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In 62 - Metodos Microbiologicos Mapa
In 62 - Metodos Microbiologicos Mapa
microrganismos
2. FUNDAMENTOS
Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para
contagem seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos; Agar padro para contagem (PCA);
Soluo salina peptonada 0,1%.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos
alimentos.
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL
da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o
preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Esta a diluio 10-1.
5.2 Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais
diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com as instrues
contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.
Semear 1 mL de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis.
Adicionar cerca de 15 a 20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48C.
Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo.
Deixar solidificar em superfcie plana.
5.3 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas.
5.4 Leitura: Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura
selecionando as placas de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias
presentes:
Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;
Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.
6. RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na
amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos
para contagem de colnias, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
FRANK, J.F. Microbial spoilage of foods: Milk and dairy products. In: Food
Microbiology Fundamentals and Frontiers. Michael
P. Doyle, Beuchat, L.R.; Montville, T.J. (Eds.). ASM Press Washington D.C., p.
101-116.
MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health
Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.
CAPTULO II
CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e leveduras em
alimentos.
Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes.
2. FUNDAMENTOS
Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se
desenvolverem em meios de cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de
incubao de 25 1C.
A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o
crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos;
gar batata glicose 2%;
L(+) cido tartrico 10%;
Soluo salina peptonada 0,1%.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos
alimentos.
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo das placas
Fundir o gar batata glicose.
Resfriar em banho-maria at 46-48C.
Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 mL de soluo de cido
tartrico 10% para cada 100 mL de meio.
Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL.
Deixar solidificar em superfcie plana.
Identificar as placas.
Antes da utilizao, secar as placas semi-abertas com o fundo voltado para
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Aps a pr-incubao, as amostras visualmente
inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes.
Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo
desinfetante e aps com etanol 70% ou etanol 70 GL.
Deixar secar.
Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a
embalagem. Caso se observe alterao evidente (coagulao, floculao, dessorao,
odor no caracterstico ou outros), interromper a anlise e reportar como produto
alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias.
As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas.
Reportar o resultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de
alterao observada.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de soluo
salina peptonada 0,1% at 10-2.
Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluies
preparadas (10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata.
Adicionar cerca de 20 mL de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de
cada diluio. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de gar nutriente isento de extrato
de levedura.
Homogeneizar adequadamente os meios com os inculos.
Deixar solidificar. Inverter as placas.
5.4 Incubao: Incubar as placas a 30 1C por 72 horas.
5.5 Leitura: Verificar a presena de colnias nas placas, contando cada uma e
observando suas caractersticas.
Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias para a realizao da
contagem.
Se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes
entre si, proceder conforme Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias,
deste Manual.
Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas
placas de ABHI.
Quando o crescimento bacteriano devido presena de esporos de Bacillus
sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado nas placas de ABHI um
abundante crescimento de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco
e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis.
No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans
comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias
puntiformes, de colorao entre branco e bege.
Esta diferenciao necessria porque as colnias de B.sporothermodurans no
devem ser contabilizadas no clculo de mesfilos aerbios viveis capazes de causar
alterao no produto.
Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem
nas placas de ABHI, registrando em separado o nmero de colnias suspeitas de
serem Bacillus sporothermodurans, que devero ser confirmadas de acordo com o que
segue:
Repicar 3 a 5 colnias suspeitas para tubos com ABHI inclinado.
Incubar a 36 1C por at 72h.
Realizar os testes confirmatrios.
5.6 Colorao de Gram
Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram, conforme instrues
BHINO3.
Incubar a 36 1C por 72 horas.
Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5
a 1 mL de cido sulfanlico 0,8%.
O aparecimento de colorao rosa indica positividade para
reduo de nitrato.
Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns
miligramas de p de zinco. Nessa situao, o aparecimento de colorao rosa indica
reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade.
O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato a nitrito.
5.13 Prova da urease: Inocular a cultura, com ala, em tubos ou placas
contendo gar uria.
Incubar a 36 1C por 72h.
Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que
indica positividade para produo de urease.
O Bacillus sporothermodurans no produz urease.
6. RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos
aerbios viveis presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no
Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual.
O nmero de UFC/mL de Bacillus sporothermodurans no dever ser reportado
como resultado da contagem de mesfilos aerbios.
Quando estes microrganismos forem encontrados, fazer constar do campo
OBS do Certificado Oficial de Anlise (COA): Presena de Bacillus
sporothermodurans.
Somente ser reportado o nmero de unidades formadoras de colnias de
outros mesfilos encontrados.
Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre
o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos,
bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s)
presente(s), quando identificado(s).
Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em
leite UHT a 30C por at 72 horas devem ser expressos em UFC/mL.
Para todos os produtos UHT, o resultado da anlise de pr-incubao por 7 dias
a 36 1C deve ser expresso como alterado ou sem alterao.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria.
Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de
mtodos microbiolgicos para alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal.
1991/1992 2 reviso. 136p.
PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G.
Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant
endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. p. 759-764.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture methods for
enumeration of microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association.
Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 53-62.
MORTON, R.D. Aerobic Plate Count. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health
Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.
CAPTULO IV
CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E
DE Clostridium perfringens
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Clostridium sulfito redutores e de
Clostridium perfringens em alimentos.
Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da
mesma em meios de cultura seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium
formam colnias negras, devido reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage
com citrato de amnio e ferro III, formando um precipitado negro.
2.2 Fermentao tempestuosa: Baseia-se na verificao da fermentao
tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro, caracterstica do Clostridium
perfringens.p.
Essa fermentao caracteriza-se por formao de cogulo bem definido, com
grande formao de gs, durante incubao temperatura seletiva de 46 1C.
2.3 Testes confirmativos: A confirmao de Clostridium perfringens se faz por
meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas caractersticas de:
imobilidade, reduo de nitratos, produo de cido e gs a partir da lactose,
fermentao da rafinose e liquefao da gelatina.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos;
Soluo salina peptonada 0,1%;
gar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou gar
Sahid Ferguson Perfringens (SFP) -base;
gar estoque;
gar motilidade - nitrato tamponado;
Meio leite com ferro;
Meio lactose-gelatina;
Caldo vermelho de fenol-base;
Soluo de rafinose 10% ;
Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi);
Meio tioglicolato;
Alfa naftilamina 0,5%;
cido sulfanlico 0,8%;
Soluo de cicloserina 5%;
Polimixina B;
Kanamicina;
Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida;
Gerador de anaerobiose;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
nitrato tamponado.
Incubar em anaerobiose a 36 1C por 24 horas.
O Clostridium perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da linha
de inoculao.
5.6.4 Prova da reduo do nitrato: Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao
gar 0,5 a 1 mL de soluo de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 mL de cido sulfanlico
0,8%.
O aparecimento de colorao vermelha indicar a reduo do nitrato a nitrito.
Para confirmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p
de zinco.
O aparecimento de uma cor rosa ser indicativo da no reduo do nitrato,
enquanto que a no alterao de cor ser indicativa de reao positiva para reduo
do nitrato.
O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito.
5.6.5 Fermentao da lactose e liquefao da gelatina: Inocular a cultura, com
agulha, em vrios pontos do meio lactose-gelatina.
Se o meio for utilizado 8 ou mais horas aps a sua preparao, regener-lo por
aquecimento a 50C por 2 horas em banhomaria, antes da inoculao.
Incubar em anaerobiose a 36 1C por 44 2h. Aps a incubao, manter os
tubos em geladeira por 1 hora.
Observar a fermentao da lactose pela produo de bolhas de gs e pela
mudana da cor do meio de vermelho para amarelo e tambm a liquefao da gelatina
por meio da permanncia do estado lquido aps o resfriamento por cerca de 1 hora
em geladeira.
O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 2h a
36 1C.
5.6.6 Fermentao da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para
fermentao da rafinose.
Aps inoculao, adicionar 1 a 2 mL de selo estril: vaspar ou vaselina ou
parafina lquida ou leo mineral. Incubar a 36 1C por 72 2h.
Verificar a fermentao da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho
de fenol para amarelo.
As provas de liquefao da gelatina em 44 2h horas e a fermentao da
rafinose em 72 2h tornam possvel a diferenciao entre Clostridium perfringens e
outros clostrdios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum,
Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens.
O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 2h.
CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS
Espcies de Clostridium
C. perfringens A
C.perfringens B
C. absonum
C. baratii
C. celatum
C. paraperfringens
C. sardiniense
Meio lactose-gelatina
cido/ gs
Liquefao.gelatina
AG/T
+ (48h)
AG/T
+ (48/72h)
AG/CS
-*
AG/CS
AG/CS
AG/CS
AG/CS
-*
6. RESULTADOS
6.1 Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutores presentes
na amostra:
Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de
colnias negras contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado,
conforme recomendaes constantes do Anexo IV, Procedimentos para contagem de
colnias, deste Manual.
6.2 Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium
perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes
Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de
fermentao tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em
44 2h, da rafinose em at 72 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 2h.
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes, de
acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological
Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.
LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health
Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330.
MacFADDIN, J.F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of
medical bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1985. 928p. MacFADDIN, J.F.
Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins,
Baltimore, USA, 2000. 912p.
CAPTULO V
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Staphylococcus aureus.
Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos.
Para os produtos destinados ao comrcio no MERCOSUL, a contagem final se
referir apenas a Staphylococcus coagulase positiva.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras
em gar Baird-Parker, cuja composio evidencia a habilidade desse
microrganismo de crescer na presena de 0,01 a 0,05% de telurito de potssio em
combinao com 0,2 a 0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a 1,26% de glicina.
