de feridas críticas de 5 mm de diâmetro em calota craniana
de 22 ratos adultos machos, divididos em dois grupos. No grupo 1 foram feitas
duas feridas críticas, sendo adicionado o Bio-Oss+PRP em uma ferida e na
outra Bio-Oss+ células tronco mesenquimais. No segundo grupo, foi usado o
Kasios como substituto do Bio-Oss. Os ratos foram sacrificados 6 semanas
após a cirurgia e a regeneração óssea avaliada histologicamente e
 15

histometricamente. Na avaliação histológica, os dois grupos apresentaram

formação óssea variáveis. No novo osso formado observaram osteócitos e
células semelhantes a osteoblastos ativos, sugerindo uma continuação de
formação óssea. Na análise histométrica, as feridas tratadas com
Kasios+MSCs mostraram maior dimensão óssea quando comparado com o
outro grupo contendo Bio-Oss. Nos dois grupos as células mesenquimais
mostraram percentual maior de formação óssea em comparação com os
grupos que continham PRP. Concluíram sugerindo que a engenharia tecidual
pode ser uma alternativa eficaz para enxertos em cirurgias orais e maxilo-
faciais.
Oliveira et al. (2008) estudaram em feridas críticas com 8mm de
diâmetro em calota craniana de 50 ratos, o potencial reparador do osso bovino
desmineralizado (DBB) e de osso autógeno (AB) implantados nas feridas, em
períodos de 7, 14, 21, 30 e 90 dias pós-cirurgia. A análise histológica mostrou
cicatrização total dos defeitos em 90 dias no grupo AB, sem alterações
marcantes durante os períodos experimentais e com melhor neoformação
óssea. No grupo DBB ocorreu a substituição do biomaterial por tecido fibrótico
no período experimental de 21 dias, uma rápida reabsorção do material
implantado e um reparo incompleto das feridas.
Park et al. (2008) efetuaram feridas críticas de 8mm de diâmetro na
calota de 75 ratos. Estes foram divididos em 4 grupos experimentais e um
grupo controle (sem tratamento). As feridas dos grupos experimentais foram
preenchidas com partículas de dentina de porco (grupo 1), o grupo 2 com uma
mistura de partícula de dentina e gesso Paris, o grupo 3 com partícula de
dentina e chitosan e o grupo 4 só com chitosan. Os animais foram sacrificados
2, 4 e 8 semanas depois da cirurgia. Todos os grupos experimentais mostraram
maior formação óssea quando comparada com o grupo controle. Todos os
grupos exibiram crescimento maior na 8o semana do que na 4o semana.
Concluiram que as feridas tratadas com a mistura de partícula de dentina com
chitosan apresentam um excelente efeito na regeneração óssea.
Öztürk et al. ( 2008) avaliaram quais os efeitos do fitoestrogeno na
cicatrização de fraturas em modelos experimentais de ratos. Utilizaram a planta
Verbenaceae, encontrada nas regiões do meio oeste e sul da Europa, que
contem os flavonóides chamados fitoestrogenos. Foram utilizados vinte ratos,
 16

