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Enzimas

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A importância e das enzimas e seu funcionamento
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Enzimas

Profª Drª Ângela de Mattos Dutra

Importância Biomédica
Toxicologia e Farmacologia
Drogas terapeuticamente importantes Venenos metabólicos

Inibir a atividade de enzimas

Inibir ou abolir reações metabólicas essenciais

Utilizadas no tratamento de inúmeras patologias

Descoberta do mecanismo de ação de enzimas

Enzimas
• Inibição enzimática • Regulação enzimática • Ampliação enzimática • Uso de enzimas em diagnóstico • Isoenzimas

Inibição Enzimática
Quanto ao tipo: inespecífica - inibidor ↓ a atividade de todas
as enzimas ex: agentes desnaturantes

específica - inibidor ↓ a atividade de uma
única enzima ou de um grupo restrito de enzimas irreversível reversível competitiva
não-competitiva incompetitiva

Inibição Enzimática
– Inibição Enzimática Irreversível
• inibidor se combina com um grupo funcional (sítio ativo) da enzima • inibidor se liga à enzima formando um complexo ESTÁVEL • forma-se uma ligação COVALENTE entre o inibidor e a enzima

Inibição Enzimática Irreversível
Ex: Inibição da enzima ciclo-oxigenase pelo acetilsalicilato

Ciclo-oxigenase

Ácido araquidônico

Prostaglandinas

Processos fisiológicos, ex. sensação de dor

Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas Thomas Devlin 5ªedição pg 382.

2

Inibição Enzimática Irreversível
Uteís para o estudo do mecanismo de reação através da determinação do aminoácido que se liga covalentemente ao inibidor quando a enzima é inibida
H+ F

Enz - CH2-OH
Serina

+

DIFP

diisopropilfluorfosfato

Ex. DIFP inibe aceticolinesterase hidrolisa

aceticolina

Neurotransmissor Contração e peristaltismo intestinal Bradicardia

Inibição Enzimática Irreversível

Inibição Enzimática Irreversível
Inibidores Suicidas
ou

Inibidores com Base no Mecanismo Compostos, em geral, pouco reativos até se ligarem à enzima
ou Convertido em um composto muito reativo que se combina IRREVERSIVELMENTE com a enzima Forma um produto que é um potente inibidor do próximo passo da via metabólica

Exemplo de Inibidor Suicida
Reações do Ciclo de Krebs Oxalacetato + Acetil-CoA → Citrato → Isocitrato → →
Citrato Sintase Aconitase

Oxalacetato + Fluoroacetato → Fluorocitrato

Inibidor suicida

Inibição Enzimática
– Inibição Enzimática Reversível
• inibidor forma com a enzima um complexo INSTÁVEL • inibição NÃO envolve modificação COVALENTE • Tipos de inibidores reversíveis
• competitivos • não competitivos • incompetitivos

Inibição Competitiva
Inibidor competitivo Estrutura semelhante à do substrato Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima E+S + I EI ES E+P

Inibição Competitiva
Enzima
Sítio Ativo

S S S S IC

S S

P P P P P P

IC S IC

S

IC IC

S

Inibição Competitiva
Na presença do inibidor competitivo afinidade da enzima pelo substrato [substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente

Km da enzima

Inibição Competitiva
Análise Gráfica
v

V
V

1/V

V/2 1/V Km Km 1/s s -1/Km -1/Km
Com inibidor Sem inibidor

[s]

1/[s]

Inibição Competitiva
Exemplo: inibidor do metabolismo energético
FAD
CH2 – COOH

FADH2

CH - COOH CH - COOH Ácido Fumárico Fumarato

Succinato CH2 – COOH Ácido Succínico Desidrogenase Succinato

COOH

CH2

inibidor competitivo

COOH Ácido Malônico (inibidor) Malonato

Inibição Competitiva
Intoxicação por Metanol

URINA

Metanol

Álcool desidrogenase

Formaldeído
Causa lesão tecidual

Infusão EV Etanol

cegueria

Inibição Competitiva
Terapias com drogas
Conceitos de inibição enzimática Drogas projetadas para inibirem uma enzima específica ANTIMETABÓLITOS Antivirais, antibacterianos, antitumorais

Inibição Competitiva
Exemplo antibacteriano

Sulfanilamida PABA
Diidropteroato sintetase bacteriana

Ácido fólico Essencial para o crescimento bacteriano

Inibição Competitiva
Exemplo: Quimioterápico - Leucemia

Inibição Competitiva

Metotrexato Diidrofolato
Diidrofolato redutase

Síntese de purinas pirimídinas

Multiplicação das células leucêmicas

Inibição Competitiva
Exemplo: Tratamento de hipertensão

Inibidores da ECA
(Enzima Conversora de Angiotensina)