O Staphylococcus aureus reduz anaerbia e aerobiamente o telurito de
potssio, produzindo colnias negras.
O gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema de ovo possibilita a
verificao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus , por meio
do aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da
colnia, respectivamente.
2.2 Prova da coagulase: Baseia-se na comprovao da capacidade de coagular
o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo
com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e
descarte de amostras, deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Essa a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas
em
laboratrios
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
alimentos.
Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).
de
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL
da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o
preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Esta a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Prova presuntiva
5.3.1 Inoculao
A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em
soluo salina peptonada 0,1 % de acordo com as instrues contidas no Anexo II,
"Diluies e solues", deste Manual.
Inocular 1 mL de cada diluio desejada em placas de Petri esterilizadas.
Adicionar a cada placa cerca de 1.5mL de VRBA previamente fundido e mantido
a 46C 48C em banho-maria.
Homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso at total solidificao do
meio.
Adicionar, sobre cada placa, cerca de 10mL de VRBA previamente fundido e
mantido a 46C - 48C em banho-maria, formando uma segunda camada de meio.
Deixar solidificar.
5.3.2 Incubao
Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posio invertida em
temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas.
5.3.3 Leitura
Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias.
Contar as colnias que apresentarem morfologia tpica de coliformes, ou seja.
colnias rseas; com 0,5 a 2 mm de dimetro rodeadas ou no por uma zona de
precipitao da bile presente no meio. Anotar os resultados de contagem.
Contar separadamente colnias tpicas e atpicas e submeter 3 a 5 colnias, de
cada uma. s provas confirmativas.
5.4 Provas confirmativas
5.4.1 Coliformes totais
5.4.1.1 Inoculao
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Bacillus cereus.
Aplica-se a matrias primas e alimentos.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras
sob teste em gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus
(PEMBA).
Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da
produo de lecitinase pelo B.cereus .
No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sdio
evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio.
A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a
flora acompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado
no alimento, poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/mL) como agente
seletivo.
Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus .
No MYP, o indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol.
2.2 Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se
na verificao de produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na
capacidade de decomposio da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do
tipo de crescimento em superfcie de gar nutriente, e da no produo de corpsculos
de incluso cristalina.
<!ID720419-2>
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos; Soluo salina peptonada 0,1%;
gar nutriente;
gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus
(PEMBA);
gar estoque;
gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado;
gar tirosina;
gar motilidade - nitrato;
cido sulfanlico soluo 0,8%;
Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5%;
Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/mL;
Emulso de gema de ovo 50%;
Sangue de carneiro desfibrinado;
cido actico 5N;
Zinco em P;
Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL
da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o
preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.
Colorao
Gram
Catalase
Motilidade
Reduo
nitrato
Hemlise
sangue
carneiro
Decomp.
tirosina
Corpsc.de
incluso
cristalina
Crescimento
rizide
Bacillus
anthracis
+
de -d
+
b
+
+
-c
+
+
+
-d
-d
em de
da
a: 90 a 100% so positivos
b: 50 a 90% so positivos
c: 90 a 100% so negativos
d: a maioria negativa
6.RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua de acordo com as
instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte
de amostras", deste Manual.
No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga,
deixar descongelar no prprio frasco, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para
seu completo descongelamento.
Antes do incio da anlise, homogeneizar bem.
Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a amostra dentro
de outro saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sob
refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento.
Aps descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo
da amostra, o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse
caso, no analisar a amostra.
Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em
descongelamento devero ser descartadas.
Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidncias de que no
continha perfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder
anlise, seguindo o procedimento estabelecido para amostras de gua.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Prova presuntiva
5.3.1 Inoculao: Inocular volumes de 10 mL da amostra a ser analisada em
uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla.
Inocular volumes de 1 mL da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo
caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples e volumes de 1 mL da diluio
10-1 na terceira srie de 3 tubos contendo o mesmo meio.
Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies, proceder de
acordo com as instrues contidas no Anexo II, "Diluies e solues", deste Manual.
Neste caso, inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies efetuadas em sries
de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.
Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL, usar sries de 5 tubos.
Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL, usar sries de 10 tubos.
5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas.
5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs
nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado
gentilmente.
Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s
sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra
5.1.1 Produtos slidos e pastosos: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da
amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, "Procedimentos para o
preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instrues
contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de
amostras", deste Manual.
Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Esta a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Provas presuntivas
PASTOSOS E VISCOSOS
1.OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de microrganismos
mesfilos aerbios viveis, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos
e no causadores de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas em produtos lcteos
pastosos e viscosos.
Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos
demais microrganismos mesfilos aerbios viveis.
Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos
tratados pelo processo UHT e produtos esterilizados.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C
por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do
produto.