com os animais sedados e anestesiados foram criadas fraturas na tíbia direita e

separados em dois grupos aleatoriamente. Após o preparo do extrato da planta
Verbenaceae foi administrado na dose intramuscular de 0.75mg 5 vezes a
cada 2dias no grupo 1, em cada rato. O grupo 2 foi utilizado para controle. As
fraturas foram avaliadas semanalmente baseada no nível de fosfatase alcalina
no sangue, radiografias das extremidades e 99m-Tc MDP cintiligrafia.
observaram que a utilização de fitoestrogênios, promove melhoria na resposta
do reparo ósseo nos primeiros períodos, 7 e 14 dias pós-fratura, e que em
períodos tardios, 25 dias, não apresenta nenhuma modificação. O trabalho
conclui que o fitoestrogeno afeta positivamente a cascata de cicatrização e
futuros estudos podem ser feitos utilizando maiores dosagens do extrato
utilizado.
Porter, Rack e Popart (2009) com a finalidade de verificar o estado atual
dos estudos sobre bioengenharia de substitutos do osso, fundamentado nos
critérios de biomecânica e fisicoquímica, destacaram que vários materiais
sintéticos já foram estudados para este uso, mas devido às propriedades
fisicoquímicas, biocompatibilidade, biodegradabilidade e fixação somente as
cerâmicas e os polímeros se tornam viáveis. Porém, destacam que o desafio
ainda é encontrar um material biodegradável que funcione como entregador de
moléculas bioativas e drogas no local da injúria, e assim, acelere a cicatrização
e regeneração do tecido enquanto previne patologias. As tecnologias e
estratégias analisadas neste estudo, para o desenvolvimento de um
componente sintético capaz de reproduzir os atributos fisioquímicos do osso,
não obtiveram um tecido com engenharia que fosse ao encontro de todos os
requisitos. Entretanto, salientam que os avanços na tecnologia em calotas
ósseas sintéticas têm superado vários obstáculos, mas ainda assim existem
lacunas a ser preenchidas. Concluem que a melhor estratégia para
desenvolver calotas ósseas, vai ser aquela com abrangência interdisciplinar no
processo de desenvolvimento ósseo.
Pripatinanont, Nuntananont e Vongvatcharemon ( 2009) afirmaram que o
osso bovino desproteinizado tem sido usado em enxertos ósseos juntamente
com osso autólogo por ter características similares ao osso humano, assim
como propriedades de osteocondução e biocompatibilidade. Este compósito é
bastante usado clinicamente, pois combina as propriedades osteogênicas e de
 17

osteocondução. A proporção de osso bovino e osso autólogo no compósito

podem variar. Este estudo avaliou a qualidade e a quantidade de formação
óssea usando três diferentes proporções, 1:1, 1:2 e 1:4, em defeitos na calota
de coelhos. Foram usados 15 coelhos brancos de 5 a 7 meses onde foram
feitas 2 feridas críticas na calota craniana de cada animal. Os coelhos foram
divididos em 3 grupos. No grupo 1, uma ferida foi deixada como controle e na
outra foi adicionado osso autólogo, no grupo 2, osso bovino desproteinizado e
na outra compósito com a proporção de 1:1, no grupo 3, o compósito com
proporção de 1:2 e na outra ferida 1:4. Os animais foram sacrificados após 8
semanas e avaliados radiograficamente e histomorfometricamente. Quanto à
densidade, os grupos não tiveram diferenças estatisticamente significativas.
Histomorfometricamente, os enxertos com proporções 1:1 e 1:2 são melhores
que 1:4 referente à neoformação óssea. A diferença entre os outros grupos não
pode ser demonstrada devido a grande variação de dados. No grupo em que
não foi adicionado nenhum enxerto, houve somente uma fina camada de tecido
fibroso. Neste estudo, os enxertos com compósitos mostraram-se hábeis para
promover neoformação óssea e cobrir o defeito como demonstrado
qualitativamente. As proporções 1:1 e 1:2 mostraram-se confiáveis quando
comparadas as outras proporções em termos de neoformação óssea.
Tran et al. (2009) mostraram que algumas modificações na molécula de
chalconas pode especificar uma das suas atividades biológicas, assim as
chalconas que sintetizaram, se mostraram mais efetivas como anti-
inflamatórios, inibindo a produção de prostaglandina-2, do que sua atividade
citotóxica. Apesar das várias atividades biológicas, das chalconas sintéticas,
relatadas na literatura consultada, não se encontra nenhuma relacionada com
a atividade osteogênica.
Pugalendhi et al. ( 2009) ao avaliarem a frequência de micronúcleos e
alterações em células da medula óssea, ajuda a monitorar o alto risco para o
câncer na população humana. Mutações cancerígenas induzidas em células
somáticas levam à instabilidade genética, fato considerado importante na
carcinogênese. Agentes que inibem a formação de DNA, estimulam os
mecanismos de reparo do DNA e possuem funções antioxidantes são
considerados agentes antigenotóxicos. A genisteína e a isoflavona são
produtos da soja que, experimentalmente, protegem os animais contra câncer
 18

