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IN62
IN62
Meio lactose-gelatina
cido/ gs
Liquefao.gelatina
AG/T
+ (48h)
AG/T
+ (48/72h)
AG/CS
-*
AG/CS
AG/CS
AG/CS
AG/CS
-*
A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; = negativa; (+) = fraco; = motilidade fraca; * = hidrlise lenta da gelatina
6. RESULTADOS
6.1 Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutores presentes
na amostra:
Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias
negras contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado, conforme
recomendaes constantes do Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste
Manual.
6.2 Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium
perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes Gram
positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentao
tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 2h, da rafinose em
at 72 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 2h.
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes, de acordo
com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological
Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.
LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances
Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos;
gar Baird-Parker - base;
gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse, com verde de metila;
gar estoque;
Caldo crebro-corao (BHI);
Soluo salina peptonada 0,1%;
Soluo salina 0,85%;
Emulso de gema de ovo a 50%;
Telurito de potssio 3,5%;
Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;
Perxido de hidrognio 3%;
Etanol 70% ou Etanol 70 GL;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g da amostra de acordo com as
instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de
amostras, deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Essa a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo
com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.
Inocular, sobre a superfcie seca do gar Baird-Parker, 0,1 mL de cada diluio
selecionada.
Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo
cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro.
Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio.
Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em
duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos
lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10o), o que corresponder
diluio 10-1.
5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 30 a 48 horas.
5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colnias.
Contar as colnias tpicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo
claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio.
Contar tambm colnias atpicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com
ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para
uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.
Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.
A no formao de borbulhas indica prova negativa para
catalase.
A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.
O Staphylococcus aureus catalase positiva.
6. RESULTADOS
Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias selecionadas e
repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em considerao a diluio
utilizada.
Quando o nmero de colnias confirmadas for diferente do nmero de colnias
selecionadas e repicadas, calcular a proporo de colnias positivas de acordo com o Anexo IV,
Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual.
O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas confirmadas.
Expressar o resultado como:
Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC/ g ou mL
ou
Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x10y UFC/ g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BENNETT, R.W.; LANCETTE, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical
Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov
BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de
identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/
Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso
de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de
Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p.
GUNN, B.A.Culture Media, Tests, and Reagents in Bacteriology. In: Clinical and
Pathogenic Microbiology, Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all(Eds.). 2 ed. Mosby. St.
Louis, 1994, p. 863-912.
HOWARD. B. J.; KLOOS, W.E. Staphylococci. In: Clinical and Pathogenic Microbiology,
Howard, B.J.; Keiser, J.F.; Smith, T.F. et all (Eds.). 2 ed. Mosby. St. Louis, 1994, p.243-256.
LANCETTE, G. A.; TATINI, S.R. Staphylococcus aureus. In: Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health
Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. P.387-403.
MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia
clinica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, p. 39-49 e 50-60.
MAC FADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott
Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p.
PAHO. Organizacin Panamericana de la Salud. Contaminacin microbiana de los
alimentos vendidos en la va pblica en ciudades de Amrica Latina y caractersticas socioeconomicas de sus vendedores y consumidores. Almeida, C.R.; Schuch, D.M.T.; Gelli, D.S. et al.
(Eds.). 1996, 176p.
SALYERS, A.A; WHITT, D.D. Disease Without Colonization; Food-Borne Toxinoses
caused by Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, and Clostridium perfringens. In:
7. BIBLIOGRAFIA C ONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de
identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/
Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso
de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de
Produtos de Origem Animal; n.2, 1997, 77p.
ICMSF. Microorganismos de los Alimentos - Tcnicas de Anlisis Microbiolgico.
International Commission on Microbiological Specifications for Foods. V.1. 2. ed. Acribia,
Zaragoza, Espanha.
HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia
coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em:
http://www.cfsan.fda.gov.
KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as
Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes &
Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.
CAPTULO VII
CONTAGEM DE Bacillus cereus
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Bacillus cereus.
Aplica-se a matrias primas e alimentos.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste
em gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus (PEMBA).
Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da produo
de lecitinase pelo B.cereus .
No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sdio
evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio.
A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a flora
acompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado no alimento,
poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/mL) como agente seletivo.
Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus . No MYP, o
indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol.
2.2 Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se na
verificao de produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na capacidade de
decomposio da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do tipo de crescimento em
superfcie de gar nutriente, e da no produo de corpsculos de incluso cristalina.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos; Soluo salina peptonada 0,1%;
gar nutriente;
gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus (PEMBA);
gar estoque;
gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado;
gar tirosina;
gar motilidade - nitrato;
cido sulfanlico soluo 0,8%;
Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5%;
Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/mL;
Emulso de gema de ovo 50%;
Sangue de carneiro desfibrinado;
cido actico 5N;
Zinco em P;
Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia
de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra
de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e
descarte de amostras, deste Manual.
Adicionar 225 mL da soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Esta a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Inoculao
A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas conforme o Anexo II,
Diluies e solues, deste Manual.
Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP ou gar PEMBA 0,1 mL de cada diluio
selecionada.
Com auxilio de ala de Drigalski ou basto tipo hockey, espalhar o inculo
cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro.
Utilizar, no mnimo, duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio.
Nos casos em que for necessria a obteno de resultado menor que 100 UFC/g ou mL
distribuir 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL).
No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra.
5.4 Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 1C por 30 a 48 horas.
5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.
Contar as colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no
gar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com cerca de 5 mm de dimetro e rodeadas
por halo de precipitao de lecitina hidrolizada, no gar PEMBA.
Bacillus
mycoides
Bacillus
anthracis
Colorao de +
+a
+
+
+
Gram
Catalase
+
+
+
+
+
Motilidade
-c
d
Reduo
de +
+
+
nitrato
Hemlise em +
+
+
-d
sangue
de
carneiro
Decomp.
da
+
+
-d
tirosina
Corpsc.de
+
incluso
cristalina
Crescimento
+
rizide
a: 90 a 100% so positivos
b: 50 a 90% so positivos
c: 90 a 100% so negativos
d: a maioria negativa
6.RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra
em anlise seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de
colnias, deste Manual.
Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas, nas
provas confirmativas, pelo fator de diluio usado, conforme recomendaes constantes no
Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos tcnicos de
identidade e qualidade de leite e produtos lcteos. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/
Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal/ Diviso
de Normas Tcnicas. Braslia, D.F. Srie Regulamentao Tcnica de Identidade e Qualidade de
Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p.
BENNETT, R.W.and BEHY, N. . Bacillus cereus . In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.). 4.ed.
Washington DC: American Public Health Association, 2001, p.311-316
MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia
clnica. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana S.A. 1980, 275p.
RHODEHAMEL, E.J. and HARMON, S.M. Bacillus cereus. In: Bacteriological Analytical
Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov.
CAPTULO VIII
CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Enterobactrias.
Aplica-se a amostras de produtos de origem animal.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras testadas
em gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composio evidencia a
habilidade dos microrganismos fermentarem a glicose com produo de cido, reao indicada
por uma viragem do indicador a vermelho e a precipitao de sais biliares ao redor das colnias.
A seletividade exercida pela presena de cristal violeta e bile no meio.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos;
gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG);
gar estoque;
Soluo salina peptonada 0,1%;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase;
Reativos para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos, obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra
de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e
descarte de amostras, deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Esta a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Inoculao: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em
soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua de acordo com as instrues
contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste
Manual.
No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga, deixar
descongelar no prprio frasco, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo
descongelamento.
Antes do incio da anlise, homogeneizar bem.
Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a amostra dentro de outro
saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sob refrigerao, pelo perodo
necessrio para seu completo descongelamento.
Aps descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo da
amostra, o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse caso, no
analisar a amostra.
Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em
descongelamento devero ser descartadas.
Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidncias de que no continha
perfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder anlise, seguindo o
procedimento estabelecido para amostras de gua.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Prova presuntiva
5.3.1 Inoculao: Inocular volumes de 10 mL da amostra a ser analisada em uma srie de
3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla.
Inocular volumes de 1 mL da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril
sulfato de sdio em concentrao simples e volumes de 1 mL da diluio 10-1 na terceira srie de
3 tubos contendo o mesmo meio.
Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies, proceder de acordo
com as instrues contidas no Anexo II, "Diluies e solues", deste Manual. Neste caso,
inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies efetuadas em sries de 3 tubos contendo
caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.
Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL, usar sries de 5 tubos.
Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL, usar sries de 10 tubos.
5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas.
5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de
Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente.
Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos
os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados
por mais 24 horas.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinao do Nmero Mais Provvel de coliformes
totais e termotolerantes em alimentos.
Aplica-se a amostras de matrias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o
limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio,
em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durhan,
produzido pela fermentao da lactose contida no meio.
O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos
que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se
deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na
membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.
2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmao da presena de coliformes
totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose em caldo
verde brilhante bile lactose 2% e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de
Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio.
O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composio, bile bovina e um
corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos
microrganismos Gram positivos.
2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de
coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em
temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A
presena de gs nos tubos de Durhan evidencia a fermentao da lactose presente no meio.
O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um
poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de
sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos;
Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples;
Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla;
Caldo verde brilhante bile lactose 2%;
Caldo EC;
Soluo salina peptonada 0,1%.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao)
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra
5.1.1 Produtos slidos e pastosos: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de
prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose.
5.4.1.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas.
5.4.1.3 Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs
(mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado gentilmente.
Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os
resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por
mais 24 horas.
5.4.2 Coliformes Termotolerantes
5.4.2.1 Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio, obtido na
prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC.
5.4.2.2 Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com
agitao ou circulao de gua.
5.4.2.3 Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de
gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescncia quando agitado
gentilmente.
Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada.
Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os
resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por
mais 24 horas.
6. RESULTADOS
A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram
resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes
termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel de acordo com o Anexo III, "Procedimentos
bsicos de contagem, deste Manual.
Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico.
Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia
coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em:
http:// www.cfsan.fda.gov.
KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as
Quality and Safety Indicators. In Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes &
Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.
CAPTULO XI
NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de Staphylococcus aureus em
alimentos.
Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitao determinados pela
legislao encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Determinao do NMP: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras
sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com
sal 10%- piruvato de sdio 1% (TSB-NP), com posterior confirmao em gar Baird-Parker.
No caldo TSB-NP, a alta concentrao de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o
crescimento de microbiota acompanhante que no apresente capacidade de se desenvolver
nesta condio.
O Staphylococcus aureus reduz, anaerbia e aerobiamente, o telurito de potssio,
produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colnias negras no gar BairdParker.
O gar Baird-Parker, enriquecido com soluo de gema de ovo, possibilita a evidenciao
das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do
aparecimento de um halo de precipitao e um de transparncia ao redor da colnia.
Prova da coagulase
Baseia-se na comprovao da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de
coelho pela ao da enzima coagulase.
2.3 Provas complementares
2.3.1 Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e
tintoriais do microrganismo.
2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos
pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo.
A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de
toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila.
2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o
perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de
borbulhas.
2.4 Limitaes do Mtodo: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere
aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao
fato de algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S.
hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas.
Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca
reao na prova da coagulase. Alm disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de
termonuclease positiva.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos;
gar Baird-Parker-base;
gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse com verde de metila;
gar estoque;
Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sdio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol
glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC);
Caldo crebro-corao (BHI);
Soluo salina peptonada 0,1%;
Soluo salina 0,85%;
isoladas.
A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvao, com auxlio de ala de
platina ou nquel-cromo, repicar sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker.
Incubar a 36 1C por 30 a 48 horas.
Selecionar de 2 a 3 colnias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitao e/ou
rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cada
colnia para um tubo contendo caldo BHI.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase.
5.5.1 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos
estreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho.
Incubar a 36 1C, por 6 horas.
Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:
Reao negativa: no formao de cogulo;
Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado;
Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado;
Reao 3+ : cogulo grande e organizado;
Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo que no se desprender quando o
tubo for invertido;
Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para
Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova
negativa para Staphylococcus aureus;
Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um
tubo contendo gar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas para a realizao dos
testes complementares.
5.6 Testes complementares: A partir da cultura pura em caldo BHI ou gar estoque,
realizar as seguintes provas confirmativas:
5.6.1 Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram.
A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A
presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes
complementares.
5.6.2 Pesquisa da termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes, com cerca de 2 mm de
dimetro, no gar para ensaio da termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas
previamente preparadas.
Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15
minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado.
Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas.
O aparecimento de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no
gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para
termonuclease.
Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1
mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva.
5.6.3 Prova da catalase
Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur,
estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de
vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.
Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.
L-lisina;
Manitol;
Sacarose;
leo mineral ou parafina lquida estreis;
Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametilparafenileno-diamina);
Teepol;
O-nitrofenil--D-galactopiranosdeo ou p-nitrofenil--D-galactosdeo;
Etanol 96%;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instrues contidas no
Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher.
Esta a diluio 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Provas presuntivas
5.3.1 Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10-1),
efetuar as demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas
diluies) de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste
Manual.
Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos
contendo GSTB ou caldo HAEB.
5.3.2 Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 18 horas a 24 horas.
5.3.3 Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio
parahaemolyticus.
Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao.
5.3.4 Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS)
5.3.4.1 Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvao, sem
agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma
alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citrato
sacarose sais biliares (TCBS).
5.3.4.2 Incubao: Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas.
5.3.4.3 Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul
esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus.
Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem.
5.4 Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus
De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para
tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.
concentrao de 150g.
Incubar as placas a 36 1C por 24 horas.
O Vibrio parahaemolyticus resistente concentrao de 10g de agente vibriosttico
O/129 enquanto o V. vulnificus sensvel.
Todos os vbrios so sensveis concentrao de 150g do agente O/129.
6. RESULTADOS
Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus
as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao:
Motilidade - positiva
Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo
Descarboxilao da lisina - positivo
Hidrlise da arginina - negativo
Crescimento a 42C - positivo
Fermentao do manitol - positivo
Fermentao da arabinose - positivo
Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 - 10g - resistente
Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 - 150g - sensvel
gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo
Halofilismo (6% sal) - positivo
Halofilismo (8% sal) - positivo
Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto
A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero
Mais Provvel de acordo com o Anexo III, Procedimentos Bsicos de Contagem, deste Manual.
Expressar o valor obtido em NMP/g.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V
parahaemolyticus, V. vulnificus and Others vbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online.
2001. Disponvel em: http: www.cfsan.fda.gov.
MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed. Lippincott
Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169.
CAPTULO XIII
NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS
MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR
ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS UHT E ESTERILIZADOS,
PASTOSOS E VISCOSOS
1.OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinao do NMP de microrganismos mesfilos
aerbios viveis, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadores
de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas em produtos lcteos pastosos e viscosos.
Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais
microrganismos mesfilos aerbios viveis.
Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos tratados
pelo processo UHT e produtos esterilizados.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias
e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto.
2.2 Determinao do NMP: Baseia-se na semeadura de diluies seriadas da amostra em
tubos contendo caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE), seguida de
incubao a 30 1C por 72 horas, com posterior repique em gar crebro-corao (BHI) e gar
nutriente isento de extrato de levedura e a subseqente identificao da flora presente.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos;
gar crebro-corao (ABHI);
gar nutriente isento de extrato de levedura;
gar esculina;
gar uria;
Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3);
Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE);
Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentrao dupla (BHISE2);
Caldo vermelho de fenol com glicose;
Soluo salina peptonada 0,1%;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-aminodimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Perxido de hidrognio 3%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
cido sulfanlico 0,8%;
Zinco em p;
Etanol 70% ou Etanol 70 GL;
Reagentes para colorao de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Aps pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem
ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com
soluo desinfetante e posteriormente com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar.
Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas
no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.
Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%.
A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas de acordo com o Anexo II,
Diluies e solues, deste Manual.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
abaixo descrito.
5.8 Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico
descartveis, estreis, realizar a prova da oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro
impregnado com o reativo ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente
disponveis.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso positivas podem
ocorrer.
O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso
(oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva.
No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de
oxidase pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso positiva.
O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva.
5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e
incubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h.
O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose.
5.10 Hidrlise da esculinaInocular a cultura, com agulha, em tubos contendo agar
esculina inclinado.
Incubar a 36 1C por at 72 horas.
A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio.
O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.
5.11 Fermentao da glicose: Semear tubos de caldo vermelho de fenol-base adicionados
de glicose.
Incubar a 36 1C por at 72 horas.
A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do
acar presente.