2.2 Determinao do NMP: Baseia-se na semeadura de diluies seriadas da
amostra em tubos contendo caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura
0,6% (BHI-SE), seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, com posterior repique
em gar crebro-corao (BHI) e gar nutriente isento de extrato de levedura e a
subseqente identificao da flora presente.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos;
gar crebro-corao (ABHI);
gar nutriente isento de extrato de levedura;
gar esculina;
gar uria;
Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3);
Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE);
Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentrao dupla
(BHI-SE2);
Caldo vermelho de fenol com glicose;
Soluo salina peptonada 0,1%;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de
para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Perxido de hidrognio 3%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
cido sulfanlico 0,8%;
Zinco em p;
Etanol 70% ou Etanol 70 GL;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos.
<!ID720419-4>
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Aps pr-incubao, as amostras visualmente
inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar
externamente as embalagens com soluo desinfetante e posteriormente com etanol
2. FUNDAMENTOS
2.1 Enriquecimento Seletivo: O enriquecimento seletivo, realizado em duas
etapas (a primeira em caldo UVM, e a segunda em caldo Fraser), tem a finalidade de
inibir a flora acompanhante, permitindo a recuperao de baixos nmeros de clulas
de Listeria sp.
O efeito seletivo no caldo UVM exercido pela associao de cido nalidxico e
acriflavina e no caldo Fraser pelo cloreto de ltio, cido nalidxico e acriflavina.
2.2 Seleo e Isolamento: Nos produtos crneos, a seleo se realiza em dois
meios slidos: gar triptose com cido nalidxico (ATN) e gar Palcam (AP), enquanto
que nos produtos lcteos esta se realiza em agar Oxford (AO), gar Palcam (AP) e gar
triptose com cido nalidxico (ATN).
As substncias impedientes presentes nos meios slidos so cido nalidxico no
ATN, sulfato de polimixina B, acriflavina, cloreto de ltio e ceftazidina no AP, e cloreto
de ltio, acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximide e fosfomicina no AO.
A seleo no ATN baseia-se nas caractersticas das colnias, quando observadas
sob luz oblqua, em estereoscpio. No AP, observa-se a no fermentao do manitol e
a formao de esculetina pela hidrlise da esculina, reao revelada pela presena de
ferro trivalente. No AO, as colnias de Listeria sp apresentam-se pretas, rodeadas por
halo negro devido hidrlise da esculina.
2.3 Confirmao da presena de Listeria sp: A confirmao bioqumica de
Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de catalase, observao das
caractersticas morfolgicas e tintoriais, verificao do crescimento tpico em meio
semi-slido e, adicionalmente, por meio da verificao da incapacidade de reduo de
nitrato e verificao da positividade nas reaes de Vermelho de Metila e Voges
Proskauer (VM-VP).
2.4 Identificao de Listeria monocytogenes: A diferenciao das espcies de
Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de -hemlise em gar
sangue de cobaio ou gar sangue de carneiro, verificao da capacidade de produzir
reao de CAMP positiva com S. aureus (e opcionalmente tambm com Rodococcus
equi), e verificao da capacidade de fermentao dos carbohidratos ramnose, xilose e
manitol. A utilizao concomitante de culturas de R. equi e S. aureus no CAMP teste
til para a diferenciao de L. ivanovii, que apresenta reao de CAMP forte com R.
equi (em forma de flecha). Quando se julgar conveniente, a identificao poder ser
realizada por meio de um sistema comercialmente disponvel de testes bioqumicos
miniaturizados padronizados, conjuntamente com a prova de -hemlise ou CAMP
teste.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos;
Caldo Fraser - base;
Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) ou opcionalmente
Caldo para Enriquecimento de Listeria (LEB);
Caldo VM-VP;
Caldo vermelho de fenol - base ou gar para fermentao de carbohidratos base;
gar Palcam (AP);
gar Columbia com cido nalidxico - base;
gar triptose com cido nalidxico (ATN);
gar Oxford (AO) - base;
gar motilidade;
S. aureus ATCC 25923 para CAMP teste;
Rodococcus equi ATCC 6939 para CAMP teste (opcional);
Sistema miniaturizado para identificao bioqumica de Listeria (opcional);
cido nalidxico 1%;
Acriflavina cloridrato 1%;
Perxido de hidrognio 3%;
Vermelho de metila 0,06%;
Alfa-naftol 5%;
Hidrxido de potssio 40%;
cido sulfanlico 0,8%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
Suplemento para caldo UVM (cido nalidxico 20mg/L; acriflavina 12mg/L);
Suplemento para caldo LEB (acriflavina 12mg/L);
Suplemento para gar Oxford (cicloheximide 200mg/0,5L; sulfato de colistina
10,0mg/0,5L;
acriflavina
2,5mg/0,5L;
Cefotetan
1,0mg/0,5L;
fosfomicina
5,0mg/0,5L);
Suplemento para gar Palcam (polimixina B 5,0mg/0,5L; acriflavina
2,5mg/0,5L; Ceftazidime 10,0mg/0,5L);
Suplemento para caldo Fraser (citrato de amnio e ferro III 250mg/0,5L;
acriflavina 12,5mg/0,5L; cido nalidxico 10mg/0,5L);
P de Zinco;
Xilose soluo aquosa 5%;
Manitol soluo aquosa10%;
Ramnose soluo aquosa 5%;
Sangue desfibrinado de carneiro;
Sangue desfibrinado de cobaio .
