Universidade de São

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Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
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Atividades do projeto: Investigação química e avaliação das atividades antioxidante e

de inibição enzimática dos extratos de Dillenia indica e Costus spicatus

Item 3.3

3.2. Métodos

3.2.1. Ensaios em cromatoplacas

Todos os ensaios foram desenvolvidos sobre cromatofolhas de sílica nas
quais 2,5µL de cada amostra diluída em solventes apropriados foram aplicadas na
concentração mínima de 20mg/mL para as frações e extratos brutos e 10mg/mL
para os compostos puros. Em alguns casos as amostras foram aplicadas
pontualmente e, em outros, foi feita a otimização das condições cromatográficas e
as amostras foram eluidas na melhor condição. Após a secagem das placas foram
feitos os ensaios.

3.2.1.2. Ensaio com acetilcolinesterase utilizando o método de Marston

Este ensaio foi realizado seguindo a descrição feita por Marston e
colaboradores , no qual a atividade enzimática é detectada pela conversão do
acetato de α-naftil a α-naftol que reage com o sal de diazônio Fast Blue B
formando um corante diazo de cor púrpura Figura 4, p.20.
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Figura 1: Catálise do acetato de α-naftil e reação com Fast Blue.

No preparo do tampão B, 273mg de tampão tris HCl foi solubilizado em 30mL

de água e o pH foi ajustado para 7,8 com HCl 10%v/v. Agitou-se por 5 minutos
25mg de BSA (estabiliza a enzima durante o ensaio) e 84µL da enzima AChE
(0,9mg de AChE em 200µL de água) (solução 5). Em 12 mL de água, adicionou-se
30mg de sal fast blue (solução 6). Em 3mL de etanol, adicionou-se 7,5mg de
acetato de α-naftil. As cromatoplacas foram nebulizadas com a solução 5 e
incubadas a 37oC por 20 minutos em um ambiente úmido. Após incubação, as
soluções 6 e 7 foram misturadas e nebulizados sobre a cromatoplaca que
desenvolveu uma coloração púrpura contra a cor branca dos halos representando
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compostos presentes na amostra que inibiram a enzima não ocorrendo, portanto,

a formação do α-naftol e a consequente formação do corante púrpura.

3.1. Atividade antioxidante com DPPH

O ensaio para a determinação da atividade antioxidante total pela captura do radical

livre DPPH foi realizado de acordo com a técnica adaptada de Sousa et al. (2007). O

método baseia-se na transferência de elétrons, onde o DPPH, que possui cor purpura, é

reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de cor amarela. Podendo, assim, ser monitorado

pelo decréscimo da absorbância. Brevemente. A solução de DPPH é preparada pesando-se

2,4 mg do reagente e dissolvido a 100 mL de MeOH, em frasco de vidro âmbar. A curva de

calibração do DPPH é realizada em triplicata a partir da solução inicial de DPPH (60 mM)

e soluções variando a concentração (a cada dez unidades) de 10 mM a 50 mM. Em

microplaca de 96 poços, a solução de DPPH é adicionada e a leitura é feita a 505 nm por 10

vezes a cada 5 s, utilizando MeOH como branco e uma solução controle de 20% MeOH e

28% acetona. Em software apropriado, Origin 6.5, são plotadas as concentrações no eixo X

e as respectivas absorbâncias no eixo Y, calculando a equação da reta.

3.2.1.3. Ensaio Antioxidante com DPPH

Quando o radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH .) em presença de um
antioxidante doador de hidrogênio passa à sua forma reduzida 2,2-difenil-1-picril-hidrazina
(DPPH-H) de cor amarela, seu elétron desemparelhado não está mais em conjugação com
os grupos arilos, e, dessa forma, o DPPH-H sofre um decréscimo de absortividade molar
em 517 nm Figura 5, p.21, , .
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Figura 2: Mecanismo simplificado da reação entre o DPPH e um antioxidante doador

de hidrogênio.

Os padrões rutina e quercetina (3mM em MeOH) foram utilizados neste ensaio onde
cada cromatoplaca foi nebulizada com uma solução metanólica de DPPH 0,02%. O
aparecimento de halos amarelos, após 30 minutos à temperatura ambiente, é decorrente da
redução do DPPH, por um mecanismo baseado em transferência de elétrons, e caracterizam
a presença de substâncias com atividade antioxidante.