O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose.
5.12 Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3.
Incubar a 36 1C por 72 horas.
Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de
cido sulfanlico 0,8%.
O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato.
Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas
de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa
enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade.
O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato nitrito.
5.13 Prova da urease: Inocular com ala a superfcie de placas ou tubos com agar uria
previamente preparadas.
Incubar a 36 1C por at 72 horas.
Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica
positividade para produo de urease.
O Bacillus sporothermodurans no produz urease.
6. RESULTADOS
Considerar positivos os tubos que apresentaram crescimento de outras bactrias
diferentes do Bacillus sporothermodurans e considerar como negativo quando no for observado
crescimento de colnias nas placas e quando o crescimento observado for confirmado como
sendo somente de Bacillus sporothermodurans.
A partir dos resultados obtidos, consultando a tabela de NMP apropriada e seguindo as
instrues contidas no Anexo III, Procedimentos bsicos de contagem, deste Manual, calcular o
nmero mais provvel de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na amostra em
anlise.
Quando for confirmada a presena de Bacillus sporothermodurans juntamente com outros
mesfilos na amostra, devero ser excludos os tubos que continham apenas Bacillus
sporothermodurans para o clculo final do NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis.
Quando for observada somente a presena de colnias de Bacillus sporothermodurans na
amostra, reportar o resultado de mesfilos aerbios viveis como <0,3 NMP/mL. Sempre que for
observada a presena de Bacillus sporothermodurans, fazer constar no Certificado Oficial de
Anlise (COA), no campo OBS., a expresso: Presena de Bacillus sporothermodurans.
Devero ainda acompanhar o resultado de anlise informaes adicionais sobre o tipo de
microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram
negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quando
identificado(s).
Os resultados da anlise de NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis a 30C
por 72 horas em produtos lcteos UHT e esterilizados, pastosos e viscosos, devem ser
expressos em: NMP/g.
O resultado da anlise de pr-incubao a 36C por 7 dias deve ser expresso como
alterado ou sem alterao.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de
Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para
alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p.
PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus
sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International
Journal of Systematic Bacteriology, 1996. P. 759-764.
MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances
Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.
CAPTULO XIV
PESQUISA DE Listeria monocytogenes
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer mtodo analtico para a deteco de Listeria monocytogenes em alimentos de
origem animal.
A metodologia aplica-se a todos os alimentos crneos e lcteos.
2. FUNDAMENTOS
5.4 Segundo enriquecimento seletivo.: Aps a incubao, transferir 0,1 mL da cultura para
tubo contendo 10mL de caldo Fraser suplementando-o, se necessrio, com 0,1 mL do vial diludo
conforme a indicao do fabricante.
OBS:Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio j pronto para o uso; outros fornecem o
meio adicionado de cido nalidxico e de acriflavina, bastando a suplementao com citrato de
amnio e ferro III (0,1 mL de soluo a 5% equivalente a 250 mg/0,5L de meio).
Incubar a 30 1C por 24 a 48 horas.
5.5 Isolamento
5.5.1 Amostras de produtos crneos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro,
repicar do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP suplementado, sendo
que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a proporcionar a obteno de
colnias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS em paralelo com os meios ATN e AP.
Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP e ATNS, na mesma
temperatura, por 24 a 48 horas.
5.5.2 Amostras de produtos lcteos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro,
repicar do caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas contendo AP
suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a
proporcionar a obteno de colnias isoladas.
Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP na mesma
temperatura, por 24 a 48 horas.
5.6 Seleo; Com auxlio de lupa ou estereoscpio com iluminao angular de 45,
selecionar 3 a 5 colnias de cor azulada ou azulacinzentada em ATN.
Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal,
colnias pretas rodeadas por halo escuro em AO.
Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal,
colnias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colnias verde-acinzentadas, em AP.
5.7 Confirmao da presena de Listeria sp: Repicar o mesmo inculo para tubos com
gar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 1C por 24 horas.
Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do gar estoque para a
realizao das provas de confirmao e identificao.
5.7.1 Prova da catalase
Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de perxido de hidrognio 3%. Com auxlio de
ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, retirar uma alquota do
cultivo e misturar com a gota do reagente. A presena de catalase se traduz por desprendimento
de borbulhas de oxignio (catalase positiva). Das culturas catalase positivas, fazer um esfregao
para colorao de Gram.
5.7.2 Colorao de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou na forma de
cocobacilo, Gram positivo.
5.7.3 Prova da motilidade tpica: Inocular uma alquota da cultura em gar motilidade, com
agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biolgica de Oxignio) a 22-25C por
2 a 5 dias. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento.
A Listeria sp apresenta crescimento mvel caracterstico em forma de guarda-chuva.
5.7.4 Prova de Reduo de Nitrato: Aps a leitura da motilidade, adicionar a cada tubo 2 a
ivanovii com R. equi se caracteriza por ser mais intensa e se apresentar em forma de flecha. As
L. innocua, L. welshimeri e L. grayi so no-hemolticas e no apresentam reao de CAMP
positiva com o S. aureus nem com o R. equi.
O CAMP teste diferencia L. ivanovii de L. seeligeri e pode diferenciar uma L. seeligeri,
fracamente hemoltica, de L. welshimeri. Isolados que do reaes tpicas para L.
monocytogenes, exceto para a produo de hemolisina, devem ser testadas para CAMP antes de
serem identificadas como L. innocua (no hemoltica).
A maioria dos isolados de L. monocytogenes produz tambm uma zona de intensificao
da hemlise junto linha de crescimento do R. equi.
5.8.3 Fermentao de carbohidratos: Inocular 3 tubos com caldo vermelho de fenol-base,
adicionados respectivamente, de xilose, manitol e ramnose.
Incubar a 30 1C por 36 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para
amarelo indica a fermentao do acar presente. Alternativamente, esta prova pode ser
realizada inoculando as culturas com agulha (em apenas um ponto) em 3 placas de gar para
fermentao de carbohidratos adicionado de xilose, manitol e ramnose, respectivamente. A
viragem de cor do indicador prpura de bromocresol (azul) para amarelo indica a fermentao do
acar presente.
As reaes tpicas das diversas Listeria sp esto representadas no quadro abaixo:
-hemlise
Red-NO3
CAMP Teste-SA
CAMP Teste-RE
Manitol
Ramnose
Xilose
VM
Gram
LM
+
+
V
+
+
+
LIVA
+
+
+
+
+
LINN
V
+
+
LW
V
+
+
+
LS
+
+
+
+
+
LG
+
+
+
5.7.1.2 Reaes em gar TSI ou gar Kligler (KIA): Inocular o gar atravs de picada
profunda e estriamento na superfcie inclinada do bisel.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
No gar TSI, esto presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose (10,0 g/L).
Como a glicose um monossacardeo e est em baixa concentrao, ser rapidamente
fermentada anaerobiamente, formando cido no fundo do tubo, o que torna o meio amarelo pela
viragem do indicador vermelho de fenol (todos os membros da famlia Enterobacteriaceae
fermentam a glicose com produo de cido).
A fermentao aerbia da glicose, que ocorre na superfcie do bisel, resulta em cido
pirvico, que posteriormente degradado a CO2 e gua.
A grande maioria das salmonelas no fermenta a sacarose e a lactose, no provocando
alteraes no meio TSI (que contm esses dois acares; j no KIA, a sacarose no est
presente). Como a fonte de carbono utilizvel (glicose) rapidamente esgotada, a Salmonella
passa a degradar aerobiamente o substrato protico do meio, produzindo amonaco (NH3), o que
confere ao meio um pH alcalino, modificando a colorao do bisel para rosa intenso.
A maioria das salmonelas apresenta no TSI e no KIA as seguintes reaes:
cido na base, com ou sem produo de gs.
Alcalino ou inalterado no bisel.
Com produo de H2S.
5.7.1.3 Descarboxilao da lisina: Utilizar caldo lisina ou gar LIA.
Inocular o caldo lisina e adicionar selo estril (vaspar, vaselina, parafina), visando evitar o
contato do meio com o ar e o conseqente aparecimento de uma falsa alcalinizao na superfcie
do meio por degradao aerbia do substrato protico.
Quando usar o gar, inocular atravs de picada profunda, estriando na superfcie inclinada
do bisel.
Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas.
Observar se ocorreu descarboxilao da lisina pela alcalinizao do meio, o que
demonstrado pela no alterao de cor do indicador presente.
A atividade da enzima lisina descarboxilase dependente do pH, sendo mais ativa em pH
abaixo de 5,5.
A acidificao do meio obtida pela fermentao da glicose presente. Nessa etapa do
processo, ocorre a viragem do indicador prpura de bromocresol, de violeta para amarelo.
recomendvel a inoculao de um tubo controle de caldo base para descarboxilao
sem lisina, para comprovao da acidificao pela fermentao da glicose. Esse tubo deve
permanecer amarelo at o final do perodo de incubao.
Na condio anaerbia, obtida pelo uso da camada de selo (no caldo lisina) ou na base
(do LIA), todo o oxignio no combinado consumido pelo microrganismo presente, na fase
inicial de crescimento.
A descarboxilao da lisina, que ocorre posteriormente, resulta na produo de uma
diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio caractersticas de alcalinidade e nova
viragem da cor do indicador, que passa de amarelo para violeta. A diamina cadaverina estvel
quando produzida em condies anaerbias.
A maioria das salmonelas capaz de produzir lisina descarboxilase.
Quatro por cento das cepas de Salmonella no descarboxilam a lisina.
A Salmonella paratyphi A e alguns outros sorovares no produzem lisina descarboxilase.
5.7.1.4 Meio SIM: Inocular com picada o meio de cultura.
Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas.
A motilidade caracterizada pela difuso do crescimento por todo o meio. Se for restrito
linha de semeadura, indica que o microrganismo imvel.
A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva. A Salmonella Gallinarum e a
Salmonella Pullorum apresentam motilidade negativa.
O meio SIM o meio mais indicado para a verificao da produo de H2S.
O H2S um gs incolor produzido pelo microrganismo em teste, pela reduo do tiosulfato
presente no meio. A revelao da presena de H2S se realiza por meio da reao do H2S com o
citrato de ferro e amnio (presente no meio), formando um precipitado negro insolvel.
Quinze por cento das culturas de Salmonella Choleraesuis e 95% das de Salmonella
Paratyphi A no produzem H2S.
A maioria das salmonelas produz H2S .
Quatorze por cento das cepas de Salmonella so H2S negativo.
Aps a leitura da motilidade e da produo de H2S, adicionar algumas gotas de reativo de
Kovacs (ou, opcionalmente de reativo de Ehrlich) aos tubos para verificar se houve produo de
indol.
A oxidao do triptofano presente no meio SIM leva formao de trs principais
compostos: indol, escatol e indolacetato.
A adio do reativo de Kovacs resulta na formao de um anel vermelho, resultante da
reao entre o indol e o dimetilaminobenzaldedo contido nesse reativo.
Quase a totalidade das salmonelas no produz indol. Segundo Weissfeld et al (1994),
cerca de 1% das salmonelas produzem indol.
5.7.1.5 Prova da Oxidase: Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas
Pasteur, estreis, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre
papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de
Oxidase, disponveis comercialmente.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, podem ocorrer reaes falsopositivas.
O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso
(oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva.
No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois
traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva.
Todas as salmonelas apresentam reao de oxidase negativa.
5.7.2 Provas bioqumicas complementares opcionais
5.7.2.1 Desaminao da fenilalanina
Inocular a superfcie do gar fenilalanina por estriamento.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
Adicionar 2 a 3 gotas de soluo de cloreto frrico 10%.
A alterao da colorao da cultura na superfcie do bisel para verde indica reao de
desaminao da fenilalanina. Salmonella no desamina a fenilalanina.
5.7.2.2 Reao de Voges-Proskauer
Inocular o caldo VM-VP em duplicata.
Incubar um dos tubos a 36 1C por, pelo menos, 24 horas.
O outro tubo deve ser incubado a 22 1C, por 96 horas.
Adicionar primeiramente 0,6 mL de soluo de -naphtol 5% e, em seguida, 0,2 mL de
soluo de hidrxido de potssio 40%.
Agitar os tubos para que haja oxigenao do meio.
Aguardar de 10 a 15 minutos.
base (amarela), sem produo de gs (sem bolhas) nem de H2S (sem enegrecimento). Por no
metabolizar a lactose, produz uma alcalinizao no bisel (vermelho).
5.6.3 Fermentao da sacarose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%,
com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de
fenol-sacarose.
Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho
para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido.
O Vibrio cholerae fermenta a sacarose.
5.6.4 Descarboxilao da lisina: A partir do inculo mantido em caldo peptonado sal 3%,
com auxlio de ala de nquel-cromo, inocular um tubo contendo caldo lisina.
Inocular tambm um tubo de meio base (sem lisina), que servir de controle para a
produo de cido a partir da glicose contida no meio.
Cobrir os tubos com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo lisina, no inoculado
e coberto por leo, que servir de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao
da glicose e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido
produo de aminas primrias e dixido de carbono.
O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio cholerae descarboxila a lisina.
5.6.5 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que
apresentarem as caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio de provas
adicionais.
Kligler - Bisel vermelho (alcalino)
Kligler - Base amarela sem gs (cida)
Kligler - Sem enegrecimento (H2S negativo)
Sacarose - Positiva
Lisina descarboxilase - Positiva
Caldo peptonado sem sal - Crescimento
Caldo peptonado sal 3% - Crescimento
Caldo peptonado sal 6% - Sem crescimento
5.7 Provas adicionais para a identificao do Vibrio cholerae
5.7.1 Prova de Hugh-Leifson glicose (Meio O/F): A partir do inculo mantido em T1N1,
com auxlio de agulha de nquel-cromo ou de platina, inocular dois tubos contendo meio de HughLeifson glicose.
Cobrir um dos tubos com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas.
Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo
e a presena de gs nos tubos de Durhan.
A cor amarela em ambos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela
somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose.
O Vibrio cholerae fermenta a glicose sem produo de gs, por isto ambos os tubos
devem apresentar colorao amarela, sem gs.
5.7.2 Prova da fermentao do manitol: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal
3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo
vermelho de fenol manitol.
Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho
para amarelo, o que indica a fermentao do manitol.
O Vibrio cholerae fermenta o manitol.
5.7.3 Prova da fermentao da arabinose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado
sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo
vermelho de fenol arabinose.
Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho
para amarelo, o que indica a fermentao da arabinose.
O Vibrio cholerae no fermenta a arabinose, portanto o meio deve permanecer vermelho.
5.7.4 Prova da fermentao da manose: A partir da cultura mantida em caldo peptonado
sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, inocular um tubo
contendo caldo vermelho de fenol manose.
Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho
para amarelo, o que indica a fermentao da manose.
O Vibrio cholerae fermenta a manose.
5.7.5 Prova da fermentao do inositol: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal
3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo
vermelho de fenol inositol.
Cobrir o meio com 1 a 2 mL de leo mineral, ou vaselina
lquida, estril.
Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho
para amarelo, o que indica a fermentao do inositol.
O Vibrio cholerae no fermenta o inositol, portanto o meio deve permanecer vermelho.
5.7.6 Prova da descarboxilao da ornitina: A partir da cultura mantida em caldo
peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo
caldo ornitina.
Semear tambm um tubo de meio base (sem ornitina) para controle.
Cobrir os tubos com 1 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo ornitina no
inoculado e com leo, que servir de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao
da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da ornitina, o meio retorna cor prpura devido
produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar
para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio cholerae descarboxila a ornitina.
5.7.7 Prova da hidrlise da arginina: A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal
3%, com auxlio de ala de nquel-cromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo arginina.
Semear tambm um tubo de meio base (sem arginina) para controle.
Cobrir os tubos com 1 mL de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina no
inoculado e leo, que servir de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao
da glicose e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna cor prpura devido produo
de aminas primrias e dixido de carbono.
O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio cholerae no hidrolisa a arginina, portanto ambos os tubos devem permanecer
amarelos.
5.7.8 Leitura: Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que
apresentarem as caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio do teste
sorolgico.
Hugh-Leifson (Meio O/F) glicose - Fermentativo
Fermentao do manitol - Positivo
Fermentao da arabinose - Negativo
Fermentao da manose - Positivo
Fermentao do inositol - Negativo
Descarboxilao da ornitina - Positivo
Hidrlise da arginina - Negativo
5.8 Teste sorolgico: Marcar duas sees de aproximadamente 1 x 2 cm no interior de
uma placa de Petri ou em uma lmina de vidro de 2 x 3 polegadas ou em uma placa Huddleson.