de mama e próstata. DMBA, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, são

amplamente usados para induzir genotoxicidade em medula óssea de ratos. O
DMBA é um potente carcinógeno específico que induz a mutação no DNA
através do seu metabólito ativo, o epoxido diidrodiol, o que é um passo crucial
na iniciação do câncer. Neste estudo, foi investigado o efeito da genisteína
antigenotóxica contra a genotoxicidade induzida por DMBA, analisando a
frequência dos eritrócitos policromáticos micronucleados (MnPCEs) e
citogenética de aberrações cromossômicas como end-points. O potencial
antigenotóxico da genisteína foi avaliado pela frequência de MnPCEs,
aberrações cromossômicas e pela mensuração da peroxidação de lipídios,
antioxidantes e agentes desintoxicantes em DMBA-induzida genotoxicidade,
em ratos fêmeas Wistar. Elevada frequência de MnPCEs, aberrações
cromossômicas e elevado estado de peroxidação lipídica, antioxidantes e
agentes desintoxicantes foram observados em animais tratados com DMBA.
Pré-tratamento oral com genisteína a 20mg/kg, por cinco dias, em animais
tratados com DMBA reduziu significamente a frequência de formação de
micronúcleos e anormalidades cromossômicas assim como inverteu o estado
de variacções bioquímicas. Os resultados sugerem que a genisteína tem
potente efeito antigenotóxico contra genotoxicidade induzida de DMBA.
Uprety et al. (2010) destacaram que nos últimos tempos, o interesse
pela fitomedicina vem crescendo e com isso os estudos sobre seu potencial
farmacológico. As pesquisas científicas são necessárias para avaliar as plantas
medicinais quanto seu principio ativo e bio eficácia. Dados foram coletados
através de entrevista a 50 chefes de família na região de Chilime no distrito de
Rasuwa, a fim de recolher informações sobre uso da planta, partes usadas e
modo de utilização. As ervas foram separadas em espécies e seu uso para
cada doença. Ao total 56 plantas medicinais foram identificadas em uso na
medicina de Rasuwa. Uma vasta gama de plantas são usadas para tratamento
de doenças gastrointestinais, febre, dor de cabeça, feridas, tosse. Os estudos
fitoquímicos e farmacológicos mostraram-se coerentes com a visão empírica
sobre as propriedades das plantas em 90% dos casos, mas estes estudos
mostraram-se ainda limitados para algumas espécies usadas nesta região.
Bandgar et al. (2010a) prepararam chalconas sintéticas e avaliaram seu
potencial anticancerígeno contra 5 tipos celulares de câncer; anti-inflamatória
 19

e anti-oxidante. Observaram a inibição das células cancerosas humanas com

uma eficiência semelhante ou maior às obtidas por compostos conhecidos
como flavopiridol e gecitabine; a atividade antiinflamatória foi também
promissora comparando a capacidade inibitória de TNF-ά e IL-6, com
antiinflamatórios conhecidos como a dexametasona; também foi obtida
atividade antioxidante.
Bandgar et al. (2010b) observaram que as chalconas sintetizadas
mostraram atividade antiinflamatória inibindo efetivamente a atividade das
enzimas: ciclooxigenase-2, tripsina e ß-glucoronidase; sua capacidade
antioxidante foi moderada.
Nascimento e Tames (2010) estudaram o potencial osteogênico da
chalcona em feridas críticas de calota craniana de ratos, para tanto foram
utilizados 10 ratos Norvegicus albinus, fêmeas, com 60 dias de idade. Em
todos os animais sob anestesia, foram realizadas feridas únicas na calota
craniana; depois, 05 foram tratados com gel de Chalcona e 05 não foram
tratados. Trinta dias após, foram sacrificados por perfusão, sob anestesia, com
paraformaldeído a 7% em tampão fosfato. Para mensuração da área de ferida
foi utilizado o programa imagetool. As calotas foram desmineralizadas com
EDTA e preparadas para inclusão em parafina e obtenção de cortes com 7µm
de espessura e corados com H.E. Os resultados obtidos mostraram que as
feridas tratadas com chalcona tiveram uma redução significantemente maior do
que as feridas não tratadas. Os dados obtidos permitiram concluir que a
formulação farmacológica da chalcona utilizada neste estudo promove estímulo
do reparo ósseo demonstrado pela presença de osteoblastos ativos.
Batovska; Todorova. (2010) afirmaram que as Chalconas são um grupo
de compostos que são intermediários ou produtos finais na biosíntese de
flavonóides. Funcionam como substâncias defensivas, participando nas inter-
relações planta/insetos e contribuem com o potencial medicinal das plantas.
Estudos farmacológicos de várias Chalconas isoladas de plantas têm mostrado
potencial medicamentoso para tratamento de câncer, desordens virais e cárdio-
vasculares ou como ingredientes de preparados cosméticos. As Chalconas
sinteticamente derivadas podem conter um ou mais radicais aryl substituintes;
muitos desses grupos funcionais influenciam em certo grau atividades
biológicas específicas.
 20