Captropil Enalapril
Produzem vasoconstrição, elevando a pressão arterial e promovem a síntese de aldosterona (hormônio esteróide) que promove a retenção de sódio

Inibição Competitiva
Exemplo:Tratamento de hipercolesterolemia

Lovastatina Droga que inibe competitivamente a HMG-CoA redutase
(hidroximetil glutaril-CoA redutase)

Inibição Não-Competitiva
• Inibido não-competitivo
NÃO se liga ao sítio ativo da enzima E+S + I EI + S ES + I EIS E+P

Inibição Enzimática
Não-Competitiva
• Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato • NÃO se liga no sítio ativo da enzima • Aumento da [substrato] não diminui a inibição • Km da enzima NÃO se altera • A VELOCIDADE máxima DIMINUI na presença do inibidor

Inibição Não-Competitiva
Diminui a concentração de enzima ativa

Velocidade Máxima da Reação
Exemplos: Metais pesados - Pb+2

Inibição Não-Competitiva
Análise Gráfica
v

V
V V V/2 V/2 km s

1/v 1/V

1/V 1/V -1/Km 1/s

Km

[s]

1/Km

[1/s]

Com inibidor Sem inibidor

Mecanismos de Regulação da Atividade Enzimática

Mecanismos de Regulação da Atividade Enzimática
• • • • • • Compartimentalização intracelular Disponibilidade de substrato Enzimas alostéricas Modificação covalente Clivagem proteolítica de pró-enzimas Controle à nivel gênico
– indução – repressão

Regulação da Atividade Enzimática Enzimas Alostéricas
• Reguladas por efetores ou moduladores alostéricos

fora do sítio ativo
(sítio alostérico)

modo não covalente
positivos negativos

Regulação da Atividade Enzimática Modificação Covalente
Fosforilação
Regula inúmeros processos metabólicos Proteínas quinases e fosfatases (ENZIMAS)

Regulação da Atividade Enzimática Modificação Covalente Fosforilação
EX:

ATP Quinase Enzima-OH
inativa

ADP

Enzima-OPO3ativa

Fosfatase HPO4H2O

Regulação da Atividade Enzimática Clivagem Proteolítica
Pró-Enzimas Zimogênios
Clivagem Proteolítica

Enzima Ativa

Regulação da Atividade Enzimática Clivagem Proteolítica
Enzimas digestivas - Proteases Pepsinogênio → Pepsina Tripsinogênio →Tripsina Quimiotripsinogênio → Quimiotripsina

Regulação da Atividade Enzimática Controle à Nível Gênico
Mensagem genética RNAm PROTEÍNA (ENZIMA) Algumas enzimas não são sintetizadas continuamente pelas células

Regulação da Atividade Enzimática Controle à Nível Gênico
Sua produção é induzida pela presença de uma substância adequada

INDUTOR Induzir a transcrição dos genes da proteína (enzima)

Regulação da Atividade Enzimática Controle à Nível Gênico
INDUTOR presente INDUTOR ausente

Síntese da proteína

NÃO ocorre a síntese da proteína

Exemplo: lac operon (E. coli)
• Operon - Unidade regulatória completa
•Gene regulador •Sítios de controle •Genes estruturais

lac operon (E. coli)
Gene regulador

RNA polimerase Genes estruturais NÃO serão transcritos Proteína NÃO será sintetizada

lac operon (E. coli) lac operon (E. coli)
β-galactosidase
RNAm

Permease

Transacetilase

RNA polimerase

(Lactose)

Repressor inativo

Lac operon

ENZIMAS
•Constitutivas •Induzidas ou Adaptativas

Enzimas Constitutivas
• Organismos possuem independente da constituição do meio

Enzimas Induzidas ou Adaptativas
• Organismos sintetizam quando em presença do substrato
Indução enzimática Exemplo: β galactosidase (Lactase)

Enzimas Induzidas no Fígado ESTADO ABSORTIVO
• • • • • • • • • ∀ Glicoquinase Glicose 6-fosfato desidrogenase 6-fosfogluconato desidrogenase PFK1 Piruvato quinase Enzima málica Citrato liase Acetil-CoA carbolixase Ácido graxo sintase ∆ 9 dessaturase (estearoil CoA dessaturase)

Enzimas Induzidas no Fígado ESTADO DE JEJUM
1. 2. 3. 4. Glicose 6-fosfatase Frutose1,6difosfatase Fosfoenolpiruvato carboxiquinase Aminotransferases