OBS: Os suplementos podem ser adquiridos em forma de vial (comercialmente
disponvel), necessitando apenas a suspenso em diluente antes de seu uso. Verificar
sempre a composio, comparando com aquela indicada nesta metodologia.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios
alimentos.
Estereoscpio com iluminao em ngulo de 45.
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da Amostra: Acrescentar alquota de 25 0,2 g ou mL da
amostra preparada conforme Anexo V, 225 mL de caldo UVM adicionado de seu
suplemento.
OBS: Verificar a formulao do Caldo UVM ou LEB. Algumas marcas de caldo UVM j
contm em sua formulao cido nalidxico e acriflavina. O caldo LEB j contm cido
nalidxico, bastando a suplementao com 0,25 mL de soluo 1% de acriflavina.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Primeiro enriquecimento seletivo: Homogeneizar as alquotas preparadas
conforme item 5.1 e incubar a 30 1C por 24 horas.
5.4 Segundo enriquecimento seletivo.: Aps a incubao, transferir 0,1 mL da
cultura para tubo contendo 10mL de caldo Fraser suplementando-o, se necessrio,
com 0,1 mL do vial diludo conforme a indicao do fabricante.
OBS:Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio j pronto para o uso; outros
fornecem o meio adicionado de cido nalidxico e de acriflavina, bastando a
suplementao com citrato de amnio e ferro III (0,1 mL de soluo a 5% equivalente
a 250 mg/0,5L de meio).
Incubar a 30 1C por 24 a 48 horas.
5.5 Isolamento
5.5.1 Amostras de produtos crneos: Utilizando ala de platina de 5 mm de
dimetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP
suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a
proporcionar a obteno de colnias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS
em paralelo com os meios ATN e AP.
Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP e ATNS,
na mesma temperatura, por 24 a 48 horas.
5.5.2 Amostras de produtos lcteos: Utilizando ala de platina de 5 mm de
dimetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas
contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies
secas, de forma a proporcionar a obteno de colnias isoladas.
Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP na mesma
temperatura, por 24 a 48 horas.
5.6 Seleo; Com auxlio de lupa ou estereoscpio com iluminao angular de
45, selecionar 3 a 5 colnias de cor azulada ou azulacinzentada em ATN.
Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao
normal, colnias pretas rodeadas por halo escuro em AO.
Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao
normal, colnias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colnias verdeacinzentadas, em AP.
5.7 Confirmao da presena de Listeria sp: Repicar o mesmo inculo para
tubos com gar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 1C por
24 horas.
Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do gar estoque para
a realizao das provas de confirmao e identificao.
5.7.1 Prova da catalase
Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de perxido de hidrognio 3%. Com
auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur,
retirar uma alquota do cultivo e misturar com a gota do reagente. A presena de
catalase se traduz por desprendimento de borbulhas de oxignio (catalase positiva).
Das culturas catalase positivas, fazer um esfregao para colorao de Gram.
5.7.2 Colorao de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou
na forma de cocobacilo, Gram positivo.
5.7.3 Prova da motilidade tpica: Inocular uma alquota da cultura em gar
motilidade, com agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biolgica
de Oxignio) a 22-25C por 2 a 5 dias. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento.
A Listeria sp apresenta crescimento mvel caracterstico em forma de guardachuva.
5.7.4 Prova de Reduo de Nitrato: Aps a leitura da motilidade, adicionar a
cada tubo 2 a 3 gotas de alfa-naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico a
0,8%.
O aparecimento de colorao rosa indica positividade.
Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao meio alguns
miligramas de p de zinco. Nesse caso, o aparecimento de colorao rosa indica reao
-hemlise
Red-NO3
CAMP Teste-SA
CAMP Teste-RE
Manitol
Ramnose
Xilose
VM
Gram
LM
+
+
V
+
+
+
LIVA
+
+
+
+
+
LINN
V
+
+
LW
V
+
+
+
LS
+
+
+
+
+
LG
+
+
+
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL
da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o
preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada (ver excees na
observao abaixo).
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher.
Deixar 1 hora em temperatura ambiente.
OBS: Para leite em p e soro de leite em p, utilizar como diluente gua destilada e
adicionar 5 mL de verde brilhante soluo aquosa 0,1%.