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Neste estudo foram utilizados 20 ratos, Norvegicus Albinus, fêmeas,

com idade de 45 dias, que foram divididos em dois grupos: experimental,
tratados com Chalcona ( N= 10) e controle sem tratamento (N= 10).
Em estudo prévio foi observado (Sheila e Luana, 2010) que a aplicação
do veículo da Chalcona nas feridas, trinta dias após, não promove reparo
significativo; por este motivo, no presente estudo, este grupo foi abolido.

Composição molecular da chalcona sintética.

3.1 Procedimentos cirúrgicos

Em todos os animais e sob anestesia com cloridrato de ketamina

10mg/kg, após incisão na linha média da calota craniana e rebatidos os planos
cutâneo e periosteal, foram realizadas feridas críticas, utilizando trefina com
5mm de diâmetro e sob abundante irrigação com soro fisiológico, tomando-se o
cuidado de remover somente as corticais ósseas e o diploe.
Imediatamente antes da finalização do procedimento cirúrgico e com a
finalidade de obter conforto pós-cirúrgico, foi administrado, por via subcutânea,
Bupremorfina 0,05mg/kg e repetidos a cada 12 horas durante 2 dias. Durante
todo o período experimental os animais foram observados diariamente a fim de
identificar prováveis infecções e observar as características macroscópicas do
fechamento da ferida.
 21

3.2 Procedimentos histológicos

Transcorridos quarenta e oito dias da intervenção cirúrgica, todos os

animais foram sacrificados por perfusão intracardíaca sob anestesia e retirada
a área da ferida critica a ser analisada.
O material coletado foi fixado por imersão em paraformaldeído a
4% em tampão fosfato, pH 7,4 por 72 horas. Após a fixação, iniciou-se o
processo de desmineralização com EDTA a 10% em tampão fosfato,
analisando semanalmente o nível de desmineralização, utilizando uma ponta
de agulha hipodérmica e a facilidade ou não de sua penetração no osso.

Após verificar o nível ótimo de desmineralização as peças ósseas

contendo as feridas foram desidratadas progressivamente em alcoóis de
concentração crescente (70, 90 e 100%), diafanizadas com xilol e incluídas em
parafina: deste material foram obtidos cortes semisseriados (1: 10) com
espessura de 7 micrometros e corados com hematoxilina e eosina para
observar a morfologia tecidual. Estas análises foram realizadas em microscopia
de luz transmitida, sendo feita uma análise qualitativa do tecido de reparo
observando os tipos celulares e teciduais e uma análise quantitativa para
verificarmos a quantidade de osso que regenerou nesta ferida crítica.

3.3. Análise quantitativa

Para avaliar e mensurar os tamanhos de todas as feridas críticas, para

explicitar valores fornecidos macroscopicamente e para comparar as distâncias
entre as bordas do tecido ósseo de reparo, foi utilizado o programa Image Tool.
Foi a partir deste mesmo programa que se definiu uma média de 18.413,00
como total de pixels para uma área correspondente a 5mm de diâmetro (Figura
1), para posterior comparação com os demais resultados. Os dados
quantitativos obtidos foram analisados estatisticamente usando o método de
Tukey.
 22

Figura1: Programa Image Tool. Ferida crítica com 5mm de diâmetro e sua conversão
para pixels.