Colocar uma pequena quantidade da cultura, crescida em gar T1N1 inclinado,
diretamente sobre a placa ou lmina, na regio marcada.
Adicionar uma gota de soluo salina 0,85% na parte inferior de cada uma das regies
marcadas. Com auxlio de uma ala ou agulha de nquel-cromo ou de platina, suspender a
cultura com soluo salina em cada seo.
Adicionar uma gota do anti-soro polivalente de Vibrio cholerae a uma das sees com a
suspenso da cultura e misturar com a ala. A outra seo contendo antgeno somente um
controle de autoaglutinao.
Observar a reao em 1 minuto contra um fundo escuro.
Uma reao positiva indicada por uma aglutinao rpida e forte.
Enviar as culturas que se comportem como Vibrio cholerae, em gar estoque, para
tipificao Instituio de Referncia designada pela CLA.
6. RESULTADO
Sero consideradas como positivas para Vibrio cholerae as culturas que apresentarem os
resultados esperados tanto nas provas adicionais de identificao quanto no teste sorolgico.
Expressar o resultado como:
Pesquisa de Vibrio cholerae: Presena/25g ou mL; ou
Pesquisa de Vibrio cholerae: Ausncia/25g ou mL
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ICMSF. International Commission
on
Microbiological
Specifications
for
Foods.
Soluo salina peptonada tamponada com vancomicina, cefsulodin e cefixime (SPT VCC);
Caldo verde brilhante-bile-lactose 2% - metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG);
Caldo verde brilhante-bile-lactose 2%;
Caldo vermelho de fenol-base;
Caldo soja triptona;
Caldo EC modificado com novobiocina (Caldo EC + n);
Soluo salina tamponada pH 7,2;
Soluo salina tamponada 1% adicionada de 0,02% de tween 20;
Soluo salina 0,85%;
Soluo salina peptonada 0,1%;
Meio SIM;
Soluo aquosa de Vancomicina 0,8%;
Soluo aquosa de Cefsulodin 1%;
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios para laboratrios de microbiologia; Cmara UV (366
nm);
Misturador de Amostras;
Separador Imunomagntico;
Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000L) e ponteiras
correspondentes, com barreira.
5.PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar assepticamente 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2
mL de amostra em sacos de stomacher ou frascos Erlenmeyer estreis, seguindo as
orientaes contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos
estabelecidos pelo laboratrio.
5.3 Pr-enriquecimento: A cada alquota adicionar 225 mL de SPT-VCC e incubar por 6
horas a 36 1C.
5.4 Separao imunomagntica: Aps as 6 horas de incubao, de cada amostra prenriquecida, transferir 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada.
Adicionar a cada eppendorf 20 L de beads 280nm cobertas com anticorpo policlonal
antiEscherichia coli O157.
Aps homogeneizao, por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos no
equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos em baixa velocidade.
Em seguida, colocar os tubos no separador com suporte magntico j acoplado, onde
devem permanecer por 5 minutos.
Sem retirar os tubos do separador magntico, extrair todo o lquido dos tubos eppendorf,
com o auxlio de pipetas Pasteur ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado para
no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas.
Descartar o lquido em recipiente com desinfetante.
Retirar o suporte magntico do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de soluo salina
primeira, misturar uma gota do ltex reagente e sobre a outra uma gota do ltex
controle. Misturar por um minuto e observar aglutinao.
Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos, apresentarem
aglutinao apenas no ltex reagente. Para os controles positivo e negativo, utilizar os controles
que acompanham o kit.
As culturas que apresentarem resultado negativo no teste de aglutinao de ltex devem
ser descartadas.
5.8 Testes adicionais
5.8.1 Verificao da motilidade das culturas suspeitas.: A partir das culturas puras, em
gar estoque inclinado, que apresentarem reao positiva frente ao ltex reagente e negativa
frente ao ltex controle, repicar para tubos contendo gar motilidade modificado, utilizando
agulha de inoculao.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Observar o tipo de crescimento: difuso (motilidade
positiva) ou apenas na linha de inoculao (motilidade negativa).
As cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam motilidade positiva, enquanto que a
E.coli ATCC 25922 apresenta motilidade negativa.
5.8.2 Verificao da produo de -D-glicuronidase e de gs em caldo BRILA-MUG.
A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos com caldo verde
brilhante bile-lactose-metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG), com tubos de Durhan invertidos.
Incubar a 36 1C por 24 a 48 horas.
Observar a produo de gs nos tubos de Durhan. Anotar os resultados.
Em cmara de UV (366nm), verificar a formao de 4-metilumbeliferona a partir do MUG.
Considerar como positivo para -Dglicuronidase as culturas que produzirem fluorescncia no
meio de cultura.
A Escherichia coli O157:H7 no produz -D-glicuronidase, portanto no se observa
fluorescncia no caldo BRILA-MUG.
A Escherichia coli ATCC 25922 produz fluorescncia (reao positiva) neste meio.
OBS: A cultura de E.coli O157:H7 ATCC 43888 (no toxignica) no produz gs no caldo verde
brilhante lactose 2%, enquanto que as E.coli O157:H7 verotoxignicas ATCC 43889, ATCC
43890 e ATCC 43894 so capazes de produzir gs neste meio.
5.8.3 Verificao da fermentao do sorbitol, da celobiose e do dulcitol
A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos contendo 3 mL de
caldo vermelho de fenol base adicionado, separadamente, de sorbitol, celobiose e de dulcitol
(esterilizados por filtrao), de forma a obter uma concentrao final do acar de 0,1%.
Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 30 horas. Aps incubao, observar a produo de
cido, evidenciada pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo nas culturas
fermentadoras dos acares presentes.
Os resultados esperados esto na tabela abaixo:
Cultura
Escherichia coli O157:H7
Escherichia hermannii
Escherichia fergusonii
Escherichia coli
Sorbitol
+
Celobiose
+
+
-*
Dulcitol
+
-/+
5.5.1 Prova da Catalase; Com auxlio de uma ala de platina, basto de vidro, palito de
madeira ou pipeta de Pasteur estreis, retirar uma alquota do cultivo, transferir para uma lmina
ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.
Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.
A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase.
A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.
As culturas de Paenibacillus larvae so catalase negativas.
Repicar as colnias catalase negativas para tubos contendo gar leite com tiamina
inclinado e incubar a 36 1C por 24 a 48 h.
Manter essas culturas para testes complementares, caso sejam necessrios.
5.6 Provas Confirmativas: Realizar as provas confirmativas completas em cada uma das
colnias catalase negativas.
5.6.1 Colorao de Gram; Das colnias suspeitas, fazer esfregao e corar pelo mtodo de
Gram.
O P.larvae se apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e fino, porm,
pode se apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento varivel.
As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas devem ser
testadas para:
5.6.2 Crescimento em superfcie de gar nutriente sem extrato de levedura: A partir das
colnias catalase negativas, repicar tambm em tubos com gar nutriente inclinado isento de
extrato de levedura e incubar a 36 1C por 3 dias.
A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em gar nutriente sem
extrato de levedura aps 3 dias.
5.6.3 Decomposio da casena e verificao de crescimento tpico no ALT
A partir das colnias catalase negativas, repicar sobre a superfcie seca de placas com
gar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 1C por 3 dias.
Aps incubao, verificar a presena de halo transparente ao redor das colnias.
O Paenibacillus larvae decompe a casena em at 3 dias.
As colnias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de colorao
entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas).
Diferenciao entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos
relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apcolas.
Microrganismos
Decomposio
da casena
P.larvae subsp. larvae
POS*
POS
Paenibacillus alvei
POS
Brevibacillus laterosporus
P.larvae subsp. Pulvifaciens POS
NEG
Paenibacillus popilliae
NEG
Paenibacillus lentimorbus
Catalase
NEG
POS
POS
NEG
NEG
NEG
6.1 Interpretao
Considerar como P.larvae subsp. larvae as culturas que se apresentarem como
bastonetes Gram positivos finos, mdios a longos, dispostos em cadeias, catalase negativas,
com reao positiva para hidrlise da casena associada ao crescimento tpico no ALT, e com
crescimento escasso no gar nutriente sem extrato de levedura em 3 dias.
6.2 Expresso do Resultado
Expressar o resultado das anlises de mel como:
Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Presena /20 mL de mel; ou
Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Ausncia /20 mL de mel.
Para outros produtos da colmia expressar o resultado como:
Presena (ou Ausncia) / quantidade de amostra submetida anlise.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
SCHUCH, D.M.T.; MADDEN, R.H.; SATTLER, A. 2001. An improved method for the
detection and presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey J.
Apicult. Res., 40(2): 59-64.
GOCHNAWER, T. A., CORNER, J. 1974. Detection and identification Bacullis larvae in a
commercial pollen samples. J. Apicult. Res. 13: 264-267.
DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial
Nomenclature Up-to-Date - (Approved Lists, Validation Lists).Nov. 2002. Braunschweig,
Germany.Disponvel In: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm
CAPTULO XX
TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS
DE BAIXA ACIDEZ - pH > 4,6
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a verificao da eficcia do processo de esterilizao
aplicado a alimentos de baixa acidez, comercialmente estreis;
Aplica-se a amostras de alimentos comercialmente estreis de baixa acidez (enlatados).
2. FUNDAMENTOS
Pr-incubao:: Baseia-se na incubao das amostras nas temperaturas de 36 1C pelo
perodo de 10 dias e a 55 1C pelo perodo de 5 a 7 dias, objetivando a deteco de
crescimento bacteriano com formao de gs, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na
verificao de possveis microfugas.
2.1 Semeadura e incubao: Baseia-se na utilizao de meios lquidos no seletivos com
capacidade de promover o crescimento de microrganismos por meio da incubao em aerobiose
e anaerobiose, em temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesfilos e
termfilos.
2.2 Provas complementares
2.2.1 Colorao pelo mtodo de Gram e de esporos: Baseia-se na observao
microscpica das caractersticas morfolgicas e tintoriais dos microrganismos presentes e de
seus esporos.
Prova da Catalase
Baseia-se na verificao da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima
catalase, que decompe o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por
meio da formao de borbulhas.
2.2.3 Prova da termofilia estrita: Baseia-se na verificao da germinao e crescimento
dos esporos nas temperaturas de 36 1C e 55 1C para certificao da exigncia absoluta de
elevada temperatura para seu desenvolvimento.
A germinao dos esporos a 36 1C indica a capacidade mesoflica do microrganismo.
O crescimento a 36 1C e a 55 1C indica a capacidade termoflica facultativa do
microrganismo.
O crescimento somente a 55 1C indica a capacidade termoflica estrita do
microrganismo.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de
alimentos;
Equipamentos, vidraria e outros;
Abridores metlicos estreis;
Pinas estreis;
Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi;
Caldo glicose triptona;
gar glicose triptona;
gar nutriente;
gar nutriente com sulfato de mangans;
gar para esporulao;
gar crebro-corao (ABHI);
Corantes para a colorao de esporos;
Corantes para a colorao de Gram;
Perxido de hidrognio 3%;
Vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pr-incubao: Seguir os procedimentos para pr incubao no item 3.1.1 do Anexo V,
Procedimento para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.
Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no
sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a
presena de microfugas ou vazamentos.
Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos
recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a alterao,
quando ocorrer.
5.1.1 Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao: Ao final da princubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado,
evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise de aerbios e
anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da pr-incubao. Proceder
microrganismos.
Sempre que possvel, fazer constar do resultado final as observaes feitas ao
microscpio.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura e do Abastecimento-Secretaria de Defesa Animal Departamento Nacional de Defesa Animal - Coordenao Geral de Laboratrio Animal - Mtodos
de Anlise Microbiolgica para Alimentos - Teste de Esterilidade Comercial Braslia, D.F.
1991/1992 - 2 Reviso, p. 111 - 113.
DEIBEL K. E.; JANTSCHKE, M. Canned Foods - Tests for Commercial Sterility . In: In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC.
American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 577-588.
DENNY C. B; PARKINSON, N.G. Canned Foods - Tests for cause of spoilage . In: In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC.
American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.583-600.
DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial
Nomenclature
Up-to-Date-(Approved
Lists,
Validation
Lists).Nov.2002.Braunschweig,
Germany.Disponvel In:http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm
ANEXO I
PROCEDIMENTOS DE RECEBIMENTO DE AMOSTRAS
1. RECEBIMENTO DAS AMOSTRAS NO LABORATRIO
O setor de recepo far a triagem das amostras enviadas pelo SIF.
Somente sero aceitas, pelo setor de recepo do laboratrio, as amostras lacradas pelo
responsvel pela colheita que vierem acompanhadas de cinta de identificao no produto
(protegida para evitar danificaes) e Certificado Oficial de Anlise (COA) devidamente
preenchido.
1.1 Certificados Oficiais de Anlise: Os COAs devero ser originais, carbonados,
carimbados e assinados pelo responsvel pela colheita. Cabe a este o correto preenchimento (
mo ou mquina), legvel em todas as vias.
O responsvel pela colheita dever preencher os campos 1, 2 e 4 a 16 do certificado.
Sero recusadas as amostras que vierem acompanhadas de fotocpias dos mesmos ou
de Certificado Oficial de Anlise (COA) proveniente de outra instituio.
1.2 Nmero de Protocolo; O setor de recepo de amostras do laboratrio dever registrar
o nmero do protocolo da amostra no laboratrio no campo n 3 do COA.
1.3 Outras verificaes e registros: No recebimento das amostras, devero ser anotadas
informaes referentes data, hora e temperatura de recebimento da amostra.
No campo referente temperatura da amostra no recebimento, dever ser registrada a
condio de resfriamento em que a amostra foi entregue no laboratrio, isto : resfriada,
congelada ou em temperatura ambiente.
Quando houver necessidade de verificao da temperatura com termmetro, dever ser
utilizada uma amostra recebida nas mesmas condies das demais e que ser usada
Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.),
2001. p.13-23.
ANEXO II
DILUIES E SOLUES
1. DILUIES
Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a
concentrao de uma das substncias.
O uso mais comum da palavra diluio ocorre no sentido de que tantas partes de um
material esto sendo diludas em um nmero total de partes do produto final (diluente +
material).
Uma diluio uma expresso de concentrao ou proporo,
no de volume.
Diluio indica a quantidade relativa de substncias em uma soluo.
Em frases de diluio, o menor nmero sempre se refere ao nmero de partes da
substncia que est sendo diluda, enquanto que o maior nmero sempre se refere ao nmero de
partes que constitui a soluo final.
Exemplo:
Frase de Diluio: Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina peptonada.
Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado:
Fazer uma diluio 1 em 10, de leite em soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1 para 10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1/10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1:10, de leite usando soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio de 1 parte de leite e 9 partes de soluo salina peptonada.
1.1 Diluies decimais: Diluies decimais so diluies em que a quantidade de
substncia a ser diluda corresponde unidade, ou mltiplos da unidade e o volume final da
soluo diluda igual a 10 ou mltiplo de 10 (diluies de base 10).
1.2 Diluies decimais seriadas: So diluies decimais preparadas em srie e que
possuem um fator de diluio nico e igual a 10.
Exemplo:
Preparar diluies decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionria at 10-3:
a) Preparar uma diluio 1:10 da cultura em fase estacionria em soluo salina
peptonada, isto , misturar 1 mL da cultura em fase estacionria com 9 mL de soluo salina
peptonada (10-1).
b) A partir da diluio 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, aps
homogeneizao em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina
peptonada, de forma a obter a diluio 1:100 da cultura em fase estacionria (10-2).
c) A partir da diluio 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, aps
homogeneizao em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina
peptonada, de forma a obter a diluio 1:1000 da cultura em fase estacionria (10-3).
1.3 Clculos de Diluies
1.3.1 Clculo envolvendo uma diluio: Para preparar uma diluio 1:100 de carne em
soluo salina peptonada, devemos misturar uma parte de carne em um volume final de 100
partes, isto , 1 + 99.