Para produtos gordurosos (creme e manteiga) utilizar como diluente soluo
salina peptonada 1% tamponada com 1% de Tween 80.
Para os demais alimentos, utilizar soluo salina peptonada 1% tamponada.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Pr-enriquecimento: O pr-enriquecimento se realiza por meio da incubao
das alquotas das amostras preparadas conforme item 5.1, a 36 1C por, no mnimo,
16 horas e no mais que 20 horas.
5.4 Enriquecimento seletivo: A partir do procedimento de pr-enriquecimento
estabelecido em 5.3, inocular, simultaneamente, nos meios lquidos seletivos conforme
abaixo:
5.4.1 Inoculao em caldo Rappaport Vassiliadis: Pipetar alquotas de 0,1 mL
das amostras pr-enriquecidas para tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport
Vassiliadis.
Incubar os tubos a 41 0,5C, em banho-maria, preferencialmente com
agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas.
5.4.2 Inoculao em caldo selenito cistina: Pipetar alquotas de 1 mL das
amostras pr-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo selenito
cistina.
Incubar os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com
agitao ou circulao contnua de gua, por 24 a 30 horas.
gar estoque;
Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro (LIA);
Caldo uria ou gar uria;
Caldo Rappaport Vassiliadis (RV);
Meio SIM;
Soluo salina 0,85%;
Soluo salina 2%;
Soluo salina peptonada tamponada, pH 7,2 (PBS);
gua destilada estril;
Soluo salina peptonada 1% tamponada;
cido clordrico 0,1N;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de
para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Reativo de Kovacs (ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich);
Verde brilhante soluo aquosa 0,1%;
Cloreto frrico soluo aquosa 10%;
Novobiocina soluo aquosa 4%;
Soro anti-Salmonella polivalente O;
Soluo salina peptonada 1% tamponada adicionada de 0,02% de tween 20;
leo mineral, vaspar ou parafina lquida estreis.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia; Misturador
de amostras;
Separador imunomagntico;
Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e respectivas
ponteiras com barreira.
5. PROCEDIMENTO
5.1 Preparo da amostra: Proceder conforme instrues contidas no Captulo XV,
Pesquisa de Salmonella, deste Manual.
5.2 Pr-enriquecimento; Proceder conforme instrues contidas no Captulo XV,
Pesquisa de Salmonella, deste Manual.
5.3 Separao imunomagntica; De cada amostra pr-enriquecida, transferir
uma alquota de 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada, com capacidade de
1,5 mL.
Adicionar a cada eppendorf 20 microlitros de partculas imunomagnticas de
280nm cobertas com anticorpo especfico para Salmonella (beads).
Aps homogeneizao por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os
tubos no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos, em baixa
velocidade.
Em seguida colocar os tubos no separador com a barra magntica j acoplada
no suporte, onde devem permanecer por 10 minutos.
Sem retirar os tubos do separador magntico, retirar todo o lquido dos tubos
eppendorf com o auxlio de pipetas Pasteur, ou descartveis com bulbo, estreis,
tomando o cuidado para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas
esto aderidas.
Descartar o lquido em recipiente com desinfetante testado e aprovado.
Retirar a barra magntica do suporte do separador.
A cada tubo, adicionar 1 mL de soluo salina peptonada 1% tamponada,
adicionada de 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inverses.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos;
gar sal triptona (T1N1);
gar ferro dois acares (gar Kligler);
gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (gar TCBS);
gar soja triptona (TSA);
gar gelatina (AG);
gua peptonada alcalina pH 8,5 0,1;
Caldo peptonado sem sal;
Caldo peptonado sal 3%;
Caldo peptonado sal 6%;
Caldo vermelho de fenol base;
Caldo gelatina fosfato sal (GPS);
Caldo vermelho de fenol manitol;
Caldo vermelho de fenol sacarose;
Meio O/F Hugh-Leifson;
Bacto Vibrio cholerae - anti-soro polivalente;
Arabinose;
Desoxicolato de sdio;
L-arginina;
L-inositol;
L-lisina;
L-ornitina;
Manitol;
Manose;
Reativo para oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina
ou N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou tiras para teste de
oxidase;
Etanol 96%;
Reagentes para colorao de Gram;
leo mineral estril.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos
alimentos.
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Enriquecimento: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas
no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste
Manual.
Pesar, separadamente, 25 0,2 g da amostra em dois recipientes estreis.
Adicionar 225 mL de gua peptonada alcalina pH 8,5 a um dos recipientes e
225 mL de caldo gelatina fosfato sal (GPS) ao outro.
Homogeneizar, no mximo por 60 segundos em stomacher.
Incubar os caldos a 36 1C por 6 a 8 horas.
Para amostras de ostras, inocular um terceiro recipiente com 25 0,2 g de
amostra e 225 mL de gua peptonada alcalina pH 8,5, que dever ser incubado por 6 a
8 horas a 42 0,2C.