3.4. Análise qualitativa

Foi analisado, utilizando microscópio de luz transmitida, o tipo de

tecido preenchendo a área da ferida crítica tratada com Chalcona (grupo
experimental) e não tratada (grupo controle).
O projeto de pesquisa foi submetido e aprovado, pela Comissão de Ética
em Pesquisa da Univali, sob o número 342/09A.
 23

4 APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS

A análise macroscópica das feridas mostra que o tratamento com

Chalcona permite o reparo completo da ferida crítica (Fig. 2B); nas feridas não
tratadas na houve reparo ósseo significativo (Fig. 2A)

*
*

BB
Fig 2.- Macrofotografia da ferida do grupo controle (A) e experimental (B), escala em
mm. Observar o fechamento completo da ferida (asterisco) tratada com chalcona (B).

Os valores médios da área da ferida, utilizando o Image Tool (Programa

com funções de análise de imagem como distância, ângulo, perímetro, área; e
medições em escala de cinza como ponto, linha e histograma estatístico),
mostrou que a ferida remanescente no grupo controle foi muito maior que a do
grupo experimental e mantém o valor da ferida original. No grupo experimental
somente em um animal remanesceu uma área muito pequena da ferida. A
análise estatística mostrou que as diferenças com o grupo experimental são
altamente significantes (P<0,005) sugerindo reparo total estimulado pela
aplicação de dose única de Chalcona nas feridas críticas (Fig 3).
 24

Fig. 3.- Gráfico das médias da área de ferida em mm². Observar que os valores
médios das áreas das feridas críticas do grupo controle (2) e das feridas originais (1)
sâo significantemente maiores que do grupo experimental (3).

A
Comparando os valores médios iniciais da área da ferida crítica
(18.413,00mm2) e os valores observados no grupo controle (18,078,00 mm2)
observou-se que houve um reparo espontâneo porém insignificante no grupo
controle.
As análises histológicas mostraram que o reparo nas feridas tratadas
com Chalcona foi com tecido ósseo de aparência esponjosa em toda sua
extensão (Fig 4), nas feridas controle se observou a presença de tecido
conjuntivo denso preenchendo o espaço da ferida (Fig. 5).

Fig 4 Montagem de 05 fotomicrografias do reparo do grupo experimental. Coloração

H.E. Aumento no original 4x. Observar o reparo completo da ferida com tecido ósseo
(entre setas).
 25

Fig 5.- Montagem de 05 fotomicrografias do reparo do grupo controle. Coloração H.E.

Aumento no original 4x. Observar o preenchimento da ferida com tecido conjuntivo
denso. As setas indicam as margens da ferida.

No grupo tratado com Chalcona, no tecido ósseo de reparo observou-se,

presença de osso primário, osso secundário, osteoblastos ativos e inativos e
em algumas áreas, a presença de osso com morfologia semelhante ao osso
primário devido à presença de corpúsculos esferoidais pouco corados pelo
H.E., sem nenhuma orientação e numerosos, porém sem nenhuma
semelhança com osteócitos (Fig. 6).

OSSO PRIMÁRIO

Fig.6 Área de osso de reparo do grupo experimental. Coloração H.E. Aumento no

original 10x. Observar: presença de inclusões de forma eferoidal pouco corados e
sem orientação definida (setas pretas). Osteoblastos ativos, e inativos (seta branca),
osso primário e osso secundário.
 26

Aparentemente as inclusões esferoidais são o resultado de um

mecanismo de englobamento pela matriz óssea secreta pelos osteoblastos
(Figs 7 e 8).

