Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geociências

Departamento de Engenharia Química
Engenharia Bioquímica 2022.1

Prática 1: Determinação da cinética da morte celular

Professora: Angeles Perez Palha

Alunos: Ana Giovana Almeida
Fabian Cavalcanti
João Victor Moraes
Maria Gabriela Nascimento
Mauro Henrique

Recife, 24 de Julho de 2022.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 3
2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL
2.1 Materiais 4
2.2 Métodos 5
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5
4 CONCLUSÃO 7
5 REFERÊNCIAS 7
 1. INTRODUÇÃO

A velocidade de destruição pelo "calor úmido" de microrganismos presentes em um

dado meio depende de vários fatores, a saber:
a) do microrganismo (gênero, espécie, linhagem; idade da cultura, existência ou não de
esporos);
b) do meio (composição, pH, presença de sólidos em suspensão);
c) da temperatura.

Num experimento em que um determinado microrganismo, em suspensão em um

dado meio, é mantido a uma temperatura constante e superior à temperatura mínima letal. Se
durante o ensaio determinarmos o número de microrganismos vivos existentes no sistema,
como a temperatura é superior à mínima letal esse número de microrganismos vivos será uma
função decrescente do tempo, que pode ser visto na Figura 1.

Figura 1. Representação esquemática da variação do número de microrganismos vivos (N) após um

tempo t de manutenção do meio a uma temperatura letal constante T.N0 =número de microrganismos vivos no
instante t = 0.
Isso nos mostra que, do ponto de vista cinético, a destruição do microrganismo se
comporta como se fosse uma reação de primeira ordem, isto é:

(1)
Sendo N o número de microrganismos vivos existentes no meio após um tempo t de
aquecimento do sistema a uma dada temperatura constante. A constante k é denominada
constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo.
Para um dado microrganismo k dependerá apenas da temperatura. Sendo N0 o número
de microrganismos vivos no instante t = 0, a equação 1 nos dá:
(2)
Costuma-se definir um outro parâmetro: o tempo de redução decimal, indicado por D.
É o tempo necessário para reduzir o número de microrganismos a 1/10 do valor inicial (em
outras palavras, para destruir 90% dos microrganismos vivos existentes). Se na equação 2
substituirmos N = 0,1.N0 , teremos, de acordo com a definição de tempo de redução decimal,
t = D. Logo:
 (3)
Logo:

(4)
A aplicação da equação 2 para cálculos de tempos de esterilização não é tão simples
como pode parecer à primeira vista.

(5)
O fato de que os meios de fermentação a esterilizarem não possuem uma única
espécie de microrganismo a ser destruída. Nos meios a esterilizar, as células microbianas a
serem destruídas poderem se encontrar na forma de aglomerados, ou ainda protegidas por
partículas sólidas em suspensão no meio, isso acarreta um verdadeiro aumento da resistência
dos microrganismos à destruição térmica, aumento esse de quantificação muito difícil.
Lembrando que a esterilização é a operação que tem por finalidade destruir todos os
microrganismos vivos existentes no meio, o número final de microrganismos vivos deverá ser
N = 0 e, neste caso, a equação 5 deixa de ser aplicável.
Define-se probabilidade de falha (P) dessa esterilização, para contornar esse limite
matemático, pela relação:

(6)
De um modo geral, sendo P a probabilidade de falha, podemos escrever:

(7)
Sabendo de todos esses parâmetros a prática teve como objetivo determinar a curva de
morte celular, construir o gráfico ln(N)xt, determinar o valor de k em h-1, determinar a
concentração inicial de células vivas, determinar o tempo de redução decimal, calcular o
tempo de esterilização considerando uma probabilidade de falha de 5% e determinar a
viabilidade celular do fermento no tempo T0.

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
2.1. Materiais

● Solução de azul de metileno para contagem de levedura;

● Suspensão de levedura liofilizada (S. cerevisiae) - 1,0g/L;
● Balança analítica;
● Câmara de Neubauer;
● Banho Maria temperatura variável;
● Microscópio óptico.
 2.2 Métodos

Agitou-se a suspensão de leveduras e transferiu-se 1mL para 5 tubos de ensaios, em

seguida, levou-se todos os tubos ao mesmo tempo para o banho regulado a temperatura de
50°C e retirando-os em tempos intercalados de 3 minutos e colocados em banho de gelo. Em
seguida adicionou-se 1 mL de azul de metileno e aguardou-se 15 minutos para cada tubo.
Com o auxílio de um microscópio contou-se a quantidade de células vivas e as mortas (com
coloração em azul). Preencheu-se a tabela dada em aula com os valores obtidos.

Figura 2. Visualização no microscópio

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 a seguir encontra-se a distribuição de dados obtida com as cinco

contagens de células realizadas em diferentes tempos no experimento:

Tabela 1. Concentração de células de leveduras em diferentes tempos.

t (min) N (cel/mL) ln N

3 222 5,402677

6 192 5,257495

9 146 4,983607

12 142 4,955827

15 51 3,931826
 Com os dados foi possível estabelecer a curva de morte celular ilustrada na Figura 3, a
seguir:

Figura 2. Curva de concentração celular de leveduras x tempo.

Ao realizar a regressão linear no gráfico ln(N) x t acima obtém-se a seguinte equação

de reta:
𝑦 =− 0, 1081𝑥 + 5, 8793 (10)

Comparando os parâmetros da equação obtida com a Equação 2 é possível determinar

−1
o parâmetro k, em ℎ , e a concentração celular inicial, em 𝑐𝑒𝑙/𝑚𝐿 :

−1
𝑎 = 𝑘 = 6, 4860 ℎ (11)
𝑏 = 𝑙𝑛(𝑁𝑜) = 5, 8793 (12)
5,8793
𝑁𝑜 = 𝑒 (13)
𝑁𝑜 = 357, 56 𝑐𝑒𝑙/𝑚𝐿 (14)

Com o parâmetro k determinado é possível calcular também o tempo de redução

decimal D:
2,303 2,303
𝐷 = 𝑘
= 6,486
= 0, 355 ℎ = 21, 30 𝑚𝑖𝑛

O tempo de esterilização é definido baseado no erro P, que é um dado experimental

que não pôde ser calculado no seguinte experimento, por falta de dados. No entanto,
considerando um erro de 5%, obtém-se o seguinte resultado:

1 1
𝑇= 𝑘
𝑙𝑛(𝑁𝑜/𝑃) = 6,486
𝑙𝑛(357, 56/0, 05) = 1, 36ℎ = 82, 1 𝑚𝑖𝑛
 4. CONCLUSÃO
Com o experimento, foi possível compreender como os microorganismos se
comportam quando submetidos à temperatura, um conhecimento extremamente importante
quando se trata de indústrias e laboratórios químicos que precisam utilizar material estéril,
como os de fármacos ou alimentícios.

Calor úmido é uma forma muito eficiente de eliminar microorganismos, pois possui
um alto poder de penetração. Apesar de não se aplicar a qualquer tipo de equipamento, é
amplamente utilizado na indústria pois tem alta eficiência e baixo custo.

O tempo de esterilização calculado foi relativamente alto, provavelmente porque a

temperatura não estava suficientemente alta. Ainda assim, esse método se provou eficaz e foi
possível entender, na prática, como funciona.

5. REFERÊNCIAS
Schmidell, Willibaldo; De Almeida, Urgel; Aquarone, Eugênio; Borzani, Walter -
Biotecnologia Industrial. Volume 11, Brasil, 1983.