Referências

107. Marston, A., J. Kissling, and K. Hostettmann,. A rapid TLC

bioautographic method for the detection of acetylcholinesterase
and butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochemical
Analysis, 2002. 13(1): p. 51-54.
108. Rice-evans, C.A., et al. The Relative Antioxidant Activities of
Plant-Derived Polyphenolic Flavonoids. Free Radical Research,
1995. 22(4): p. 375-383.
109. Oliveira, A.C., et al. Fontes vegetais naturais de antioxidantes.
Química Nova, 2009. 32(3): p. 689-702.
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Protocolo ensaio de sequestro de radicais livres usando DPPH

Procedimentos experimentais
* usar luvas durante o ensaio pois o DPPH é um potente agente oxidante.

O ensaio é realizado através da determinação da porcentagem de seqüestro de radicais

livres da molécula de DPPH (2,2-diphenil-1-picrylhydrazyl, PM 394,3)

DPPH (DPPH)H
λ 517nm (lilás) (amarelo)

Preparo das soluções mães dos padrões:

Rutina (PM 610,0; solução mãe: 1,64 mM)

Em um tubo de microcentrífuga, dissolver 1 mg em 1 mL de CH3OH.
Rutina (0,164 mM, diluída 10 vezes):
Em um frasco com capacidade para 3 mL
1. 300 μL da solução mãe (concentração= 1,64 mM)
2. 2700 μL de CH3OH.

α-tocoferol (Vitamina E): (PM 430,7; solução mãe: 2,32 mM)

Em um tubo de microcentrífuga, dissolver 1 mg em 1 mL de CH3OH.
Vitamina E (0,232 mM, diluída 10 vezes):
Em um frasco com capacidade para 3 mL
1. 300 μL da solução mãe (concentração= 2,32 mM)
2. 2700 μL de CH3OH.

Extrato bruto e frações (C=1 mg/mL):

Em um tubo de microcentrífuga, dissolver 1 mg em 1 mL de CH3OH.

Preparo das demais concentrações: (estes cálculos podem ser facilmente realizados no
programa EXCEL)

Numa placa de 96 poços com capacidade para 2,0 mL preparar as seguintes soluções:

Rutina:
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Poço A1: 100 μM (610 μL Rutina (0,164 mM) + 390 μL CH3OH);
Poço B1: 80 μM (488 μL Rutina (0,164 mM) + 512 μL CH3OH);
Poço C1: 60 μM (366 μL Rutina (0,164 mM) + 634 μL CH3OH);
Poço D1: 40 μM (244 μL Rutina (0,164 mM) + 756 μL CH3OH);
Poço E1: 20 μM (122 μL Rutina (0,164 mM) + 878 μL CH3OH);
Poço F1: 10 μM (61 μL Rutina (0,164 mM) + 939 μL CH3OH);
Poço G1: 5 μM (30 μL Rutina (0,164 mM) + 970 μL CH3OH);
Poço H1: 0 μM (0 μL + 1000 μL CH3OH).
Vitamina E:
Poço A2: 100 μM (431 μL Vitamina E (0,232 mM) + 569 μL CH3OH);
Poço B2: 80 μM (345 μL Vitamina E (0,232 mM) + 655 μL CH3OH);
Poço C2: 60 μM (259 μL Vitamina E (0,232 mM) + 741 μL CH3OH);
Poço D2: 40 μM (172 μL Vitamina E (0,232 mM) + 828 μL CH3OH);
Poço E2: 20 μM (86 μL Vitamina E (0,232 mM) + 914 μL CH3OH);
Poço F2: 10 μM (43 μL Vitamina E (0,232 mM) + 957 μL CH3OH);
Poço G2: 5 μM (22 μL Vitamina E (0,232 mM) + 978 μL CH3OH);
Poço H2: 0 μM (0 μL + 1000 μL CH3OH).