Fig 7.- Área de osso de reparo do grupo experimental. Coloração H.E. Aumento no
original 20x. Observar o englobamento dos corpúsculos esferoidais (setas) pela matriz
óssea secretada pelos osteoblastos

Fig 8.- Magnificação maior (40x) das inclusões observadas na área inferior direita da
figura 7.
 27

DISCUSSÃO

É ampla a produção de dados utilizando as feridas críticas (vide revisão

da literatura), como modelo de estudo dos mecanismos envolvidos na
osteogênese, reparo, bioengenharia com a aplicação de medicamentos
alopáticos, homeopáticos, células tronco, plantas medicinais, etc. Isto permite
dar um bom grau de confiabilidade aos dados que obtivemos em nosso estudo
utilizando uma Chalcona sintética como indutora do reparo ósseo.
É amplamente conhecido que em feridas críticas de calota craniana de
ratos e/ou de outros mamíferos, não ocorre o reparo espontâneo. Isto permite
afirmar com muita confiabilidade que o material incluído na ferida crítica tem
potencial osteogênico, quando é observado o fechamento da ferida. Embora,
em nosso estudo, não tenhamos dados sobre a cascata de eventos
moleculares vinculados à osteogênese, como relata o estudo de Ripamont e
I
Reddi (1992), em implantes heterotópicos de matriz óssea desmineralizada,
que a proteína morfogenética óssea está envolvida no mecanismo de reparo,
podemos sugerir a sua ocorrência, em nosso estudo, induzida pela Chalcona.
É provável que a Chalcona utilizada neste estudo, tenha um potencial
osteogênico melhor que algumas moléculas bioativas como o FGF1, estudada
por Gómez et al (2006) que relata que esta molécula não evidenciou
benefícios no reparo ósseo de feridas críticas de calota craniana de ratos, pois
ao contrário, nossos resultados mostraram fechamento completo da ferida em
9 ratos e somente em um rato permaneceu uma área insignificante de ferida.
O grau de atividade celular comprometida com a osteogênese no
reparo, foi avaliada pelo grau de diminuição das dimensões da ferida crítica
como encontrado por Gómez et al. (2006), em feridas críticas de calota
craniana de ratos.
Kneser et al. (2006) relatam que discos de osso esponjoso bovino
revestidos com gel de fibrina contendo osteoblastos, após 4 meses ocorre
neoformação óssea significativa e que a presença dos osteoblastos não
modifica o potencial de reparo do disco de osso esponjoso. Nossos resultados
indicam que em tempo bem menor a aplicação do gel de Chalcona permite o
reparo total, sugerindo uma efetividade biológica melhor que o uso de células
obtidas de cultivo e com um procedimento cirúrgico mais simples e
 28

economicamente viável, por não necessitar do preparo de um disco de osso e

cultivo de células aplicadas a uma matriz condutora.
Werkman et al. (2006), estudando reparo ósseo em lesões corticais na
tíbia de ratos experimentalmente osteoporóticos (castrados), observaram que o
uso de medicamentos homeopáticos como a calcarea phosphorica (3
gotas/dia) podem ser mais eficientes que os medicamentos alopáticos como o
risedronato (1mg/kg/dia), formando osso primário 30 dias pós início do
tratamento. Em estudo prévio, Nascimento; Tames (2010), em animais
normais, 30 dias após a aplicação local do gel Chalcona, obtiveram, não
somente a formação de osso primário, mas também a sua substituição parcial
por osso secundário; somente este dado já indica um maior benefício no uso
do gel de Chalcona e mais ainda quando se leva em consideração nossos
resultados indicando que em 48 dias ocorre o reparo total e utilizando um
protocolo experimental muito mais cômodo do que o utilizado por Werkman et
al. (2006).
Kamakura et al. (2007), em feridas críticas de calota craniana em ratos
tratados com implantes de discos de compósitos de colágeno e fosfato
octocálcico, fosfato tricálcico e hidroxiapatita, mostrou que 3 meses após o
compósito de colágeno e fosfato octocálcico promoveu um reparo mais
acentuado que os outros compósitos, porem não relata reparo total. Desta
forma, fica evidente que o uso do gel de Chalcona é muito mais eficiente por
promover reparo total em tempo menor que o relatado por eles.
Da mesma forma, os dados que obtivemos em nosso estudo mostram
maior eficiência da Chalcona frente aos resultados obtidos por Marzouk et al.
(2007) que utilizando superfícies de microesferas de polivinil estireno tratadas
com fator de crescimento derivado de plaquetas e implantadas em feridas
críticas de calotas cranianas de ratos, relatam que 4 meses após ocorre um
reparo estatisticamente mais acentuado sem evidenciar reparo total.
Os meios utilizados na produção do material a ser implantado em feridas
críticas para estudo do reparo ósseo é importante; assim, Pripatnanont et al.
(2007) relatam que as hidroxiapatitas sintetizadas a 1200°C promove uma
maior formação óssea do que as sintetizadas a 800°C e 135°C. Estes dados
nos abrem a perspectiva de que modificando a formulação do gel de Chalcona
 29

