Esterilizao de meios de cultura

e equipamentos de fermentao
Introduo:
Esterilizar significa remover todas as
formas de vida da superfcie ou interior de um
equipamento;

Pode ser feita mtodos fsicos calor

seco e mido, radiao UV, gama e ultra-som;

Mtodos qumicos lquidos ou gases,

hipoclorito, xido de etileno, oznio, dixido
de enxofre.
Significado dos diversos processos:

Desinfeco processo menos rigoroso

com auxlio de agentes qumicos (germicida
ou desinfetante);

Anti-sptico agente qumico que

destri microrganismos, um desinfetante;

Assepsia a contnua remoo de

patognicos ou indesejveis de um ambiente
ou objeto;

Processos industriais usam vapor para

esterilizao de meios e equipamentos.
Modo de atuao:

calor mido desnaturao

irreversvel das protenas , como as enzimas;

calor seco elimina microrganismos

pela oxidao de seus constituintes qumicos

luz ultravioleta absorvida de modo

significativo pelos cidos nuclicos, leses
entre 220 a 300 nm;

radiaes ionizantes como alfa ( )

e gama ( ), raios X levando inviabilidade
da molcula de DNA.
 xido de etileno agente alquilante,
substituindo H das protenas e cidos
nuclicos por EtO;

Agentes fsicos calor mido em

processo descontnuo 121o C e contnuo em
trocadores de calor;
calor seco vidraria a 150o C;
Radiaes UV vidraria e embalagens
Raios Gama Co 60 e Ce 137;

Agentes qumicos quando

equipamentos no admitem esterilizao
por vapor;
sanitizantes lquidos ou germicidas;
Os germicidas qumicos podem ser:

de alto nvel destroem esporos de

C. botulinum. Ex. H2O2 de 6 a 30%;

nvel intermedirio destroem mofos

e leveduras. Ex. soluo hidroalcolica 70 a
90%;

nvel baixo destroem clulas

vegetativas, mas no os esporos. Ex.
compostos quaternrios de amnio 0,1 a
0,2%.
Clculos de esterilizao:

A ao do calor mido elimina os

microrganismos numa velocidade que est
relacionada:

com microrganismo gnero,

espcie, linhagem, idade, esporos;

com meio de cultura

composio, pH, slidos em suspenso;

com temperatura do processo;

A morte do microrganismo num meio com
temperatura superior letal pode ocorrer
por:
ativao da molcula pela
energia trmica;

reao da molcula com

oxignio;

reao molcula com vapor

dgua;

Todas as reaes ocorridas pela ao do

calor mido so reaes qumicas de 1a
ordem.
Assim, considerando que, em temperatura
constante e taxa de morte de 1a ordem:

No: no inicial de microrganismos

viveis;
N: no de microrganismos viveis aps
tempo t;
N: no de microrganismos mortos
aps tempo t;

Tem-se a seguinte relao:

dN (1)
k ( N o N )
'

dt
 dN
k .N (2)
dt

Sendo a temperatura constante, a integrao

da equao (2) entre No para t= o e N para
t=t, tem-se a relao:
No N
ln k .t ln k .t
N No

ou ln N ln N o k .t (3)
 N
A relao
No

Significa a frao de microrganismos viveis

aps um tempo t de tratamento trmico,
sendo k uma constante dependente da
temperatura de tratamento.

A figura a seguir mostra o grfico que

obtido se um grande nmero de bactrias for
submetido a um tratamento trmico.

A ordenada logartmica e a abscissa linear

 N
ln k .t
No
Esta equao no admite a reduo do
nmero de microrganismos a zero, pois se N
chegar a zero, o tempo de tratamento ser
infinito;

Entretanto, isso obtido na prtica dentro de

um determinado perodo;

O que esta equao realmente indica?

Para valores de N menores do que 1 no h
N
problema, pois N representa a frao de
o
microrganismos viveis aps um tempo t;

Supondo que N = 0,1 aps um tempo t de

tratamento;

No se pode considerar que um dcimo

(1/10 ou 0,1) de microrganismo sobreviver

Mas sim que h a probabilidade de que 1 em

10 microrganismos sobreviver.
 K constante de destruio trmica,
funo da temperatura para um
microrganismo;

Em temperatura constante possvel

determinar N a partir da equao (3);

ln N ln N o k .t

A partir de valores de N obtidos em

diferentes tempos, pode-se calcular k;

Na prtica industrial no se pode

considerar somente o tempo na temperatura
de esterilizao.
 Nos processos em batelada devem ser
considerados tambm os perodos de
aquecimento e resfriamento do meio;

O valor da constante k ir variar com a

temperatura, de acordo com a equao de
Arrhenius:
d ln k E E
ln k C (4)
dT RT 2 RT

E: energia de ativao
R: constante dos gases
T: temperatura absoluta
C: constante de Arrhenius
Valores de k em diversas temperaturas, se
plotados como ln k x 1/T geram linha reta
cuja inclinao ser E/R;

De onde se poder calcular a energia de

ativao do microrganismo;

A interseco da reta no eixo ln k dar o

valor de C a constante de Arrhenius;

Considerando a curva temperatura x tempo,

ter-se- a seguinte curva
Deve ocorrer morte trmica nos perodos AB
(aquecimento) e CD (resfriamento);

A seo BC o perodo de manuteno na

temperatura de esterilizao Ts;

No havendo danos ao meio de cultura pode-

se desconsiderar os perodos de aquecimento
e resfriamento;