Quando necessrio preparar um determinado volume de uma diluio especfica de uma
substncia, o clculo se efetua pelo processo razo-proporo, conforme exemplo abaixo:
Substncia: NaCl
Volume a ser preparado: 130 mL
Diluio: 1:80 (= 1 parte de NaCl em volume final de 80 partes)
1 parte de NaCl
=
X gramas de NaCl
80 partes de soluo final
130 mL de soluo final
80 X = 130 x 1
X = 130 =
1,625 partes de NaCl/130 mL de soluo
80
ou
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi = volume inicial
Ci = concentrao inicial
Vf = volume final
Cf = concentrao final
1.3.2 Vrias diluies relacionadas: Vrios mtodos laboratoriais indicam o uso de uma
srie de diluies, o que nada mais que um nmero de solues obtidas pela diluio de uma
substncia em um diluente, e fazendo diluies seqenciais a partir das solues resultantes.
1.4 Diluies de alimentos para realizao de anlises microbiolgicas: O processo de
diluio da amostra, bem como o procedimento tcnico utilizado durante esse processo,
constituem fatores importantes de interferncia nos resultados finais da anlise microbiolgica.
Em microbiologia de alimentos, comumente so utilizadas diluies decimais da amostra,
adotando-se rotineiramente dois critrios: massa por unidade de volume (m/v) e volume por
unidade de volume (v/v).
Para a obteno de uma diluio de base 10, homogeneizam-se pores da amostra com
volume de diluente necessrio para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume (ou
peso) da amostra.
Assim, a diluio 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida
homogeneizando:
1 mL de leite + 9 mL de diluente, ou
10 mL de leite + 90 mL de diluente, ou
20 mL de leite + 180 mL de diluente, ou
25 mL de leite + 225 mL de diluente, e assim por diante.
Em todos os exemplos acima, a amostra resulta diluda 1:10 (10-1) e, conseqentemente, em
cada mL da diluio teremos uma quantidade de amostra correspondente a um dcimo de mL
(0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.
Sempre que necessrio inocular amostras lquidas sem diluir em meios de cultura, considera-se
que a amostra se encontra na diluio 100.
Para produtos slidos h a necessidade de pesar a amostra.
Normalmente utilizam-se alquotas de 10 ou 25 gramas de alimentos slidos. Dez ou vinte e
1.5.5 Aderncia do lquido s paredes da pipeta: No inserir a ponta da pipeta mais do que
2,5 cm abaixo da superfcie do lquido dentro dos tubos ou dos recipientes contendo as diluies
das amostras, diminuindo assim, a superfcie de contato da pipeta com a amostra diluda.
Dispensar lentamente o inculo, permitindo a drenagem total
at a marca final da pipeta por um perodo de 4 a 6 segundos, nos
casos em que o mesmo corresponda ao volume total da pipeta. Preferentemente, usar pipetas
que no sejam de esgotamento total.
Quando da dispensa de parte do contedo de uma pipeta, deixar que o lquido escorra
lentamente. O procedimento de expulso rpida do lquido contido na pipeta acarreta a reteno
de um maior volume de lquido aderido s paredes.
1.5.6 Tipo e capacidade das pipetas: Sempre utilizar pipetas com marcao ntida de
volume e, preferencialmente, que permitam a pipetagem do volume desejado sem que seja
necessria a expulso da ltima poro da pipeta. Quando esse tipo de pipeta no estiver
disponvel no laboratrio, para a pipetagem de 1 mL, recomendvel a utilizao de pipetas com
capacidade de 2 mL, com graduao de 1/10 ou 1/100, aspirando o inculo at o volume total da
mesma e dispensando a primeira poro (1 mL) no interior da placa ou do tubo.
As pipetas utilizadas no devero ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser
medido, para assegurar que o inculo dispensado seja o requerido. Por exemplo, se o inculo for
de 0,1 mL, utilizar uma pipeta de 1 mL com graduao de no mnimo 1/10, aspirando o inculo
at o volume total da mesma e dispensando a primeira diviso no interior da placa ou do tubo.
1.5.7 Preciso dos volumes dos inculos; Manter a pipeta sempre na posio vertical e
inclinar o tubo at posio que forme um ngulo de 45 em relao pipeta, facilitando, desta
forma, a leitura na pipeta do "menisco" do volume a ser dispensado.
1.5.8. Uso de pipetas: Sempre utilizar uma pipeta para cada diluio.
No tocar com a pipeta de uma determinada diluio no diluente da diluio seguinte.
NUNCA enxaguar a pipeta com o diluente da diluio subseqente.
A mesma pipeta poder ser utilizada para a semeadura de diluies de amostras, desde
que se parta da maior diluio (amostra mais diluda) para a menor diluio (amostra menos
diluda).
2. SOLUES
Solues so misturas homogneas unifsicas constitudas de duas ou mais substncias
miscveis. So formados por dois compostos, o soluto e o solvente.
O soluto a substncia que est dissolvida no solvente e, conseqentemente, o solvente
a substncia que dissolve o soluto.
Nas solues, os dois componentes no se encontram quimicamente combinados.
2.1 Solues saturadas: So solues que contm a quantidade mxima possvel de um
soluto, em uma determinada temperatura e presso, perfeitamente dissolvido no solvente.
Por exemplo, em solues de Cloreto de sdio, a saturao ocorre quando h
aproximadamente 360 g do sal por litro de gua.
2.2 Concentrao de solues; Concentrao o quociente entre a quantidade do soluto e
a do solvente ou da prpria soluo. Para determinar esse quociente alguns autores referem-se
ao ttulo de uma soluo.
A concentrao de uma soluo pode ser expressa de 3 maneiras:
2.3 Partes: Estabelece uma relao em que a mesma unidade de medida, ou mltiplos da
unidade, usada ao longo de todas as pores relacionadas do processo.
Partes no se limita a uma nica unidade de medida.
Concentraes de partes por milho ou ppm so freqentemente usadas para aditivos
de meios de cultura e solues de antibiticos.
Exemplo:
Uma parte por milho (1 ppm) de cloridrato de tetraciclina possui uma parte do princpio
ativo dissolvido em 1 milho de partes da soluo.
Medidas que correspondem a 1 ppm so:
- grama por tonelada (g/ton);
- miligrama por quilo (mg/kg);
- micrograma por grama (/g);
- mililitro por litro (mL/L);
- microlitro por mililitro (L/mL).
2.4 Hidratos; Os sais utilizados no laboratrio de microbiologia podem se apresentar na
forma anidra ou na forma de um ou mais hidratos, em que uma ou mais molculas de gua esto
ligadas molcula do sal.
Quando se necessita preparar uma soluo cuja composio indique o uso de um sal na
forma anidra, e somente est disponvel no laboratrio um hidrato, deve-se determinar quanto do
hidrato corresponde quantidade da forma anidra estabelecida na formulao.
Para esse clculo necessrio considerar os pesos moleculares e, por regra de trs,
estabelecer o peso correspondente.
Exemplo:
Exemplo 1:
Preparar uma soluo 4000 U/mL de sulfato de polimixina B em tampo fosfato pH 8.
Potncia do produto usado: 7600 U/mg
Peso 23,7 mg (quantidade pesada)
Volume =
23,7 x 7600 = 45,03 mL
4000
Para obter a soluo 4000U/mL, basta dissolver as 23,7 mg de sulfato de polimixina em
45,3 mL de tampo. Cada mL desta soluo oferecer uma soluo de sulfato de polimixina de
4000U.
OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluente, conforme
o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa, qual a quantidade de antibitico a ser
pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado no item
2.5.1.
Exemplo 2
No meio SFP h a indicao da adio de 3 mg/L de sulfato de polimixina e de 12 mg/L
de canamicina.
Quando as quantidades do aditivo so to pequenas quanto estas, preparar soluo-me.
Adicionar ao meio final, volumes das solues-me que ofeream uma concentrao fina, por
litro de meio, correspondente ao indicado pelo fabricante.
No caso deste exemplo (meio SFP) preparar:
a) soluo de sulfato de polimicina a 3mg/L. (potencia 7600 U/mg)
Pesar 300mg de sulfato de polimicina e diluir para 100mL, com gua destilada. Esta
soluo ter concentrao de 3mg de polimicina B com potncia de 7600U/mg por mL.
Neste exemplo seria usado 1 mL desta soluo por litro d meio.
b) Kanamicina 12mg/mL.
Potncia 80%
1mg do produto contm 0,8 mg de princpio ativo.
Pesar mais de 100mg do antibitico (por exemplo 158mg)
Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para
obter o volume de diluente a ser adicionado.
X = 158 x 0.8
12
= 10,58mL
OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluentes, conforem
o exemplo acima, pode-se estabelecer, de forma inversa qual a quantidade de antibitico a ser
pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado no item
2.5.1.
Cada mL desta soluo conter 12mg de kanamicina
2.5.1. Determinao do peso do peso de antibitico para preparao de solues,
priorizando o volume.
Nos exemplos 1 e 2 acima os volumes de diluentes a serem adicionados resultaram em
nmeros quebrados, o que certamente leva a erros na concentrao final do antibitico.
Para evitar volumes fracionados, fazer o clculo inverso, pr estabelecendo o volume de diluente
a ser utilizado e calculando a quantidade de antibitico a ser pesado, usando a mesma frmula:
25x12
0,8
= 375mg
A quantidade de antibitico a ser pesada neste caso seria de 375mg, que sero diludas
em 25mL de diluente para a obteno de uma soluo com 12mg/mL
2.6 Concentrao por Centrifugao: Em microbiologia, o processo de centrifugao
freqentemente usado para a concentrao de clulas ou esporos em processos de lavagem ou
purificao.
O processo de centrifugao promove a sedimentao de partculas mais densas por meio
da aplicao de fora centrfuga obtida pela rotao em alta velocidade.
As unidades usadas para indicar centrifugao so Rotaes por minuto (RPM) e fora
gravitacional (g).
Para calcular g se utiliza a seguinte frmula:
g = 0,0000118 x raio do rotor (cm) x (rpm)2
3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Diluies. In.: Matemtica de Laboratrio - Aplicaes
Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 77-88.
CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL, J.B. Solues. In.: Matemtica de Laboratrio - Aplicaes
Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 93-118.
COOPER, T.G. The tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York. 1977. 422p.
FELTRE, R. Solues. In.: Qumica - Fsico-Qumica. 2.ed. So Paulo, SP. Editora
Moderna.1983. p. 1-75.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of
microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.
Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.),
2001. p.53-62.
ANEXO III
PROCEDIMENTOS BSICOS DE CONTAGEM
1. TCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS
As tcnicas de contagem em placas permitem a visualizao da formao de colnias a
partir de um nmero "fixo" de clulas viveis.
So utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colnias
(UFC) presentes na amostra sob anlise.
Os meios de cultura usados para a obteno do nmero de colnias em uma amostra
podem ser de uso geral (meios com ingredientes nutritivos bsicos), enriquecidos (meios com
nutrientes adicionais, como sangue, gema de ovo e soro), acrescidos ou no de sistemas
alimento especfico, o padro de aceitao/rejeio no pode ser atendido por meio de provas de
contagem.
b) Quando, devido ao processo tecnolgico sofrido pelo alimento, as clulas presentes
estejam lesadas fisiologicamente (clulas estressadas), no tendo portanto condies de formar
colnias em meios slidos seletivos.
A tcnica de NMP deve ser realizada incluindo as seguintes etapas analticas:
a) Teste presuntivo (leitura dos resultados obtidos na srie de tubos mltiplos).
b) Teste confirmatrio (subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de
maior impedincia ou em gar seletivodiferencial para o microrganismo pesquisado).
c) Teste completo (identificao bioqumica da(s) espcie(s)`microbiana(s) presente(s)).
Esta tcnica tem por base a probabilidade estatstica relacionada com a freqncia da
ocorrncia de resultados positivos mais provveis em funo do nmero real de microrganismos
presentes. necessrio que a amostra seja preparada de modo que as bactrias no se
encontrem agrupadas, que estejam aleatriamente distribudas na amostra; e que os meios e
condies de incubao permitam a recuperao e deteco de ao menos uma clula vivel do
organismo alvo.
Para a determinao do NMP, a amostra dever ser diluda tantas vezes quantas
necessrias para que a ltima diluio de 3, 5 ou 10 tubos apresente todos os resultados
negativos. Quanto maior o nmero esperado do microrganismo pesquisado, maiores devero ser
as diluies usadas.
Quando no se pode estimar qual a diluio do alimento que oferecer essa situao, so
inoculadas mais de 3 sries com diluies decimais (por exemplo 100 at 10-4, ou mais diluies).
Entretanto, na leitura final do NMP devero ser consideradas somente as 3 diluies mais
significativas.
Como na rotina de laboratrios analticos esse procedimento aumenta em muito o volume
de trabalho e de material a ser usado, normalmente so utilizadas apenas trs diluies,
considerando a estimativa do nmero esperado do microrganismo em estudo.
Ento, o nmero de clulas viveis presentes obtido por meio de 3 diluies decimais
sucessivas e transferncia de alquotas determinadas (tambm decimais, como 10 e 1mL) de
cada diluio em sries de tubos.
O nmero de tubos por srie varivel, podendo ser de 2 a 10. Mais comumente so
usadas sries de 3 ou 5 tubos por diluio.
Quando houver necessidade de inocular grande volume (10 mL) da amostra diluda ou
no, na primeira srie de tubos, estes devero conter meio em concentrao dupla.
O arranjo de nmero de tubos positivos das 3 diluies (ou as mais significativas)
transposto para tabelas estatsticas que informam o NMP para as diferentes combinaes de
tubos positivos e que tambm incluem os limites de confiana dos nmeros mais provveis dos
microrganismos pesquisados em funo da tabela em questo.
Os intervalos de confiana 95% constantes das tabelas de NMP oferecem a informao de
que, em pelo menos 95% das vezes, h a chance da concentrao real do microrganismo alvo
estar incluido no intervalo de confiana calculado para cada arranjo de tubos positivos.
Por exemplo, o arranjo de tubos positivos 3-1-0 oferece como NMP o valor 43/g. Nesse
caso, o intervalo de confiana 95% corresponde aos valores compreendidos entre 9 e 180. Isto
significa que a chance do nmero real presente na amostra estar includo no intervalo de valores
entre 9 e 180 UFC/g de 95%.
A expresso do NMP feita somente por meio do nmero mais provvel que corresponda
0.001
0,0001
1/3
1/3
1/3
1/3
Combinao
tubos
3-3-1
3-2-1
3-2-0
2-2-0
3-2-2
3-2-1
de
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 10, 1,0 e 0,1 g
ou mL. Para a gua, cujo resultado final dever ser expresso em NMP por 100 mL, o nmero
constante da tabela dever ser multiplicado por 10.
Neste Manual, para maior praticidade, a tabela para leitura de resultados de NMP em gua
j contm os nmeros corrigidos (multiplicado por 10).
Exemplo 2:
Inoculao de
10 mL da diluio 10-1 na 1 srie
1,0 mL da diluio 10-1 na 2 srie
0,01 g ou mL
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 1, 0,1 e 0,01 g
ou mL. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso igual
quantidade para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP ser obtido diretamente da tabela.
Exemplo 3:
Inoculao de
1,0 mL da amostra na 1 srie
1,0 mL da diluio 10-1 na 2 srie
1,0 mL da diluio 10-2 na 3 srie
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 1, 0,1 e 0,01 g ou
mL. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso igual a quantidade
para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP obtido ser o mesmo encontrado na tabela.
Exemplo 4:
Inoculao de
1,0 mL da diluio 10-1 na 1 srie
1,0 mL da diluio 10-2 na 2 srie
1,0 mL da diluio 10-3 na 3 srie
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para inculos de
0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL. Poder tambm ser usada a tabela de NMP para inculos de 1, 0,1 e
0,01 mL desde que o resultado da tabela seja multiplicado por 10, j que a quantidade de
amostra inoculada neste caso foi 10 vezes menor que a quantidade para a qual a tabela se
refere.
2.2 Casos especficos
a) Inoculao de mais de 3 diluies seriadas
Quando da inoculao de mais de 3 diluies seriadas, selecionar a maior diluio na qual
todos os tubos inoculados so positivos e considerar as 2 diluies maiores seguintes que a
selecionada (casos 2 e 3 da tabela 1 acima e exemplos abaixo).
Exemplo 1: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo e apresentou os
seguintes resultados:
100 3 tubos positivos
10-1 3 tubos positivos
10-2 3 tubos positivos
10-3 2 tubos positivos
10-4 0 tubos positivos
10-5 0 tubos positivos
O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/2/0,
que corresponde ao valor 9,3 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluda a 10-2, o
resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obteno do valor do NMP real
por grama ou mL do alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 930 NMP/g ou mL.
Exemplo 2: Amostra de alimento lquido da qual foram inoculadas apenas as diluies 100, 10-1,
10-2 e 10-3, e os resultados obtidos foram os seguintes:
100 3 tubos positivos
10-1 3 tubos positivos
10-2 3 tubos positivos
10-3 2 tubos positivos
O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/3/2,
que corresponde ao valor 110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diluda a 10-1, o
resultado deve ser multiplicado por 10 para se obter o valor do NMP por grama ou mL do
alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 1100 NMP/g ou mL.
Exemplo 3: Na anlise do mesmo alimento acima, caso as diluies inoculadas fossem as
seguintes:
10-3 2 tubos positivos
10-4 0 tubos positivos
10-5 0 tubos positivos
10-6 0 tubos positivos
O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 2/0/0,
que corresponde ao valor 0,92 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra estava diludo a 10-3, o
resultado deve ser multiplicado por 1000 para se obter o valor do NMP/g ou mL do alimento em
anlise. Assim, o resultado final seria 920 NMP/g ou mL.
Exemplo 4: No mesmo exemplo acima, se as diluies inoculadas fossem 100, 10-1 e 10-2,
considerando os mesmos resultados:
100 3 tubos positivos
10-1 3 tubos positivos
10-2 3 tubos positivos
O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para a combinao de tubos positivos
3/3/3, que corresponde ao valor >110 NMP/g ou mL. Como neste caso a amostra no estava
diluda (100), o resultado final a ser emitido obtido diretamente da tabela.
As diferenas de resultados observadas nos diferentes exemplos de trabalho com a
mesma amostra e diluies diferentes demonstram a importncia de se fazer diluies da
amostra considerando o nmero estimado do microrganismo teste, pois a mesma amostra
analisada conforme os exemplos 4 (sem suficiente diluio) e 1 (com diluies adequadas)
apresentam resultados bem diferentes (> 110 NMP/g ou mL e 930 NMP/g ou mL).
O resultado >110 NMP/g ou mL vago e pode no ser adequado para a tomada de
deciso a respeito do destino do lote a que se refere o alimento analisado, especialmente quando
h uma tolerncia em nmeros maiores que este.
Exemplo 5: Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos e que
Tubos NMP/g ou mL
0,001
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
<3,0
3,0
3,0
6,1
6,2
9,4
3,6
7,2
11
7,4
11
11
15
16
9,2
14
20
Superior
9,5
9,6
11
18
18
38
18
18
38
20
38
42
42
42
38
42
42
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
1
1
1
2
2
2
3
3
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
15
20
27
21
28
35
29
36
23
38
64
43
75
120
160
3,7
4,5
8,7
4,5
8,7
8,7
8,7
8,7
4,6
8,7
17
9
17
37
40
42
42
94
42
94
94
94
94
94
110
180
180
200
420
420
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
93
150
210
290
240
460
1100
>1100
18
37
40
90
42
90
180
420
420
420
430
1000
1000
2000
4100
-.-
Tubos NMP/g ou mL
0,1
0
1
0
1
0
0
0
1
2
<3,0
3,0
3,0
6,1
6,2
9,4
3,6
7,2
11
Superior
9,5
9,6
11
18
18
38
18
18
38
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
0
0
0
1
1
1
1
2
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
7,4
11
11
15
16
9,2
14
20
15
20
27
21
28
35
29
36
23
38
64
43
75
120
160
93
150
3
2
2
210
3
2
3
290
3
3
0
240
3
3
1
460
3
3
2
1100
3
3
3
>1100
Fonte: Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.
1,3
3,6
3,6
4,5
4,5
1,4
3,6
4,5
3,7
4,5
8,7
4,5
8,7
8,7
8,7
8,7
4,6
8,7
17
9
17
37
40
18
37
20
38
42
42
42
38
42
42
42
42
94
42
94
94
94
94
94
110
180
180
200
420
420
420
420
40
90
42
90
180
420
430
1000
1000
2000
4100
-.-
Tabela 3. NMP por grama ou mL para sries de 10 tubos com inculos de 10 mL, 1,0 mL e
0,1mL e respectivos intervalos de confiana 95%.
Nmero
de
Positivos
10
1,0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
Tubos NMP/g ou mL
0,1
0
1
2
0
1
<0,9
0,9
1,8
0,9
1,8
Superior
3,1
3,1
5,1
3,6
5,1
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
2
3
3
4
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
4
4
5
0
0
0
1
1
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
1,8
2,7
2,7
0,94
1,9
2,8
1,9
2,9
3,8
2,9
3,8
3,8
4,8
4,8
2
3
4
3
4
5
4
5
6,1
5,1
6,1
6,1
7,2
7,2
3,2
4,2
5,3
4,2
5,3
6,4
0,33
0,8
0,8
0,05
0,33
0,8
0,33
0,8
1,4
0,8
1,4
1,4
2,1
2,1
0,37
0,81
1,4
0,82
1
2,1
1,4
2,1
3
2,1
3
3
3,1
3,1
0,9
1,4
2,1
1.4
2,1
3
5,1
7,2
7,2
5,1
5,1
7,2
5,7
7,2
9
7,2
9
9
11
11
7,2
7,3
4,9
7,8
4,9
11
9,1
11
14
11
14
14
15
15
9
9,1
11
10
11
14
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
2
2
2
3
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3
4
4
5
0
0
1
2
0
1
2
0
1
0
0
5,3
6,4
7,5
6,5
7,6
8,7
7,6
8,7
8,8
4,5
2,1
3
3,1
3
3,1
3,6
3,1
3,6
3,6
1,6
12
14
15
14
15
17
15
17
17
11
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
6
6
6
6
6
6
6
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
5
5
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6
0
0
0
0
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1
1
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2
2
3
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3
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4
4
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5
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0
0
0
0
1
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1
1
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0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
0
0
0
1
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3
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
0
1
2
3
0
1
2
5,6
6,8
5,6
6,8
8
6,8
8
9,2
8,1
9,3
10
9,3
11
11
12
12
12
6
7,2
8,5
9,8
7,3
8,5
9,8
11
8,6
9,9
11
10
11
13
11
13
14
13
14
14
7,8
9,2
11
12
9,2
11
12
2,2
3
2,2
3
3,6
3
3,6
3,7
3,6
4,5
5
4,5
5
5
5,6
5,6
5,6
2,5
3,1
3,6
4,5
3,1
3,6
4,5
5
3,6
4,5
5
4,5
5
5,6
5
5,6
7
6,3
7
7
3,1
3,6
5
5,6
3,7
5
5,6
12
14
12
14
17
15
17
17
17
18
20
18
20
20
22
22
22
14
15
17
18
15
17
18
21
17
18
21
18
21
23
21
23
26
25
26
26
17
17
20
22
18
21
22
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
1
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
7
0
0
0
0
1
1
1
1
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2
2
2
0
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3
3
3
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4
4
4
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5
5
6
6
6
7
3
0
1
2
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0
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0
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10
1
2
0
1
0
0
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0
1
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0
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3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
14
11
12
14
15
15
14
15
14
15
17
16
17
19
17
19
19
10
12
13
15
12
13
15
17
13
15
17
19
15
15
17
19
21
17
19
21
23
19
21
23
21
23
25
23
7
5
5,6
7
7,4
5,6
7
7,4
7
7,4
9
7,4
9
9
9
9
9
4,5
5
6,3
7,2
5
6,3
7,2
7,7
6,4
7,2
7,7
9
72
7,2
9
9
10
9
9
10
11
9
10
11
10
11
12
11
26
21
22
26
30
23
26
30
26
30
34
30
34
34
34
34
34
20
21
25
28
22
25
28
31
26
28
31
34
30
30
34
34
39
34
34
39
44
34
39
44
39
44
46
44
7
8
8
8
8
8
8
8
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0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
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3
0
1
2
26
13
15
17
19
15
17
19
12
5,6
7
7,5
9
7,1
7,7
9
50
25
26
30
34
28
31
34
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
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2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
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5
5
5
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6
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7
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0
0
0
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17
19
21
23
19
21
24
26
22
24
26
29
24
27
29
32
27
30
33
30
33
36
34
37
17
19
22
24
19
22
25
28
31
22
25
10
7,7
9
10
22
9
10
11
12
10
11
12
14
11
12
14
15
12
14
15
14
17
17
17
17
7,5
9
10
11
9
10
11
14
14
10
11
39
34
34
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44
34
39
44
50
39
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50
58
44
50
58
62
50
58
62
58
73
74
73
74
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34
39
44
39
40
44
58
58
44
46
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9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
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2
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3
3
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5
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32
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29
33
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45
33
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14
14
17
12
14
15
17
20
14
15
17
20
20
17
17
20
20
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58
73
50
58
62
74
91
58
62
74
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91
73
74
91
91
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9
9
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9
9
9
9
9
9
9
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10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
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8
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0
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49
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50
55
61
68
57
63
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27
31
37
27
32
38
44
52
33
39
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17
20
21
25
20
21
25
26
25
25
26
30
25
30
30
11
12
14
17
12
14
17
20
25
15
17
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74
91
100
120
91
100
120
120
120
120
120
140
120
140
140
44
50
58
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61
74
91
120
73
79
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
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2
2
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4
4
4
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5
5
5
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6
6
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0
1
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3
4
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0
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3
46
54
63
40
47
56
66
77
89
49
59
70
82
94
110
62
74
87
100
110
130
140
79
94
110
120
20
25
30
17
20
25
30
34
39
21
25
30
38
44
50
26
30
38
44
50
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70
34
39
50
57
91
120
140
91
100
120
140
150
180
120
120
150
180
180
210
140
150
180
180
210
220
280
180
180
210
220
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
4
5
6
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
4
5
5
140
160
180
100
120
140
150
170
190
220
240
130
150
170
200
220
250
250
70
74
91
44
50
61
73
91
91
100
110
60
70
80
90
100
120
120
280
208
350
210
220
280
280
350
350
380
480
250
280
350
350
380
480
480
10
8
6
280
120
10
8
7
310
150
10
8
8
350
150
10
9
0
170
74
10
9
1
200
91
10
9
2
230
100
10
9
3
260
120
10
9
4
300
140
10
9
5
350
150
10
9
6
400
180
10
9
7
460
210
10
9
8
530
210
10
9
9
610
280
10
10
0
240
110
10
10
1
290
120
10
10
2
350
150
10
10
3
430
180
10
10
4
540
210
10
10
6
700
280
10
10
6
920
350
10
10
7
1200
480
10
10
8
1600
620
10
10
9
2300
810
10
10
10
>2300
1300
Fonte: Adaptado Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.
480
620
620
310
380
480
480
620
630
820
970
970
1300
480
620
820
970
1300
1500
1900
2400
3400
5300
-.-
3. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de
Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicas para
alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2
reviso. 136p.
MATURIN,L.J.; PEELER, J.T. Aerobic Plate Count. In: Bacteriological Analytical Manual. 8
ed. Arlington, AOAC International, 1995. p. 3.01 - 3.10.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture Methods for Enumeration of
Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed.
Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association,
2001. p. 53-62.
FDA.
Bacteriological
Analytical
Manual
Online.
2001.
Disponvel
em:
http://www.cfsan.fda.gov
ANEXO IV
PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS
1. INTRODUO
A aplicao de procedimentos de controle durante o processo analtico visa garantia da
confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, preciso e exatido.
b = expoente (0 a 10)
UFC = unidade formadora de colnias
g = grama e mL= mililitro
Exemplos:
Diluio 10-2 (1:100)
Mdia das contagens: 25 UFC
Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL
Diluio 10-3 (1:1.000)
Mdia das contagens: 38 UFC
Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL
O resultado final ser expresso considerando-se os dois primeiros algarismos
representativos, separados por vrgula. Os algarismos subseqentes, quando existirem, devero
ser arredondados e transformados em potncia de 10.
3.2 Arredondamento de resultados: Quando se fizer necessrio, e visando no criar uma
falsa idia de preciso, aplicar a seguinte regra para a aproximao dos resultados:
3.2.1 Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo
imediatamente aps for superior a 5.
Exemplo:
Diluio 10-2
Mdia das contagens: 186 UFC
Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado:
190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL
3.2.2 Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo
imediatamente aps for inferior a 5.
Exemplo:
Diluio 10-2
Mdia das contagens: 184 UFC
Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado:
180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL
3.2.3 Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqente for igual a cinco,
arredondar para baixo quando o segundo ou o subseqente for menor ou igual a 5 e para cima
quando for maior que 5.
Exemplos:
Diluio 10-2
Mdia das contagens: 185 UFC
Arredondando o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado:
190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL
Mdia das contagens: 145 UFC
Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado:
140 x 100 = 14.000 = 1,4 x 104 UFC/g ou mL
Quadrado 5: 6 colnias
Quadrado 6: 8 colnias
Quadrado 7: 8 colnias
Quadrado 8: 8 colnias
Quadrado 9: 8 colnias
Quadrado 10: 6 colnias
Quadrado 11: 9 colnias
Quadrado 12: 7 colnias
OBS: Nas situaes descritas acima, nos itens 4.2 e 4.3, o resultado tambm pode ser expresso
como maior que 250 vezes amaior diluio utilizada. Expressar o resultado como nmero
estimado.
Exemplo:
10-2 (> 250)
10-3 (> 250) = > 2.500.000
10-4 (> 250)
Resultado: > 2,5 x 106 UFC/g ou mL est.
4.4 Placas com colnias invasoras
4.4.1 Quando a rea invadida exceder 1/4 da rea total, expressar o resultado como
"presena de colnias invasoras".
4.4.2 Quando a rea invadida for inferior a 1/4 da rea total, contar tanto as invasoras
como as normais. Quando as colnias invasoras estiverem aglutinadas, contar como uma colnia
e quando estiverem isoladas, contar uma a uma.
4.5 Contagem incoerentes
Quando o resultado da contagem da maior diluio for duas ou mais vezes maior que o
resultado obtido na diluio anterior, ou o da menor diluio for duas ou mais vezes maior que o
resultado obtido na diluio posterior, considerar como resultado final o valor da menor diluio.
Exemplo 1:
Dil: 10-2 = 140 colnias (14.000)
Dil: 10-3 = 52 colnias (52.000)
Resultado: 1,4 x 104 UFC/g ou mL
Exemplo 2:
Dil: 10-2 = 95 colnias (9.500)
Dil: 10-3 = 2 colnias (2.000)
Resultado: 9,5 x 104 UFC/g ou mL
4.6 Situaes nas quais todas as placas encontram-se com nmeros de colnias abaixo
dos limites do intervalo de preciso e repetibilidade.
Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias
contido no intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias.
Neste caso, o resultado deve ser expresso pelo nmero de colnias da placa de menor
diluio, por estimativa.
Exemplo:
Dil: 10-2 = 21 UFC
Dil: 10-3 = 2 UFC
21 x 100 = 2.100
Resultado 2,1 x 103 UFC/g ou mL est.
4.6.1 Situaes nas quais todas as placas no apresentem crescimento de colnias,
independente do intervalo de seleo Quando em nenhuma placa for observado o crescimento
de colnias, emitir o resultado como estimado: <1,0 vezes a menor diluio utilizada.
Ex.: <1,0 x 101 UFC/g ou mL est.
20 x 4 x 100 =
1.600
5
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:
RA
10 x 2 x 100 =
5
400
O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas:
Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL.
4.7.3 Quando for necessrio contar colnias tpicas e atpicas em placas de diferentes
diluies
Nunca somar colnias tpicas ou atpicas de diferentes diluies, pois colnias atpicas em
uma determinada diluio podero se apresentar tpicas em diluies subseqentes. Submeter
aos testes confirmativos, segundo a metodologia especfica para cada caso, 3 a 5 colnias
tpicas e 3 a 5 colnias atpicas da diluio escolhida.
Calcular o nmero de UFC/g ou mL somente aps a confirmao de cada tipo (T e A) em
uma mesma diluio.
Exemplo:
Diluio 10-2 = 240 colnias contadas, das quais 50 eram tpicas e 190 atpicas.
Diluio 10-3 = 20 colnias tpicas e 5 atpicas.
Como na diluio 10-3 o nmero de colnias se encontra fora do intervalo de preciso e
repetibilidade, a diluio escolhida para confirmao foi 10-2. Destas, foram repicadas 5 colnias
tpicas e 5 colnias atpicas. Todas as colnias tpicas e 4 atpicas apresentaram resultado
positivo nos testes confirmativos.
10-2 RT
=
50x5x100
=
5000
5
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:
10-2 RA
=
190x4x100 =
15.200
5
Colnias confirmadas na diluio 10-2 = 20.200 colnias
Resultado final ser a soma do nmero de colnias confirmadas na diluio escolhida:
Res final
5.000 + 15.200
5. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de
Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para
alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 reviso. 136p.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN,J.H. Culture methods for enumeration of
microorganisms In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed.
Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.),
2001. p.53-62.
ANEXO V
PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E
DESCARTE DE AMOSTRAS
1. CONSIDERAES GERAIS
1.1. A pesagem e o preparo de amostras so pontos crticos de controle do processo
analtico.
1.2. O local deve estar higienizado antes do incio da pesagem, conforme norma
especfica do laboratrio.
1.3. Deve ser feito um controle do ambiente, conforme norma especfica do laboratrio.
1.4. O responsvel pelo procedimento deve, antes do incio dos trabalhos, realizar
assepsia das mos e antebraos.
1.5. Deve ser usado uniforme de uso exclusivo para a rea analtica e Equipamento de
Proteo Individual (EPI), conforme estabelecido em normas especficas do laboratrio.
1.6. Devem ser aplicados os procedimentos de verificao de balanas, conforme
procedimento especfico do laboratrio.
1.7. O trabalho deve ser realizado perto da chama do bico de Bunsen, no caso de uso de
bancada, ou em fluxo laminar especfico para tal atividade.
1.8. A superfcie de trabalho deve estar protegida por pano de campo embebido em
soluo desinfetante no inflamvel, previamente testada.
1.9. Todo o material deve estar organizado e em condies adequadas de uso antes do
incio dos trabalhos.
1.10. No deve ser permitida a entrada e a permanncia de pessoas estranhas no local,
principalmente durante a pesagem das amostras.
2. INSTRUES PARA MANUTENO E DESCARTE DE AMOSTRAS NO LABORATRIO
2.1 No laboratrio, aps o recebimento, as amostras devem ser estocadas at o momento
da anlise, conforme abaixo:
2.1.1 Refrigeradas perecveis: As refrigeradas perecveis devem ser mantidas sob
refrigerao e analisadas o mais rapidamente possvel. Aguardar no mximo at o dia seguinte.
2.1.2 Congeladas: As amostras congeladas devem ser mantidas no mximo a 18 C e analisadas em um prazo mximo de 7 dias da colheita.
2.1.3 No perecveis Amostras no perecveis devem ser estocadas em lugar fresco,
protegidas da umidade e da luz, de forma que suas caractersticas originais sejam mantidas, e
analisadas o mais rapidamente possvel.
2.2 Registros: Manter registros completos sobre as amostras recebidas e analisadas,
conforme estabelecido em procedimento especfico do laboratrio.
2.3 Manuteno das amostras aps a anlise: Aps a retirada das alquotas para anlise,
as amostras devem ser embaladas em sacos plsticos de primeiro uso, perfeitamente
identificadas e mantidas congeladas, conforme item 2.1.2.
As amostras estveis em temperatura ambiente devem ser mantidas identificadas,
protegidas por saco plstico de primeiro uso ou adequadamente fechadas na embalagem
original, em temperatura ambiente e em local apropriado previamente estabelecido, conforme
item 2.1.3.
Todas as amostras, exceto gua, leite e outros produtos lquidos, os quais devem ser
descartados logo aps a realizao do procedimento analtico, devem ser mantidas nas
condies acima especificadas por 10 dias. Aps esse prazo, as amostras devem ser
descartadas conforme item 2.4.
2.4 Descarte de amostras analisadas: Todas as amostras que derem entrada no
laboratrio de microbiologia devem ser descartadas conforme procedimento especfico
estabelecido pelo laboratrio.
3. PREPARO DA AMOSTRA
Quando a metodologia indicar diluentes diferentes, como por exemplo para provas de:
Contagem de Microrganismos, Pesquisa de Salmonella, Pesquisa de Listeria monocytogenes,
Pesquisa de Vibrio cholerae, etc., fazer tantas pesagens por amostra quantas forem necessrias.
3.1 Enlatados: No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a
integridade das embalagens, observando se esto amassadas, levemente tufadas ou com
microfugas aparentes.
Quando forem observadas quaisquer dessas alteraes, proceder conforme estabelecido
no Captulo 20 Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de baixa acidez.
3.1.1 Pr-incubao de amostras visualmente normais: As amostras de conservas
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, ou ainda aspirar o contedo
deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador, quando no houver espao livre para a
homogeneizao.
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo
embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Para pesquisa de Salmonella em gua usada em aqicultura e em gua de chiller,
homogeneizar bem a amostra invertendo o recipiente por 25 vezes, e transferir 100 mL da
amostra para um frasco contendo 50 mL de gua peptonada 1% tamponada em concentrao
tripla.
3.7 Outros Produtos Lquidos
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes.
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo
embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Quando no houver espao livre dentro do recipiente para homogeneizao da amostra,
aspirar o contedo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador.
Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e retirar
a alquota analtica.
3.8 Produtos gordurosos
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma, usando algodo
embebido em desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Com auxlio de esptula estril, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra, retirando
alquotas de vrios pontos da superfcie e profundidade, em frasco erlenmeyer previamente
esterilizado, ou em sacos stomacher.
Colocar em banho-maria a 46 1C, por um perodo mximo de 15 minutos.
Somente aps a liquefao da amostra, adicionar o diluente previamente aquecido a 46 1C.
Agitar, de forma a obter uma suspenso homognea.
Para amostras de produtos gordurosos, utilizar o diluente especificado na tcnica,
adicionado de 1% de Tween 80.
3.9 Produtos em p e granulados
Agitar ou inverter o produto por 25 vezes.
Antes da abertura da embalagem que contm a amostra, proceder assepsia da mesma
usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e transferir, cuidadosamente, para um
frasco erlenmeyer ou saco para stomacher.
OBS: Quando as embalagens forem sacos de 25 kg ou mais, ou quando as amostras forem
colhidas em vidros onde no exista espao livre para homogeneizao, transferir cerca de 500g
do produto para um saco estril, e em seguida agitar ou inverter o saco com a amostra por 25
vezes.
Com o auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e em
seguida pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para stomacher, utilizando
esptula ou colher estril.
3.10 Ovos
Ovos com casca: Lavar a casca de 5 a 7 ovos com escova e secar bem. Coloc-los de
molho em soluo de cido peractico 0,02% por 15 minutos. Aps, secar com algodo
embebido em etanol 70% ou etanol 70 GL.
Quebrar a casca assepticamente, transferindo a gema para recipiente estril. Descartar as
claras. Misturar as gemas com auxlio de basto de vidro estril. Pesar 25 0,2 g da mistura de
gemas em sacos para stomacher.
No caso de ovos de codorna, pesar 25 0,2 g de gema com a clara.
Ovo lquido integral e ovo em p:
Pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra em frasco erlenmeyer ou saco para
stomacher.
4. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ANDREWS, J.R.; JUNE, G.A. Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate. In:
Bacteriological Analytical Manual Online. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001.
Disponvel em: http:// www.cfsan.fda.gov
BRASIL. Ministrio da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria de
Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual de mtodos microbiolgicos para
alimentos. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. 1991/1992 2 Reviso. 136p.
ANEXO VI
PROCEDIMENTOS DE MICROSCOPIA
1. COMPONENTES BSICOS DO MICROSCPIO
1.1 Estativa
o corpo do microscpio que d suporte aos outros componentes.
1.2 Revlver porta objetivas
Suporte rotativo de objetivas, acoplado no brao da estativa.
1.3 Objetivas
Tubos de lentes que formam a primeira imagem ampliada do objeto. Fornecida geralmente
nos aumentos 10x (vezes), 20x, 40x e 100x. As objetivas modernas de 40x vm com a lente
frontal mvel para evitar danos lmina e lente frontal. A objetiva de 40x moderna possui
diafragma-ris acionada por anis para correo da espessura da lamnula.
1.4 Tubo de observao
Suporte de oculares. Existem trs tipos: monoculares, bioculares e trioculares. Neste
ltimo caso, o terceiro tubo serve para fixao da mquina fotogrfica.
1.4.1 Ajuste de dioptria
Dioptria a diferena de capacidade visual de cada olho.
Nos tubos destinados s oculares, existem controles giratrios que permitem o ajuste da
dioptria.
1.4.2 Ajuste da distncia interpupilar
Os tubos das oculares so mveis, para permitir o ajuste da distncia interpupilar, que
varia individualmente.
1.5 Oculares
Tubos com lentes por onde se realizam as observaes microscpicas.
Fornecidos com aumentos de 10x e 16x.
Para maior comodidade dos usurios de culos, existem as oculares de campo amplo que
permitem a observao com os culos.
Estas lentes aumentam a imagem virtual formada pelas objetivas.
Se a objetiva for de 100x e a ocular de 10x, o resultado ser um aumento de 1.000x (10 x
100).
1.6 Platina
Mesa onde so colocadas as preparaes para observaes microscpicas. Nelas, se
encontram acopladas o charriot, com comandos coaxiais que permitem a movimentao nas
coordenadas X e Y.
1.7 Charriot
O charriot serve para fixar a lmina microscpica e moviment-la em todas as direes.
1.8 Condensador
um conjunto de lentes colocado logo abaixo da platina do microscpio que concentra e
fornece luz necessria iluminao do objeto em estudo.
O diafragma-ris do condensador (diafragma de abertura) crtico na formao da
imagem.
Se estiver totalmente aberto, a imagem torna-se menos ntida devido reflexo da luz ao
longo do trajeto tico e a outros fatores.
Quando muito fechado, se obtm menor resoluo e diminuio da nitidez com o aumento
da refringncia do material. Para se obter uma boa imagem, o condensador dever estar mais
prximo possvel da lmina.
Organismos de maior tamanho e mais refringentes, como ovos de helmintos e
protozorios, tornam-se mais facilmente evidenciados com o condensador um pouco baixo e o
diafragma de abertura mais fechado.
1.9 Lentes auxiliares
Existentes em alguns modelos de microscpio que possuem lentes auxiliares abaixo do
condensador. Quando disponveis so somente utilizadas junto com as objetivas de 10x e
20x. Sem estas lentes, no possvel obter uma boa iluminao do campo microscpico.
1.10 Diafragma de campo Situado na base da estativa e serve para controlar a intensidade
luminosa. Possui um diafragma-ris que pode ser aberto ou fechado atravs do anel de controle.
1.11 Lente fosca
Est localizada sobre o diafragma de campo e se destina a melhorar a difuso do feixe
luminoso.
1.12 Lente luz do dia
Lente cinza azulada utilizada para que o feixe luminoso se aproxime da aparncia da luz
natural. Geralmente colocada sobre o diafragma de campo.
1.13 Controles de ajuste macromtrico e micromtrico
O controle macromtrico serve para focalizao inicial do objeto e o micromtrico para
ajustes finos de focalizao.
Pasteur;
- Colocar uma pequena quantidade de vaselina slida nos cantos da lamnula com a gota;
- Colar a lamnula com a gota para baixo na rea da escavao da lmina;
- Focalizar com aumento de 10x e depois de 40x, com a rea escavada da lmina para
cima.
Os organismos apresentam-se estticos ou com movimentos retilneos, ondulantes,
espiralados, sempre progressivos.
Os movimentos trmulos so causados pelo movimento browniano que provocado por
fenmeno fsico observado em meio fluido se diferenciando do movimento microbiano.
3. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
A microscopia de contraste de fase utilizada para a observao de preparados sem
tratamento prvio com corantes (movimentos bacterianos, presena de flagelos, estruturas
celulares).
Nesta tcnica, a formao de imagem segue o princpio fsico da interferncia de ondas
luminosas em diferentes fases que se intensificam ou se anulam entre si.
3.1 Acessrios de microscopia de contraste de fase
3.1.1 Objetivas anulares de 10x, 20x, 40x e 100x
So lentes com uma srie de anis concntricos (anis de fase).
3.1.2 Discos de diafragmas anulares
So discos acoplados sobre o condensador onde podemos colocar os diafragmas
anulares em posio, por meio de movimento em revlver. Os anis de cada um correspondem
aos espaos existentes entre os anis de fase da objetiva correspondente. Existem modelos em
que o condensador vem conjugado neste disco. O disco contm marcas indicando o aumento da
objetiva correspondente na sua borda externa, alm da marca zero onde nenhum diafragma
encontra-se no trajeto luminoso.
3.1.3 Lente ou microscpio auxiliar
Usado para centralizao dos anis de fase do diafragma anular. Tubo tipo telescpio
colocado no tubo de observao para centralizao dos diafragmas anulares.
3.1.4 Filtro verde para diafragma de campo
3.2 Procedimento
- Colocar o disco de diafragma anular correspondente ao aumento de cada objetiva;
- Ligar o microscpio;
- Colocar o disco na posio zero e centralizar o diafragma de campo com a objetiva de
10x em posio;
- Colocar a lente auxiliar no tubo de observao;
- Soltar o parafuso de fixao da lente frontal telescpica da lente auxiliar e moviment-la
para cima e para baixo, at obter uma imagem ntida dos anis de fase das objetivas e dos
diafragmas anulares; fixar o tubo telescpico;
- Fazer com que os anis de fase coincidam entre si atravs dos controles existentes nas
laterais de cada diafragma anular com auxlio da pequena chave que o acompanha. Realizar este
ajuste em todos os aumentos;
- Colocar o filtro verde sobre o diafragma de campo;
- Colocar uma gota da suspenso de microrganismos em meio lquido ou diluda em
soluo fisiolgica com uma pipeta de Pasteur, e cobrir com uma lamnula;
8. CONSERVAO DE MICROSCPIOS
Esta instruo se destina a estabelecer procedimentos de limpeza e conservao de
microscpios e a preveno contra fungos nos componentes ticos.
8.1 Materiais necessrios
Pincis de plo natural desengordurado com lcool-ter;
Panos de algodo macio;
Xilol ou benzina;
Slica-gel;
Tabletes de paraformaldedo;
Vaselina lquida.
leo lubrificante fino para mquina de costura.
Soluo ter-acetona 1:1.
8.2 Procedimento
Retirar a poeira das lentes com pincel. No usar espanador, pano ou camura para este
fim.
As marcas de dedos ou manchas de gorduras devem ser removidas com panos
embebidos em benzina ou xilol. No utilizar lcool que pode dissolver a cola que une as lentes.
A limpeza das objetivas deve ser limitada s lentes frontais e posteriores, roscas e
superfcies externas.
Imediatamente aps finalizao do trabalho, limpar o leo de imerso da objetiva com
flanela limpa e macia, embebida em soluo 1:1 de ter-acetona.
Manter o instrumento em local ventilado e seco.
Os microscpios devem ser mantidos em ambiente com umidade relativa abaixo de 65%.
Os microscpios devem ser submetidos periodicamente ao arejamento, colocando-os
prximos a um ventilador.
Os pequenos componentes que no se encontram em uso devem ser guardados em
compartimentos bem secos com slica-gel no seu interior, salvo instrues em contrrio do
fabricante.
A slica-gel hidratada toma a cor rsea e pode ser regenerada em estufa temperatura de
120C por algumas horas, recuperando a cor azulada.
Instrumentos quando guardados em caixas devem ser protegidos com tabletes de
paraformaldedo.
Cobrir os instrumentos que so mantidos no local de trabalho com protetor que permita a
ventilao e colocar tabletes de paraformaldedo sobre a platina.
As partes brilhantes, foscas ou fosfatadas devem ser protegidas com vaselina lquida
neutra.
Os parafusos de controle e de fixao de componentes devem ser retirados pelo menos
anualmente, lavados com solvente e lubrificados com leo, pois a graxa utilizada pelo fabricante
seca e dificulta a manobra com estas peas. O mesmo deve ser realizado com a engrenagem do
charriot.
8.3 Condies consideradas inadequadas para o armazenamento
- Ambiente com umidade relativa do ar acima de 75%;
- Escurido e falta de movimento de ar;
- P e marcas de dedos nas superfcies de vidro;
Esta colorao se baseia na substituio da safranina por arbol fucsina, que mais efetiva
para a colorao de alguns anaerbios Gram negativos e Legionella.
O aumento do tempo de exposio ao contracorante (carbol fucsina) permite uma maior
penetrao do mesmo dentro destas clulas, o que as tornar mais facilmente visveis.
Para anaerbios o descorante usado o etanol.
4.1 Procedimento de colorao
a) Corar o esfregao por 30 segundos com cristal violeta;
b) Retirar o excesso de cristal violeta;
c) Cobrir com lugol por 30 segundos;
d) Escorrer e lavar com gua corrente (fluxo suave);
e) Descorar com etanol 95% por 30 segundos;
f) Lavar com gua corrente (fluxo suave);
g) Adicionar soluo de contracorante carbol fucsina por 1 minuto ou mais (soluo
aquosa de fucsina bsica 0,8% (m/v);
h) Deixar secar em ambiente.
5. TCNICAS DE COLORAO PARA FLAGELOS
5.1 Colorao para flagelos
Os flagelos so organelas das bactrias responsveis pela motilidade, os quais possuem,
em sua constituio, molculas proticas denominadas flagelinas. O flagelo formado por
milhares de monmeros polimerizados de flagelina ordenados de maneira a formar
um nico flagelo.
Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja demonstrar este tipo de
estrutura em uma bactria:
a) A produo de flagelos nas bactrias no contnua e dependente de vrios fatores
como temperatura, substrato, estgio do crescimento, etc;
b) Os flagelos podem ser acidentalmente removidos da bactria pela pipetagem ou
homogeneizao muito vigorosa;
c) O flagelo se despolimeriza facilmente, isto , se dissocia
em monmeros de flagelina com freqncia (quando a temperatura
alcana mais de 60C, quando o pH se torna muito cido (pH 4,0) e
quando a clula est em presena de lcalis, de uria e de solventes
orgnicos);
d) necessria a aplicao de tcnicas para aumentar o dimetro dos flagelos, de forma a
torn-los visveis pelas tcnicas microscpicas usualmente adotadas em laboratrios
microbiolgicos.
O cido tnico contido no corante se ligar ao flagelo, tornando-o mais grosso. A
demonstrao do flagelo ocorrer devido ligao do corante ao cido tnico.
5.2 Procedimento
a) Preparar cultura da bactria em estudo sobre a superfcie de gar infuso de crebro ou
em gar soja triptona (com ou sem sangue), incubando em temperatura e tempo adequados;
b) Transferir delicadamente uma alada do crescimento para tubo contendo cerca de 3mL
de gua destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspenso. Colocar uma gota
desta suspenso sobre uma lmina e deixar secar ao ar;
c) Cobrir a lmina com o corante e deixar por 5 minutos, at que um brilho metlico
solues e dos reagentes includas nos anexos esto sinalizados com uma letra, indicando o
grupo de risco ao qual pertencem, sendo:
N = nocivo;
I = irritante;
T = txico;
H = hidropoluente;
P = perigoso para o meio ambiente;
C = corrosivo;
O = oxidante;
F = inflamvel;
E = explosivo;
M = mutagnico;
Co = comburente.
Recomenda-se que, antes da manipulao e descarte das referidas substncias, sejam
consultadas fichas prprias ou manuais de segurana, visando o reconhecimento dos principais
riscos inerentes e das medidas indispensveis para prevenir ou evitar a ocorrncia de acidentes
e minimizar os danos sade do usurio e ao meio ambiente.
1. gar azul de toluidina - DNA
Pesar separadamente os seguintes ingredientes:
gar DNAse - 4,2 g
Cloreto de sdio - 1,0 g
Tris (Hidroximetil) aminometano(I*). - 0,61 g
Soluo de Azul de Toluidina(H) 1 % - 0,92 mL
pH 9,00,2
(H) -hidropoluente
(I*) - irrita os olhos e a pele
Adicionar 100 mL de gua destilada/deionizada aos componentes da formulao, com
exceo do azul de toluidina.
Agitar com auxlio de basto de vidro at completa dissoluo.
Deixar repousar por 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Adicionar a soluo de azul de orto-toluidina.
No necessrio esterilizar.
Distribuir em placas cerca de 25 mL e deixar solidificar em superfcie plana.
2. gar Bacillus larvae (ABL)
Preparar, separadamente, alquotas de 100 mL de gar cereus (PEMBA) base, gar soja
triptona e gar estoque de acordo com o descrito neste captulo para cada um dos meios
especficos.
Fundir os meios e resfriar at 47 1C, mantendo em banhomaria.
Em um erlenmeyer estril, com capacidade mnima de 500 mL, misturar:
gar cereus (PEMBA) base - 100,0 mL
gar soja triptona (TSA) - 100,0 mL
gar estoque - 100,0 mL
Emulso de gema de ovo a 50% estril (*) - 30,0 mL
Agar - 15,0 g
pH 7,4 0,2
(N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele
(N) - nocivo por ingesto
(I ) - pode causar leses oculares graves
(H) - muito txico para os organismos aquticos
(P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico
11. gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose(VRBG)
Pesar o gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose de acordo com o volume de meio a
ser preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar repousar por 15 minutos.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Aquecer at completa dissoluo.
Normalmente, no necessrio esterilizar este meio, porm, se for preciso, este meio
pode ser autoclavado a 121C 1C por 5 minutos.
A composio bsica de gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose dever ser a
seguinte, por litro de meio:
Peptona de carne - 7,0 g
Extrato de levedura - 3,0 g
Glicose - 10,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Sais biliares n 3 - 1,5 g
Vermelho neutro (N*).- 0,03 g
Cristal violeta (N/I/H/P.- 0,002 g
Agar - 13,0 g
pH: 7,4 0,2
(N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele
(N) - nocivo por ingesto
(I ) - pode causar leses oculares graves
(H) - muito txico para os organismos aquticos
(P) - a longo prazo pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico
12. gar eosina azul de metileno (EMB)
Pesar o gar EMB de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Distribuir volumes de acordo com a necessidade.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar EMB dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de carne - 10,0 g
Lactose - 10,0 g
Fosfato de potssio bibsico - 2,0 g
Eosina amarela - 0,4 g
Azul de metileno (N/H). - 0,065 g
gar - 15,0 g
pH 7,0 0,2
(N) - nocivo por ingesto
(H) - substncia muito perigosa para gua
13. gar esculina
Pesar o gar esculina de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo do gar.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 3 a 5 mL em tubos.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar bile esculina dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de carne - 3,0 g
Peptona de carne - 5,0 g
Esculina - 0,1 g
Citrato frrico - 0,5 g
Agar - 14,5 g
pH 6,6 0,2
14. gar estoque
Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada em sua formulao.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir em tubos volumes que permitam a formao de um bisel longo.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Aps autoclavao, deixar os tubos solidificarem em posio inclinada.
Quando o meio for destinado estocagem de culturas referenciais, distribuir em tubos
pequenos com tampa de rosca ou em frascos tipo penicilina, deixando solidificar em posio
vertical.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar estoque dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona bacteriolgica - 13,8 g
Extrato de levedura - 6,0 g
Extrato de carne - 12,2 g
Cloreto de sdio - 10,0 g
Fosfato de sdio bibsico - 2,0 g
Agar - 15,0 g
pH 7,4 0,2
15. gar fenilalanina
Pesar o gar fenilalanina de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo do gar.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir em tubos volumes de 3 a 5 mL.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar fenilalanina dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de levedura - 3,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
DL-Fenilalanina - 2,0 g
Fosfato de sdio monobsico - 1,0 g
Agar - 15,0 g
pH 7,3 0,2
16. gar ferro dois acares (gar Kligler)
Pesar o gar ferro dois acares de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar repousar por cerca de 15 minutos.
Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volume compatvel com o tubo disponvel, capaz de, quando inclinado, formar
uma base de 3,0 cm de altura e, sobre ela, um bisel de 2 a 3 cm.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
A composio bsica de gar ferro dois acares dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de carne - 3,0 g
Extrato de levedura - 3,0 g
Peptona de casena - 15,0 g
Peptona de carne - 5,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Lactose - 10,0 g
D (+)Glicose - 1,0 g
Citrato frrico - 0,3 g
Tiosulfato de sdio - 0,3 g
Vermelho de fenol - 0,05 g
Agar - 12,0 g
pH 7,4 0,2
17. gar ferro dois acares (gar Kligler) sal 3%
Proceder conforme o indicado pelo fabricante para o preparo do gar Kligler,
acrescentando 25 g de cloreto de sdio a cada litro de meio preparado.
18. gar ferro trs acares (TSI)
Pesar o gar TSI de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar repousar por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volume compatvel com o tubo disponvel, capaz de formar uma base de 3,0
cm de altura e, sobre ela, um bisel de 2 a 3 cm quando inclinado.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar TSI dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de carne - 3,0 g
Extrato de levedura - 3,0 g
Peptona de casena - 15,0 g
Peptona de carne - 5,0 g
Lactose - 10,0 g
Sacarose - 10,0 g
D (+) Glicose - 1,0 g
Citrato de amnio e ferro - 0,5 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Tiosulfato de sdio - 0,3 g
Vermelho de fenol - 0,024 g
Agar - 12,0 g
pH 7,4 0,1
19. gar ferro trs acares (TSI) sal 3%
Proceder conforme o indicado pelo fabricante para o preparo do gar TSI, acrescentando
25 g de cloreto de sdio a cada litro de meio preparado.
A composio bsica do gar gelatina dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de carne - 5,0 g
Extrato de carne - 3,0 g
Gelatina - 120,0 g
pH 6,9 0,1
L-lisina - 10,0 g
Glicose - 1,0 g
Citrato Frrico Amoniacal - 0,5 g
Tiosulfato de Sdio - 0,04 g
Prpura de Bromocresol - 0,02 g
Agar - 12,5 g
pH 6,7 0,1
23. gar MacConkey-sorbitol (MCS)
Pesar o gar MacConkey-sorbitol (MCS) de acordo com o volume de meio a ser
preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada
correspondente.
Deixar repousar por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 100 mL em frascos adequados.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar MacConkey-sorbitol dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de casena - 17,0 g
Peptona de carne - 3,0 g
Sorbitol - 10,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Sais biliares - 1,5 g
Vermelho neutro (N*) - 0,03 g
Cristal violeta (N/I/H/P) - 0,001 g
Agar - 13,5 g
pH 7,1 0,1
(N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele
(N) - nocivo por ingesto
(I ) - pode causar leses oculares graves
(H) - muito txico para os organismos aquticos
(P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aqutico
24. gar manitol-gema de ovo-polimixina segundo Mossel (MYP)
Pesar o meio desidratado de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada
correspondente.
Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 90 mL em frascos adequados.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar manitol-gema de ovo-polimixina segundo Mossel dever ser
a seguinte, por litro de meio:
Extrato de carne - 1,0 g
Peptona de carne e peptona de casena (1:1) - 10,0 g
D-manitol - 10,0 g
Cloreto de sdio - 10,0 g
Vermelho de fenol - 0,025 g
Agar - 15,0 g
pH 7,1 0,1
Fundir o meio e resfriar em banho-maria at 49-50C.
Adicionar a cada 90 mL de gar fundido e resfriado:
a) 10 mL de emulso de gema de ovo a 50%;
b) 1 mL de soluo de sulfato de polimixina B 0,1% esterilizada por filtrao.
25. gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB)
Pesar o gar MLCB de acordo com volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada
correspondente.
Deixar repousar por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Evitar superaquecimento.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
No autoclavar.
Deixar resfriar at 49-50C, em banho-maria.
Distribuir em placas estreis.
Deixar solidificar em superfcie plana.
Identificar, datar e armazenar adequadamente.
Manter as placas sob refrigerao, invertidas e protegidas contra desidratao.
Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas
em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos.
A composio bsica do gar MLCB dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de Levedura - 5,0 g
Peptona - 10,0 g
Extrato de carne - 2,0 g
Cloreto de sdio - 4,0 g
Manitol - 3,0 g
L-Lisina cloridrato - 5,0 g
Tiosulfato de sdio - 4,0 g
Citrato de ferro e amnio - 1,0 g
Verde brilhante (N*) - 0,0125 g
Cristal violeta (N/I/H/P) - 0,01 g
gar - 15,0 g
pH 6,8 0,1
(N*) - nocivo por ingesto, por contato com os olhos e pele
(N) - nocivo por ingesto
Amido - 1,5 g
Agar - 17,0 g
pH 7,3 0,2
31. gar nutriente
Pesar o gar nutriente de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo do gar.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir alquotas de 10 mL em tubos apropriados.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Aps autoclavao, deixar solidificar em posio inclinada, de forma a obter um bisel
longo.
Identificar, datar e armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar nutriente dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona - 5,0 g
Extrato de carne - 1,0 g
Extrato de levedura - 2,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Agar - 15,0 g
pH 7,4 0,2
32. gar nutriente com sulfato de mangans
Preparar o gar nutriente conforme descrito no item anterior e adicionar 300 mg de sulfato
de mangans a cada litro de meio.
Fundir o meio e deixar resfriar em banho-maria at 45-50C.
Distribuir cerca de 10 mL em tubos.
Deixar solidificar de forma inclinada, de maneira a obter um bisel maior ou igual a 4 cm.
Identificar, datar e armazenar adequadamente.
33. gar nutriente isento de extrato de levedura
Pesar o gar nutriente de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo do gar.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir alquotas de 10 mL em tubos apropriados.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Aps autoclavao, deixar solidificar em posio inclinada, de forma a obter um bisel
longo.
Identificar, datar e armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar nutriente isento de extrato de levedura dever ser a
at completa dissoluo.
Adicionar um vial para cada 500 mL de meio.
Distribuir em placas estreis, deixando solidificar em superfcie plana.
Identificar, datar e armazenar sob refrigerao, protegidas da luz, por at 4 semanas.
O suplemento para o gar PALCAM contido em cada vial, comercialmente disponvel, tem
em sua composio as seguintes substncias:
Sulfato de Polimixina B - 5,0 mg
Ceftazidina - 10 mg
Acriflavina(T). - 2,5 mg
(T) - txico por ingesto e por inalao
38. gar para ensaio de DNAse com verde de metila
Pesar separadamente os seguintes ingredientes:
gar DNAse - 4,2 g
Verde de metila(H). - 0,05g
pH 7,30,2
(H) - hidropoluente
Adicionar 100 mL de gua destilada/deionizada ao agar DNAse.
Agitar com auxlio de basto de vidro at completa dissoluo.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Adicionar o verde de metila.
No necessrio esterilizar.
Distribuir em placas cerca de 25 mL e deixar solidificar em superfcie plana.
39. gar para esporulao
Pesar o gar para esporulao de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar.
Esterilizar a 121 1C por 20 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar para esporulao dever ser a seguinte, por litro de meio:
Polipeptona - 15,0 g
Extrato de levedura - 3,0 g
Amido solvel - 3,0 g
Sulfato de mangans - 0,1 g
Tioglicolato de sdio - 1,0 g
Fosfato de sdio bibsico - 11,0 g
Agar - 15,0 g
pH 7,8 0,1
40. gar para fermentao de carboidratos - base com prpura de bromocresol
Sacarose - 20,0 g
Colato de sdio - 3,0 g
Cloreto de sdio - 10,0 g
Citrato frrico - 1,0 g
Azul de bromotimol - 0,04 g
Azul de timol - 0,04 g
Agar - 15,0 g
pH 8,6 0,2
48. gar tirosina
Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada em sua formulao.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 100 ou 50 mL em frascos adequados.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
A composio do gar tirosina base dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de carne - 8,6 g
Peptona - 1,0 g
Agar - 15,0 g
pH 7,0 0,2
A 100 mL do meio base, fundido e resfriado a 45-50C, adicionar 10 mL de soluo
aquosa estril de tirosina a 5% e misturar bem.
Distribuir cerca de 10 mL em tubos de ensaio estreis, agitando para evitar a separao
da tirosina.
Este meio tambm pode ser distribudo em placas.
49. gar triptose (AT)
Pesar o meio gar triptose de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando
a proporo indicada pelo fabricante.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Adicionar a cada litro de meio 2 mL de soluo de cido nalidxico a 1%.
Homogeneizar.
Deixar repousar por 15 minutos.
Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir pores de 100 e 50 mL em frascos apropriados.
Aquecer at completa dissoluo.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C, por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar AT dever ser a seguinte por litro de meio:
Bacto triptose - 20,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Dextrose - 1,0 g
Extrato de levedura - 6,0 g
gar - 15,0 g
pH 7,4 0,2
(N) - nocivo por ingesto
50. gar Triptose com cido nalidxico (ATN)
Preparar o AT de acordo com o item anterior.
Adicionar a cada litro de meio 2 mL de soluo de cido nalidxico a 1%.
Homogeneizar.
51. gar triptose sulfito cicloserina (TSC)
Pesar o gar TSC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar repousar por 15 minutos.
Aquecer, sob agitao, at completa dissoluo do meio.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir em frascos. Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica de gar TSC dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de carne - 15,0 g
Peptona de soja - 5,0 g
Extrato de levedura - 5,0 g
Bisulfito de sdio - 1,0 g
Citrato de amnio e ferro III - 1,0 g
Agar - 20,0 g
pH 7,4 0,2
No momento do uso, fundir o gar e resfriar at 46-48C em banho-maria.
Incorporar ao meio fundido e resfriado 10 mL de uma soluo a 5% de cicloserina
esterilizada por filtrao, por cada litro de meio.
52. gar uria
Pesar o gar uria base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Homogeneizar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir em frascos. Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar uria dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de Carne - 1,0 g
Fosfato de potssio monobsico - 2,0 g
D+Glicose - 1,0 g
Vermelho de fenol - 0,012 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Agar - 12,0 g
pH 6,8 0,2
Antes do uso, fundir o gar uria e resfriar at 50C em banho-maria.
Assepticamente, adicionar 50 mL de soluo de uria 40% esterilizada por filtrao, por
litro de meio.
Distribuir de acordo com o uso.
53. gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose(BPLS)
Pesar o gar BPLS, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Deixar em repouso por cerca de 15 minutos.
Aquecer at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de acordo com a necessidade.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do gar BPLS dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de carne - 5,0 g
Peptona de casena - 5,0 g
Extrato de levedura - 3,0 g
Lactose - 10,0 g
Sacarose - 10,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Fosfato de sdio bibsico - 2,0 g
Verde brilhante (N). - 0,0125 g
Vermelho de fenol - 0,08 g
Agar - 12,0 g
pH 6,9 0,1
(N) - nocivo por ingesto
Antes do uso, aps dissoluo do meio e resfriamento at cerca de 50C, adicionar a cada
100 mL de meio 0,1 mL de soluo de novobiocina a 4%.
Distribuir em placas estreis.
Deixar solidificar em superfcie plana.
Manter as placas sob refrigerao, invertidas e protegidas contra desidratao.
Antes do uso, secar a superfcie do meio, colocando as placas semi-abertas e invertidas
em estufa a 45-50C por cerca de 15 minutos.
54. gar xilose-lisina-desoxicolato (XLD)
Pesar o gar XLD de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
pH 7,0 0,2
58. Caldo crebro-corao (BHI)
Pesar o meio caldo crebro-corao (BHI) de acordo com o volume de meio a ser
preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Homogeneizar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir 10 mL em tubos com tampa de rosca.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do caldo crebro-corao (BHI) dever ser a seguinte, por litro de
meio:
Infuso de crebro de carneiro - 12,5 g
Infuso de corao de boi. - 5,0 g
Proteose-peptona - 10,0 g
D (+) glicose - 2,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Fosfato dissdico - 2,5 g
pH 6,6 0,2
59. Caldo crebro-corao concentrao dupla-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6%(BHI-SE)
Pesar 2 vezes a quantidade de meio caldo crebro-corao (BHI) indicada pelo fabricante,
adicionando 1,5 g de Cloreto de sdio e 6,0 g por litro de meio a ser preparado.
60. Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3)
Pesar o meio caldo crebro-corao, de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Adicionar 1,5 g de nitrato de potssio(Co) para cada litro de meio.
(Co) - perigo de fogo em contato com materiais combustveis
61. Caldo crebro-corao-sal 0,65%- extrato de levedura 0,6%(BHI-SE)
Pesar o meio caldo crebro-corao (BHI), de acordo com o volume de meio a ser
preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Adicionar 1,5 g de Cloreto de sdio e 6,0 g de extrato de levedura, por litro de meio a ser
preparado.
62. Caldo Crebro-corao tiamina (BHI-T)
Pesar o meio caldo crebro-corao (BHI), de acordo com o volume de meio a ser
preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Antes do uso, adicionar, em cada tubo com 10 mL, 0,2 mL de soluo aquosa de tiamina a
0,01%, esterilizada por filtrao.
63. Caldo de carne cozida (CCC)
Em cada tubo selecionado para uso, distribuir 10 mL de gua destilada/deionizada e 1 g
Triptona - 5,0 g
Extrato de carne purificado - 5,0 g
Extrato de levedura - 5,0 g
Cloreto de sdio - 20,0 g
Fosfato de potssio monobsico - 1,35 g
Fosfato de sdio bibsico - 12,0 g
Esculina - 1,0 g
pH 7,4 0,2
Imediatamente antes do uso, assepticamente adicionar 1 vial de suplemento especfico
para cada 500 mL de caldo.
Na ausncia do suplemento vial, adicionar 1,2 mL de soluo aquosa a 1,0% de acriflavina
cloridrato (T) e 2 mL de cido nalidxico soluo 1% em NaOH 0,1N (esterilizadas por filtrao)
por litro de caldo.
(T) - txico por ingesto e por inalao
(N) - nocivo por ingesto
OBS: Algumas marcas j contm os suplementos. Outras contm o cido nalidxico,
necessitando apenas a complementao com acriflavina.
O contedo do suplemento vial para o caldo UVM, comercialmente disponvel, o
seguinte:
Acriflavina(T/H).- 6,0 mg
cido nalidxico(N/H) .- 10,0 mg
gua destilada ou deionizada - 5,0 mL
(T) - txico por ingesto e por inalao
(N) - nocivo por ingesto, e em contato com a pele e com
olhos
(H) - hidropoluente classe 3
66. Caldo EC
Pesar o caldo EC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Agitar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio previamente preparados com tubos de
Durhan invertidos.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
A composio bsica de caldo EC dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona - 20,0 g
Lactose - 5,0 g
Bile bovina - 1,5 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Fosfato de potssio bibsico - 4,0 g
Fosfato de potssio monobsico - 1,5 g
pH 6,9 0,2
Identificar e datar.
Autoclavar a 115 1C por 10 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do caldo Rappaport Vassiliadis dever ser a seguinte, por litro de
meio:
Peptona de soja - 5,0 g
Cloreto de sdio - 8,0 g
Fosfato de potssio monobsico - 1,6 g
Cloreto de magnsio* - 40,0 g
Verde malaquita* (N).- 0,04 g
pH 5,2 0,2
(N) - nocivo por contato com a pele e por ingesto
* - algumas marcas de meio Rappaport Vassiliadis no incluem cloreto de magnsio e
verde malaquita em sua formulao. Ao utilizar este meio, verificar a necessidade de
suplementao.
OBS. O meio preparado pode ser estocado em refrigerao por at 7 meses (Vassiliadis et al.
1985)
82. Caldo selenito cistina
Pesar o caldo selenito cistina, de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Aquecer, se necessrio, at no mximo 60C, para completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir 10 mL em tubos de ensaio.
No autoclavar.
Usar imediatamente aps o preparo.
Descartar o meio que no for utilizado.
A composio bsica do caldo selenito cistina dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona de casena - 5,0 g
L (-) cistina - 0,01 g
Lactose - 4,0 g
Fosfato de sdio bibsico - 2,0 g
Bi-selenito de sdio (T) - 4,0 g
pH 7,0 0,2
(T) - txico por inalao e ingesto / pode ter efeitos cumulativos
83. Caldo soja triptona (TSB)
Pesar o caldo TSB, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Agitar, com auxlio de basto de vidro ou agitador magntico, at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de acordo com a necessidade.
Identificar e datar.
A composio bsica do caldo uria dever ser a seguinte, por litro de meio:
Extrato de levedura - 0,1 g
Fosfato de potssio monobsico - 9,1 g
Fosfato de sdio bibsico - 9,5 g
Uria - 20,0 g
Vermelho de fenol - 0,1 g
pH 6,8 0,1
89. Caldo Verde brilhante bile lactose 2%
Pesar o caldo Verde brilhante bile lactose 2%, de acordo com o volume de meio a ser
preparado, respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de gua destilada/deionizada
correspondente. Agitar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
A composio bsica de caldo Verde brilhante-bile 2%-lactose dever ser a seguinte, por
litro de meio:
Peptona - 10,0 g
Lactose - 10,0 g
Bile Bovina - 20,0 g
Verde brilhante (N).- 0,0133 g
pH 7,4 0,2
(N) - nocivo por ingesto
90. Caldo Verde brilhante-bile-lactose 2% - MUG (BRILAMUG)
Pesar o caldo Brila-MUG de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Misturar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos.
Identificar e datar.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
Armazenar adequadamente.
A composio bsica do caldo Brila-MUG dever ser a seguinte, por litro de meio:
Peptona - 10,0 g
Lactose - 10,0 g
L-triptofano - 1,0 g
Bile concentrado - 20,0 g
Verde brilhante (N).- 0,0133 g
4 - Metilumbeliferil - - D- glicurondeo - 0,1 g
pH 7,2 0,1
(N) - nocivo por ingesto
91. Caldo vermelho de fenol - base (para fermentao de carboidratos)
Pesar o caldo vermelho de fenol - base de acordo com o volume de meio a ser preparado,
respeitando a proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Agitar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 90 mL em frascos.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos ou esterilizar por filtrao aps a adio da soluo
de carboidrato.
A composio bsica de caldo vermelho de fenol base dever ser a seguinte, por litro de
meio:
Proteose peptona - 10,0 g
Extrato de carne - 1,0 g
Cloreto de sdio - 5,0 g
Vermelho de fenol - 0,018 g
pH 7,4 0,2
Adicionar aos frascos com 90 mL de meio autoclavado e resfriado a 45-50C 10 mL de
soluo de carboidrato esterilizada por filtrao; caso se opte por no autoclavar o meio base,
adicionar a soluo de carboidrato e esterilizar a mistura por filtrao. As solues de
carboidratos devero estar em concentrao final de 5,0 a 10,0 g por litro de meio.
O preparo das solues de carboidratos poder ser verificada no captulo Reagentes e
Solues, deste Anexo.
Distribuir em tubos, de acordo com a necessidade.
Tampar e identificar os tubos.
Manter sob refrigerao at o momento do uso.
92. Caldo Vermelho de fenol sal 3%
Preparar o caldo vermelho de fenol base de acordo com o indicado, adicionando 30 g de
cloreto de sdio por litro de meio.
93. Caldo vermelho de fenol sal 3%-lisina
Preparar o caldo vermelho de fenol-sal de acordo com o indicado.
Adicionar 1 mL de soluo de lisina a 10% esterilizada por filtrao a cada tubo com 10 mL
de meio bsico.
94. Caldo VM-VP
Pesar o caldo VM-VP de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a
proporo indicada pelo fabricante.
Transferir para recipiente adequado.
Adicionar o volume de gua destilada/deionizada correspondente.
Agitar at completa dissoluo.
Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especfica do laboratrio.
Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio.
Autoclavar a 121 1C por 15 minutos.
A composio bsica de caldo VM-VP dever ser a seguinte, por litro de meio:
Proteose peptona - 7,0 g
Glicose - 5,0 g
O = oxidante;
F = inflamvel;
E = explosivo;
M = mutagnico.
Recomenda-se que, antes da manipulao e descarte das referidas substncias, sejam
consultadas as fichas prprias de cada substncia ou os manuais de segurana, visando ao
reconhecimento dos principais riscos inerentes e das medidas indispensveis para prevenir ou
evitar a ocorrncia de acidentes e minimizar os danos sade do usurio e ao meio ambiente.
Quando houver manipulao de materiais corrosivos, usar sempre luvas adequadas e
mscaras; sendo material txico, utilizar sempre a cabine qumica.
CONVENES
As solues preparadas por meio da dissoluo do reativo em lcool, seguida ou no da
adio de gua destilada/deionizada, neste anexo sero denominadas como soluo alcolica.
Ex.: Alfa-naftol soluo alcolica 5%.
As solues preparadas por meio da dissoluo do reativo em gua destilada/deionizada,
neste anexo sero denominadas como soluo aquosa.
Ex.: Novobiocina soluo aquosa 4%.
As solues preparadas por meio da dissoluo do reativo em meio alcalino ou cido,
neste anexo sero acompanhadas da indicao do diluente usado para sua preparao.
Ex.: cido nalidxico soluo 2% em NaOH 0,1 N.
Alfa-naftilamina soluo 0,5% em cido actico 5N.
Onde houver a indicao Esterilizar por Filtrao utilizar filtro com membrana de 0,22
micrmetros previamente preparado e esterilizado.
PREPARO DE REAGENTES E SOLUES
1. cido actico 5N
Adicionar 28,75 mL de cido actico glacial(C/F) a 71,25 mL de gua destilada/deionizada.
Armazenar em frasco de vidro. Identificar e datar.
(C) - corrosivo / provoca queimaduras graves
(F) - inflamvel
2. cido clordrico 0,01N
Adicionar a 10 mL de cido clordrico 0,1N quantidade de gua destilada/deionizada
suficiente para completar 100 mL. Usar vidraria volumtrica para a preparao. Armazenar em
frasco de vidro.
Identificar e datar.
3. cido clordrico 0,1N
Adicionar a 10 mL de cido clordrico 1N quantidade de gua destilada/deionizada
suficiente para completar 100 mL. Usar vidraria volumtrica para a preparao. Armazenar em
frasco de vidro.
Identificar e datar.
4. cido clordrico 1N
Dissolver 82,3 mL de cido clordrico fumegante(C/I) (concentrao 37%) em volume de
gua destilada/deionizada suficiente para completar 1000 mL. Armazenar em frasco de vidro.
Identificar e datar.
(C) - corrosivo / provoca queimaduras
(I) - irrita as vias respiratrias
5. cido nalidxico soluo 0,1% em PBS pH 7,2
Transferir 10 mL da soluo de cido nalidxico 1% para balo volumtrico de capacidade
para 100 mL e completar o volume com tampo fosfato pH 7,2.
Esterilizar por filtrao.
Distribuir em alquotas de 20 mL, em frascos de vidro estreis identificados e datados.
Manter a -20C por at 6 meses.
Manter uma das alquotas sob refrigerao, para uso dirio.
Usar 1 mL desta soluo para cada 100 mL de gar ABL.
6. cido nalidxico soluo 1% em NaOH 0,1N
Pesar 1,0 g de cido nalidxico(N), colocar em balo volumtrico de 100 mL e adicionar
NaOH 0,1 N, agitando para dissoluo, at completar o volume.
Distribuir em frasco plstico identificado e datado, e manter protegido da luz.
7. cido nalidxico soluo 2% em NaOH 0,1 N
Pesar 2,0 g de cido nalidxico(N), colocar em balo volumtrico de 100 mL e adicionar
NaOH 0,1 N, agitando para dissoluo, at completar o volume.
Distribuir em alquotas de 10 mL, em frascos plsticos identificados e datados, protegidos
da luz.
Manter a -20C por at 12 meses.
Manter uma das alquotas sob refrigerao para utilizao diria.
(N) - nocivo por ingesto
8. cido peractico soluo aquosa 0,02%
Diluir 6,5 mL de cido peractico(C/I/E) (produto comercial a 15%) em 5 litros de gua
destilada/deionizada.
Manter em frasco de plstico identificado e datado.
Utilizar a soluo preparada, no mximo, em 48 horas.
(C) - corrosivo / provoca queimaduras
(I) - irritante para o aparelho respiratrio, pele e olhos
(E) - potencialmente explosivo
9. cido pipemdico soluo 0,2% em PBS pH 7,2
Transferir 10 mL da soluo de cido pipemdico 2% para balo volumtrico de
capacidade 100 mL e completar o volume com tampo fosfato pH 7,2.
Esterilizar por filtrao.
Distribuir em alquotas de 20 mL, em frasco de vidro estril identificado e datado.
Manter a -20C por at 6 meses.