possamos obter respostas mais efetivas, pois neste estudo utilizamos o gel de
Chalcona em vaselina somente na concentração de 10%.
Honma et al. (2008), relataram que tanto as feridas críticas como as não
críticas, em calota craniana de ratos, a neoformação óssea durante o reparo
cessa dentro de 24 semanas e que o reparo ocorre da superfície do periósteo e
não a partir dos bordos da ferida. Nossos resultados concordam com o fato de
que a ferida crítica não tem reparo espontâneo e que embora tenha ocorrido
uma diminuição da área da ferida, esta não foi significante. Por outro lado, em
nenhum dos casos foi observado indícios de reparo a partir do periósteo, pois
não encontramos osteogênese no centro da ferida. Isto nos sugere que o
fechamento da ferida 48 dias após aplicação única de gel de Chalcona, ocorreu
da periferia para o centro da ferida, discordando dos dados de Honna et al.
(2008).
Por outro lado, nossos resultados nos permitem sugerir que a Chalcona
pode ter uma performance medicamentosa semelhante ao fator de crescimento
osteogênico mais conhecido, a ponto de este fator ser utilizado como controle
positivo em estudos como os de Intini et al. (2008), que relataram reparo total
em 8 semanas nas feridas tratadas com rhBMP-2. Cabe salientar que o reparo
total que obtivemos foi 48 dias após aplicação da Chalcona.
O uso de células tronco mesenquimais (Khojasteh, Eslaminejad e
Nazarian, 2008), isoladas ou em combinação com biomateriais como o Bio-Oss
(osso liofilizado), tem também mostrado um sucesso maior na indução de
reparo ósseo, entretanto devemos salientar que, assim como os fatores de
crescimento, sua obtenção para posterior utilização numa formulação
medicamentosa, é muito dispendiosa inviabilizando seu uso em programas de
saúde coletiva quando comparadas a moléculas bioativas de plantas
medicinais como é caso da Chalcona usado neste estudo.
Durante o reparo de feridas críticas, promovidas pelo implante de osso
autógeno e osso bovino desmineralizado, Oliveira et al. (2008) mostraram que
o osso bovino desmineralizado, 21 dias após, é substituído por tecido fibrótico
e que em períodos posteriores (90 dias) o reparo é incompleto. Cabe salientar
que em nosso estudo encontramos a permanência de tecido fibrótico somente
nas feridas não tratadas e o mecanismo de reparo induzido pela aplicação de
Chalcona permitiu o reparo total em 48 dias, indicando uma atividade indutora
 30