No agitar os frascos aps a incubao.
5.2 Procedimentos de controle; Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
MUG);
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios para laboratrios de microbiologia; Cmara
UV (366 nm);
Misturador de Amostras;
Separador Imunomagntico;
Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e ponteiras
correspondentes, com barreira.
5.PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar assepticamente 25 0,2 g ou
pipetar 25 0,2 mL de amostra em sacos de stomacher ou frascos Erlenmeyer
estreis, seguindo as orientaes contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste
Manual.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Pr-enriquecimento: A cada alquota adicionar 225 mL de SPT-VCC e
incubar por 6 horas a 36 1C.
5.4 Separao imunomagntica: Aps as 6 horas de incubao, de cada
amostra pr-enriquecida, transferir 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada.
Adicionar a cada eppendorf 20 L de beads 280nm cobertas com anticorpo
policlonal antiEscherichia coli O157.
Aps homogeneizao, por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os
tubos no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos em baixa
velocidade.
Em seguida, colocar os tubos no separador com suporte magntico j acoplado,
onde devem permanecer por 5 minutos.
Sem retirar os tubos do separador magntico, extrair todo o lquido dos tubos
eppendorf, com o auxlio de pipetas Pasteur ou descartveis com bulbo, estreis,
tomando o cuidado para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas
esto aderidas.
Descartar o lquido em recipiente com desinfetante.
Retirar o suporte magntico do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de
soluo salina peptonada 1% tamponada - 0,02% de tween 20 e misturar
delicadamente por repetidas inverses.
Recolocar o suporte magntico no separador e deixar por mais 5 minutos.
Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional
com PBS sem tween, sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante.
Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta
ser denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS.
5.5 Semeadura, seleo e isolamento: Inocular no centro de uma placa com
gar MCS, previamente seca, 10 L da FIS. Espalhar com auxlio de ala de Drigalski
ou basto tipo hokey.
Partindo dos 10 L restantes da FIS, inocular com ala de 1 L sobre outra
placa com gar MCS, de forma a obter colnias isoladas.
Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas.
Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de
3 a 5 colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em
forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar
BEM. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado.
Incubar a 36 1C por 18 a 24h. Aps o perodo de incubao, observar a
pureza e caractersticas das culturas e, quando necessrio, reisolar em superfcie seca
de gar MCS.
Quando, aps dois procedimentos de reisolamento, no forem obtidos cultivos
puros, repicar para tubos com caldo EC+n, ou com caldo verde brilhante bile lactose
2% e incubar por 18 a 24 horas a 36 1C, inoculando posteriormente sobre a
superfcie seca de gar MCS e de gar EMB, independentemente da produo de gs
nos tubos de Durhan.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de
3 a 5 colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em
forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar
EMB.
Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
5.6 Teste da oxidase: A partir dos cultivos puros em gar estoque inclinado,
usando palitos de madeira estreis ou de plstico descartvel, ala de platina ou pipeta
de Pasteur, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro
impregnado com o reativo para oxidase (podem tambm ser utilizadas tiras para
oxidase, comercialmente disponveis).
O aparecimento de cor azul intensa (N N N N -tetrametil-parafenilenodiamina) ou vermelho escuro (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de
reao positiva.
No utilizar alas de nquel-cromo ou de ao para realizar a prova de oxidase.
Todas as cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam resultado negativo na
prova de oxidase.
As culturas que apresentam resultado positivo no pertencem famlia
Enterobacteriaceae, portanto no necessitam ser submetidas a testes complementares
para Escherichia coli 0157:H7.
5.7 Teste de aglutinao de ltex: Submeter as culturas puras obtidas conforme
item 5.5 ao teste de aglutinao de ltex, suspendendo-as em duas gotas de soluo
salina colocadas sobre o carto de teste que acompanha o kit.
primeira, misturar uma gota do ltex reagente e sobre a outra uma gota do
ltex controle. Misturar por um minuto e observar aglutinao.
Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos,
apresentarem aglutinao apenas no ltex reagente. Para os controles positivo e
negativo, utilizar os controles que acompanham o kit.
coli O157:H7
hermannii
fergusonii
coli
Sorbitol
+
Celobiose
+
+
-*
Dulcitol
+
-/+
5.6.1 Colorao de Gram; Das colnias suspeitas, fazer esfregao e corar pelo
mtodo de Gram.
O P.larvae se apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e
fino, porm, pode se apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento
varivel.
As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas
devem ser testadas para:
5.6.2 Crescimento em superfcie de gar nutriente sem extrato de levedura: A
partir das colnias catalase negativas, repicar tambm em tubos com gar nutriente
inclinado isento de extrato de levedura e incubar a 36 1C por 3 dias.