Extrato bruto ou frações:

Poço A2: 0,2 mg/mL (200 μL extrato ou fração (1,0 mg/mL) + 800 μL CH 3OH);
Poço B2: 0,1 mg/mL (100 μL extrato ou fração (1,0 mg/mL) + 900 μL CH 3OH);
Poço C2: 0,03 mg/mL (150 μL extrato ou fração (0,2 mg/mL) + 850 μL CH3OH);
Poço D2: 0,02 mg/mL (100 μL extrato ou fração (0,2 mg/mL) + 900 μL CH3OH);
Poço E2: 0,01 mg/mL (100 μL extrato ou fração (0,1 mg/mL) + 900 μL CH3OH);
Poço F2: 0,008 mg/mL (80 μL extrato ou fração (0,1 mg/mL) + 920 μL CH 3OH);
Poço G2: 0,005 mg/mL (250 μL extrato ou fração (0,02 mg/mL) + 750 μL CH3OH);
Poço H2: 0 mg/mL (0 μL + 1000 μL CH3OH).

Preparo da solução de DPPH (101,4 μM ou 0,04 g/L):

* 25 mL de solução de DPPH são suficiente para uma placa de 96 cavidades, caso seja
necessário mais de uma placa esta quantidade deve ser adaptada.

1. Dissolver 1,0 mg de DPPH (freezer da geladeira do NuBBE 1) em 100 mL de

CH3OH em um balão volumétrico de 25 mL encapado com papel alumínio.

Procedimento experimental:
A placa de 96 poços deverá conter:

1. BRANCO:
1. 300 μL de CH3OH
2. CONTROLE – DPPH:
1. 100 μL de CH3OH
2. 200 μL de DPPH
3. PADRÕES
1. 100 μL do padrão nas diferentes concentrações
2. 200 μL de DPPH
4. AMOSTRAS:
1. 100 μL da amostra nas diferentes concentrações
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2. 200 μL de DPPH

Preparo da Placa de 96 poços para leitura:

1. A microplaca de 96 poços utilizada é transparente e com capacidade para 400 μL.

2. Caso a placa de 96 poços tenha sido totalmente utilizada com as amostras, padrões e
controles devemos efetuar a leitura de uma placa que contenha apenas o branco,
totalmente preenchida com metanol, isto é, 300 μL de CH3OH por poço, que deve ser
adicionado, com o auxílio da micropipeta de 12 canais e do reservatório de solvente para
pipeta multicanais.

3. Não esquecer de anotar o layout da placa, isto é, a posição das amostras e de suas
diferentes concentrações nas diferentes fileiras da placa de 96 poços.
4. Adicionar 100 μL, com o auxílio da pipeta de 8 canais, das soluções armazenadas na
placa de 96 poços de 2 mL de capacidade na placa de 96 poços transparente.
5. É recomendado que as análises sejam realizadas em triplicata.
6. Finalmente adicionar 200 μL da solução de DPPH com o auxílio da pipeta de 12 canais
e aguardar 30 minutos ao abrigo da luz a placa poderá ser colocada dentro do leitor de
microplacas ou dentro de uma caixa fechada.
7. Após os 30 minutos, fazer a leitura no leitor de microplacas SYNERGY-HTS a λ 517
nm.
* Caso seja necessário o preparo da microplaca com metanol, esta deve ser lida antes da
placa com as amostras.

Processamento dos dados:

Fórmula: % de seqüestro do radical livre estável DPPH

%= (absorbância do CONTROLE-DPPH- absrobância da AMOSTRA ou PADRÃO)*100

Absorbância do CONTROLE-DPPH

Os dados obtidos são exportados para o EXCEL onde a média e o desvio padrão devem
ser calculados para cada uma das concentrações e o gráfico plotado.

* As concentrações finais são:

(as que devem constar no eixo x do gráfico)

Substâncias puras ou padrões:

33,3; 26,7; 20,0; 13,3; 6,7; 3,3; 1,7 μM (quando adicionamos a solução à placa de
96 poços transparente estamos diluindo 3 vezes)

Extratos e frações:
66,7; 33,3; 10,0; 6,67; 3,33; 2,67; 1,67 μg/mL (quando adicionamos a solução à
placa de 96 poços transparente estamos diluindo 3 vezes)

Limpeza:
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1. Descartar os conteúdos das placas no descarte para metanol.

2. Lavar as placas imediatamente, pois estas deverão ser reutilizadas.
3. Guardar os reagentes nos locais apropriados.
4. Desligar o fluorômetro e o computador.