muito mais eficiente que o implante de osso autógeno e osso bovino

desmineralizado.
Os dados que encontramos na literatura consultada, mostram a
preocupação de descobrir um material que melhore o mecanismo de reparo de
feridas críticas. Neste contexto, Park et al. (2008) observaram que a mistura de
partículas de dentina e chitosana, sessenta dias pós, apresenta um excelente
efeito na regeneração óssea, embora não relate um reparo completo da ferida.
Acreditamos que a Chalcona possa ser relacionada com a mesma, ou melhor,
eficiência e em período inferior, pois nossos resultados relatam dados obtidos
em 48 dias.
Da mesma forma, Por et al. (2007), estudaram implantes de cromo
cobalto cobertas com misturas complexas de matriz óssea desmineralizada,
rhBMP-2 e plasma enriquecido com plaquetas; seus resultados mostraram que
os complexos contendo rhBMP-2 promoveram reparo mais acentuado e que os
complexos contendo plasma enriquecido com plaquetas não tem efeito
significativo no reparo. Estes dados permitem sugerir estudos futuros utilizando
complexos de metais com a Chalcona, cujos resultados eventualmente
poderiam ser aproveitados na implantodontia com um custo inferior aos
complexos metal/rhBMP-2 que a literatura já consagrou como o melhor agente
osteogênico.
A etnobotânica tem uma contribuição importante na descoberta de
drogas e no desenvolvimento socioeconômico assim, Uprety et al. (2010), em
estudo realizado no Nepal, relataram que as plantas medicinais são
encontradas nas próprias residências e utilizadas principalmente para resolver
problemas de saúde relacionadas com distúrbios gastrointestinais, menstruais,
febre, dor de cabeça, dor de dente, problemas oftalmológicos e renais. Apesar
dos vários estudos já realizados, são poucos os que comparam o uso de
plantas indígenas com as propriedades fitoquímicas e farmacológicas, neste
aspecto, as Chalconas estão sendo estudadas pelo grupo de investigadores do
curso de Farmacologia da UNIVALI e no presente momento se encontra na
fase de sua manipulação molecular para descobrir novas aplicações
medicamentosas, sendo que nosso estudo salienta a possibilidade de
utilização medicamentosa para reparo de feridas ósseas.
 31

As Chalconas são flavonóides de cadeia aberta, importantes na

pigmentação de flores agindo como atraentes para a polinização, estes
flavonóides despertaram interesse na fitoterapia devido a suas propriedades
biológicas como antioxidante, citotóxica, anticancerígena, antimicrobiano,
analgésica, antiúlcera, antihistamínico e antiinflamatório (KIM et al., 2007;
CAMPOS-BUZZI et al., 2007; TRAN et al., 2009; BANDGAR et al., 2010). Por
outro lado a sua síntese, mantendo o esqueleto de Chalcona e mudando
apenas alguns radicais, tem se observado clinicamente a manutenção e
melhoria de algumas das propriedades medicamentosas, entretanto a sua
potencialidade farmacológica ainda não está esgotada (BATOVSKA;
TODOROVA, 2010). Neste aspecto a molécula de Chalcona sintetizada que
utilizamos sugere um potencial reparador de feridas ósseas que poderá ser
utilizada pela indústria na formulação de um medicamento osteogênico
eficiente.
Õztürt et al. (2008) observou, em fratura de tíbia de coelhos, que
fitoestrogênios contidos em extratos de Vitex agnus- castus L (Verbenaceae),
administrados por via intramuscular, melhoram o reparo somente nas fases
iniciais (7 e 14 dias); Em nosso estudo, o gel contendo Chalcona surge como
uma alternativa medicamentosa mais eficiente que os fitoestrogênios uma vez
que 48 dias após aplicação única nas feridas críticas mostra reparo total em
quanto as feridas não tratadas mantêm suas dimensões iniciais.
Historicamente entender a regeneração tem sido uma preocupação dos
pesquisadores permitindo avanços importantes nas intervenções cirúrgicas,
transplantes entre outros. Recentemente, Neste contexto, podemos considerar
que a Chalcona (molécula sintetizada a partir de plantas medicinais) é uma
molécula bioativa com potencial indutor do reparo ósseo, como é sugerido em
nosso estudo, e que poderá ser utilizada como uma opção entre outras
moléculas cujo potencial indutor de osteogênese já está comprovado, com a
vantagem de ser economicamente viável devido ao baixo custo de sua
obtenção quando comparado às extrações de moléculas bioativas de tecidos
animais.
 32

6 CONCLUSÃO

Os dados obtidos neste trabalho, nas condições em que foi realizado,

nos permitem concluir.
- A aplicação única de Chalcona sintética a 10% em vaselina, promove
reparo total de feridas críticas em calota craniana de rato.
- As feridas críticas não tem reparo espontâneo significante.
- As dimensões das feridas críticas não tratadas, após quarenta e oito
dias são significantemente semelhantes às feridas inicias.
- Existe a possibilidade de formulação medicamentosa eficiente para o
reparo de feridas ósseas críticas.
 33

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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