Mas se considerar, haver reduo do tempo

BC, pela ao letal nos dois perodos
considerados.
Para destruir esporos de um microrganismo
precisaremos conhecer:

E (energia de ativao);
C (constante de Arrhenius);

Pois estes parmetros caracterizam a

destruio trmica de um microrganismo.
E
Ento, a partir da equao k A.e RT

Pode-se construir um grfico k x T para a

faixa de atuao.
 Definindo o valor (nabla) como:

NO
ln
N

Considerando que o processo de esterilizao

de 1a ordem, tem-se:
dN
k .N
dt
Pela definio de
Integrando, tem-se:
NO
t ln (B)
NO N
ln
N
k .dt
o
(A)
E
E a equao de Arrhenius k A.e RT (C)
 Combinando (A), (B) e (C), ter-se-:
E
t
=A. 0
e RT
.dt

Em temperatura constante:
E
=k.T = A . T . e RT

Exemplo: esterilizar 1.000 L meio com No = 103

esporos/mL. Nmero total de esporos 109 esporos.
Probabilidade de 0,001, ou 1 esporo vivel em
1.000, logo N = 10-3.
Pode-se escrever:
N0 109
1012

N 10 3
 Como:
N0
= ln ln 1012
2,303 log 1012
27,64
N

O valor de para todo o processo ser 27,64 mas

parte da populao microbiana cair no perodo de
aquecimento e resfriamento.
Desta forma:
total = aquecimento + esterilizao + resfriamento

Para determinar os valores no aquecimento e

resfriamento, deve-se integrar a equao:
t E

= A. e RT
.dt
0
Para resolver analiticamente conhecer a
relao matemtica entre temperatura e
tempo para as curvas de aquecimento e
resfriamento;

Da equao:
E

= k . t = A. t. e RT

O perodo de permanncia na temperatura

constante dado por:

=k.t
De onde se pode o tempo na temperatura
constante;
O valor de k na parte de aquecimento tem
que ser calculada pelo mtodo grfico.
No grfico temperatura x tempo cada degrau
pode ser considerado estar em T constante;

Dessa forma, obtm-se valores de para

cada um deles, onde t o intervalo de tempo
escolhido;

1 = k1 .t 2 = k2 . t .......n = kn . t etc.

Para o primeiro degrau:

N0
1 = ln N
1

Onde N1 a populao reduzida ao fim do

tempo na temperatura T1;
Da mesma forma para o segundo degrau:
N1
= ln
N 2

Dessa forma:
N 0 N1 N 0 N1 N0
1 + 2 = ln ln x ln
N
1 2 N N
1 N 2 N
2

A soma do valor dos de cada degrau da

curva de aquecimento dar o valor total do
do perodo de aquecimento;

Assim na curva de aquecimento (fig. 7.1),

sendo NA e NB os nmeros de microrganismos
nos pontos A e B, respectivamente, ter-se-:
 NA
aquecimento = ln = 1 +2 + 3 + etc
NB

Ex. 12.000 L meio aquecido de 55o a 121o C,

com No = 2 x 1010 esporos/L e probabilidade
de sobrevivncia de 1 esporo em 1.000.
Isto levou a um de 40.
Mas integrao de curvas de aquecimento e
resfriamento levou aos valores:

aquec. = 9,8
resfr. = 10,1
A permanncia na temperatura de 121o C ser
de 40 19,1 = 20,1
 Consideraes sobre clculo do tempo de
esterilizao

Da expresso ln N = ln No k . t (3)
obtm-se:
1 N0
t ln
k N
Sabendo valor de k calcular t necessrio
para reduzir No at o valor N;

Mas a aplicao dessa equao para calcular

o tempo de esterilizao no simples;

Pelos seguintes motivos:

1)Os meios de cultura no tem s um tipo de
microrganismo;

2) K tambm funo da composio do meio

portanto o microrganismo escolhido precisa
ter um k neste meio e nesta temperatura;

3) As clulas podem se agregar ou ficar

protegidas por partculas em suspenso,
aumentando sua termo resistncia;
4) A prpria definio de esterilizao, em
que o N = 0 no fim do processo, tornando
impraticvel esta equao.

O item 4) pode ser resolvido pela aplicao

da probabilidade de falha da esterilizao;

Sendo:
Et = no total de esterilizaes realizadas; Ef
= no de esterilizaes que falharam;

A probabilidade de falha (P) ser:

Ef
P=
Et
Multiplicando por 100 falha em percentagem

Ex. No = microrganismos vivos em lotes de

meios;
100No = microrganismos em 100 lotes;
H trs lotes que no sero esterilizados;

A condio necessria e suficiente para que

falhe a esterilizao um microrganismo vivo;

Nmero final de microrganismos vivos = 3

(um em cada lote que a esterilizao falhou);
1 N0
Aplicando a equao t ln
k N
Ao conjunto dos 100 lotes
Teremos

1 100 N 0 1 N
t ln ln
k 3 k 0,03

De um modo geral, sendo P a probabilidade

de falha, pode-se escrever:
1 N0
t ln
k P
Ex. Um volume de meio contm 2,5 . 1010
microrganismos vivos e k = 3,4 min-1.
Calcular os tempos de esterilizao para que
as probabilidades de falha sejam 0,1, 0,01 ou
0,001.
Para P = 0,1 ou 10%

1 2,5.1010
t ln 7,7 min
3,4 0,1

Para P = 0,01 ou 1%
1 2,5.1010
t ln 8,4 min
3,4 0,01

Para P = 0,001 ou 0,1%

1 2,5.1010
t ln 9,1 min
3,4 0,001