Mecanismo de Amplificação Enzimática

Mecanismo de Amplificação Enzimática Degradação do Glicogênio

Adrenalina Glucagon
Adenilato Ciclase Inativa Adenilato Ciclase Ativa ATP PKA inativa
Proteína quinase dependente de AMPc

Mecanismo de Amplificação Enzimática

AMPc PKA ativa Fosforilase quinase inativa

Glicogênio Fosforilase inativa

Degradação do glicogênio

Fosforilase quinase ativa Glicogênio Fosforilase ativa P

P

Mecanismo de Amplificação Enzimática

Enzimas e as Análises Clínicas
• Além do papel central das enzimas na bioquímica, a atividade das enzimas no sangue fornece informações importantes para o diagnóstico de doenças. • O perfil da atividade de enzimas no soro está relacionado à processos patológicos.

Enzimas e as Análises Clínicas
As enzimas podem ser classificadas em dois grupos Plasma-específicas
secretadas ativamente no plasma por certos órgãos, tendo papel funcional no plasma

Não-plasma específicas
produzidas pelas células durante o metabolismo celular normal. São enzimas intracelulares, sem função fisiológica no plasma.

Enzimas não-plasma específicas
↑ Atividade de enzimas intracelulares no plasma Extravazamento por lesão tecidual Extravazamento por alteração de permeabilidade da membrana

Estado patológico

Enzimas não-plasma específicas
Distribuição tecidual restrita a um ou a poucos tecidos Distribuição tecidual ampla

↑ Concentração no plasma Diagnóstico específico
(Contribuição das isoenzimas)

Valor diagnóstico limitado

Em termos de diagnóstico deve-se considerar que: • a proporção das enzimas varia de tecido para tecido • tempo de aparecimento destas no plasma é diferente

Isoenzimas
Enzimas intracelulares que catalisam a mesma reação em diferentes tipos celulares Enzimas formadas por várias cadeias polipeptídicas permitindo diferentes associações Proteínas geneticamente diferentes Propriedades diferentes: Km imunológicas Aplicação na clínica médica

Isoenzimas
Lactato desidrogenase - LDH
NADox NADred

Lactato
Tetrâmero: subunidades M e H Composição Tipo MMMM M4 LDH5 MMMH M3H LDH4 MMHH M2H2 LDH3 MHHH MH3 LDH2 HHHH H4 LDH1

Piruvato
5 isoenzimas

Localização Fígado e Músculo Esquelético Fígado e Músculo Esquelético Cérebro e Rim Miocárdio e Hemáceas Miocárdio e Hemáceas

Padrão normal e alterado das isoenzimas LDH no soro humano

Isoenzimas LDH do soro humano foram separadas em acetato de celulose, em pH 8,6 e coradas para enzima. A: paciente com infarto do miocárdio B: paciente normal C: paciente com doença hepática

Isoenzimas
Creatina quinase
ATP ADP

Creatina Dímero: subunidades B e M Composição BB MB MM Tipo CK1/CPK1 CK2/CPK2 CK3/CPK3

Fosfocreatina 3 isoenzimas Localização Cérebro Coração Músculo esquelético infarto do miocárdio

Aparecimento de CPK2 no sangue

Cinética de liberação de enzimas cardíacas no soro após um IAM

CPK – creatina quinase LDH – Lactato desidrogenase HBDH - α-hidroxibutírico desidrogenase

Outras enzimas importantes em diagnóstico

Transaminases
TGO - Transaminase glutâmico oxalacética TGP - Transaminase glutâmico pirúvica Presentes nas células do fígado, coração, músculo esquelético, rim e pâncreas.
DOENÇA HEPÁTICA INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO
TGO eleva-se após 12 horas, atingindo seu pico após 24-36 horas.

Outras enzimas importantes em diagnóstico

Fosfatases
Fosfatase Alcalina
Presente em muitos tecidos, principalmente no fígado e nos ossos. O aumento fisiológico é
observado na GRAVIDEZ e na INFÂNCIA. DISTÚRBIOS ÓSSEOS DOENÇA HEPÁTICA OBSTRUTIVA

Outras enzimas importantes em diagnóstico

Transferases
GAMA GLUTAMIL TRANSPEPTIDASE Presente no fígado.

INDICADOR DE DOENÇA HEPÁTICA ALCOOLISMO

Outras enzimas importantes em diagnóstico

Amilase
Produzida pelo pâncreas e pelas glândulas salivares.
PANCREATITE CAXUMBA

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