A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em gar
nutriente sem extrato de levedura aps 3 dias.
5.6.3 Decomposio da casena e verificao de crescimento tpico no ALT
A partir das colnias catalase negativas, repicar sobre a superfcie seca de
placas com gar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 1C por 3 dias.
Aps incubao, verificar a presena de halo transparente ao redor das
colnias.
O Paenibacillus larvae decompe a casena em at 3 dias.
As colnias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de
colorao entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas).
Diferenciao entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos
relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apcolas.
Microrganismos
P.larvae subsp. larvae
Paenibacillus alvei
Brevibacillus laterosporus
P.larvae subsp. Pulvifaciens
Paenibacillus popilliae
Paenibacillus lentimorbus
Decomposio
da casena
POS*
POS
POS
POS
NEG
NEG
Catalase
NEG
POS
POS
NEG
NEG
NEG
bsicos
obrigatrios
em
laboratrios
de
microbiologia
de
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pr-incubao: Seguir os procedimentos para pr incubao no item 3.1.1
do Anexo V, Procedimento para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste
Manual.
Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os
recipientes no sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que
possam evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos.
Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos
recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a
alterao, quando ocorrer.
5.1.1 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao: Ao final da
pr-incubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver
manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra
anlise de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a
temperatura da pr-incubao. Proceder conforme item 5.3 para a anlise destas
amostras.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Amostras tufadas; As amostras que derem entrada no laboratrio com
evidncias de tufamento e estiverem acompanhadas de ofcio com solicitao de
anlise especial sero analisadas imediatamente, devendo ser preparadas conforme as
instrues descritas abaixo:
Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo
desinfetante e em seguida com etanol 70% ou etanol 70 GL.
Deixar secar.
Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada
para o lado oposto ao analista.
Colocar um chumao de algodo embebido em soluo desinfetante,
previamente aprovada pelos testes do laboratrio, no local onde ser iniciada a
abertura da embalagem. Esse procedimento tem o objetivo de proteger o ambiente e o
analista contra uma possvel contaminao proveniente do alimento em anlise pela
expulso de gases e/ou lquidos presentes no recipiente no momento do rompimento
da hermeticidade. Outros cuidados como o uso de luvas, mscara, toucas, etc.
tambm devero ser adotados.
Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um
pequeno orifcio sob o chumao de algodo.
Deixar em repouso sem retirar a proteo de algodo sobre o orifcio at que a
microrganismo isolado.
Registrar no resultado final a caracterstica mesoflica ou termoflica do
microrganismo isolado.
5.7.4 Confirmao de microrganismos flat sour (opcional): A partir das
culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de caldo glicose
triptona incubados a 55 1C, repicar para a superfcie seca de 2 placas com gar
glicose triptona. Incubar uma das placas a 36 1C por 72 horas e a outra a 55 1C
por 48 horas em cmara mida.
O crescimento de colnias amarelas, regulares, com dimetro de
aproximadamente 2 a 3 mm, rodeadas de zona de clarificao tambm amarela, nas
placas incubadas a 55 1C, com ncleo opaco e o no crescimento naquelas
incubadas a 36 1C, confirmar a presena de Bacillus stearothermophilus
(renomeado Geobacillus stearothermophilus ), microrganismo responsvel pela
deteriorao flat sour.
6. RESULTADOS
6.1 Pr-incubao: Expressar, no campo referente a emisso do resultado para
prova de pr-incubao, nas temperaturas requeridas, o resultado como sem
alterao quando no se observar qualquer alterao ou anormalidade no recipiente e
nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra, e como alterado quando for
observada qualquer alterao ou anormalidade no recipiente ou nas caractersticas
fsicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o tipo de alterao
observado.
6.2 Pesquisa de aerbios e anaerbios termfilos e mesfilos: Expressar, nos
campos referentes a emisso dos resultados para as pesquisas de aerbio e anaerbio
mesfilo e termfilo, o resultado como negativa, quando no for observado qualquer
desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como positiva quando for
observada a presena de microrganismos.
Sempre que possvel, fazer constar do resultado final as observaes feitas ao
microscpio.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento-Secretaria de Defesa
Animal - Departamento Nacional de Defesa Animal - Coordenao Geral de Laboratrio
Animal - Mtodos de Anlise Microbiolgica para Alimentos - Teste de Esterilidade
Comercial Braslia, D.F. 1991/1992 - 2 Reviso, p. 111 - 113.
DEIBEL K. E.; JANTSCHKE, M. Canned Foods - Tests for Commercial Sterility .
In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.
Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito
(Eds.), 2001. p. 577-588.
DENNY C. B; PARKINSON, N.G. Canned Foods - Tests for cause of spoilage . In:
In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.
Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito
(Eds.), 2001. p.583-600.
DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Bacterial
Nomenclature
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In:http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm