1

CAPTULO 8 - ENZIMAS
Existem duas condies fundamentais para a vida. Uma delas que o organismo
vivo deve ser capaz de se auto replicar (um tpico que ser visto na Parte IV deste livro).
A segunda que o organismo deve ser capaz de catalisar reaes qumicas eficiente e
seletivamente. A importncia fundamental da catlise pode surpreender alguns estudantes
iniciantes em bioqumica, mas fcil ilustra-la. Como descrito no Captulo 1, os sistemas
vivos utilizam energia do meio ambiente. Os seres humanos, por exemplo, consomem
quantidades substanciais de sacarose o acar comumente usado como uma espcie de
combustvel, na forma de comidas aucaradas, bebidas ou como acar. A converso da
sacarose em CO2 e H2O na presena de oxignio um processo altamente exergnico, que
libera energia livre que pode ser usada para pensar, mover, sentir e ver. Entretanto, um
saco de acar pode ser armazenado durante vrios anos sem ser transformado em CO2 e
H2O. Embora esse processo qumico seja termodinamicamente favorvel, ele muito lento
! Contudo, quando a sacarose consumida por uma pessoa (ou qualquer outro organismo),
ela libera sua energia qumica em segundos. A diferena a catlise. Sem a catlise, as
reaes qumicas necessrias para sustentar a vida no ocorrem em uma escala de tempo
til.
Ns dirigiremos agora a ateno para os catalisadores das reaes que ocorrem nos
sistemas biolgicos: as enzimas, as mais notveis e altamente especializadas protenas. As
enzimas apresentam uma eficincia cataltica extraordinria, em geral muito maior que a
dos catalisadores sintticos ou inorgnicos. Elas tm um alto grau de especificidade por
seus substratos, aceleram as reaes qumicas de uma maneira formidvel e funcionam em
solues aquosas sob condies muito suaves de temperatura e pH. Poucos catalisadores
no-biolgicos apresentam tais propriedades.
As enzimas so fundamentais para qualquer processo bioqumico. Agindo em
seqncias organizadas, elas catalisam as centenas de reaes sucessivas onde as molculas
nutrientes so degradadas, a energia qumica conservada e transformada e as
macromolculas biolgicas so sintetizadas a partir de molculas precursoras simples.
Devido ao das enzimas reguladoras, as vias metablicas so altamente coordenadas de
forma a produzir uma atuao harmoniosa das muitas diferentes atividades necessrias
para manter a vida.
O estudo das enzimas tem uma grande importncia prtica. Em algumas doenas,
especialmente nas desordens genticas herdadas, pode ocorrer uma deficincia ou mesmo a
ausncia total de uma ou mais enzimas. Outras condies anormais tambm podem ser
causadas pela excessiva atividade de uma enzima. Medidas da atividade de enzimas no
plasma sangneo, eritrcitos ou amostras de tecido so importantes no diagnstico de
vrias doenas. Muitas drogas exercem seu efeito biolgico atravs de interaes com as
enzimas. As enzimas tornaram-se importantes ferramentas prticas, no apenas na
medicina, mas tambm na indstria qumica, no processamento de alimentos e na
agricultura.
Ns iniciaremos este captulo com a descrio das propriedades das enzimas e dos
princpios fundamentais do seu poder cataltico. Em seguida ser feita uma introduo
cintica enzimtica, uma disciplina que fornece a maior parte dos fundamentos para
qualquer discusso sobre enzimas. Exemplos especficos de mecanismos enzimticos sero
ento mostrados, ilustrando os princpios introduzidos anteriormente. Finalmente faremos
uma discusso sobre as enzimas reguladoras.
Uma Introduo s Enzimas
A maior parte da histria da bioqumica a histria da pesquisa sobre enzimas. A
catlise biolgica foi inicialmente reconhecida e descrita no final de 1700, em estudos
sobre a digesto da carne por secrees do estmago. Em 1800 as pesquisas continuaram
com o estudo da converso do amido em acares simples pela saliva e por vrios extratos
vegetais. Em 1850, Louis Pasteur concluiu que a fermentao do acar em lcool pela
levedura catalisada por fermentos. Ele postulou que esses fermentos eram inseparveis
da estrutura das clulas de levedura vivas, uma hiptese chamada vitalismo, que

prevaleceu por muitos anos. Em 1897, Edward Buchner descobriu que os extratos de
levedura podiam fermentar o acar at lcool, provando que a fermentao era promovida
por molculas que continuavam funcionando mesmo quando removidas das clulas.
Frederick W. Khne denominou tais molculas de enzimas. medida que as noes do
vitalismo da vida foram refutadas, o isolamento de novas enzimas e a investigao das
suas propriedades propiciaram o progresso da cincia da bioqumica.
Edward Buchner
1860-1917
James Sumner
1887-1955
J.B.S. Haldane
1892-1964

O isolamento e a cristalizao da urease em 1926 por James Sumner, propiciou um

significante avano nos estudos iniciais acerca das enzimas. Sumner demonstrou que os
cristais de urease consistiam inteiramente de protena e postulou que todas as enzimas so
protenas. Devido falta de outros exemplos, esta idia permaneceu controvertida por
algum tempo. Somente em 1930, aps John Northrop e Moses Kunitz terem cristalizado a
pepsina, a tripsina e outras enzimas digestivas e terem concludo que elas tambm eram
protenas, que a concluso de Sumner foi completamente aceita. Durante esse perodo,
J.B.S. Haldane escreveu um tratado intitulado Enzimas. Embora a natureza molecular
das enzimas no estivesse completamente entendida, Haldane fez a extraordinria sugesto
de que as interaes fracas que se estabelecem entre a enzima e o seu substrato poderiam
ser usadas para distorcer a molcula do substrato e catalisar a reao. Este conhecimento
representa o cerne da compreenso atual da catlise enzimtica.
No final do sculo XX, a pesquisa com enzimas que catalisam as reaes do
metabolismo celular foi intensa. Isto levou purificao de milhares de enzimas,
elucidao da estrutura molecular e do mecanismo qumico da ao de centenas delas e a
uma compreenso geral de como as enzimas funcionam.
A maioria das enzimas so protenas
Com exceo de um pequeno grupo de molculas de RNA que apresentam
propriedades catalticas (Captulo 26), todas as enzimas so protenas. A sua atividade
cataltica depende da integridade da sua conformao protica nativa. Se uma enzima
desnaturada ou dissociada em subunidades, a atividade cataltica geralmente destruda.
Se uma enzima quebrada em seus aminocidos constituintes, a sua atividade cataltica
sempre destruda. Assim, as estruturas proteicas primria, secundria, terciria e
quaternria das enzimas so essenciais para a sua atividade cataltica.
As enzimas, como outras protenas, tm pesos moleculares que variam entre cerca de
12.000 at mais de 1 milho. Algumas enzimas no requerem nenhum outro grupo
qumico alm dos seus resduos de aminocidos. Outras requerem um componente qumico
adicional chamado de cofator um ou mais ons inorgnicos, tal como Fe2+, Mg2+, Mn2+
ou Zn2+ (Tabela 8-1), uma molcula orgnica complexa ou uma molcula metalorgnica
chamada de coenzima (Tabela 8-2). Algumas enzimas requerem ambas, a coenzima e um

ou mais ons metlicos para sua atividade. A coenzima ou on metlico que est
firmemente ou at mesmo covalentemente ligada parte protica da enzima chamada de
grupo prosttico. Uma enzima completa e cataliticamente ativa, juntamente com a sua
coenzima e/ou ons metlicos ligados, chamada de holoenzima. A parte protica desta
enzima chamada de apoenzima ou apoprotena. As coenzimas funcionam como
transportadores transitrios de grupos funcionais especficos (Tabela 8-2). Geralmente elas
so derivadas de vitaminas, nutrientes orgnicos necessrios em pequenas quantidades na
alimentao diria. As coenzimas sero estudadas com maiores detalhes medida que elas
forem sendo encontradas nas vias metablicas discutidas na Parte III deste livro.
tabela 8-1
Alguns elementos inorgnicos que servem como cofatores das enzimas
Cu2+
Citocromo oxidase
Fe2+ ou Fe3+
Citocromo oxidase, Catalase, Peroxidase
K+
Piruvato quinase
2+
Mg
Hexoquinase, Glicose-6-fosfatase, Piruvato quinase
Mn2+
Arginase, Ribonucleotdeo redutase
Mo
Dinitrogenase
2+
Ni
Urease
Se
Glutationa peroxidase
Zn2+
Anidrase carbnica, Desidrogenase alcolica, Carboxipeptidases A
eB
Finalmente, algumas enzimas so modificadas covalentemente por fosforilao,
glicosilao e outros processos. Muitas destas alteraes esto envolvidas na regulao da
atividade enzimtica.
tabela 8-2
Algumas coenzimas que servem como carregadores transientes de tomos especficos
ou grupos funcionais*
Coenzima
Exemplos de grupos
Precursor diettico em
qumicos transferidos
mamferos
Biocitina
CO2
Biotina
Coenzima A
Grupos acila
cido pantotnico e outros
compostos
5-deoxiadenosilcobalamina tomos de H e grupos acila Vitamina B12
(coenzima B12)
Flavina adenina
Eltrons
Riboflavina (vitamina B2)
dinucleotdeo
Lipoato
Eltrons e grupos acila
No requerido na dieta
Nicotinamida adenina
on hidreto (:H-)
cido nicotnico (niacina)
dinucleotdeo
Piridoxal fosfato
Grupos amina
Piridoxina (vitamina B6)
Tetrahidrofolato
Grupos monocarbnicos
Folato
Tiamina pirofosfato
Aldedos
Tiamina (vitamina B1)
*A estrutura e o modo de ao destas coenzimas esto descritos na Parte III deste livro.
As enzimas so classificadas pelas reaes que catalisam
Muitas enzimas tm sido nomeadas pela adio do sufixo ase ao nome do seu
substrato, ou palavra ou frase que descreve sua atividade. Assim, a urease catalisa a
hidrlise da uria e a DNA polimerase catalisa a polimerizao dos nucleotdeos para
formar o DNA. Outras enzimas, como a pepsina e a tripsina, tm nomes independentes dos
seus substratos ou reaes. Algumas vezes, a mesma enzima tem dois ou mais nomes ou
duas diferentes enzimas possuem o mesmo nome. Devido a tais ambigidades e ao sempre
crescente nmero de enzimas recm descritas, atravs de um acordo internacional, foi

adotado um sistema para nomear e classificar as enzimas. Este sistema divide as enzimas
em seis grandes classes, cada uma com subclasses, conforme o tipo de reao catalisada
(Tabela 8-3). A cada enzima atribudo um nmero classificatrio de quatro dgitos e um
nome sistemtico, que identifica a reao que ela catalisa. Exemplificando, o nome
sistemtico formal da enzima que catalisa a reao:
ATP + D-glicose ADP + D-glicose-6-fosfato
ATP-glicose fosfotransferase, indicando que ela catalisa a transferncia de um grupo
fosfato do ATP para a glicose. O seu nmero na Comisso de Enzimas (nmero E.C.)
2.7.1.1. O primeiro dgito (2) denota o nome da classe (transferase); o segundo dgito (7),
a subclasse (fosfotransferase); o terceiro dgito (1), uma fosfotransferase que apresenta um
grupo hidroxila aceptor de fosfato; e o quarto dgito (1), indica que a D-glicose o aceptor
do grupo fosfato. Para muitas enzimas, um nome trivial pode ser usado, como por exemplo
no caso da hexoquinase.
tabela 8-3
Classificao internacional das enzimas*
No.
Classe
Tipo de reao catalisada
1
Oxidoredutases
Transferncia de eltrons (ons hidretos ou tomos de H)
2
Transferases
Reaes de transferncia de grupos
3
Hidrolases
Reaes de hidrlise (transferncia de grupos funcionais
para a gua)
4
Liases
Adio de grupos duplas ligaes ou formao de duplas
ligaes atravs de remoo de grupos
5
Isomerases
Transferncia de grupos dentro da mesma molcula para
formar ismeros
6
Ligases
Formao de ligaes do tipo C-C, C-S, C-O e C-N atravs
de reaes de condensao acopladas quebra do ATP
*A maioria das enzimas catalisa a transferncia de eltrons, tomos ou grupos funcionais.
Desse modo, elas so classificadas de acordo com um nmero de cdigo e atribuindo-se
um nome de acordo com o tipo da reao de transferncia, do grupo doador e do grupo
aceptor. Uma lista completa e a descrio das milhares de enzimas conhecidas est alm do
objetivo deste livro. Este captulo destinado principalmente aos princpios e s
propriedades comuns a todas as enzimas.
Como As Enzimas Funcionam
A catlise enzimtica das reaes essencial para os sistemas vivos. Sob condies
biolgicas relevantes, as reaes no catalisadas tendem a ser lentas muitas das
molculas biolgicas so bastante estveis no ambiente aquoso, de pH neutro e
temperatura moderada, do interior das clulas. Alm disso, muitas reaes bioqumicas
comuns envolvem eventos qumicos que so desfavorveis ou improvveis no ambiente
celular, tais como a formao de intermedirios carregados ou a coliso de duas ou mais
molculas com a orientao precisa necessria para que ocorra a reao. Sem catlise, as
reaes necessrias para digerir os alimentos, enviar sinais atravs dos nervos ou contrair
um msculo simplesmente no ocorrem com uma velocidade til.
Uma enzima contorna estes problemas fornecendo um ambiente especfico onde
uma dada reao energeticamente mais favorvel. A caracterstica que distingue uma
reao catalisada enzimaticamente que ela ocorre no interior dos limites de uma cavidade
na enzima chamada stio ativo (Fig. 8-1). A molcula que se liga ao stio ativo e que sofre
a ao da enzima chamada substrato. A superfcie do centro ativo contornada com
resduos de aminocidos cujos grupos substituintes se ligam ao substrato e catalisam a sua
transformao. O complexo enzima-substrato, cuja existncia foi inicialmente proposta por
Adolphe Wurtz em 1980, fundamental para a ao das enzimas. Ele tambm o ponto de
partida para os tratamentos matemticos que definem o comportamento cintico das

reaes catalisadas por enzimas bem como para as descries tericas dos mecanismos
enzimticos.
figura 8-1
Ligao de uma molcula de substrato no stio ativo de uma enzima. A enzima
quimotripsina est ligada ao substrato mostrado em vermelho. Alguns aminocidos
essenciais do stio ativo so mostrados como manchas vermelhas na superfcie da enzima.
As enzimas afetam a velocidade mas no o equilbrio qumico das reaes
Uma reao enzimtica simples pode ser escrita
E + S ES EP E + P
(8-1)
onde E, S e P representam, a enzima, o substrato e o produto. ES e EP so complexos
transientes da enzima com o substrato e com o produto.
Para compreender a catlise enzimtica, precisamos primeiro entender a importante
distino entre equilbrio da reao (discutido no Captulo 4) e velocidade da reao. A
funo de um catalisador aumentar a velocidade de uma reao. Os catalisadores no
afetam o equilbrio da reao. Qualquer reao, do tipo S P, pode ser descrita por um
diagrama de coordenadas da reao (Fig. 8-2), uma representao das mudanas de energia
durante a reao. Conforme explicado nos Captulos 1 e 3, a energia nos sistemas
biolgicos descrita em termos de energia livre, G. No diagrama de coordenadas, a
energia livre do sistema representada em funo do progresso da reao (coordenada da
reao). O ponto de partida, tanto para a reao de ida como para a reao reversa,
chamado estado fundamental e representa a contribuio de uma molcula tpica (S ou P)
para a energia livre do sistema, em um dado conjunto de condies. Para descrever as
variaes de energia livre das reaes, os qumicos definem um conjunto de condies
padres (temperatura 298 K; presso parcial de cada gs, 1 atm ou 101,3 kPa;
concentrao de cada soluto 1M, e expressam a variao da energia livre para este sistema
reagente como Go, a variao da energia livre padro. Como os sistemas biolgicos
geralmente envolvem concentraes de H+ muito diferentes de 1M, os bioqumicos
definem a variao da energia livre padro bioqumica Go, como sendo a variao da
energia livre padro em pH 7,0, que ser utilizada neste livro. Uma definio mais
completa de Go dada no Captulo 14.
figura 8-2
Diagrama de coordenadas de reao para uma reao qumica. A energia livre do
sistema representada em funo do progresso da reao S P. Um diagrama desta
natureza descreve as mudanas de energia durante a reao e o eixo horizontal
(coordenadas da reao) reflete as mudanas qumicas sucessivas (por exemplo, quebra e
formao de ligaes) medida que S convertido em P. As energias de ativao para as
reaes S P e P S, esto indicadas por G. Go a variao total da energia livre
padro para a reao SP.
O equilbrio entre S e P reflete a diferena em energia livre dos seus estados
fundamentais. No exemplo mostrado na Figura 8-2, a energia livre do estado fundamental
de P menor que a de S, assim Go negativa para a reao S P e o equilbrio favorece
a formao de P. A posio e a direo do equilbrio no so afetadas por nenhum
catalisador.
Um equilbrio favorvel no significa que a converso SP ocorra com uma
velocidade mensurvel. A velocidade da reao depende de um parmetro completamente
diferente. Existe uma barreira energtica entre S e P que representa a energia necessria
para o alinhamento dos grupos qumicos reagentes, formao de cargas transientes
instveis, rearranjos de ligaes e outras transformaes necessrias para que a reao
ocorra em uma das direes. Isto ilustrado pela colina de energia nas Figuras 8-2 e 83. Para sofrer a reao, as molculas devem superar esta barreira e portanto precisam ser

excitadas para um nvel de energia maior. No topo da colina de energia est um ponto
onde a passagem para o estado de S ou P igualmente provvel ( sempre um caminho
morro abaixo em cada sentido). Este o chamado estado de transio. O estado de
transio no uma espcie qumica que apresenta uma estabilidade significativa e no
deve ser confundido com um intermedirio da reao (tal como ES ou EP). Ele apenas
um momento molecular efmero onde eventos como quebra de ligaes, a formao de
ligaes e o desenvolvimento de cargas ocorrem em um ponto preciso onde a
decomposio para formar o substrato ou o produto igualmente provvel. A diferena
entre os nveis de energia do estado fundamental e do estado de transio chamada
energia de ativao (G). A velocidade de uma reao reflete essa energia de ativao,
isto , uma energia de ativao alta corresponde a uma reao lenta. As velocidades das
reaes podem ser aumentadas pela elevao da temperatura, que aumenta o nmero de
molculas com energia suficiente para superar esta barreira de energia. Alternativamente,
a energia de ativao pode ser diminuda pela adio de um catalisador (Fig. 8-3). Os
catalisadores aumentam a velocidade das reaes diminuindo a energia de ativao.
As enzimas no so exceo regra de que os catalisadores no afetam o equilbrio
da reao. As setas bidirecionais na equao 8-1 deixam claro este ponto: qualquer enzima
que catalisa a reao SP tambm catalisa a reao PS. O papel das enzimas acelerar a
interconverso de S e P. A enzima no gasta no processo e o ponto de equilbrio no
afetado. Entretanto, a reao atinge o equilbrio muito mais rapidamente quando a enzima
apropriada est presente, uma vez que a velocidade da reao aumentada.
Este princpio geral pode ser ilustrado considerando-se a converso da sacarose e oxignio
em CO2 e H2O:
C12H22O11 + 12 O2 12 CO2 + 11 H2O
Esta converso, que ocorre atravs de uma srie de reaes isoladas, tem um Go
grande e negativo e, no equilbrio a quantidade de sacarose desprezvel. A sacarose um
composto estvel porque a barreira de energia de ativao que deve ser superada para que
ela reaja com o oxignio muito grande. Ela pode ser armazenada em um recipiente
contendo O2 indefinidamente sem reagir. Entretanto, nas clulas a sacarose rapidamente
transformada em CO2 e H2O atravs de uma srie de reaes catalisadas por enzimas.
Essas enzimas no apenas aceleram as reaes, mas as organizam e as controlam de tal
forma que a maior parte da energia liberada conservada em outras formas qumicas e que
fica disponvel para a clula executar outras tarefas. O caminho reacional atravs do qual a
sacarose (e outros acares) degradada a via primria de liberao de energia
(Captulos 15 e 19) e as enzimas desta via permitem que a seqncia de reaes ocorra em
uma escala de tempo biologicamente til.
Na prtica, qualquer reao pode ter vrios passos (etapas) envolvendo a formao
e o consumo de espcies qumicas transientes chamados de intermedirios da reao*.
Quando a reao S P catalisada por uma enzima, os complexos ES e EP so os
intermedirios (equao 8-1). Eles ocupam os vales no diagrama de coordenadas da reao
(Fig. 8-3). Quando ocorrem vrios passos em uma reao, a velocidade total determinada
pelo passo (ou passos) com a maior energia de ativao. Esse passo chamado passo
limitante da velocidade.
_____________________________________________________
* Observe que os termos passos e intermedirios neste captulo se referem s espcies
qumicas que ocorrem no caminho reacional de uma simples reao catalisada
enzimaticamente. No contexto das vias metablicas que envolvem vrias enzimas (Parte
III deste livro) esses termos so usados de uma maneira diferente. Uma reao enzimtica
geralmente considerada como um passo em uma via metablica e o produto de uma
reao enzimtica (que o substrato para a prxima enzima na via) considerada como
um intermedirio.
Para os casos simples, o passo limitante da velocidade o ponto de mais alta
energia no diagrama para as interconverses de S e P. Na prtica, o passo limitante da

velocidade pode variar com as condies da reao. Para muitas enzimas vrios passos tm
energia de ativao similar, o que significa que todos eles so parcialmente limitantes da
velocidade.
figura 8-3
Diagrama de coordenadas de reao comparando uma reao catalisada
enzimaticamente com uma no-catalisada. Na reao SP, os intermedirios ES e EP
assumem valores mnimos na curva de progresso da reao catalisada enzimaticamente. Os
termos Gno cat e Gcat correspondem s energias de ativao das reaes no catalisada e
catalisada, respectivamente. A energia de ativao para o processo global menor quando
a enzima catalisa a reao.
Como descrito no Captulo 1, as energias de ativao so barreiras energticas para
as reaes qumicas. Estas barreiras so cruciais para a existncia da prpria vida. A
estabilidade de uma molcula aumenta com o aumento da altura da sua barreira de
ativao. Sem tais barreiras energticas, as macromolculas complexas poderiam reverter
espontaneamente para as formas moleculares mais simples e, as estruturas complexas e
altamente ordenadas bem como os processos metablicos das clulas poderiam no existir.
As enzimas evoluram para diminuir seletivamente as energias de ativao de reaes
necessrias sobrevivncia das clulas.
A velocidade das reaes e o equilbrio tm definies termodinamicamente precisas
O equilbrio de uma reao est intrinsecamente ligado ao Go enquanto a
velocidade da reao est ligada ao G. Uma introduo bsica a essas relaes
termodinmicas o prximo passo na compreenso de como as enzimas trabalham.
Um equilbrio como S P descrito por uma constante de equilbrio, Keq ou
simplesmente K. Sob condies padres, empregadas para comparar processos
bioqumicos, uma constante de equilbrio expressa por Keq (ou K):
Keq= [P]/[S]
(8-2)
o
Da termodinmica, a relao entre Keq e G pode ser descrita pela expresso:
Go= - RT ln Keq
(8-3)
onde R a constante dos gases, 8,315J/mol.K e T a temperatura absoluta, 298 K (25C).
A equao 8-3 ser desenvolvida e discutida com mais detalhes no Captulo 14. O ponto
importante aqui que a constante de equilbrio est diretamente relacionada com a
variao global da energia livre padro da reao (Tabela 8-4). Um grande valor negativo
para Go reflete um equilbrio de reao favorvel mas, como j foi salientado, isto no
significa que a reao ocorrer com uma velocidade considervel.
tabela 8-4
A relao entre Keq e Go (veja a equao 8-3)
Keq
Go (kJ/mol)
10-6

34,2

10-5

28,5

10-4

22,8

10-3

17,1

10-2

11,4

10-1

5,7

0,0

10

-5,7

102

-11,4

103

-17,1

A velocidade de qualquer reao determinada pela concentrao do reagente (ou

dos reagentes) e pela constante de velocidade, geralmente representada pelo smbolo k.
Para a reao unimolecular SP, a velocidade da reao v, que representa a quantidade de
S que reage por unidade de tempo, expressa pela equao da velocidade:
V = k [S]
(8-4)
Nesta reao a velocidade depende apenas da concentrao de S. Ela chamada de
uma reao de primeira ordem. O fator k uma constante de proporcionalidade que reflete
a probabilidade da reao ocorrer em um dado conjunto de condies (pH, temperatura
etc.). Aqui, k uma constante de velocidade de primeira ordem e sua unidade o
recproco do tempo, por exemplo s-1. Se uma reao de primeira ordem tem uma constante
de velocidade de 0,03 s-1, isto pode ser interpretado (qualitativamente) que 3% do S
disponvel ser convertido a P em 1 s. Uma reao com uma constante de velocidade de
2.000 s-1 estar terminada em uma pequena frao de segundo. Se a velocidade da reao
depende da concentrao de dois compostos diferentes, ou se duas molculas do mesmo
composto reagem entre si, a reao de segunda ordem e k uma constante de velocidade
de segunda ordem, com unidade M-1 s-1. Neste caso, a equao da velocidade torna-se:
V = k [S1] [S2]
(8-5)
A partir da teoria do estado de transio, pode-se derivar uma expresso que
relaciona a magnitude da constante de velocidade com a energia de ativao:
k = (k T e-G/RT)/h
(8-6)
onde k a constante de Boltzmann e h a constante de Planck. O ponto importante a
salientar aqui que a relao entre a constante de velocidade, k, e a energia de ativao,
G, inversa e exponencial. Em outras palavras, esta a base para a afirmao de que
uma energia de ativao menor significa uma velocidade de reao maior e vice-versa.
Agora vamos mudar o assunto de o que as enzimas fazem, para como elas o fazem.
Alguns princpios explicam o poder cataltico e a especificidade das enzimas
As enzimas so catalisadores extraordinrios. Os aumentos da velocidade
provocado pelas enzimas variam entre 5 a 17 ordens de magnitude (Tabela 8-5). As
enzimas tambm so muito especficas, discriminando entre substratos com estruturas
muito similares. Como esses aumentos, enormes e altamente seletivos, na velocidade das
reaes podem ser explicados ? De onde vem a energia que diminui dramaticamente a
energia de ativao para reaes especficas ?
tabela 8-5
Alguns valores do aumento da velocidade produzido por enzimas
Ciclofilina
Anidrase carbnica
Triose fosfato isomerase
Carboxipeptidase A
Fosfoglicomutase

105
107
109
1011
1012

Succinil CoA transferase

Urease
Orotidina monofosfato descarboxilase

1013
1014
1017

A resposta para estas questes apresenta duas partes distintas mas interligadas. A
primeira diz respeito aos rearranjos das ligaes covalentes durante a reao enzimtica.
Reaes qumicas dos mais variados tipos ocorrem entre o substrato e os grupos funcionais
da enzima (cadeias laterais de aminocidos especficos, ons metlicos e coenzimas). Os
grupos funcionais catalticos das enzimas podem formar uma ligao covalente transitria
com um substrato e ativ-lo para a reao ou ento, algum grupo pode ser transferido
transientemente do substrato para um grupo da enzima. Em muitos casos, estas reaes
somente ocorrem no centro ativo da enzima. Elas diminuem a energia de ativao (e
portanto aceleram a reao) propiciando um caminho reacional alternativo de energia mais
baixa.
A segunda parte da resposta diz respeito s interaes no covalentes entre a
enzima e o substrato. A maior parte da energia necessria para diminuir a energia de
ativao derivada de interaes fracas, no-covalentes, entre o substrato e a enzima. O
fator que, de fato distingue as enzimas da maioria dos catalisadores no enzimticos a
formao de um complexo ES especfico. A interao entre o substrato e a enzima neste
complexo mediada pelas mesmas foras que estabilizam a estrutura protica, incluindo as
pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas e inicas (Captulo 6). A formao de cada
interao fraca no complexo ES acompanhada por uma pequena liberao de energia
livre que garante o grau de estabilidade para a interao. A energia derivada da interao
enzima-substrato chamada de energia de ligao, GB. O seu significado vai alm de
uma simples estabilizao da interao enzima-substrato. A energia de ligao a maior
fonte de energia livre usada pelas enzimas para diminuir a energia de ativao das
reaes.
Dois princpios fundamentais e inter-relacionados fornecem uma explicao geral para
o fato das enzimas utilizarem a energia de ligao no covalente.
1. A maior parte do poder cataltico das enzimas derivada, em ltima instncia, da
energia livre liberada na formao das mltiplas ligaes fracas e interaes entre a
enzima e o seu substrato. Esta energia de ligao contribui tanto para a especificidade
como para a catlise.
2. As interaes fracas so otimizadas no estado de transio da reao. Os centros ativos
das enzimas so complementares no aos respectivos substratos per si, mas aos estados
de transio pelos quais os substratos passam medida que so transformados em
produtos durante as reaes enzimticas.
Esses aspectos so crticos para a compreenso da ao das enzimas e agora eles se
tornaro o foco da nossa ateno.
As interaes fracas entre a enzima e o substrato so otimizadas no estado de
transio
Como uma enzima utiliza a energia de ligao para diminuir a energia de ativao
da reao ? Embora a formao do complexo ES no a explicao adequada, algumas
das primeiras consideraes dos mecanismos enzimticos comearam com esta idia. Os
estudos sobre a especificidade das enzimas desenvolvidos por Emil Fischer levaram-no a
propor, em 1894, que as enzimas eram estruturalmente complementares aos seus
substratos, de tal forma que eles se ajustariam tal qual uma fechadura e chave (Fig. 8-4).
Esta idia elegante, de que a interao especfica (exclusiva) entre duas molculas
biolgicas mediada por superfcies moleculares com formas complementares, influenciou
fortemente o desenvolvimento da bioqumica e tais interaes permanecem no cerne de
muitos processos bioqumicos. Entretanto, a hiptese fechadura e chave pode gerar
confuso quando aplicada catlise enzimtica. Uma enzima totalmente complementar a
seu substrato seria uma enzima muito pouco eficiente.

10

figura 8-4
Formas complementares de um substrato e seu stio ativo em uma enzima. A enzima
diidrofolato redutase mostrada com o seu substrato NADP+ (vermelho) no ligado
(esquerda) e ligado (direita). Tambm visvel um outro substrato ligado enzima, o
tetraidrofolato (amarelo). O NADP+ se liga a uma cavidade que complementar sua
forma e propriedades inicas. Na realidade, a complementaridade entre a proteina e o
ligante (neste caso o substrato) raramente perfeita, como j visto no Captulo 7. A
interao de uma protena com um ligante freqentemente envolve mudanas na
conformao de uma ou ambas as molculas, um processo denominado ajuste induzido.
Esta falta de uma complementaridade perfeita entre a enzima e o substrato (no
evidenciada nesta figura) importante para a catlise enzimtica.
Considere uma reao imaginria, a quebra de um basto de metal magnetizado. A
reao no catalisada est mostrada na Figura 8-5a. Vamos analisar duas enzimas
imaginrias duas bastonases que catalisam esta reao e ambas empregando foras
magnticas como modelo para a energia de ligao empregada pelas enzimas reais. Vamos
considerar inicialmente uma enzima perfeitamente complementar ao substrato (Fig. 8-5b).
O centro ativo desta bastonase uma cavidade delimitada por magnetos. Para reagir
(quebrar), o basto precisa atingir o estado de transio da reao, mas ele se ajusta muito
firmemente ao stio ativo que no pode se dobrar. Isto porque o dobramento do basto
eliminaria parte das interaes magnticas entre ele e a enzima. Esse tipo de enzima
impede a reao uma vez que, na realidade, estabiliza o substrato. Num diagrama de
coordenadas da reao (Fig. 8-5b), este tipo de complexo ES corresponderia a um poo de
energia do qual o substrato dificilmente escaparia. Esse tipo de enzima seria intil.
A noo moderna de catlise enzimtica, proposta inicialmente por Haldane em
1930, foi elaborada por Linus Pauling, em 1946: afim de catalisar reaes, uma enzima
deve ser complementar ao estado de transio. Isto significa que as interaes timas
(atravs de ligaes fracas) entre o substrato e a enzima ocorrem apenas no estado de
transio. A Figura 8-5c mostra como uma enzima deste tipo pode trabalhar. O basto de
metal se liga enzima, mas algumas poucas interaes magnticas so usadas para formar
o complexo ES. O substrato ligado precisa ainda receber um aumento de energia livre para
atingir o estado de transio. Assim, o aumento em energia livre necessrio para dobrar o
basto e quebrar parcialmente a sua conformao compensado ou pago pelas
interaes magnticas (energia de ligao) que se formam entre a enzima e o substrato no
estado de transio. Muitas destas interaes envolvem partes do basto que esto longe do
ponto de rompimento. Assim sendo, as interaes entre a bastonase e as regies no
reativas do basto fornecem parte da energia necessria para o rompimento do basto. Este
pagamento de energia traduzido em uma menor energia de ativao real e uma maior
velocidade de reao.
figura 8-5
Uma enzima imaginria (bastonase) projetada para catalisar a quebra de um
basto de metal. (a) Para ser quebrado, primeiramente o basto deve ser dobrado (o
estado de transio). Em ambos os exemplos de bastonase as interaes magnticas
fazem o papel das interaes por ligaes fracas entre enzima e substrato. (b) Uma
bastonase que apresenta uma cavidade magnetizada com estrutura complementar
estrutura do basto (o substrato) estabiliza este substrato. O dobramento do basto
impedido pela atrao magntica entre basto e a bastonase. (c) Uma enzima
complementar ao estado de transio da reao ajuda a desestabilizar o basto,
contribuindo para a catlise da reao. A energia de ligao das interaes magnticas
compensa o aumento de energia livre necessria para dobrar o basto. Os diagramas de
coordenadas da reao ( direita) mostram as conseqncias energticas da
complementaridade ao substrato versus a complementaridade ao estado de transio. O

11

termo GM representa a diferena entre as energias dos estados de transio da reao no

catalisada e da catalisada e provm das interaes magnticas entre o basto e a
bastonase. Quando a enzima complementar ao substrato (b), o complexo ES mais
estvel e tem menos energia livre no estado fundamental que o prprio substrato. O
resultado um aumento na energia de ativao.
As enzimas reais trabalham dentro de um princpio anlogo. Algumas interaes
fracas so formadas no complexo ES, mas a totalidade das interaes fracas que se
estabelecem entre o substrato e a enzima estabelecida apenas quando o substrato atinge o
estado de transio. A energia livre (energia de ligao) liberada pela formao dessas
interaes supre parcialmente a energia requerida para se atingir o topo da colina de
energia. A somatria da energia de ligao desfavorvel (positiva), G, e favorvel
(negativa), GB, resulta em uma energia de ativao lquida menor (Fig. 8-6). Mesmo para
a enzima, o estado de transio no uma espcie estvel, mas um breve ponto no tempo
que o substrato gasta para atingir o topo da barreira de energia. A reao catalisada
enzimaticamente muito mais rpida que o processo no catalisado, porque a barreira
muito menor. O princpio importante que as interaes de ligaes fracas entre a enzima
e o substrato fornecem a maior parte da fora que dirige a catlise enzimtica. Os grupos
no substrato que so envolvidos nessas interaes fracas podem estar a uma certa distncia
das ligaes que so quebradas ou mudadas. As interaes fracas que se formam apenas no
estado de transio so as que contribuem fundamentalmente para a catlise.
figura 8-6
O papel da energia de ligao na catlise. Para diminuir a energia de ativao de uma
reao, o sistema precisa adquirir uma quantidade de energia equivalente diminuio do
G. A maior parte desta energia provm da energia de ligao (GB) e disponibilizada
pela formao de interaes no-covalentes fracas entre o substrato e a enzima no estado
de transio. O significado de GB anlogo ao do GM na Figura 8-5.
A necessidade de mltiplas interaes fracas para dirigir a catlise uma das razes
porqu as enzimas (e algumas coenzimas) so molculas to grandes. A enzima deve
fornecer os grupos funcionais para a formao de interaes inicas, pontes de hidrognio
e outras interaes bem como posicionar precisamente esses grupos de tal forma que a
energia de ligao seja otimizada no estado de transio.
A energia de ligao contribui para a especificidade da reao e catlise
possvel demonstrar quantitativamente que a energia de ligao responsvel
pela enorme acelerao da velocidade das reaes catalisadas pelas enzimas ? Sim. Como
um ponto de referncia, a equao 8-6 permite calcular que o G deve diminuir
aproximadamente 5,7 kJ/mol para acelerar cerca de dez vezes uma reao de primeira
ordem, sob as condies comumente encontradas nas clulas. A energia disponvel devido
formao de uma nica interao fraca geralmente da ordem de 4 a 30 kJ/mol. A
energia total disponvel, devido formao de um certo nmero destas interaes,
provavelmente suficiente para diminuir a energia de ativao de cerca de 60 a 100
kJ/mol, requerida para explicar os grandes aumentos na velocidade observados para muitas
enzimas.
A mesma energia de ligao que fornece a energia para a catlise tambm
responsvel pela especificidade, a habilidade da enzima em discriminar entre o substrato e
uma outra molcula competidora. Conceitualmente, a especificidade fcil de ser
diferenciada da catlise, mas essa distino muito mais difcil de ser feita
experimentalmente porque a catlise e a especificidade so originrias do mesmo
fenmeno. Se o centro ativo de uma enzima tem grupos funcionais arranjados de uma
forma otimizada para formar uma variedade de interaes fracas com um dado substrato
no estado de transio, a enzima no ser capaz de interagir do mesmo modo com qualquer
outra molcula. Por exemplo, se o substrato tem um grupo hidroxila que forma uma ponte

12

de hidrognio especfica com um resduo de cido glutmico na enzima, qualquer

molcula que no possuir aquele grupo hidroxila especfico ser, de uma maneira geral,
um substrato mais pobre para a mesma enzima. Alm disso, qualquer molcula com um
grupo funcional extra, para o qual a enzima no apresenta uma cavidade ou um stio de
ligao, muito provavelmente ser excluda da enzima. Geralmente, a especificidade
derivada da formao de mltiplas interaes fracas entre a enzima e a molcula do seu
substrato especfico.
Os princpios gerais j descritos podem ser ilustrados por uma grande variedade de
mecanismos catalticos conhecidos. Estes mecanismos no so mutuamente exclusivos e
uma dada enzima pode incorporar vrios deles em seu mecanismo de ao. Geralmente
difcil quantificar a contribuio de um dado mecanismo cataltico para a velocidade e/ou
especificidade de uma determinada reao catalisada enzimaticamente.
A energia de ligao a fora impulsionadora dominante em vrios mecanismos e ela
pode ser o principal, seno o nico, contribuinte para a catlise. Vamos considerar o que
necessrio acontecer para que a reao ocorra. Os fatores fsicos e termodinmicos
importantes que contribuem para o G, a barreira energtica, incluem: (1) a mudana na
entropia, na forma de movimento de liberdade de duas molculas em soluo; (2) a
camada de solvatao de molculas de gua ligadas por pontes de hidrognio que
envolvem e ajudam a estabilizar a maioria das biomolculas em soluo aquosa; (3) a
distoro dos substratos que precisa ocorrer em muitas reaes e (4) a necessidade de se
obter um alinhamento adequado dos grupos catalticos funcionais na enzima. A energia de
ligao pode ser usada para vencer todas essas barreiras.
A vantagem mais evidente da ligao dos substratos enzima uma grande
reduo nos movimentos relativos, ou reduo da entropia, desses substratos. A energia
de ligao mantm os substratos orientados adequadamente para reagir. Isto representa
uma importante contribuio catlise, uma vez que as colises produtivas entre as
molculas em soluo podem ser muito raras. Esse alinhamento preciso do substrato sobre
a superfcie da enzima devido grande quantidade de interaes fracas entre cada
molcula de substrato e grupos estrategicamente localizados na enzima que fixam as
molculas de substrato na posio adequada. Estudos tm demonstrado que a restrio do
movimento de dois reagentes pode produzir aumentos de velocidade da ordem de
10 8
M (Fig. 8-7).
A formao de ligaes fracas entre o substrato e a enzima tambm resulta na
dessolvatao do substrato. As interaes enzima-substrato substituem a maior parte (ou
mesmo todas) das pontes de hidrognio existentes entre o substrato e a gua.
A energia de ligao envolvendo as interaes fracas formadas apenas no estado de
transio da reao ajuda a compensar termodinamicamente qualquer distoro
(fundamentalmente uma redistribuio de eltrons) que o substrato deva sofrer para reagir.
Finalmente, a prpria enzima pode sofrer mudanas conformacionais induzidas pelas
mltiplas interaes fracas com o substrato, quando da ligao com o substrato. Este fato
denominado de ajuste induzido, um mecanismo postulado por Daniel Koshland, em 1958.
O ajuste induzido serve para colocar grupos funcionais especficos da enzima em uma
posio apropriada para catalisar a reao. A mudana conformacional tambm permite a
formao de interaes adicionais por ligaes fracas no estado de transio. Em quaisquer
destes casos, a nova conformao apresenta propriedades catalticas aumentadas. Como
vimos, o ajuste induzido uma caracterstica comum da ligao reversvel dos ligantes s
protenas (Captulo 7). O ajuste induzido tambm importante na interao de quase todas
as enzimas com os seus substratos.
figura 8-7
Aumento da velocidade atravs da reduo da entropia. So representadas reaes de
um ster com um grupo carboxlico para formar um anidrido. O grupo R o mesmo em
cada caso. (a) Para esta reao bimolecular, a constante de velocidade de segunda ordem
com unidade M-1 s-1. (b) Quando os dois grupos reagentes esto na mesma molcula, a

13

reao muito mais rpida. Para esta reao unimolecular, a unidade de k s-1. Dividindose a constante de velocidade de (b) pela constante de velocidade de (a) tem-se um aumento
da velocidade de cerca de 105 M (a unidade de molaridade resultante do fato que foi
comparada uma reao unimolecular com outra bimolecular). Colocando-se de um outro
modo, se o reagente em (b) estivesse presente em uma concentrao 1 M, os grupos
reagentes se comportariam como se estivessem presentes em uma concentrao 105 M.
Embora o reagente em (b) apresenta livre rotao em trs ligaes (mostradas com setas
curvas), isto ainda representa uma substancial reduo da entropia em relao a (a). Se as
ligaes que giram em (b) ficam impedidas como em (c), a entropia reduzida mais ainda
e a reao exibe um aumento de velocidade de 108 M em relao a (a).
Grupos catalticos especficos contribuem para a catlise
Uma vez que o substrato se liga enzima, os grupos catalticos funcionais
adequadamente posicionados auxiliam a quebra e formao de ligaes atravs de uma
variedade de mecanismos incluindo a catlise cido-base geral, catlise covalente e catlise
por ons metlicos. Estes so mecanismos distintos daqueles baseados na energia de
ligao, uma vez que eles geralmente envolvem uma interao covalente transiente com o
substrato ou uma transferncia de grupos do substrato ou para o substrato.
Catlise cido-base geral Muitas reaes bioqumicas envolvem a formao de
intermedirios carregados instveis que tendem a se transformar rapidamente em suas
espcies reagentes constituintes impedindo assim a reao (Fig. 8-8). Esses intermedirios
carregados freqentemente podem ser estabilizados pela transferncia (retirada ou adio)
de prtons do substrato ou de um intermedirio, para formar espcies que se quebram em
produtos mais rapidamente que os reagentes. Para as reaes no enzimticas, a
transferncia de prtons pode envolver apenas os constituintes da gua ou tambm outros
doadores ou aceptores fracos de prtons. A catlise que envolve apenas os ons H+ (H3O+)
ou OH-, presentes na gua, denominada catlise cido-base especfica. Se a
transferncia de prtons entre o intermedirio e a gua mais rpida que a transformao
do intermedirio nos reagentes, o intermedirio ser efetivamente estabilizado todas as
vezes que se formar. Desse modo, nenhuma catlise adicional, mediada por outros
receptores ou doadores de prtons, ocorrer. Entretanto, em muitos casos, apenas a
participao da gua no suficiente. O termo catlise cido-base geral se refere a
transferncias de prtons mediada por outras classes de molculas. Para reaes no
enzimticas em solues aquosas isto ocorre apenas quando o intermedirio instvel da
reao se transforma nos reagentes com uma velocidade maior com que os prtons so
transferidos da gua ou para a gua. Nestas situaes, vrios cidos orgnicos fracos
podem suplementar a gua como doadores de prtons, ou ainda, bases orgnicas fracas
podem servir como aceptoras de prtons.
No centro ativo de uma enzima, um certo nmero de cadeias laterais de
aminocidos podem atuar tanto como doadores quanto aceptores de prtons (Fig. 8-9).
Estes grupos podem ser posicionados precisamente no centro ativo de uma enzima
permitindo a transferncia de prtons e garantindo aumentos na velocidade da reao da
ordem de 102 a 105. Este tipo de catlise ocorre com a maioria das enzimas. De fato, as
transferncias de prtons so as reaes bioqumicas mais comuns.
figura 8-8
Desenvolvimento desfavorvel de cargas durante a quebra de uma ligao amida que
pode ser evitado pela catlise. mostrada a hidrlise de uma ligao amida, a mesma
reao catalisada pela quimotripsina e outras proteases. O desenvolvimento da carga
desfavorvel e pode ser evitado pela doao de um prton pelo H 3O+ (catlise cida
especfica) ou HA (catlise cida geral), onde HA representa um cido qualquer.
Similarmente, a carga pode ser neutralizada pela captura de um prton pelo OH- (catlise
bsica especfica) ou B: (catlise bsica geral), onde B: representa uma base qualquer.

14

Catlise covalente Neste tipo de catlise formada uma ligao covalente transitria
entre a enzima e o substrato. Considere a hidrlise da ligao qumica entre os grupos A e
B:
H2 O
AB A + B
H2O
Na presena de um catalisador covalente (uma enzima com um grupo nucleoflico
X:) a reao ocorre da seguinte forma:
AB + X: AX + B A + X: + B
Isso altera o caminho da reao e resulta em catlise apenas quando o novo
caminho tem uma energia de ativao menor que aquele da reao no-catalisada. Assim,
os dois novos passos precisam ser mais rpidos que os da reao no-catalisada. Algumas
cadeias laterais de aminocidos, incluindo as da Fig. 8-9, e os grupos funcionais de alguns
cofatores de enzimas podem servir como nuclefilos na formao de ligaes covalentes
com os substratos. Estes complexos covalentes sempre sofrem reaes posteriores para
regenerar a enzima livre. A ligao covalente formada entre a enzima e o substrato pode
ativar esse substrato para uma reao subsequente de uma maneira particularmente
especfica para o grupo ou coenzima envolvido.
figura 8-9
Os aminocidos em uma catlise cido-base geral. Muitas reaes orgnicas so
promovidas por doadores de prtons (cidos gerais) ou aceptores de prtons (bases gerais).
Os stios catalticos de algumas enzimas contm grupos funcionais de aminocidos, como
os mostrados aqui, que podem participar no processo cataltico como doadores ou
aceptores de prtons.
Resduo de aminocido

Forma cida geral

(doador de prton)

Forma bsica geral

(aceptor de prton)

Glu, Asp
Lis, Arg
Cis
His
Ser
Tir
Catlise por ons metlicos Os metais, firmemente ligados molcula da enzima ou
captados da soluo junto com o substrato, podem participar de vrias maneiras na
catlise. As interaes inicas entre um metal ligado enzima e o substrato podem ajudar
a orientar o substrato para a reao ou estabilizar os estados de transio carregados
eletricamente. O uso de interaes por ligaes fracas entre o metal e o substrato similar
utilizao da energia de ligao enzima-substrato j descrita anteriormente. Os metais
podem tambm mediar reaes de oxidao-reduo atravs de mudanas reversveis no
estado de oxidao do on metlico. Cerca de um tero das enzimas conhecidas requerem
um ou mais ons metlicos para sua atividade cataltica.
A maioria das enzimas emprega uma combinao de vrias estratgias catalticas
para aumentar a velocidade da reao. Um bom exemplo do uso das catlises covalente e
cido-base geral, a reao catalisada pela quimotripsina. O primeiro a quebra de uma
ligao peptdica que acompanhada pela formao de uma ligao covalente entre um
resduo de serina da enzima e parte do substrato. A reao acelerada pela catlise bsica
geral envolvendo outros grupos na enzima (Fig. 8-10). A reao da quimotripsina ser
descrita com maiores detalhes mais adiante neste captulo.

15

A Cintica Enzimtica Como Uma Abordagem Para A Compreenso Do Mecanismo

De Ao Das Enzimas
Mltiplas abordagens so comumente empregadas para estudar o mecanismo de
ao de uma enzima purificada. O conhecimento da estrutura tridimensional da protena
fornece informaes importantes e o valor dessa informao estrutural aumentado
significativamente pelos conhecimentos obtidos atravs da qumica de protena clssica e
pelos mtodos modernos de mutagnese stio dirigida (mudana da seqncia de
aminocidos de uma protena atravs da engenharia gentica; veja Captulo 29). Essas
tecnologias permitem ao enzimologista examinar o papel individual dos aminocidos tanto
na estrutura da enzima como na sua ao cataltica. Entretanto, a abordagem central para
estudar o mecanismo de uma reao catalisada por uma enzima determinar a velocidade
da reao e como ela muda em funo de mudanas nos parmetros experimentais, uma
disciplina conhecida como cintica enzimtica. Esta a abordagem mais antiga para a
compreenso dos mecanismos enzimticos e continua sendo muito importante at hoje. O
que segue uma introduo bsica cintica das reaes catalisadas por enzimas. Para um
estudo mais avanado devem ser consultadas as referncias citadas no final do captulo.
figura 8-10
Catlises covalente e cido-base geral. O primeiro passo da reao catalisada pela
quimotripsina, chamado de passo da acilao. O grupo hidroxila da Ser 195 o
nucleoflico em uma reao acelerada pela catlise bsica geral (a base a cadeia lateral da
His57). Isto proporciona um novo caminho para a hidrlise da ligao peptdica. A catlise
somente ocorre se cada passo do novo caminho mais rpido que o da reao no
catalisada. A reao da quimotripsina est descrita com mais detalhes na Figura 8-19.
A concentrao do substrato afeta a velocidade das reaes catalisadas por enzimas
Um dos principais fatores que afetam a velocidade de uma reao in vitro,
catalisada por uma enzima purificada a concentrao do substrato, [S]. Entretanto,
estudar os efeitos da concentrao do substrato complicado pelo fato da [S] variar
durante o curso de uma dada reao, medida que o substrato convertido em produto.
Uma abordagem simplificada em experimentos cinticos, medir a velocidade inicial da
reao, designada por Vo, quando [S] geralmente muito maior que a concentrao da
enzima, [E]. Assim, se o tempo de reao suficientemente curto as mudanas na [S]
sero desprezveis e a [S] pode ser considerada constante.
O efeito em Vo provocado pela variao da [S], quando a concentrao de enzima
mantida constante, est mostrado na Figura 8-11. Em concentraes relativamente baixas
de substrato, Vo aumenta quase linearmente com o aumento da [S]. Em altas concentraes
de substrato Vo aumenta cada vez menos em resposta aos aumentos da [S]. Finalmente,
alcanado um ponto acima do qual ocorrem aumentos insignificantes de Vo medida que a
[S] aumenta. Esse patamar atingido para tais valores de Vo muito prximo da velocidade
mxima, Vmx.
figura 8-11
Efeito da concentrao de substrato na velocidade inicial de uma reao catalisada
enzimaticamente. Atravs deste tipo de grfico, a Vmx pode ser determinada apenas
aproximadamente, isto porque Vo se aproxima mas nunca chega a atingir Vmx. A
concentrao de substrato onde Vo metade da Vmx o Km, a constante de MichaelisMenten. A concentrao da enzima, em um experimento como este geralmente to baixa
que [S] >> [E] mesmo quando [S] descrita como pequena ou relativamente pequena. As
unidades so tpicas para reaes catalisadas enzimaticamente e so apresentadas apenas
para ilustrar o significado Vo e [S] (note que a curva descreve parte de uma hiprbole
retangular, com uma das assntotas em Vmx. Se a curva continuasse para concentraes
abaixo de [S]= 0, ela se aproximaria de uma assntota vertical quando [S]= Km).

16

O complexo ES fundamental para a compreenso deste comportamento cintico

j que ele foi o ponto de partida para a discusso da catlise enzimtica. O perfil cintico
apresentado na figura 8-11 levou Victor Henri, seguindo as diretrizes de Wurz, a propor
em 1903, que a combinao de uma enzima com a molcula do seu substrato para formar o
complexo ES, um passo obrigatrio na catlise enzimtica. Em 1913 esta idia foi
expandida em uma teoria geral da ao das enzimas por Leonor Michaelis e Maud Menten.
Eles postularam que inicialmente a enzima primeiro se combina reversivelmente com o
substrato para formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversvel relativamente
rpido:
k1
E + S ES
(8-7)
k-1
Em uma segunda etapa lenta, o complexo ES ento se quebra liberando a enzima
livre o produto da reao, P:
k2
ES E + P
(8-8)
k-2
Como a segunda reao mais lenta (equao 8-8) ela limita a velocidade da
reao enzimtica. Assim, a velocidade da reao enzimtica deve ser proporcional
concentrao da substncia que reage no segundo passo, isto , ES.
Leonor Michaelis
1875-1949
Maud Menten
1879-1960
Em qualquer instante de uma reao catalisada enzimaticamente, a enzima existe
em duas formas, a no ligada ao substrato ou forma livre E, e a forma ligada ao substrato,
ES. Em baixas [S], a maior parte da enzima est na forma livre E. Nestas condies a
velocidade da reao ser proporcional [S] porque o equilbrio da equao 8-7
deslocado na direo da formao de mais ES medida que a [S] aumenta. A velocidade
inicial mxima da reao (Vmx) ser atingida quando praticamente todas as molculas da
enzima estiverem na forma do complexo ES e a concentrao da enzima livre E for
significativamente pequena. Nestas condies, a enzima est saturada com seu substrato
e a velocidade da reao no aumenta mais com novos aumentos da [S]. Esta condio
existir sempre que a [S] for suficientemente alta para manter todas as molculas de
enzima na forma combinada com o substrato, ES. Em seguida o complexo ES se
transforma no produto P e a enzima liberada para catalisar a transformao de outra
molcula de substrato. O efeito de saturao uma caracterstica que distingue os
catalisadores enzimticos e o responsvel pelo patamar observado na Figura 8-11. Esta
condio de saturao existir sempre que [S] for suficientemente alta.
Quando a enzima misturada com um grande excesso de substrato, existe um
perodo inicial, o estado pr-estacionrio, onde a concentrao de ES aumenta. Esse
perodo muito curto para poder ser facilmente observado. A reao atinge rapidamente o
estado estacionrio, onde a [ES] (e a concentrao de quaisquer outros intermedirios)
permanecer praticamente constante durante o decorrer de um certo tempo. O conceito de
estado estacionrio foi introduzido por G.E. Briggs e J.B.S. Haldane em 1925. A
velocidade medida Vo geralmente reflete o estado estacionrio (mesmo considerando-se
que Vo esteja limitada aos tempos iniciais da reao) e a anlise destas velocidades iniciais
chamada de cintica de estado estacionrio.
A relao entre a concentrao do substrato e a velocidade da reao pode ser
expressa quantitativamente
A curva que expressa a relao entre [S] e Vo (Fig. 8-11) tem a mesma forma geral
para a maioria das enzimas (ela se aproxima de uma hiprbole retangular) que pode ser

17

expressa algebricamente pela equao de Michaelis-Menten. Michaelis e Menten

derivaram esta equao partindo de sua hiptese bsica de que o passo limitante da
velocidade nas reaes enzimticas a quebra do complexo ES para formar o produto e a
enzima livre. A equao
Vo = Vmx [S]/( Km + [S])
(8-9)
Os termos importantes so [S], Vo ,Vmx e uma constante chamada de constante de
Michaelis, Km. Todos estes termos so facilmente medidos experimentalmente.
Ns vamos desenvolver aqui a lgica bsica e os passos algbricos da deduo
moderna da equao de Michaelis-Menten, que inclui a considerao do estado
estacionrio introduzido por Briggs e Haldane. A deduo comea com as duas etapas
bsicas envolvidas na formao e quebra de ES (equaes 8-7 e 8-8). Nos primeiros
momentos da reao a concentrao do produto, [P], negligencivel e para simplificar
vamos assumir que k-2 (que descreve a reao reversa de P para S) pode ser ignorada. Essa
considerao no crtica mas simplifica nossa tarefa. Assim, a reao geral se reduz a
k1
k2
E + S ES E + P
(8-10)
k-1
Vo determinada pela quebra de ES para formar o produto, que por sua vez
determinada pela [ES]:
Vo = k2 [ES]
(8-11)
Como a [ES] na equao 8-10 no facilmente medida experimentalmente,
preciso encontrar uma expresso alternativa para [ES]. Primeiro vamos introduzir o termo
[Et] que representa a concentrao total da enzima (a soma das concentraes da enzima
livre e da ligada ao substrato). Desse modo, a concentrao da enzima livre ou no ligada
ao substrato pode ser representada por [Et] [ES]. Como a [S] geralmente muito maior
que a [Et], a quantidade de substrato ligada enzima, em qualquer momento da reao,
desprezvel quando comparada com a [S]. Tendo em vista estas consideraes, os passos
que seguem conduziro a uma expresso simples para Vo, em termos de parmetros que
podem ser facilmente medidos experimentalmente.
Passo 1. As velocidades de formao e quebra de ES so determinadas pelos passos
governados pelas constantes de velocidade k1 (formao) e k-1 + k2 (desaparecimento), de
acordo com as expresses
Velocidade de formao de ES = k1 ([Et] - [ES]) [S]
(8-12)
Velocidade de quebra de ES = k-1 [ES] + k2 [ES]
(8-13)
Passo 2. Considera-se agora que a velocidade inicial da reao reflete um estado
estacionrio onde a [ES] constante, isto , a velocidade de formao de ES igual
velocidade de quebra de ES. Esta a chamada considerao de estado estacionrio. Assim,
as expresses nas equaes 8-12 e 8-13 podem ser igualadas
k1 ([Et] - [ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]
(8-14)
Passo 3. Desenvolvemos agora uma srie de passos algbricos para resolver a equao 814 em funo da [ES]. Primeiramente, o lado esquerdo da equao multiplicado e o lado
direito simplificado
k1 [Et][S] k1 [ES][S] = (k-1 + k2) [ES]
(8-15)
Adicionando-se o termo k1[ES][S] a ambos os lados da equao e simplificando
k1[Et][S] = (k1[S] + k-1 + k2)[ES]
(8-16)
Resolvendo esta equao em funo da [ES]
[ES] = k1[Et][S]/( k1[S] + k-1 + k2)
(8-17)
Simplificando esta ltima expresso e combinando-se todas as constantes de
velocidade em um nico termo:
[ES] = [Et][S]/( [S] + (k2 + k-1)/k1) (8-18)
O termo (k2 + k-1)/k1 definido como a constante de Michaelis, Km. A
substituio desse valor na equao 8-18, simplifica a expresso para

18

[ES] = [Et][S]/ (Km + [S])

(8-19)
Passo 4. Vo agora pode ser expressa em termos da [ES]. Substituindo-se a [ES] da equao
8-11 pelo lado direito da equao 8-19 obtm-se
Vo = k2[Et][S]/( Km + [S])
(8-20)
Esta equao ainda pode ser simplificada. J vimos que a velocidade atingir o
ponto mximo quando a enzima estiver saturada, isto , quando [ES] = [E t]. Assim Vmx
pode ser definida como k2 [Et]. Substituindo este valor na equao 8-20 obtm-se
Vo = Vmx [S]/ (Km + [S])
Esta a equao de Michaelis-Menten, a equao da velocidade para uma
reao catalisada enzimaticamente e com um nico substrato. Ela uma expresso da
relao quantitativa entre a velocidade inicial Vo, a velocidade inicial mxima Vmx, e a
concentrao inicial de substrato [S], todas relacionadas atravs da constante de Michaelis,
Km. Note que o Km tem unidade de concentrao. Esta equao est realmente de acordo
com resultados experimentais reais ? Sim. Vamos confirmar esta afirmao considerando
situaes limites onde a [S] muito alta ou muito baixa, como mostrado na Figura 8-12.
Uma importante relao numrica emerge da equao de Michaelis-Menten no caso
especial quando Vo exatamente metade de Vmx (Fig. 8-12). Ento:
Vmx/2 = Vmx [S]/(Km + [S])
(8-21)
Dividindo por Vmx obtm-se
1/2 = [S]/(Km + [S])
(8-22)
Resolvendo em funo de Km, obtm-se Km + [S] = 2 [S], ou:
Km = [S], quando Vo = Vmx/2
(8-23)
Isto representa uma definio prtica muito til de Km: o Km equivalente
concentrao de substrato onde Vo igual metade de Vmx.
A equao de Michaelis-Menten (equao 8-9) pode ser transformada
algebricamente em formas que so mais teis para a determinao prtica de Km e Vm
(Adendo 8-1) e, como descreveremos posteriormente, na anlise da ao de inibidores
(veja Adendo 8-2).
figura 8-12
Efeito da concentrao do substrato na velocidade inicial da reao. O grfico mostra
os parmetros cinticos que definem os limites da curva em baixas e altas [S]. Em baixas
[S], Km>>[S] e o termo [S] no denominador da equao de Michaelis-Menten (equao 89) torna-se insignificante. A equao pode ser simplificada para Vo = Vmx [S]/Km e Vo
passa a ter uma dependncia linear em funo da [S], como pode ser observado na figura.
Em [S] elevadas, onde [S]>>Km, o termo Km no denominador da equao de MichaelisMenten torna-se insignificante e a equao pode ser simplificada para Vo = Vmx. Isto
consistente com o patamar observado em [S] elevadas. Portanto, a equao de MichaelisMenten consistente com a dependncia observada de Vo em relao a [S]. A forma da
curva definida pelos termos Vmx/Km quando a [S] pequena e, apenas por Vmx quando a
[S] alta.
Adendo 8-1
Transformaes da equao de Michaelis-Menten: o grfico dos duplos recprocos
A equao de Michaelis-Menten
Vo = Vmx [S]/(Km + [S])
pode ser transformada algebricamente equaes que so mais teis no tratamento grfico
dos dados experimentais. Uma transformao comum obtida simplesmente invertendo-se
os dois lados da equao de Michaelis-Menten:
1/Vo = (Km +[S])/Vmx [S]
Separando-se os componentes do numerador do lado direito da equao obtm-se
1/Vo = Km /Vmx [S] + [S]/Vmx [S]
que pode ser simplificada para:
1/Vo = Km /Vmx [S] + 1/Vmx

19

Esta forma da equao de Michaelis-Menten chamada de equao de

Lineweaver-Burk. Para as enzimas que obedecem a equao de Michaelis-Menten, o
grfico de 1/Vo versus 1/[S] (grfico dos duplos recprocos de Vo versus [S] que usamos
at agora) representado por uma linha reta (Fig. 1). Essa linha tem uma inclinao de Km
/Vmx , um intercepto de 1/Vmx no eixo de 1/Vo e um intercepto de -1/Km no eixo de 1/[S].
A representao dos duplos recprocos, tambm chamada representao de LineweaverBurk, tem a grande vantagem de permitir uma determinao mais acurada Vmx, que pode
ser obtida apenas aproximadamente atravs do grfico Vo versus [S] (veja Fig. 8-12).
figura 1
O grfico dos duplos recprocos de Lineweaver-Burk.
Outras transformaes da equao de Michaelis-Menten tm sido deduzidas, cada uma
apresentando alguma vantagem particular na anlise de dados de cintica enzimtica (veja
problema 11).
O grfico dos duplos recprocos para velocidades de reaes enzimticas muito til na
diferenciao de diferentes mecanismos de reao enzimtica (veja Fig. 8-14) e na anlise
de inibidores de enzimas (veja Adendo 8-2).
Os parmetros cinticos so usados para comparar as atividades das enzimas
importante distinguir entre a equao de Michaelis-Menten e o mecanismo
cintico especfico sobre o qual ele foi originalmente baseado. A equao descreve o
comportamento cintico da grande maioria das enzimas e, todas as enzimas que exibem
uma dependncia hiperblica de Vo em relao a [S] so denominadas enzimas que
seguem a cintica de Michaelis-Menten. A regra prtica de que Km = [S] quando Vo =
Vmx (equao 8-23) vlida para todas as enzimas que seguem a cintica de MichaelisMenten (a maioria das excees cintica de Michaelis-Menten so as enzimas
reguladoras, discutidas no final deste captulo). Entretanto, a equao de Michaelis-Menten
no depende do mecanismo de reao relativamente simples, de duas etapas, proposto por
Michaelis e Menten (equao 8-10).
Muitas enzimas que seguem a equao de Michaelis-Menten tm mecanismos de
reao muito diferentes entre si e, enzimas que catalisam reaes com seis ou oito etapas
identificveis freqentemente exibem o mesmo comportamento cintico de estado
estacionrio. Mesmo considerando que a equao 8-23 verdadeira para muitas enzimas, a
magnitude e o significado real de Vmx e Km podem variar de uma enzima para outra. Isto
uma limitao importante do modelo do estado estacionrio para a cintica enzimtica.
Vmx e Km so parmetros que podem ser obtidos experimentalmente para qualquer enzima,
mas mesmo assim eles fornecem pouca informao sobre o nmero, velocidade ou
natureza qumica das etapas discretas da reao. No obstante, a cintica de estado
estacionrio representa a linguagem padro atravs da qual as eficincias catalticas das
enzimas so caracterizadas e comparadas. Vamos agora tratar da aplicao e interpretao
e aplicao dos termos Vmx e Km.
Um mtodo grfico simples para se obter um valor aproximado para o Km est
mostrado na Figura 8-12. Um procedimento mais conveniente, usando o grfico dos
duplos recprocos est apresentado na Adendo 8-1. O Km pode variar muito de enzima
para enzima e mesmo para diferentes substratos de uma mesma enzima (Tabela 8-6). O
termo Km muitas vezes empregado (inapropriadamente) como uma indicao da
afinidade da enzima pelo seu substrato. O significado real do Km depende de aspectos
especficos do mecanismo de reao tais como o nmero e as velocidades relativas dos
passos individuais da reao. Para reaes com duas etapas,
Km = (k2 + k-1)/k1
(8-24)
Quando k2 limitante da velocidade, k2 << k-1 e Km se reduz a
k-1/k1, que
definida como a constante de dissociao, Kd, do complexo ES. Nos casos onde essas
condies prevalecem, o Km representa uma medida da afinidade da enzima pelo substrato
no complexo ES. Entretanto, essas condies no se aplicam para a maioria das enzimas.

20

Algumas vezes k2 >> k-1 e ento Km = k2/k1. Em outros casos, k2 e k-1 so comparveis e Km
permanece como uma funo mais complexa das trs constantes de velocidade (equao 824). Nesse caso, a equao de Michaelis-Menten e o comportamento caracterstico da
saturao da enzima ainda so validos, mas o Km no pode ser considerado como uma
medida da afinidade da enzima pelo substrato. Ainda mais comuns so os casos onde a
reao ocorre atravs de etapas mltiplas aps a formao do complexo ES. O Km ento se
torna ento uma funo muito complexa de muitas constantes de velocidade.
tabela 8-6
Valores de Km para algumas enzimas e substratos
Enzima
Substrato
Catalase
H2O2
Hexoquinase (crebro)
ATP
D-Glicose
D-Frutose
Anidrase carbnica
HCO3Quimotripsina
Gliciltirosinilglicina
N-Benzoiltirosinamida
-Galactosidase
D-Lactose
Treonina desidratase
L-Treonina

Km (mM)
25
0,4
0,05
1,5
26
108
2,5
4,0
5,0

A Vm tambm varia muito de uma enzima para outra. Se uma enzima reage de
acordo com o mecanismo de duas etapas Michaelis-Menten, Vm equivalente a k2[Et],
onde k2 a etapa limitante da velocidade. Entretanto, o nmero de etapas de reao e a
identidade da(s) etapa(s) limitante(s) da velocidade podem variar de enzima para enzima.
Por exemplo, considere uma situao muito comum onde a liberao do produto, EPE +
P, limitante da velocidade. Nos instantes iniciais da reao (quando a [P] baixa), a
reao global pode ser descrita pelo esquema
k1
k 2 k3
E + S ES EP E + P
(8-25)
k-1
k-2
Neste caso, a maior parte da enzima est na forma EP em condies de saturao e
Vmx = k3[Et]. til definir uma constante mais geral, kcat, para descrever a velocidade
limitante de qualquer reao catalisada por uma enzima em condies de saturao. Se
existirem vrias etapas na reao enzimtica e uma delas visivelmente limitante da
velocidade, kcat equivalente constante de velocidade da etapa limitante. Para a reao da
equao 8-10, kcat = k2. Para a reao da equao 8-25, kcat = k3. Quando vrias etapas so
parcialmente limitantes da velocidade, kcat pode se transformar em uma funo complexa
de vrias das constantes de velocidade que definem cada etapa individual da reao. Na
equao de Michaelis-Menten, kcat = Vmx/[Et] e a equao 8-9 se transforma em
Vo = kcat [Et][S] /(Km + [S])
(8-26)
A constante kcat uma constante de velocidade de primeira ordem cuja unidade o
recproco do tempo. Ela tambm chamada de nmero de renovao e equivalente ao
nmero de molculas do substrato convertidas em produto por uma nica molcula da
enzima, em uma dada unidade de tempo, quando a enzima est saturada pelo substrato. Os
nmeros de renovao de vrias enzimas so apresentados na Tabela 8-7.
tabela 8-7
Nmero de renovao (kcat) de algumas enzimas
Enzima
Substrato
Catalase
H2O2
Anidrase carbnica
HCO3Acetilcolinesterase
Acetilcolina
-Lactamase
Benzilpenicilina

kcat (s-1)
40.000.000
400.000
140.000
2.000

21

Fumarase
Protena RecA (uma ATPase)

Fumarato
ATP

800
0,4

Os parmetros cinticos kcat e Km geralmente so teis para o estudo e a

comparao de diferentes enzimas independentemente de seus mecanismos de reao
serem simples ou complexos. Cada enzima apresenta valores timos de kcat e Km que
refletem o ambiente celular, a concentrao do substrato normalmente encontrado in vivo
pela enzima e a qumica da reao que est sendo catalisada.
Os parmetros kcat e Km permitem avaliar a eficincia cataltica das enzimas mas,
esses parmetros isoladamente so insuficientes para essa tarefa. requer a seleo de um
parmetro adequado. Duas enzimas que catalisam reaes diferentes podem ter a mesma
kcat (nmero de renovao), embora as velocidades das reaes no catalisadas possam ser
diferentes. Desta forma, o aumento da velocidade provocado pela enzima pode ser muito
diferente. Experimentalmente, o Km de uma enzima tende a ser similar concentrao
celular do seu substrato. Uma enzima que atua sobre um substrato presente em uma
concentrao muito baixa no interior da clula tender a ter um Km muito menor que
aquela que atua sobre um substrato que mais abundante.
A melhor maneira de se comparar a eficincia cataltica de diferentes enzimas ou o
nmero de renovao de diferentes substratos para uma mesma enzima comparar a
relao kcat/Km para as duas reaes. Este parmetro, que algumas vezes denominada
constante especfica, a constante de velocidade para a converso de E + S em E + P.
Quando [S] << Km, a equao 8-26 se reduz forma
Vo = kcat [Et][S]/Km
(8-27)
Neste caso, como Vo depende da concentrao de dois reagentes, [Et] e [S], ela
uma equao de velocidade de egunda ordem e a constante kcat/Km uma constante de
velocidade de reao de segunda ordem com unidades M-1 s-1. Existe um limite superior
para kcat/Km, imposto pela velocidade com que E e S se difundem em uma soluo aquosa.
Este limite, controlado pela difuso, da ordem de 108 - 109 M-1 s-1 e muitas enzimas
apresentam o valor de kcat/Km prximo a este intervalo (Tabela 8-8). Tais enzimas so
consideradas cataliticamente perfeitas. Note que diferentes valores de kcat e Km podem
produzir relaes mximas.
tabela 8-8
Enzimas onde o valor de kcat/Km est prximo do limite controlado pela difuso (108 109 M-1 s-1)
Enzima
Substrato
kcat (s-1)
Km (M)
kcat/Km
(M-1 s-1)
1,4104

910-5

1,6108

CO2
HCO3-

1106
4105

1,210-2
2,610-2

8,3107
1,5107

Catalase

H2O2

4107

1,1

4107

Crotonase

Crotonil CoA

Fumarase

Fumarato
Malato

-Lactamase

Benzilpenicilina

Acetilcolinesterase

Acetilcolina

Anidrase carbnica

5,7103

210-5 2,8108

8102
9102

510-6 1,6108
2,510-5 3,6107

2,0103

210-5

1108

22

Triose fosfato isomerase

Gliceraldeido-3fosfato

4,3103

4,710-4 2,4108

Fonte: Fersht, A (1999) Structure and Mechanism in Protein Science, p. 166. Freeman and
Company, NewYork.
Muitas enzimas catalisam reaes envolvendo dois ou mais substratos
J vimos como a [S] afeta a velocidade de uma reao enzimtica simples (SP) na
qual participa apenas uma molcula de substrato. Entretanto, em muitas reaes
enzimticas duas (algumas vezes mais de duas) molculas de substratos diferentes se ligam
enzima e participam da reao. Por exemplo, na reao catalisada pela hexoquinase, o
ATP e a glicose so as molculas de substrato e o ADP e a glicose-6-fosfato so os
produtos:
ATP + glicose ADP + glicose-6-fosfato
As velocidades dessas reaes com dois substratos tambm podem ser analisadas
atravs pela abordagem de Michaelis-Menten. A hexoquinase tem um Km caracterstico
para cada um dos seus dois substratos (Tabela 8-6).
figura 8-13
Mecanismos comuns para reaes com dois substratos catalisados enzimaticamente.
Em (a) a enzima e ambos os substratos se juntam para formar um complexo ternrio. Em
uma associao ordenada, o substrato 1 deve ser ligado antes para que o substrato 2 possa
se ligar produtivamente. Em uma associao ao acaso, os substratos podem se ligar em
qualquer ordem. Em (b), um complexo enzima-substrato se forma, um produto formado,
a enzima modificada forma um segundo complexo com uma molcula de um outro
substrato e, um segundo produto formado, regenerando a enzima livre. O substrato 1
pode transferir um grupo funcional para a enzima (originando a forma modificada
covalentemente, E), que subseqentemente transferida para o substrato 2. Este o
mecanismo chamado pingue-pongue ou de dupla-troca.
As reaes enzimticas com dois substratos usualmente envolvem a transferncia
de umtomo ou um grupo funcional de um substrato para o outro. Tais reaes ocorrem
atravs de um ou vrios caminhos diferentes. Em alguns casos, ambos os substratos esto
ligados enzima ao mesmo tempo em algum instante da reao, formando um complexo
ternrio no covalente (Fig. 8-13a). Este complexo pode ser formado pela ligao dos
substratos em uma seqncia ao acaso ou em uma ordem especfica. Nenhum complexo
ternrio formado se o primeiro substrato convertido em produto e se dissocia antes da
ligao do segundo substrato. Um exemplo, o mecanismo chamado de pingue-pongue ou
dupla-troca (Fig. 8-13b). A cintica do estado estacionrio freqentemente pode ajudar na
distino entre estas possibilidades (Fig. 8-14).
figura 8-14
Anlise cintica do estado estacionrio para reaes com dois substratos. Nestes
grficos dos duplos recprocos (veja Adendo 8-1), a concentrao do substrato 1 varivel
enquanto a concentrao do substrato 2 mantida constante. Isto repetido para vrios
valores de [S2] gerando vrias retas separadas. A interseo destas retas indicam a
formao de um complexo ternrio na reao (a); retas paralelas indicam que a reao
ocorre atravs de uma via tipo Pingue-Pongue ou dupla-troca (b).
A cintica de estado pr-estacionrio pode fornecer evidncias para etapas especficas
da reao
A cintica enzimtica foi introduzida como um mtodo importante para estudar as
etapas de uma reao enzimtica bem como foram mencionadas as limitaes dos
parmetros cinticos mais comuns que fornecem tal informao. Os dois parmetros
experimentais mais importantes fornecidos pela cintica de estado estacionrio so o kcat e

23

o kcat/Km. As variaes destes parmetros com a variao do pH e da temperatura podem

fornecer informaes adicionais a respeito das etapas de uma reao. No caso de reaes
com dois substratos, a cintica do estado estacionrio pode ajudar a determinar se durante
a reao formado um complexo ternrio (Fig. 8-14). Um quadro mais completo
geralmente requer mtodos cinticos mais sofisticados, que vo alm dos objetivos de um
texto introdutrio. Assim, ser introduzida de uma forma muito breve, uma das mais
importantes abordagens para se estudar o mecanismo de uma reao, a cintica de estado
pr-estacionrio.
Uma descrio completa de uma reao catalisada por enzimas requer medidas
diretas das velocidades das etapas individuais da reao, como por exemplo a medida da
associao da enzima e do substrato para a formar o complexo ES. durante o estado prestacionrio que as velocidades de muitas etapas da reao podem ser medidas
independentemente. As condies da reao so ajustadas para facilitar a medida dos
eventos que ocorrem durante a transformao de uma nica molcula de substrato. Uma
vez que a fase de estado pr-estacionrio geralmente muito curta, freqentemente so
necessrias tcnicas especializadas para efetuar uma mistura muito rpida dos reagentes e a
amostragem que segue. Um dos objetivos a obteno de um quadro completo e
quantitativo das mudanas de energia durante a reao. Conforme mencionado
anteriormente, a velocidade das reaes e o equilbrio esto relacionados com as mudanas
de energia livre que ocorrem durante a reao. A medida da velocidade das etapas
individuais de uma reao revelam como a energia usada por uma enzima especfica, o
que representa um componente importante do mecanismo global da reao. Em um grande
nmero de casos j possvel medir a velocidade de cada uma das etapas individuais de
uma reao enzimtica que apresenta vrias etapas. Alguns exemplos da aplicao da
cintica de estado pr-estacionrio esto includos nas descries de enzimas especficas,
ainda neste captulo.
As enzimas so sujeitas inibio
Os inibidores das enzimas so agentes moleculares que interferem com a catlise,
diminuindo ou interrompendo as reaes enzimticas. As enzimas catalisam virtualmente
todos os processos celulares e no surpreendente que os inibidores das enzimas esto
entre os mais importantes agentes farmacuticos conhecidos. Por exemplo, a aspirina
(acetilsalicilato) inibe a enzima que catalisa o primeiro passo na sntese das
prostaglandinas, compostos envolvidos em muitos processos, incluindo alguns que
produzem a sensao de dor. O estudo dos inibidores das enzimas tem fornecido valiosas
informaes a respeito dos mecanismos enzimticos e tem ajudado a definir algumas vias
metablicas. Existem duas grandes classes de inibidores enzimticos: reversveis e
irreversveis.
A inibio reversvel pode ser competitiva, incompetitiva ou mista. Um tipo comum de
inibidor reversvel chamado competitivo (Fig. 8-15a). Um inibidor competitivo
compete com o substrato pelo stio ativo da enzima. Enquanto o inibidor (I) ocupar o
centro ativo da enzima, ele impede a ligao do substrato. Os inibidores competitivos so
compostos cujas estruturas moleculares freqentemente lembram a do substrato e que se
combinam com a enzima para formar um complexo EI, sem contudo propiciar a catlise.
At mesmo associaes rpidas deste tipo afetaro negativamente a eficincia da enzima.
Levando-se em considerao a geometria molecular do inibidor, que parecido com o
substrato, possvel tirar-se concluses sobre quais partes do substrato normal se ligam
enzima. A inibio competitiva pode ser analisada quantitativamente pela cintica de
estado estacionrio. Na presena de um inibidor competitivo, a equao de MichaelisMenten fica:
Vo = Vmx [S]/(Km + [S])
(8-28)
onde
= 1 + [I]/KI
e

24

KI = [E][I]/[EI]
A equao 8-28 descreve as caractersticas importantes da inibio competitiva. O
termo Km (Km observado na presena do inibidor), determinado experimentalmente
freqentemente denominado Km aparente.
Como o inibidor se liga reversivelmente enzima, a competio pode se tornar
favorvel ao substrato, atravs da adio de mais substrato. Quando a [S] muito maior
que a [I], a probabilidade de uma molcula do inibidor se ligar enzima ser mnima e a
reao exibir uma Vmx normal. Entretanto, a [S] onde Vo = Vmx/2, o Km aparente, estar
aumentada de um fator na presena do inibidor. Este efeito no Km aparente combinado
com a ausncia de um efeito em Vmx diagnstico da inibio competitiva e facilmente
revelado no grfico dos duplos recprocos (Adendo 8-2). A constante de equilbrio para a
ligao do inibidor, KI, pode ser obtida a partir do mesmo grfico.
figura 8-15
Trs tipos de inibio reversvel. (a) Os inibidores competitivos se ligam ao centro ativo
da enzima. (b) Os inibidores incompetitivos se ligam em regies diferentes do stio ativo,
mas se ligam apenas ao complexo ES. KI a constante de equilbrio para a ligao do
inibidor enzima enquanto KI a constante de equilbrio para a ligao do inibidor ao
complexo ES. (c) Os inibidores mistos se ligam em regies diferentes do stio ativo, mas
podem se ligar tanto a E como ES.
Uma terapia mdica baseada na competio pelo centro ativo usada para tratar
pacientes que ingeriram metanol, um solvente encontrado em misturas anticongelantes. A
desidrogenase alcolica do fgado converte o metanol em formaldedo, que prejudicial
maioria dos tecidos. A cegueira um resultado freqente da intoxicao pelo metanol,
porque os olhos so particularmente sensveis ao formaldedo. O etanol compete
efetivamente com o metanol como um substrato alternativo para a desidrogenase alcolica.
O efeito do etanol muito parecido com o de um inibidor competitivo, com a ressalva de
que o etanol tambm um substrato e a sua concentrao diminuir com o tempo
medida que a enzima o converte em acetaldedo. Assim, a terapia para o envenenamento
com metanol uma infuso endovenosa gradual de etanol, em uma velocidade que
mantenha uma concentrao controlada na corrente sangnea durante vrias horas. Isto
diminui a formao do formaldedo, reduzindo o perigo enquanto os rins excretam o
metanol atravs da urina sem maiores danos.
As duas outras formas de inibio reversvel, incompetitiva e mista, so
freqentemente definidas em termos de enzimas com um nico substrato, mas na prtica
tm sido observadas apenas com enzimas que tm dois ou mais substratos. Um inibidor
incompetitivo (Fig. 8-15b) se liga em um stio diferente do stio ativo do substrato e,
diferentemente do inibidor competitivo, ele se liga apenas ao complexo ES. Na presena
de um inibidor incompetitivo a equao de Michaelis-Menten se altera para
Vo = Vmx [S]/(Km + [S])
(8-29)
onde
= 1 + [I]/KI
e
KI = [ES][I]/[ESI]
Conforme descrito pela equao 8-29, em altas concentraes do substrato, Vo se
aproxima de Vmx/. Assim, um inibidor incompetitivo diminui a Vmx. O valor do Km
aparente tambm diminui porque a [S] requerida para alcanar metade da Vmx diminui de
um fator .
Um inibidor misto (Fig. 8-15c) tambm se liga a um stio diferente do stio ativo
do substrato, mas ele pode se ligar tanto a E como ES. A equao que descreve a inibio
mista
Vo = Vmx [S]/(Km + [S])
(8-30)

25

onde e so definidos como anteriormente. Um inibidor misto geralmente afeta tanto o

Km como a Vmx. O caso especial onde
= , raramente encontrado na prtica,
definido classicamente como inibio no competitiva. Analise a equao 9-30 para ver
porque um inibidor no competitivo afeta a Vmx mas no o Km.
Na prtica, as inibies incompetitiva e mista so observadas somente para enzimas
com dois ou mais substratos (por exemplo, S1 e S2) e, esses substratos so muito
importantes na anlise experimental de tais enzimas. Se um inibidor se liga ao stio
ocupado por S1, ele pode atuar como um inibidor competitivo em experimentos onde a [S 1]
varivel. Se um inibidor se liga ao stio normalmente ocupado por S2, ele pode atuar
como um inibidor misto ou um inibidor incompetitivo de S1. Os modelos de inibio
atualmente observados dependem do fato das ligaes de S1 e S2 serem ordenadas ou ao
acaso. Desse modo, pode-se determinar a ordem com que esses substratos se ligam ao stio
ativo e os produtos so liberados. Freqentemente, o uso de um dos produtos da reao
como um inibidor, particularmente informativo. Se somente um dos dois produtos da
reao est presente, ento a reao inversa no ocorre. Contudo, um produto geralmente
se ligar em alguma parte do stio ativo atuando como um inibidor. Os estudos de inibio
geralmente so elaborados e podem proporcionar uma descrio detalhada do mecanismo
de uma reao bisubstrato.
Adendo 8-2
Testes cinticos para determinao dos mecanismos de inibio
O grfico dos duplos recprocos (veja Adendo 8-1) oferece uma forma fcil de determinar
se um inibidor enzimtico competitivo, incompetitivo ou misto. Dois conjuntos de
experimentos de determinao de velocidade devem ser realizados e, em ambos os
conjuntos a concentrao da enzima mantida constante. No primeiro conjunto, a [S]
tambm mantida constante, permitindo a medida do efeito do aumento da concentrao
do inibidor [I] na velocidade inicial Vo (no mostrado). No segundo conjunto a [I]
mantida constante, mas a [S] varia. Os resultados so lanados em grfico como 1/Vo
versus 1/[S].
figura 1
Inibio competitiva.
figura 2
Inibio incompetitiva.
figura 3
Inibio mista.
A Figura 1 mostra um conjunto de grficos dos duplos recprocos, um deles obtido
na ausncia do inibidor e dois outros obtidos em duas concentraes diferentes de um
inibidor competitivo. O aumento da [I] resulta em uma famlia de retas com intercepto
comum no eixo 1/Vo mas com inclinaes diferentes. Como o intercepto no eixo 1/Vo
igual a 1/Vmx, observa-se que a Vmx permanece inalterada na presena de um inibidor
competitivo. Isto , independentemente da concentrao de um inibidor competitivo, uma
concentrao suficientemente alta do substrato sempre deslocar o inibidor competitivo do
stio ativo da enzima. Acima do grfico est mostrado o rearranjo da equao
8-28 na
qual o grfico baseado. O valor de pode ser calculado atravs da mudana da
inclinao para uma dada [I]. Conhecendo-se a [I] e , possvel determinar KI atravs da
expresso:
= 1 + [I]/KI
Para uma inibio incompetitiva e mista, grficos similares das valores de
velocidade originam as famlias de retas mostradas nas Figura 2 e 3. Mudanas nos
interceptos dos eixos assinalam mudanas em Vmx e Km.

26

A inibio irreversvel uma ferramenta importante na pesquisa das enzimas e em

farmacologia
Inibidores irreversveis so aqueles que se combinam com um grupo funcional na
molcula da enzima ou o destroem ou ainda formam uma associao covalente bastante
estvel. A formao de uma ligao covalente entre o inibidor e a enzima muito comum.
Os inibidores irreversveis representam uma ferramenta muito til no estudo do
mecanismo das reaes. Os aminocidos essenciais do stio ativo que apresentam funes
catalticas importantes freqentemente so identificados atravs da determinao do
aminocido que est ligado covalentemente ao inibidor depois que a enzima inativada.
Um exemplo est mostrado na Figura 8-16.
figura 8-16
Inibio irreversvel. A reao da quimotripsina com o diisopropilfluorfosfato (DIFP)
inibe irreversivelmente a enzima. Isto levou concluso de que a Ser 195 o resduo chave
de serina do stio ativo da quimotripsina.
Uma classe especial de inibidores irreversveis a dos inibidores suicidas. Estes
compostos so relativamente pouco reativos at se ligarem ao stio ativo de uma enzima
especfica. Um inibidor suicida desenhado para participar dos primeiros passos qumicos
da reao enzimtica normal. Entretanto, ao invs de ser transformado no produto normal,
o inibidor convertido em um composto muito reativo que se combina irreversivelmente
com a enzima. Estes compostos tambm so chamados de inibidores com base no
mecanismo, porque eles utilizam o mecanismo da reao enzimtica normal para inativar
a enzima. Estes inibidores ocupam um papel central no desenvolvimento racional de
drogas, uma abordagem moderna para a obteno de novos agentes farmacuticos, onde
novos substratos so sintetizados baseado no conhecimento dos substratos j conhecidos e
nos mecanismos da reaes. Um inibidor suicida bem planejado especfico para uma
nica enzima e no reativo at que esteja dentro do stio ativo da enzima. Assim, as
drogas baseadas nesta estratgia oferecem a grande vantagem de apresentar poucos efeitos
colaterais (veja Adendo 22-1).
A atividade enzimtica afetada pelo pH
As enzimas tm um pH timo (ou um intervalo de pH) onde a sua atividade
mxima (Fig. 8-17) Em um pH maior ou menor a atividade diminui. Isto no
surpreendente. As cadeias laterais dos aminocidos do centro ativo podem atuar como
cidos e bases fracas com funes crticas que dependem da manuteno de certos estados
de ionizao e, em algum lugar da proteina, as cadeias laterais ionizadas podem
desempenhar um papel essencial nas interaes que mantm a estrutura da proteina. Por
exemplo, a remoo de um prton de um resduo de His fora do centro ativo, pode
eliminar uma interao inica essencial para a estabilizao da conformao ativa da
enzima. Uma causa menos comum de sensibilidade ao pH a titulao de grupos do
substrato.
O intervalo de pH onde a enzima sofre mudanas na atividade pode fornecer uma
pista sobre qual aminocido est envolvido (veja Tabela 5-1). Uma mudana na atividade
enzimtica ao redor de pH 7,0, por exemplo, em geral reflete a titulao de um resduo
His. Entretanto, os efeitos do pH precisam ser interpretados com certa cautela. No
ambiente bem empacotado de uma proteina, o pKa da cadeia lateral de um aminocido
pode variar significativamente. Por exemplo, uma carga positiva vizinha pode diminuir o
valor do pKa de um resduo de lisina enquanto uma carga negativa vizinha pode aumentalo. Algumas vezes esse efeitos resultam em um pKa deslocado de duas ou mais unidades de
pH em relao ao seu valor normal (do aminocido livre). Na enzima acetoacetato
descarboxilase um resduo Lis (pKa normal 10,5) apresenta um pKa de 6,6 devido a efeitos
eletrostticos de cargas positivas prximas.

27

figura 8-17
O perfil pH-atividade de duas enzimas. Estas curvas so construdas com resultados de
medidas das velocidades iniciais quando a reao desenvolvida em tampes com
diferentes pH. Como o eixo do pH uma escala logartmica que reflete mudanas da
ordem de 10 vezes nas concentraes de H+, as mudanas em Vo tambm so lanadas em
uma escala logartmica. O pH timo para a atividade de uma enzima geralmente reflete o
ambiente onde a enzima normalmente encontrada. (a) A pepsina que hidrolisa certas
ligaes peptdicas das protenas durante a digesto no estmago, tem pH timo de cerca
de 1,6. O pH do suco gstrico da ordem de 1 a 2. (b) A glicose-6-fosfatase dos
hepatcitos (clulas do fgado) com pH timo de cerca de 7,8, responsvel pela liberao
da glicose no sangue. O pH normal do citosol dos hepatcitos cerca de 7,2.
Exemplos de Reaes Enzimticas
Este captulo focalizou at agora os princpios gerais da catlise e introduziu
alguns parmetros cinticos empregados para descrever a ao das enzimas. Os princpios
e os conhecimentos cinticos esto combinados na Adendo 8-3 que descreve algumas das
evidncias que indicam de que a energia de ligao e a complementaridade do estado de
transio so pontos centrais para a catlise enzimtica. Vamos examinar agora vrios
exemplos especficos de reao enzimtica.
A compreenso do mecanismo de ao completo de uma enzima purificada requer
a identificao de todos os substratos, cofatores, produtos e reguladores. Alm disso ele
requer o conhecimento da (1) seqncia temporal da ligao das formas intermedirias da
reao enzima, (2) estrutura de cada intermedirio e cada estado de transio, (3)
velocidade de interconverso dos intermedirios, (4) relao estrutural da enzima com
cada intermedirio e (5) energia de todos os grupos reagentes e que interagem que
contribuem para a formao dos intermedirios e estados de transio. Provavelmente no
existe nenhuma enzima onde o nosso conhecimento atual satisfaa completamente esses
requisitos. No obstante a isso, vrias dcadas de pesquisa produziram informaes
mecansticas a respeito de centenas de enzimas e, em alguns casos esta informao
altamente detalhada.
Adendo 8-3
Evidncias da complementaridade entre a enzima e estado de transio
O estado de transio de uma reao difcil de ser estudado porque ele tem um tempo de
vida curto. Entretanto, para entender a catlise enzimtica preciso analisar a interao
entre a enzima e este momento efmero durante a reao. A complementaridade entre a
enzima e o estado de transio virtualmente um requisito para a catlise, j que a colina
de energia sobre a qual o estado de transio se situa o que a enzima precisa diminuir se
a catlise ocorrer. Como podem ser obtidas evidncias para a complementaridade entre a
enzima e o estado de transio ? Felizmente existe uma variedade de abordagens novas e
velhas, para atacar este problema, cada uma delas fornecendo evidncias muito
convincentes em apoio a este princpio geral da catlise enzimtica.
Correlaes estrutura-atividade
Se as enzimas so complementares aos estados de transio da reao, ento alguns
grupos funcionais no substrato e na enzima precisam interagir preferencialmente no estado
de transio do que no complexo ES. A alterao desses grupos deve provocar pouco
efeito na formao do complexo ES e, portanto no deve afetar os parmetros cinticos (a
constante de dissociao, Kd ou algumas vezes o Km se KS = Km) que refletem o equilbrio
E + S ES. Entretanto, mudanas desses mesmos grupos devem provocar um grande
efeito na velocidade global (kcat ou kcat/Km) da reao, uma vez que o substrato no
apresenta as interaes de ligao necessrias para diminuir a energia de ativao.
Um excelente exemplo deste efeito mostrado na cintica associada a uma srie de
substratos similares para a quimotripsina (Fig. 1). A quimotripsina normalmente catalisa a

28

hidrlise das ligaes peptdicas adjacente a aminocidos aromticos. Os substratos

mostrados na Figura 1, so modelos menores convenientes para os substratos naturais
(polipeptdeos longos e protenas; veja Captulo 5). Os grupos qumicos funcionais
adicionados a cada substrato (A para B para C) esto sombreados em vermelho. Conforme
mostrado na tabela, a interao entre a enzima e estes grupos funcionais adicionados
provoca um efeito mnimo sobre o Km (assumido como uma imagem de Kd), porm um
grande efeito positivo sobre kcat ou kcat/Km. Isto o que esperaramos se a interao
contribusse significativamente para a estabilizao do estado de transio. Os resultados
tambm mostram que a velocidade da reao pode ser afetada significativamente pelas
interaes enzima-substrato que, fisicamente esto longe das ligaes covalentes que sero
alteradas na reao enzimtica. A quimotripsina descrita em maiores detalhes mais
adiante.
Uma abordagem experimental complementar modificar a enzima, eliminando
certas interaes enzima-substrato pela substituio de aminocidos especficos atravs de
mutagnese sitio-dirigida (Captulos 6 e 29). Os resultados destes experimentos
demonstram novamente a importncia da energia de ligao na estabilizao do estado de
transio.
figura 1
Efeitos que pequenas mudanas estruturais na molcula do substrato provocam nos
parmetros cinticos da hidrlise de uma amida catalisada pela quimotripsina.

Substrato A
Substrato B
Substrato C

kcat
(s-1)
0,06
0,14
2,8

Km
(mM)
31
15
25

kcat /Km
(M-1 s-1)
2
10
114

Anlogos do estado de transio

Muito embora o estado de transio no possa ser observado diretamente, os
qumicos freqentemente tm previsto a estrutura aproximada do estado de transio
baseados no acmulo de conhecimento a respeito dos mecanismos de reao. O estado de
transio, por definio, transiente e to instvel que medidas diretas da interao de
ligao entre estas espcies e a enzima so impossveis. Entretanto, em alguns casos
molculas estveis muito semelhantes ao estado de transio, podem ser projetadas. Elas
so chamadas anlogos do estado de transio. Em princpio, elas devem se ligar a uma
enzima mais firmemente do que o substrato no complexo ES, uma vez que elas devem se
ajustar melhor ao stio ativo (isto , formam um maior nmero de interaes fracas) que o
prprio substrato. A idia dos anlogos do estado de transio foi sugerida por Pauling, na
dcada de 1940, e tem sido averiguada para um certo nmero de enzimas. Esses
experimentos tm a limitao de que um estado de transio anlogo nunca pode
mimetizar perfeitamente o estado de transio. Entretanto, alguns anlogos se ligam
enzima 102 a 106 vezes mais firmemente que o prprio substrato normal, acarretando uma
boa evidncia de que os stios ativos das enzimas so realmente complementares aos
estados de transio. O mesmo princpio atualmente usado como rotina na indstria
farmacutica no desenvolvimento de novas drogas. As potentes drogas anti-HIV chamadas
inibidores de proteases foram desenvolvidas como anlogos que se ligam fortemente ao
estado de transio e direcionadas para o centro ativo da protease do HIV.
Anticorpos catalticos
Se um anlogo do estado de transio pode ser projetado para a reao SP, ento
um anticorpo que se liga fortemente ao anlogo do estado de transio pode catalisar SP.
Os anticorpos (imunoglobulinas; veja Fig. 7-23) so os principais participantes da resposta
imunolgica. Quando um anlogo do estado de transio empregado como uma proteina
ligante de epitopo para estimular a produo de anticorpos, os anticorpos que se ligam a

29

ele so catalisadores potenciais da reao correspondente. O uso de anticorpos catalticos

inicialmente sugerida por William P. Jencks, em 1969, tornou-se prtico com o
desenvolvimento de tcnicas de laboratrio para produzir anticorpos idnticos que se ligam
a um nico antgeno especfico (anticorpos monoclonais, veja Captulo 7).
Trabalhos pioneiros nos laboratrios de Richard Lerner e Peter Schultz resultaram
no isolamento de alguns anticorpos monoclonais que catalisam a hidrlise de steres ou
carbonatos (Fig. 2). Nestas reaes o ataque da gua (OH-) ao carbono da carbonila produz
um estado de transio tetradrico, onde uma carga parcial negativa se desenvolve no
oxignio da carbonila. Os fosfonatos mimetizam a estrutura e a distribuio de cargas
desse estado de transio durante a hidrlise de steres, tornando-os bons anlogos do
estado de transio. Por isso, os fosfonatos so usados nas reaes de hidrlise de
carbonatos. Os anticorpos que ligam fortemente o fosfonato ou o fosfato aceleram as
reaes de hidrlise do ster ou carbonato correspondentes, da ordem de 103 a 104.
Anlises estruturais de alguns desses anticorpos catalticos mostraram que as cadeias
laterais de alguns aminocidos catalticos esto arranjadas de tal modo que interagem com
o substrato principalmente quando ele se encontra no estado de transio.
Os anticorpos catalticos geralmente no apresentam a mesma eficincia cataltica
das enzimas, entretanto, eles esto comeando a ser utilizados na indstria e em medicina.
Por exemplo, os anticorpos catalticos desenvolvidos para degradar a cocana esto sendo
pesquisados como uma ajuda importante no tratamento da dependncia a cocana.
figura 2
Estados de transio esperados para as reaes de hidrlise de steres ou carbonatos.
Derivados de fosfonato e fosfato representam bons anlogos do estado de transio destas
reaes, respectivamente.
O mecanismo das reaes ilustra princpios
Apresentamos aqui os mecanismos da: quimotripsina, hexoquinase e enolase. Estas
enzimas foram escolhidas no por serem as mais bem conhecidas ou por abrangerem todas
as classes possveis da qumica de enzimtica, mas porque ilustram claramente alguns
princpios gerais explicados neste captulo. A discusso est concentrada em princpios
selecionados juntamente com alguns experimentos cruciais que ajudaram a chamar a
ateno sobre esses princpios. Muitos detalhes mecansticos e evidncias experimentais
foram omitidas e, em nenhum caso, os mecanismos descritos fornecem uma completa
explicao para os aumentos da velocidade cataltica provocada por estas enzimas.
Quimotripsina A quimotripsina (Mr 25.000) uma protease, uma enzima que catalisa a
hidrlise de ligaes peptdicas. Essa protease especfica para quebrar ligaes peptdicas
adjacentes a resduos de aminocidos aromticos (veja Tabela 5-7). A estrutura
tridimensional da quimotripsina mostrada na Figura 8-18, onde esto enfatizados os
grupos funcionais do stio ativo. A reao catalisada por esta enzima ilustra o princpio da
estabilizao do estado de transio e tambm fornece um exemplo clssico de catlise
cido-base geral e catlise covalente.
figura 8-18
Estrutura da quimotripsina. (a) Representao da estrutura primria mostrando as
ligaes dissulfeto e os resduos de aminocidos cruciais para a catlise. A protena
consiste de trs cadeias polipeptdicas ligadas por pontes dissulfeto. A numerao dos
resduos (14, 15, 147 e 148 no mostrados) est explicada na Fig. 8-31. Os aminocidos do
stio ativo esto agrupados na estrutura tridimensional. (b) Representao da enzima
enfatizando sua superfcie. A fenda onde a cadeia lateral do aminocido aromtico do
substrato est ligada mostrada em verde. Os resduos chaves do centro ativo, incluindo a
Ser195, His57 e Asp102 so mostrados em vermelho. O papel destes resduos na catlise est
ilustrado na Figura 8.19. (c) O esqueleto polipeptdico da quimotripsina como uma

30

estrutura em fita. As pontes dissulfeto so mostradas em amarelo; as cadeias A, B e C so

coloridas como mostradas em (a).
(d) Uma vista completa do stio ativo com o substrato (verde) ligado. Dois dos resduos
do centro ativo Ser195 e His57 (vermelho) so parcialmente visveis. A Ser195 ataca o grupo
carbonila do substrato (o oxignio mostrado em prpura) e a carga negativa que se
desenvolve no oxignio estabilizada pela cavidade oxinion (nitrognios da ligao
amida mostrados em alaranjado), conforme explicado na Figura 8-19. No substrato, a
cadeia lateral do aminocido aromtico e o nitrognio amida da ligao peptdica que ser
quebrada (projetando-se na direo do leitor e projetando a trajetria do resto da cadeia
polipeptdica do substrato) esto mostrados em azul.
A quimotripsina aumenta a velocidade de hidrlise da ligao peptdica de um fator
de pelo menos 109. A enzima no catalisa o ataque direto da gua sobre a ligao
peptdica. Ao invs disso, ocorre a formao de um intermedirio covalente transiente, a
acil-enzima. Desse modo, esta reao tem duas fases principais (Fig. 8-19) Na fase de
acilao, a ligao peptdica quebrada e uma ligao ster formada entre o carbono da
carbonila e a enzima. Na fase de desacilao, a ligao ster hidrolisada e a enzima no
acilada regenerada. Na fase de acilao o nuclefilo o oxignio da Ser 195.
Normalmente, a hidroxila da serina est protonada em pH neutro, mas a Ser195 est ligada
por ponte de hidrognio His57, que tambm est ligada por ponte de hidrognio ao Asp102.
Estes trs aminocidos so freqentemente chamados de trade cataltica. Quando o
oxignio da Ser195 ataca o carbono da carbonila da ligao peptdica, a His57, que est
ligada por pontes de hidrognio, funciona como uma base geral removendo o prton da
serina, enquanto o Asp102, carregado negativamente, estabiliza a carga positiva que se
forma no resduo de His. Isto previne a formao de uma carga positiva muito instvel na
hidroxila da Ser195 e a torna muito mais nucleoflica. A His57 pode tambm agir como um
doador de prtons e protonar o grupo amino na poro do substrato que foi deslocada (o
grupo que sai). Um conjunto semelhante de transferncias de prtons ocorre no passo de
desacilao.
Enquanto o oxignio da Ser195 ataca o grupo carbonila do substrato, formado um
intermedirio de vida muito curta, onde o oxignio da carbonila adquire uma carga
negativa. Esta carga formada dentro de uma cavidade na enzima, chamada de fenda
oxinion e, estabilizada por pontes de hidrognio proporcionadas pelos nitrognios dos
grupos amida de duas ligaes peptdicas do esqueleto da quimotripsina. Uma dessas
pontes de hidrognio ocorre apenas nesse intermedirio e nos estados de transio da sua
formao e quebra, reduzindo assim a energia necessria para atingir estes estados. Este
um exemplo do uso da energia de ligao na catlise.
figura 8-19
Passos na hidrlise de uma ligao peptdica pela quimotripsina. O substrato (um
polipeptdio ou protena) est ligado no stio ativo. A ligao peptdica a ser quebrada
posicionada pela ligao da cadeia lateral do aminocido hidrofbico adjacente (um
resduo de fenilalanina, neste exemplo) em uma fenda hidrofbica especial na enzima. A
reao consiste de duas fases. Nas etapas a , a formao do intermedirio covalente
acil-enzima est associada hidrlise da ligao peptdica (fase de acilao). Nas etapas
a , a desacilao regenera a enzima livre (fase de desacilao). Em ambas as fases, o
oxignio da carbonila do substrato adquire uma carga negativa no intermedirio
tetradrico. A carga estabilizada por pontes de hidrognio entre os nitrognios amida da
Gli193 e da Ser195. A ponte de hidrognio com a Gli193 formada apenas neste intermedirio
de curta durao e nos estados de transio que levam sua formao e decomposio. A
desacilao essencialmente o reverso da acilao, onde a gua usada em substituio ao
grupo amino do substrato. Os resduos de His e Asp cooperam na trade cataltica
proporcionando uma catlise bsica geral nas etapas e e uma catlise cido geral nas
etapas e .

31

A primeira evidncia da existncia de um intermedirio covalente acil-enzima veio

de uma aplicao clssica da cintica de estado pr-estacionrio. Alm da sua ao sobre
os polipeptdios, a quimotripsina tambm catalisa a hidrlise de pequenas molculas de
amidas e steres. Essas reaes so muito mais lentas que a hidrlise de peptdeos porque
menos energia de ligao est disponvel com estas molculas pequenas de substratos, mas
elas so mais fceis de serem estudadas. As investigaes de B.S. Hartley e B.A. Kilby
mostraram que a hidrlise do ster p-nitrofenilacetato pela quimotripsina, medida pela
liberao do p-nitrofenol, ocorre com um aumento brusco (burst) antes de se estabilizar
em uma velocidade menor (Fig. 8-20). Extrapolando os resultados para o tempo zero, eles
concluram que esse aumento brusco correspondia liberao de exatamente uma
molcula de p-nitrofenol para cada molcula de enzima presente. Hartley e Kilby
sugeriram que isto refletia uma acilao rpida de todas as molculas de enzima (com a
liberao de p-nitrofenol) e que a velocidade da renovao da enzima era limitada por uma
etapa lenta de desacilao. Resultados similares tm sido obtidos desde ento com muitas
outras enzimas. A observao da etapa de aumento brusco constitui outro exemplo do uso
da cintica para decompor uma reao em suas etapas constituintes.
figura 8-20
A cintica de estado pr-estacionrio evidencia um intermedirio acil-enzima. A
hidrlise do p-nitrofenilacetato pela quimotripsina medida pela liberao de p-nitrofenol
(um produto colorido). Inicialmente, uma quantidade de p-nitrofenol quase
estequiomtrica com a quantidade de enzima presente liberada atravs de um aumento
rpido. Isto reflete a fase rpida de acilao da reao. A velocidade subseqente menor
uma vez que a renovao da enzima limitada pela velocidade da fase de desacilao,
mais lenta.
Hexoquinase Esta uma enzima bisubstrato (Mr 100.000) que catalisa a interconverso
de glicose e ATP em glicose-6-fosfato e ADP. O ATP e o ADP ligam-se s enzimas como
complexos do on metlico Mg2+. A hidroxila do carbono 6 da glicose (para a qual o
fosfato do ATP transferido) similar gua em reatividade qumica, e a gua entra
livremente no stio ativo da enzima. Mesmo assim a hexoquinase discrimina a glicose da
gua, sendo a glicose favorecida por um fator de 106.
A hexoquinase pode discriminar entre a glicose e a gua devido s mudanas
conformacionais que ocorrem na enzima quando o substrato correto se liga ao stio ativo
(Fig. 8-21). Assim, a hexoquinase representa um excelente exemplo de ajuste induzido.
Quando a glicose no est presente, a enzima est em uma conformao inativa, com as
cadeias laterais dos aminocidos em uma posio inadequada para a reao. Quando a
glicose (mas no a gua) e o ATP-Mg se ligam ao stio ativo, a energia de ligao derivada
desta interao induz uma mudana conformacional para a forma cataliticamente ativa da
hexoquinase.
figura 8-21
Ajuste induzido na hexoquinase. As extremidades da hexoquinase, uma enzima em
forma de U (a) atuam como pina devido a uma mudana conformacional induzida
pela ligao da D-glicose (vermelho) (b).
Esta concluso tem sido reforada por estudos cinticos. A xilose, um acar de cinco
carbonos, estereoquimicamente similar glicose mas com um carbono a menos, se liga
hexoquinase mas em uma posio onde no pode ser fosforilada. Desse modo, a adio de
xilose mistura de reao aumenta a velocidade de hidrlise do ATP. Evidentemente, a
ligao da xilose suficiente para induzir uma mudana na hexoquinase para a sua
conformao ativa e, desse modo a enzima enganada para fosforilar a gua.

32

A reao da hexoquinase tambm ilustra que a especificidade da enzima no

apenas um simples caso de ligao de um composto mas no de outro. No caso da
hexoquinase, a especificidade no observada na formao do complexo ES mas sim nas
velocidades relativas das etapas catalticas subsequentes. A gua no excluda do centro
ativo, mas a velocidade da reao aumenta consideravelmente na presena de um grupo
aceptor de fosfato (glicose). O ajuste induzido apenas um aspecto do mecanismo
cataltico da hexoquinase: do mesmo modo que a quimotripsina, a hexoquinase utiliza
vrias estratgias catalticas. Por exemplo, os resduos de aminocidos do centro ativo
(aqueles posicionados pelas mudanas conformacionais resultantes da ligao do substrato)
participam de uma catlise cido-base geral e estabilizao do estado de transio.
Enolase Esta enzima catalisa uma etapa da via glicoltica (Captulo 15), a desidratao
reversvel do 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato:
enolase
2-fosfoglicerato
fosfoenolpiruvato
A enolase de levedura (Mr 96000) um dmero com 436 resduos de aminocidos
por subunidade. A reao da enolase ilustra um tipo de catlise por on metlico e
proporcionaum exemplo adicional de catlise cido-base geral e estabilizao do estado de
transio. A reao ocorre em duas etapas (Fig. 8-22a). O resduo Lis345 atua como um
catalisador bsico geral, retirando um prton do carbono 2 do 2-fosfoglicerato na primeira
etapa. O Glu211 atua como um catalisador cido geral, doando um prton para o grupo -OH
que removido da molcula na segunda etapa.
O prton do carbono 2 do 2-fosfoglicerato no muito cido e portanto ele no
removido rapidamente. Entretanto, no stio ativo da enzima, o 2-fosfoglicerato
submetido a fortes interaes inicas com dois ons Mg2+ ligados (Fig. 8-22b), o que torna
o carbono 2 mais cido (diminuindo seu pKa) e mais fcil de abstrair. A formao de
pontes em outros resduos do centro ativo tambm contribui para o mecanismo global. As
vrias interaes estabilizam efetivamente tanto o intermedirio enolato como o estado de
transio que precede a sua formao.
No foi includa nestas discusses de mecanismos enzimticos a contribuio
especial das coenzimas na atividade cataltica de muitas enzimas. A funo das coenzimas
quimicamente variada e, elas sero descritas medida que forem sendo encontradas na
Parte III deste livro.
figura 8-22
As duas etapas da reao catalisada pela enolase. (a) Mecanismo de transformao do
2-fosfoglicerato em fosfoenolpiruvato pela enolase. O grupo carbonila do 2-fosfoglicerato
coordenado por dois ons magnsio no centro ativo. Um prton removido atravs de
uma catlise bsica geral (Lis345). O intermedirio enlico resultante estabilizado pelos
dois ons Mg2+. A eliminao subsequente do OH facilitada por uma catlise cida geral
(Glu211). (b) O substrato 2-fosfoglicerato em relao aos ons magnsio, Lis345 e Glu211 no
centro ativo da enolase. Os tomos de H no so mostrados. Todos os tomos de oxignio
no 2-fosfoglicerato so azul claro; o fsforo alaranjado.
Enzimas Reguladoras
No metabolismo celular, grupos de enzimas trabalham em conjunto em vias
seqenciais para desenvolver um dado processo metablico, tal como a converso da
glicose em lactato no msculo esqueltico atravs de vrias reaes ou a sntese de um
aminocido a partir de precursores mais simples em uma clula bacteriana, atravs de
vrias reaes. Nesses sistemas enzimticos, o produto da reao da primeira enzima
torna-se o substrato da prxima enzima e assim sucessivamente.
A maioria das enzimas em cada sistema, segue os padres cinticos j descritos.
Entretanto, em cada via metablica existe pelo menos uma enzima que determina a
velocidade de toda a seqncia, porque ela catalisa a reao mais lenta ou a reao

33

limitante da velocidade. Alm disso, estas enzimas reguladoras tm sua atividade

cataltica aumentada ou diminuda em resposta a determinados sinais. Ajustes na
velocidade das reaes catalisadas pelas enzimas e consequentemente na velocidade da
seqncia metablica permitem clula acertar as mudanas nas necessidades de energia e
de biomolculas requeridas para o crescimento e reparo.
Em muitos sistemas multienzimticos a primeira enzima da seqncia uma
enzima reguladora. Catalisar, ainda que somente algumas reaes de uma via metablica
que leva a um produto desnecessrio, desvia energia e metablitos de processos mais
importantes. Portanto, um lugar excelente para regular uma via metablica no ponto de
comprometimento da seqncia metablica. As outras enzimas na seqncia esto
usualmente presentes em quantidades que fornecem um excesso de atividade cataltica.
Geralmente elas promovem suas reaes to rapidamente quanto seus substratos so
disponibilizados a partir das reaes precedentes.
A atividade das enzimas reguladoras modulada de vrias maneiras. Existem duas
grandes classes de enzimas reguladoras nas vias metablicas. As enzimas alostricas
funcionam atravs da ligao no-covalente reversvel de compostos reguladores
chamados moduladores alostricos, que geralmente so pequenos metablitos ou
cofatores. Outras enzimas so reguladas atravs de uma modificao covalente reversvel.
Ambas as classes de enzimas reguladoras tendem a apresentar subunidades mltiplas e, em
alguns casos os stios reguladores e o stio ativo esto em subunidades separadas.
Existem pelo menos outros dois mecanismos de regulao da atividade enzimtica.
Algumas enzimas so estimuladas ou inibidas quando elas esto ligadas por outras
proteinas regulatrias. Outras so ativadas quando segmentos peptdicos so removidos
atravs de uma clivagem proteoltica. Diferentemente da regulao mediada por um efetor,
a regulao atravs de uma quebra proteoltica irreversvel. Exemplos importantes destes
dois mecanismos so encontrados em processos fisiolgicos tais como a digesto,
coagulao sangnea, ao hormonal e o processo da viso.
O crescimento celular e a sobrevivncia depende do uso eficiente dos recursos
disponibilizados pelas enzimas reguladoras. Nenhuma regra nica governa a ocorrncia
dos diferentes tipos e regulao nos diferentes sistemas. De um certo modo, a regulao
alostrica (no-covalente) permite um ajuste fino das vias metablicas que so requeridas
continuamente, mas em diferentes nveis de atividade, medida que condies celulares
mudam. A regulao por modificao covalente pode ser tudo ou nada principalmente no
caso de quebra proteoltica ou pode permitir mudanas tnues na atividade. Mltiplos
tipos de regulao so observados em um grande nmero de enzimas reguladoras. O
restante deste captulo ser destinado regulao das enzimas.
As enzimas alostricas sofrem mudanas conformacionais em resposta ligao do
modulador
Conforme visto no Captulo 7, as proteinas alostricas so aquelas que apresentam
outras formas ou conformaes induzidas pela ligao dos moduladores. O mesmo
conceito se aplica para determinadas enzimas reguladoras,onde mudanas conformacionais
induzidas por um ou mais moduladores interconvertem formas mais e menos ativas da
enzima. Os moduladores das enzimas reguladoras podem ser tanto inibidores ou
estimuladores. Geralmente o prprio substrato um ativador da enzima. As enzimas
reguladoras cujos substrato e modulador so, idnticos so chamadas homotrpicas. O
efeito similar ligao do O2 hemoglobina, uma proteina que no tem atividade
enzimtica (Captulo 7). A ligao do substrato causa mudanas conformacionais que
afetam a subsequente atividade dos outros stios na proteina. Quando o modulador uma
molcula diferente do substrato, a enzima chamada heterotrpica.
importante que os moduladores alostricos no sejam confundidos com os
inibidores incompetitivos e mistos. Embora estes ltimos se ligam a um segundo stio na
enzima, eles no promovem necessariamente mudanas conformacionais entre as formas
ativa e inativa. Alm disso os efeitos cinticos so distintos.

34

As propriedades das enzimas alostricas so significantemente diferente daquelas

das meras enzimas no reguladoras. Algumas das diferenas so estruturais. Alm do stio
ativo, as enzimas alostricas apresentam um ou mais stios reguladores ou alostricos para
a ligao do modulador (Fig. 8-23). Tal como o centro ativo especfico para o seu
substrato, cada stio regulador especfico para seu modulador. As enzimas que
apresentam vrios moduladores geralmente apresentam stios de ligao especficos
diferentes para cada um deles. Nas enzimas homotrpicas, o centro ativo e o stio
regulatrio so os mesmos.
figura 8-23
Interaes entre as subunidades em uma enzima alostrica e interaes com os
inibidores e ativadores. Em muitas enzimas alostricas o stio de ligao do substrato e
o(s) stio(s) de ligao dos moduladores esto em subunidades diferentes, a subunidade
cataltica (C) e reguladora (R), respectivamente. A ligao de um modulador (M) positivo
(estimulador) ao seu stio especfico na subunidade reguladora comunicada subunidade
cataltica atravs de uma mudana conformacional. Esta mudana ativa a subunidade
cataltica que passa a ligar o substrato (S) com alta afinidade. Quando ocorre a dissociao
do modulador da subunidade reguladora a enzima reverte para sua forma inativa ou menos
ativa.
As enzimas alostricas geralmente so maiores e mais complexas que as enzimas no
alostricas. A maioria apresenta duas ou mais cadeias polipeptdicas ou subunidades. A
aspartato transcarbamilase, que catalisa a primeira reao da biossntese de nucleotdeos de
pirimidina (Captulo 22), apresenta 12 cadeias polipeptdicas organizadas em subunidades
catalticas e reguladoras. A Figura 8-24 mostra a estrutura quaternria desta enzima,
deduzida de anlise de raios X.
figura 8-24
Duas vistas da enzima reguladora aspartato transcarbamilase. Esta enzima reguladora
alostrica tem dois arranjos catalticos empilhados, cada um com trs cadeias
polipeptdicas catalticas (sombreados de azul e prpura) e trs arranjos reguladores
empilhados, cada um com duas cadeias polipeptdicas reguladoras (em vermelho e
amarelo). Os arranjos reguladores formam os pontos de um tringulo que rodeia as
subunidades catalticas. Os stios de ligao para os moduladores alostricos esto nas
subunidades reguladoras. A ligao do modulador provoca grandes modificaes na
conformao e na atividade da enzima. A funo desta enzima na sntese de nucleotdeos e
os detalhes da sua regulao so discutidos no Captulo 22. (Cortesia de Ray Steven,
Universidade da Califrnia, Berkeley).
A etapa reguladora em muitas vias catalisada por uma enzima alostrica
Em alguns sistemas multienzimticos a enzima reguladora inibida
especificamente pelo produto final da via sempre que a sua concentrao exceder as
necessidades celulares. Quando a reao catalisada pela enzima reguladora diminui, todas
as enzimas subseqentes operam em velocidades reduzidas uma vez que as concentraes
de seus substratos diminuem. A velocidade de produo do produto final da via , portanto
balanceada com as necessidades celulares. Este tipo de regulao chamado de inibio
por retroalimentao. O aumento da concentrao do produto final da via basicamente
desacelera toda a via.
Um dos primeiros exemplos de inibio alostrica por retroalimentao descobertos
foi o sistema enzimtico de bactria que catalisa a converso de L-treonina em Lisoleucina (Fig. 8-25). A primeira enzima desse sistema, a L-treonina desidratase, inibida
pela L-isoleucina, o produto da ltima reao da via. Este um exemplo de inibio
alostrica heterotrpica e a isoleucina um inibidor muito especfico. Nenhum outro
intermedirio nesta seqncia inibe a treonina desidratase e, nenhuma outra enzima da

35

seqncia inibida pela isoleucina. A isoleucina no se liga ao stio ativo, mas a um outro
stio especfico na molcula da enzima, o stio regulador. Esta ligao do tipo nocovalente e facilmente reversvel. Se a concentrao de isoleucina diminui, a atividade da
treonina desidratase aumenta. Desse modo, a atividade da treonina desidratase responde
rpida e reversivelmente s variaes da concentrao da isoleucina na clula.
figura 8-25
Inibio por retroalimentao. A converso da L-treonina em L-isoleucina catalisada
por uma seqncia de cinco enzimas (E1 a E5). A L-treonina desidratase (E1) inibida
especifica e alostericamente pela L-isoleucina, o produto final da seqncia, mas por
nenhum dos quatro intermedirios (A a D). A inibio por retroalimentao est indicada
pela linha pontilhada e pelo smbolo na seta da reao catalisada pela treonina
desidratase, um esquema que usado neste livro.
As propriedades cinticas das enzimas alostricas divergem do comportamento de
Michaelis-Menten
As enzimas alostricas apresentam relaes entre Vo e [S] que diferem da cintica
de Michaelis-Menten. Elas apresentam saturao pelo substrato quando [S]
suficientemente grande mas, para algumas enzimas alostricas, o grfico de Vo versus [S]
(Fig. 8-26) resulta em uma curva de saturao sigmoidal ao invs da curva hiperblica
tpica das enzimas no reguladoras. Embora possvel encontrar um valor de [S] na curva
de saturao sigmoidal para a qual Vo metade da velocidade mxima, no se pode referir
a ela como designando o Km pois a enzima no segue o comportamento hiperblico de
Michaelis-Menten. Como substituto, o smbolo [S]0.5 ou K0.5 frequentemente usado para
representar a concentrao de substrato que produz metade da velocidade mxima da
reao catalisada por uma enzima alostrica (Fig. 8-26).
O comportamento cintico sigmoidal geralmente reflete interaes cooperativas
entre mltiplas subunidades proteicas. Em outras palavras, mudanas na estrutura de uma
subunidade so traduzidas em mudanas estruturais nas subunidades adjacentes, um efeito
que mediado por interaes no covalentes na(s) interface(s) subunidade-subunidade. Os
princpios so muito bem ilustrados pela ligao do O2 hemoglobina (Captulo 7). O
comportamento cintico sigmoidal explicado pelos modelos ajustado e sequencial para
interaes de subunidades (Fig. 7-14).
As enzimas alostricas homotrpicas geralmente apresentam mltiplas
subunidades. Conforme salientado anteriormente, o mesmo stio de ligao em cada
subunidade pode funcionar tanto como stio ativo ou stio regulador. O substrato, pode ser
um modulador positivo (um ativador) porque as subunidades atuam cooperativamente: a
ligao de uma molcula do substrato a um stio de ligao altera a conformao da
enzima e favorece a ligao de outras molculas do substrato. Isto explica o aumento
sigmoidal, e no o hiperblico, de Vo com o aumento da [S]. Uma caracterstica da cintica
sigmoidal que pequenas mudanas na concentrao de um modulador pode ser associada
a grandes mudanas na atividade. Como fica evidente na Figura 8-26a, um aumento
relativamente pequeno na [S] na parte ascendente da curva provoca um aumento
comparativamente grande em Vo.
Para as enzimas alostricas heterotrpicas, cujo modulador um metablito
diferente do substrato, difcil fazer generalizaes acerca da forma da curva de saturao
pelo substrato. Um ativador pode tornar a curva mais prxima de uma hiprbole, com uma
diminuio no K0.5 mas sem mudanas em Vo, resultando assim em uma maior velocidade
de reao para uma concentrao fixa de substrato (Vo maior para qualquer valor de [S])
(Fig. 8-26b, curva superior). Outras enzimas alostricas heterotrpicas respondem a um
ativador atravs de um aumento de Vmx com uma pequena variao no K0.5 (Fig. 8-26c).
Um modulador negativo (um inibidor) pode produzir uma curva de saturao pelo
substrato mais sigmoidal, com um aumento no K0.5 (Fig. 8-26b, curva inferior). As
enzimas alostricas heterotrpicas podem apresentar diferentes tipos de respostas nas suas

36

curvas de variao da atividade em funo da [S] porque vrias apresentam moduladores

inibidores, vrias apresentam moduladores ativadores e vrias apresentam ambos os tipos.
figura 8-26
Curvas de variao da atividade em funo da concentrao do substrato para
enzimas alostricas representativas. Trs exemplos de respostas complexas dadas por
enzimas alostricas aos seus reguladores. (a) Curva sigmoidal de uma enzima
homotrpica, onde o substrato tambm atua como um modulador positivo (estimulador) ou
ativador. Note a semelhana com a curva de saturao da hemoglobina pelo oxignio (veja
Fig. 7-12). (b) Efeitos de um modulador positivo e um modulador negativo , sobre
uma enzima alostrica onde K0.5 alterado sem mudanas na Vmx. A curva central mostra a
relao atividade-concentrao do substrato sem um modulador. (c) Tipo menos comum
de modulao onde Vmx alterada e K0.5 permanece quase constante.
Algumas enzimas reguladoras sofrem modificaes covalentes reversveis
Em uma outra classe importante de enzimas reguladoras, a atividade regulada por
modificao covalente da molcula da enzima. Entre os grupos modificadores esto o
fosfato, adenosina monofosfato, uridila monofosfato, adenosina difosfato ribose e grupos
metila (Fig. 8-27). Estes grupos geralmente so ligados covalentemente e removidos da
enzima reguladora por outras enzimas.
figura 8-27
Exemplos de reaes de modificao de enzimas.
Modificao covalente
Resduo de aminocido que ser modificado
covalentemente
Fosforilao
Tir, Ser, Tre, His
Adenililao
Tir
Uridililao
Tir
ADP-ribosilao
Arg, Gln, Cis, diftamida (His modificada)
Metilao
Glu
Um exemplo de metilao a protena quimiottica aceptora de grupos metila de
bactrias. Esta protena parte de um sistema que permite uma bactria nadar em direo a
uma substncia atrativa (tal como um acar) em soluo e se distanciar de uma substncia
repelente. O agente metilante o S-adenosilmetionina (adoMet) descrito no Captulo 18.
Uma reao especialmente interessante a ADP-ribosilao observada em algumas poucas
protenas. A ADP-ribose derivada da nicotinamida adenina dinucleotdeo (veja Fig. 1041). Este tipo de modificao ocorre para a enzima bacteriana dinitrogenase redutase,
resultando na regulao do importante processo de fixao biolgica do nitrognio. Alm
disso, as toxinas da difteria e do clera so enzimas que catalisam a ADP-ribosilao (e
inativao) de enzimas celulares de grande importncia e proteinas. A toxina da difteria
age sobre e inibe, o fator de elongao 2, uma protena envolvida na biossntese de
proteinas. A toxina do clera age sobre uma proteina especfica (uma protena G especfica
que parte de uma via de sinalizao, veja Fig. 13-31), levando fundamentalmente a
vrias respostas fisiolgicas que inclui a perda macia de fluidos corporais e algumas vezes
a morte.
As fosforilaes representam a grande maioria das modificaes reguladoras
conhecidas. Cerca de um tero ou at mesmo a metade de todas as proteinas de uma clula
eucaritica so fosforiladas. Algumas proteinas apresentam apenas um resduo fosforilado,
outras apresentam vrios e algumas poucas apresentam dzias de stios para fosforilao.
Esse tipo de modificao covalente fundamental para um grande nmero de vias
reguladoras e por esse motivo ser tratado detalhadamente a seguir.
Os grupos fosfato afetam a estrutura e a atividade cataltica das proteinas

37

A ligao de grupos fosfato a resduos de aminocidos especficos de uma proteina

catalisada por proteinas quinases e a remoo desses grupos catalisada por proteinas
fosfatases. A adio de um grupo fosfato a um resduo de Ser, Tre ou Tir introduz um
grupo volumoso e carregado em uma regio que era apenas moderadamente polar. Os
oxignios do grupo fosfato so capazes de formar ligaes de hidrognio com um ou
vrios grupos em uma proteina, geralmente os grupos amida do esqueleto peptdico no
incio de uma alfa hlice ou ento com grupos guanidino carregados das cadeias laterais da
Arg. A dupla carga negativa na cadeia lateral fosforilada tambm pode repelir grupos
vizinhos de resduos carregados negativamente (Asp ou Glu). (Nenhuma cadeia lateral de
aminocido no modificada apresenta duas cargas negativas). Quando a cadeia lateral
modificada est localizada em uma regio da proteina que crtica para a sua estrutura
tridimensional, pode-se esperar efeitos dramticos da fosforilao na conformao da
proteina e por conseguinte na ligao do substrato e catlise.
Um exemplo importante de regulao pela fosforilao observado na glicognio
fosforilase (Mr 94.500) do msculo e fgado (Captulo 15) que catalisa a reao:
(Glicose)n + Pi (glicose)n-1 + glicose-1-fosfato
Glicognio
Glicognio com cadeia diminuda
A glicose-1-fosfato assim formada pode ser usada para a sntese de ATP no
msculo ou convertida em glicose livre no fgado. A glicognio fosforilase ocorre em duas
formas: a forma mais ativa ou fosforilase a e a forma menos ativa ou fosforilase b (Fig. 828). A fosforilase a tem duas subunidades, cada uma delas com um resduo de serina
especfico que fosforilado no seu grupo hidroxila. Esses resduos de serina-fosfato so
requeridos para a atividade mxima da enzima. Os grupos fosfato podem ser removidos da
fosforilase a atravs de uma hidrlise efetuada por uma outra enzima denominada
fosforilase fosfatase:
Fosforilase a + 2H2O fosforilase b + 2Pi
(mais ativa)
(menos ativa)
Nesta reao a fosforilase a convertida em fosforilase b pela quebra de duas
ligaes covalentes de serina-fosfato, uma em cada subunidade da glicognio fosforilase.
A fosforilase b, por sua vez, pode ser reativada novamente transformada
covalentemente em fosforilase a ativa por uma outra enzima, a fosforilase quinase que
catalisa a transferncia dos grupos fosfato do ATP para os grupos hidroxila de dois
resduos especficos de serina na fosforilase b:
2ATP + fosforilase b 2ADP + fosforilase a
(menos ativa)
(mais ativa)
figura 8-28
Regulao da atividade da glicognio fosforilase por modificao covalente. Na forma
mais ativa da enzima, fosforilase a, um resduo especfico de serina em cada subunidade
est fosforilado. A fosforilase a convertida na fosforilase b, menos ativa, atravs da
perda enzimtica destes grupos fosfato que catalisada pela fosforilase fosfatase. A
fosforilase b pode ser reconvertida (reativada) na fosforilase a pela ao da fosforilase
quinase.
figura 8-29
Regulao da glicognio fosforilase. Devido ao seu papel central no metabolismo
intermedirio, a glicognio fosforilase est sujeita a vrios nveis de regulao. Esta
representao transparente da molcula simtrica da glicognio fosforilase a mostra os
stios de regulao por modificao covalente (fosforilao da Ser14, amarelo) e ativao
alostrica pelo AMP (azul escuro) em cada uma das duas subunidades. A glicose
(vermelho) est ligada ao stio ativo. O piridoxal fosfato (PLP; azul claro), um derivado da
vitamina B6, um cofator ligado enzima. Na glicognio fosforilase, o PLP participa na
catlise cido-base geral, um papel no usual para este cofator, cujas funes mais tpicas

38

sero descritas em detalhe no Captulo 18. Note quo distante os stios reguladores esto
do centro ativo da enzima.
A quebra do glicognio nos msculos esquelticos e no fgado regulada por
variaes na relao entre as duas formas da glicognio fosforilase. As formas a e b da
fosforilase diferem nas suas estruturas secundria, terciria e quaternria. O centro ativo
sofre mudanas na sua estrutura e, consequentemente, mudanas na sua atividade cataltica
medida que as duas formas se interconvertem.
A regulao da glicognio fosforilase pela fosforilao ilustra os efeitos da
fosforilao sobre a estrutura e a atividade cataltica (Fig. 8.29). No estado no fosforilado,
cada subunidade desta proteina est enovelada de tal forma a juntar 20 resduos da
extremidade amino terminal, incluindo um certo nmero de resduos bsicos, em uma
regio contendo vrios aminocidos. Isto produz uma interao eletrosttica que estabiliza
a conformao. A fosforilao da Ser14 interfere com essa interao, forando o domnio
do grupo amino terminal para fora do meio cido e para uma conformao que permite a
interao entre (P)-Ser e vrias cadeias laterais da Arg. Nesta conformao, a enzima
muito mais ativa.
A fosforilao de uma enzima pode afetar a catlise de uma outra maneira:
alterando a afinidade de ligao com o substrato. Por exemplo, quando a isocitrato
desidrogenase (uma enzima do ciclo do cido ctrico; Captulo 16) fosforilada, a repulso
eletrosttica pelo grupo fosfato, impede a ligao do citrato (um cido tricarboxlico) no
centro ativo.
As interaes entre as subunidades de protenas estruturais oligomricas podem ser
alteradas pela fosforilao no stio de interao. Por exemplo, a fosforilao de proteinas
do citoesqueleto influencia o seu arranjo em estruturas supramoleculares. Tem sido
relatado que a proteina-2 associada a microtbulos, tem mais de trinta stios capazes de
serem fosforilados.
Fosforilaes mltiplas proporcionam um apurado controle regulador
Os resduos de Ser, Tre ou Tir que no esto fosforilados nas proteinas reguladoras
ocorrem no interior de motivos estruturais comuns, chamadas seqncias de consenso, que
so reconhecidas por proteinas quinases (Tabela 8-9). Algumas quinases so basfilas,
preferindo fosforilar um resduo que apresenta vizinhos bsicos; outras tm diferentes
preferncias por substratos, tal como um resduo prximo a uma prolina. A seqncia
primria no o nico fator para determinar se um dado resduo ser fosforilado. O
enovelamento da proteina aproxima resduos que esto afastados na seqncia primria e,
a estrutura tridimensional resultante pode determinar se a proteina quinase tem acesso a
um dado resduo, reconhecendo-o como um substrato. Um fator que influencia a
especificidade de substrato de certas proteinas quinases a proximidade de outros resduos
fosforilados.
A regulao pela fosforilao frequentemente muito complicada. Algumas
protenas apresentam seqncias de consenso reconhecidas por vrias proteinas quinases
diferentes, cada uma podendo fosforilar a proteina e alterar a sua atividade. Em alguns
casos, a fosforilao hierrquica: certos resduos podem ser fosforilados somente se o
resduo vizinho tiver sido fosforilado primeiro. Por exemplo, a glicognio sintase
inativada pela fosforilao de resduos especficos de serina e tambm modulada pelo
menos por quatro outras proteinas quinases que fosforilam quatro outros stios na proteina
(Fig. 8-30). A protena no uma substrato para a glicognio sintase quinase 3, por
exemplo, at que um dos stios tenha sido fosforilado pela casena quinase II. Algumas
fosforilaes inibem a glicognio sintase mais que outras e, algumas combinaes de
fosforilao so cumulativas. Essas fosforilaes reguladoras mltiplas proporcionam o
potencial para as modulaes extremamente sutis da atividade enzimtica.
Para atuar como um mecanismo regulador eficiente, a fosforilao deve ser
reversvel. Geralmente os grupos fosfato so adicionados e removidos por diferentes

39

enzimas e, os processos podem ser regulados separadamente. As clulas apresentam uma

famlia de fosfoprotenas fosfatases que hidrolisam steres de Ser-P, Tre-P e Tir-P,
liberando Pi. As fosfoprotenas fosfatases conhecidas atuam sobre um conjunto de
fosfoproteinas, porm elas apresentam uma especificidade de substrato menor que as
protenas quinases. Embora as fosfoprotenas fosfatases ainda no esto completamente
estudadas como as protenas quinases, elas tambm parecem ser importantes na regulao
dos processos celulares e do metabolismo.
tabela 8-9
Sequncia de consenso para protenas quinases
Protena quinase

Sequncia de
fosforilado*

consenso

resduo

Proteina quinase A
Proteina quinase G
Proteina quinase C
Proteina quinase B
Ca2+/calmodulina quinase I
Ca2+/calmodulina quinase II
Quinase da cadeia leve da miosina (msculo
esqueltico)
Fosforilase b quinase
Quinase regulada por sinal extracelular (ERK)
Protena quinase dependente de ciclina (cdc2)
Casena quinase I
Casena quinase II
Quinase do receptor -adrenrgico
Rodopsina quinase
Quinase do receptor da insulina
Quinase do receptor do fator de crescimento
epidrmico (EGF)
Fontes: Pinna LA & Ruzzene MH (1996) How do protein kinases recognize their
substrates ? Biochim. Biophys. Acta 1314, 191-225. Kemp BE & Pearson RB (1990)
Protein kinase recognition sequence motifs. Trends Biochem. Sci. 15, 342-346. Kennelly
PJ & Krebs EG (1991) Consensus sequences as substrate specificity determinants for
protein kinases and protein phosphatases. J. Biol. Chem. 266, 15555-15558.
* So mostradas aqui as seqncias de consenso (em tipo romano) e as seqncias reais de
substratos conhecidos (em itlico). Os resduos de Ser (S), Tre (T) ou Tir (Y) que sofrem
fosforilao esto em vermelho; todos os aminocidos esto mostrados na forma de suas
abreviaes de uma letra (veja Tabela 5-1). X representa qualquer aminocido; B, qualquer
aminocido hidrofbico; Sp, Tp e Yp, os resduos de Ser, Tre e Tir j fosforilados.
figura 8-30
Fosforilaes reguladoras mltiplas. A enzima glicognio sintase apresenta pelo menos
nove stios diferentes em cinco regies designadas para fosforilao por uma das protenas
quinases celulares. Por conseguinte, a atividade dessa enzima est sujeita modulao em
resposta a uma variedade de sinais. Assim, a regulao no simplesmente um disjuntor
binrio (liga/desliga) mas uma modulao finamente ajustada da atividade em um grande
intervalo.
Stios de fosforilao da
glicognio sintase
Quinase
Stios de fosforilao Grau de inativao da
da glicognio sintase sintase
Protena quinase A
Protena quinase G

40

Protena quinase C
Ca2+/calmodulina quinase
Fosforilase b quinase
Casena quinase I
Casena quinase II
Glicognio sintase quinase 3
Glicognio sintase quinase 4
Alguns tipos de regulao requerem a protelise de um precursor enzimtico
Para algumas enzimas, um precursor inativo, chamado zimognio, hidrolisado
para formar a enzima ativa. Muitas enzimas proteolticas (proteases) do estmago e do
pncreas so reguladas desta forma. A quimotripsina e a tripsina so inicialmente
sintetizadas como quimotripsinognio e tripsinognio, respectivamente (Fig. 8-31). A
quebra especfica provoca mudanas conformacionais que expem o stio ativo da enzima.
Uma vez que este tipo de ativao irreversvel, outros mecanismos so necessrios para
inativar estas enzimas. As proteases so inativadas por protenas inibidoras que se ligam
muito fortemente ao stio ativo da enzima. Por exemplo, o inibidor da tripsina pancretica
(Mr 6.000) liga-se tripsina e a inibe; a 1-antiproteinase (Mr 53.000) inibe primariamente
a elastase de neutrfilos. Uma insuficincia de 1-antiproteinase, que pode ser causada pela
exposio fumaa de cigarros, tem sido associada com leso do pulmo, incluindo
enfisema.
As proteases no so as nicas proteinas ativadas por protelise. Porm em outros
casos, os precursores so chamados mais frequentemente de proprotenas ou proenzimas
ao invs de zimognio. Por exemplo, o colgeno, uma protena do tecido conectivo
sintetizada inicialmente como o precursor solvel procolgeno. O sistema de coagulao
sangnea apresenta muitos exemplos de ativao proteoltica de protenas. A fibrina, uma
protena do cogulo sangneo, produzida pela protelise de sua protena inativa, o
fibrinognio. A protease responsvel por esta ativao a trombina (similar em muitos
aspectos quimotripsina), que por sua vez produzida pela protelise da proprotena
(neste caso um zimognio), protrombina. A coagulao sangnea mediada por uma
complicada cascata de ativao de zimognios.
Algumas enzimas reguladoras usam mecanismos de regulao mltiplos
A glicognio fosforilase catalisa a primeira reao de uma via que alimenta com
glicose armazenada o metabolismo de carboidratos que produz energia. (Captulo 15).
Este um importante passo metablico e, a sua regulao correspondentemente
complexa. Embora a sua regulao primria ocorre atravs de modificao covalente,
como delineada na Fig. 8-28, a glicognio fosforilase tambm modulada de uma maneira
alostrica e no covalente pelo AMP, que um ativador da fosforilase b, e por vrias
outras molculas que so inibidores.
Outras enzimas reguladoras complexas so encontradas em cruzamentos
metablicos chaves. A glutamina sintetase de bactrias, que catalisa uma das etapas que
introduz nitrognio reduzido no metabolismo celular (Captulo 22), uma das mais
complexas enzimas reguladoras conhecidas. Ela regulada por alosteria (com pelo menos
oito moduladores alostricos diferentes) e por modificao covalente reversvel. Ela
tambm regulada pela associao de outras protenas reguladoras, um mecanismo j
comentado muito brevemente neste captulo mas que ser examinado detalhadamente
quando considerarmos a regulao de vias metablicas especficas.
Qual a vantagem de tal complexidade na regulao da atividade enzimtica ? Ns
comeamos este captulo enfatizando a importncia central da catlise para a existncia da
vida. O controle da catlise tambm crtico para vida. Se todas as possveis reaes em
uma clula forem catalisadas simultaneamente, as macromolculas e os metablitos seriam
rapidamente quebrados em formas qumicas mais simples. Ao invs disso, somente as
reaes necessrias para a clula em um dado momento so catalisadas. Quando as

41

reservas qumicas esto repletas, a glicose e outros metablitos so sintetizados e

armazenados. Quando as reservas so escassas, esses depsitos so usados para alimentar o
metabolismo celular. A energia qumica usada economicamente, dividida para vrias vias
metablicas medida que as necessidades celulares ordenarem. A disponibilidade de
catalisadores poderosos, cada um especfico para uma dada reao, torna possvel a
regulao dessas reaes. Isto, por sua vez, d origem uma complexa e altamente
ordenada sinfonia que ns chamamos vida.
figura 8-31
Ativao de zimognios por clivagem proteoltica. mostrada a formao da
quimotripsina e tripsina a partir de seus zimognios. As barras representam as seqncias
primrias das cadeias polipeptdicas. Os aminocidos nas extremidades dos fragmentos
polipeptdicos gerados pela clivagem esto indicados abaixo das barras. Os nmeros dos
resduos de aminocidos representam as suas posies na seqncia primria dos
zimognios quimotripsinognio ou tripsinognio (o aminocido terminal o nmero um).
Lembrar que as trs cadeias polipeptdicas (A, B e C) da quimotripsina esto ligadas por
pontes dissulfeto. (veja Fig. 8-18).
resumo
A vida depende de catalisadores poderosos e especficos: as enzimas. Virtualmente,
todas as reaes bioqumicas so catalisadas por uma enzima. Com exceo de uns poucos
RNAs catalticos, todas as enzimas conhecidas so protenas. As enzimas so catalisadores
extraordinariamente efetivos que comumente aumentam a velocidade das reaes de um
fator de 105 a 1017. Para serem ativas, algumas enzimas requerem um cofator qumico, que
pode estar fraca ou firmemente ligado enzima. Cada enzima classificada de acordo com
a reao especfica que ela catalisa. As reaes catalisadas pelas enzimas so
caracterizadas pela formao de um complexo entre o substrato e a enzima (o complexo
ES). A ligao ocorre em uma fenda na molcula da enzima chamada stio ativo. A funo
das enzimas e outros catalisadores diminuir a energia de ativao da reao e, desta
forma, aumentar a velocidade da reao. O equilbrio de uma reao no afetado pela
enzima.
A energia empregada aumentar a velocidade da reao enzimtica derivada das
interaes fracas (pontes de hidrognio e interaes hidrofbicas e inicas) entre o
substrato e a enzima. O stio ativo enzimtico est estruturado de tal maneira que algumas
dessas interaes fracas ocorrem preferencialmente no estado de transio da reao,
estabilizando assim o estado de transio. A energia disponibilizada pela formao das
numerosas ligaes fracas entre a enzima e o substrato (a energia de ligao) substancial
e em geral pode explicar as aceleraes na velocidade das reaes. A necessidade de
interaes mltiplas uma das razes para o grande tamanho das enzimas. A energia de
ligao pode ser usada para diminuir a entropia do substrato, para tension-lo ou provocar
uma mudana conformacional na enzima (ajuste induzido). Esta mesma energia de ligao
responde pela refinada especificidade das enzimas em relao a seus substratos. Outros
mecanismos catalticos incluem a catlise cido-base geral e a catlise covalente.
Mecanismos de reao detalhados tm sido desenvolvidos para muitas enzimas.
A cintica uma metodologia importante para o estudo dos mecanismos
enzimticos. A maioria das enzimas tem algumas propriedades cinticas em comum.
medida que a concentrao do substrato aumenta, a atividade cataltica de uma
concentrao fixa de uma enzima aumenta de uma forma hiperblica aproximando-se de
uma velocidade mxima, Vmx caracterstica, na qual praticamente toda enzima est na
forma do complexo ES. A concentrao de substrato que produz metade da velocidade
mxima a constante de Michaelis Km, que caracterstica para cada enzima agindo sobre
um determinado substrato. A equao de Michaelis-Menten
Vo= Vmx [S]/(Km + [S])

42

relaciona a velocidade inicial de uma reao enzimtica com a concentrao de substrato e

a Vmx atravs da constante Km. Tanto o Km como a Vmx podem ser medidas. Elas tm
significados diferentes para enzimas diferentes. Em condies de saturao, a velocidade
limite de uma reao catalisada enzimaticamente descrita pela constante kcat, tambm
chamada nmero de renovao. A relao kcat/Km fornece uma boa medida da eficincia
cataltica. A equao de Michaelis-Menten tambm aplicvel s reaes com dois
substratos, que ocorrem ou pela formao de um complexo ternrio ou de uma dupla-troca
(Pingue-Pongue). Cada enzima tem um pH timo (ou intervalo de pH) onde apresenta
atividade mxima.
As enzimas podem ser inativadas por modificaes irreversveis de um grupo
funcional essencial para atividade cataltica. Elas tambm podem ser inibidas por
molculas que se ligam reversivelmente. Os inibidores competitivos competem
reversivelmente com o substrato pelo centro ativo, mas no so transformados pela
enzima. Os inibidores incompetitivos se ligam somente ao complexo ES, em um stio
distinto do stio ativo. Na inibio mista, o inibidor se liga tanto a E como ES. Neste
ltimo caso, em um stio distinto daquele onde o substrato se liga.
Algumas enzimas regulam a velocidade das vias metablicas na clulas. Na
inibio por retroalimentao, o produto final de uma via inibe a primeira enzima desta
via. A atividade de algumas enzimas reguladoras, chamadas enzimas alostricas, ajustada
pela ligao reversvel de um modulador especfico a um stio regulador. Tais
moduladores podem ser inibidores ou estimuladores e podem ser o prprio substrato ou
ento algum outro metablito. O comportamento cintico das enzimas alostricas reflete
interaes cooperativas entre as subunidades da enzima. Outras enzimas reguladoras so
moduladas por modificao covalente de um grupo funcional especfico necessrio para a
atividade. A fosforilao de resduos de aminocidos especficos um meio muito comum
de regular a atividade da enzima. Muitas enzimas proteolticas apresentam precursores
inativos chamados zimognio. Pequenos peptdeos so quebrados do zimognio para
formar a protease ativa.
leitura adicional
Geral
Evolution of Catalytic Function (1987) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52.
Uma coleo de excelentes artigos sobre muitos fundamentos; continua sendo muito
til.
Fersht A (1999) Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme
Catalysis and Protein Folding, W.H. Freeman and Company, New York.
Uma introduo concisa, clara e de carter mais avanado.
Friedmann H (ed) (1981) Benchmark Papers in Biochemistry, Vol. 1: Enzymes,
Hutchinson Ross Publishing Company, Stroudsburg, PA.
Uma coleo de artigos clssicos em qumica de enzima, com comentrios histricos
pelo editor. Extremamente interessante.
Jencks WP (1987) Catalysis in Chemistry and Enzymology, Dover Publications, Inc. New
York.
Um livro proeminente no assunto e de carter mais avanado.
Kornberg A (1989) For the love of enzymes: The Odyssey of a Biochemist, Harvard
University Press, Cambridge, MA.
Princpios da catlise
Hansen DE & Raines RT (1990) Binding energy and enzymatic catalysis. J. Chem. Educ.
67, 483-489.

43

Um bom lugar para o estudante principiante adquirir uma melhor compreenso dos
princpios da catlise.
Kraut J (1988) How do enzymes work ? Science 242, 533-540.
Landry DW, Zhao K, Yang GXQ, Glickman M, & Georgiadis TM (1993) Antibody
degradation of cocaine. Science 259, 1899-1901.
Uma aplicao interessante de anticorpos catalticos.
Lerner RA, Benkovic SJ & Schulz PG (1991) At the crossroads of chemistry and
immunology: catalytic antibodies. Science 252, 659-667.
Schramm VL (1998) Enzymatic transition states and transition state analog design. Annu.
Rev. Biochem. 67, 693-720.
Boas ilustraes dos princpios introduzidos neste captulo.
Cintica
Cleland WW (1977) Determining the chemical mechanisms of enzyme-catalyzed
reactions by kinetic studies. Adv. Enzymol. 45, 273-387.
Radzicka A & Wolfenden R (1995) A proficient enzyme. Science 267, 90-93.
Exame definitivo do aumento da velocidade por uma enzima que acelera a sua reao
por um fator de 1017.
Raines RT & Hansen DE (1988) An intuitive approach to steady-state kinetics. J. Chem.
Educ. 65, 757-759.
Segel IH (1975) Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and
Steady State Enzyme Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York.
Um tratamento mais avanado do assunto.
Exemplos de enzimas
Babbit PC & Gerlt JA (1997) Understanding enzymes superfamilies: chemistry as the
fundamental determinant in the evolution of new catalytic activities. J. Biol. Chem. 27,
30591-30594.
Uma descrio interessante da evoluo das enzimas com diferentes especificidades
catalticas, que utilizam um repertrio limitado de motivos estruturais proteicos.
Babbit PC, Hasson MS, Wedekind JE, Palmer DRJ, Barrett WC, Reed GH,
Rayment I, Ringe D, Kenyon GL & Gerlt J (1997) The enolase superfamily: a general
strategy for enzyme-catalyzed abstraction of -protons of carboxylic acids. Biochemistry
28, 16489-16501.
Warshel A, Nary-Szabo G, Sussman F & Hwang JK (1989) How do serine proteases
really work ? Biochemistry 28, 3629-3637.
Enzimas reguladoras
Barford D, Das AK & Egloff MP (1998) The structure and mechanism of protein
phosphatases: insights into catalysis and regulation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
27:, 133-164.
Dische Z (1976) The discovery of feedback inhibition. Trends Biochem. Sci. 1, 269-270.
Hunter T & Plowman GD (1997) The protein kinases of budding yeast: six score and
more. Trends Biochem. Sci. 22, 18-22.

44

Johnson LN & Barford D (1993) The effects of phosphorylation on the structure and
function of proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22:, 199-232.
Koshland DE Jr, & Neet KE (1968) The catalytic and regulatory properties of enzymes.
Annu. Rev. Biochem. 37, 359-410.
Monod J, Changeux JP & Jacob F (1963) Allosteric proteins and cellular control
systems. J. Mol. Biol. 6, 306-329.
Um artigo clssico introduzindo o conceito de regulao alostrica.
problemas
1. Conservando o sabor doce do milho. O sabor adocicado do gro de milho recmcolhido devido ao alto nvel de acar nos gros. O milho comprado no mercado, vrios
dias aps a colheita, no to doce porque cerca de 50% do acar livre do milho
convertido em amido um dia aps a colheita. Para preservar o sabor adocicado do milho
fresco as espigas descascadas so mergulhadas em gua fervente por alguns minutos
(branqueamento) e ento resfriadas em gua fria. O milho tratado dessa maneira e depois
guardado em congelador mantm seu sabor adocicado. Qual a base bioqumica deste
procedimento ?
2. Concentrao intracelular de enzimas. Para obter um valor aproximado da
concentrao de enzimas em uma clula bacteriana considere que ela contm 1.000
enzimas diferentes, em igual concentrao no citosol e que cada protena tem um peso
molecular de 100.000. Considere que uma clula bacteriana um cilindro (1 m de
dimetro e 2 m de altura), que o citosol (densidade especfica 1,20) contm 20% em peso
de protenas solveis e que todas as protenas solveis so enzimas. Calcule a concentrao
molar mdia de cada enzima nesta clula hipottica.
3. Aumento da velocidade pela urease. A enzima urease aumenta a velocidade de
hidrlise da uria em pH 8,0 e a 20C de um fator de 10 14. Se uma dada quantidade de
urease pode hidrolisar completamente uma dada quantidade de uria em 5 min a 20C e pH
8,0, quanto tempo ser necessrio para que a mesma quantidade de uria seja hidrolisada
na ausncia de urease ? Suponha que ambas as reaes ocorram em meios estreis de tal
forma que forma que a uria no possa ser atacada pela bactria.
4. Proteo de uma enzima contra a desnaturao pelo calor. Quando uma soluo de
enzima aquecida, ocorre uma progressiva perda de atividade cataltica com o tempo
devido desnaturao da enzima. Uma soluo da enzima hexoquinase incubada a 45C
perde 50% de sua atividade em 12 min. Entretanto, quando incubada a 45C na presena
de uma grande concentrao de um de seus substratos, ela perde apenas 3% de sua
atividade em 12 min. Sugira porque a desnaturao trmica da hexoquinase foi retardada
na presena de um dos seus substratos.
5. Requisitos dos stios ativos de enzimas. A carboxipeptidase, que remove
seqencialmente os resduos de aminocidos, a partir da carboxila terminal, de seus
substratos peptdicos um polipeptdio simples com 307 aminocidos. Os dois grupos
catalticos essenciais no stio ativo so Arg145 e Glu270.
(a) se a cadeia da carboxipeptidase fosse uma -hlice perfeita, quo distantes (em
Angstrons) estariam Arg145 e Glu270 ? (Sugesto: veja Fig. 6-4b).
(b) Explicar como dois aminocidos separados por essa distncia podem catalisar reao
que ocorre em um espao de poucos Angstrons ?
6. Ensaio quantitativo da desidrogenase lctica. A enzima desidrogenase lctica de
msculo catalisa a reao:

45

Piruvato lactato
+
NADH e NAD so as formas reduzida e oxidada, respectivamente, da coenzima NAD.
Solues de NADH, mas no de NAD+ absorvem luz em 340 nm. Esta propriedade usada
para determinar a concentrao de NADH em soluo, atravs da medida
espectrofotomtrica da quantidade de luz absorvida em 340 nm pela soluo. Explique
como estas propriedades do NADH podem ser usadas para a padronizao de um ensaio
quantitativo da desidrogenase lctica.
7. Relao entre a velocidade da reao e a concentrao do substrato: equao de
Michaelis-Menten. (a) Qual ser a concentrao do substrato na qual uma enzima com kcat
de 30 s-1 e Km de 0.005M apresentar uma velocidade que um quarto da velocidade
mxima ? (b) determine qual ser a frao de Vm para as seguintes concentraes de
substrato: [S]= Km, 2 Km e 10 Km.
8. Estimao de Vmx e Km por inspeo. Embora existam mtodos grficos para a
determinao precisa dos valores de Vmx e Km de uma reao catalisada enzimaticamente
(veja Adendo 8-1), algumas vezes esses valores podem ser estimados rapidamente por
inspeo dos valores de Vo para concentraes crescentes de S. Estime os valores de Vmx e
Km de uma reao enzimtica onde foram obtidos os seguintes resultados:
[S] (M)
2,5 10-6
4,0 10-6
1 10-5
2 10-5
4 10-5
1 10-4
2 10-3
1 10-2

Vo (M/min)
28
40
70
95
112
128
139
140

9. Propriedades de uma enzima da sntese da prostaglandina. As prostaglandinas so

uma classe de eicosanoides, derivados de cidos graxos com uma variedade de aes
extremamente potente, cuja estrutura e ao ser discutida posteriormente nos Captulos 11
e 21. As prostaglandinas so responsveis pela produo da febre e inflamao e a dor
associada a elas. Elas so derivadas do cido araquidnico, um cido graxo de 20
carbonos, atravs de uma reao catalisada pela prostaglandina endoperxido sintase. Esta
enzima, uma ciclooxigenase, usa o oxignio para converter o cido araquidnico em
PGG2, o precursor imediato de muitas prostaglandinas diferentes (Captulo 21).
(a) Os dados cinticos que seguem so da reao catalisada pela prostaglandina
endoperxido sintase. Considerando-se apenas os valores das duas primeiras colunas,
determinar a Vmx e o Km da enzima.
[cido
Velocidade de formao do PGG2
Velocidade de formao
araquidnico]
(mM/min)
do PGG2 com 10 mg/mL
(mM)
de ibuprofen (mM/min)
0,5
23,5
16,67
1,0
32,2
25,25
1,5
36,9
30,49
2,5
41,8
37,04
3,5
44,0
38,91
(b) O ibuprofen um inibidor da prostaglandina endoperxido sintase. Inibindo a sntese
das prostaglandinas, o ibuprofen reduz a inflamao e a dor. Usando os dados da primeira
e terceira colunas da tabela, determine o tipo de inibio que o ibuprofen exerce sobre a
prostaglandina endoperxido sintase.

46

10. Anlise grfica de Vmx e Km. Os dados experimentais que seguem foram coletados
durante um estudo da atividade cataltica de uma peptidase intestinal com o substrato
glicilglicina:
Glicilglicina + H2O 2 glicina
[S] (mM)
Produto formado (mol/min)
1,5
0,21
2,0
0,24
3,0
0,28
4,0
0,33
8,0
0,40
16,0
0,45
Use a anlise grfica (ver Adendo 8-1) para determinar o Km e Vmx
para esta preparao de enzima e substrato.
11. A equao de Eadie-Hofstee. Uma transformao da equao de Michaelis-Menten
a equao de Lineweaver-Burk ou dos duplos recprocos. Multiplicando-se ambos os
termos da equao de Lineweaver-Burk por Vmx e rearranjando-se tem-se a equao de
Eadie-Hofstee:
Vo= (-Km)Vo/[S] + Vmx
O grfico de Vo versus Vo/[S] para uma reao enzimtica mostrado a seguir.
A curva azul foi obtida na ausncia de inibidor. Qual a curva (A, B ou C) que mostra a
atividade da enzima quando um inibidor competitivo adicionado mistura de reao ?
12. O nmero de renovao da anidrase carbnica. A anidrase carbnica de eritrcitos
(Mr 30.000) tem o maior nmero de renovao entre todas as enzimas conhecidas. Ela
catalisa a hidratao reversvel do CO2:
H2O + CO2 H2CO3
Este um importante processo no transporte de CO2 dos tecidos at os pulmes. Se 10 g
de anidrase carbnica pura catalisam a hidratao de 0,30 g de CO2 em 1 min a 37C sob
condies de Vmx, qual o nmero de renovao (kcat) da anidrase carbnica (em unidades
de min-1).
13. Derivando a equao da velocidade para uma inibio competitiva. A equao da
velocidade para uma enzima sujeita a uma inibio competitiva
Vo = Vmx [S]/(Km + [S])
Comeando com uma nova definio de enzima total:
[E]t = [E] + [EI] + [ES]
e as definies de e Ki (ver eq. 8-28), derivar a equao da velocidade acima. Use a
derivao da equao de Michaelis-Menten como exemplo.
14. Inibio irreversvel de uma enzima. Muitas enzimas so inibidas irreversivelmente
por ons de metais pesados como Hg2+, Cu2+ ou Ag+, que podem reagir com grupos
sulfidrilas essenciais para formar mercaptdios:
Enz-SH + Ag+ Enz-S-Ag + H+
+
A afinidade dos ons Ag pelos grupos sulfidrila to grande que estes ons podem ser
usados para titular quantitativamente os grupos -SH. A 10 mL de uma soluo contendo
1,0 mg/mL de uma enzima pura, um pesquisador adicionou AgNO3 em uma quantidade
suficiente para inativar completamente a enzima. Um total de 0,342 mol de AgNO3
foram necessrios. Calcule o peso molecular mnimo da enzima. Por que o valor obtido
desta maneira fornece apenas o peso molecular mnimo ?
15. Aplicao clnica de inibio diferencial de enzimas. O soro humano contm uma
classe de enzimas conhecidas como fosfatases cidas, que hidrolisam steres de fosfato em
condies levemente cidas (pH 5,0):

47

OOR - O - P - O + H2O R - OH + HO - P - OOOAs fosfatases cidas so produzidas pelos eritrcitos, fgado, rim, bao e prstata. A
enzima da prstata clinicamente importante porque o aumento da sua concentrao no
sangue freqentemente uma indicao de cncer da prstata. A fosfatase da prstata
fortemente inibida pelo on tartarato, mas as fosfatases de outros tecidos no so. Como
esta informao pode ser usada para desenvolver um procedimento especfico para dosar a
atividade da fosfatase cida da prstata no soro sangneo humano ?
16. Inibio da anidrase carbnica pela acetazolamida. A anidrase carbnica
fortemente inibida pela droga acetazolamida, que tambm usada como diurtico (para
aumentar a secreo de urina) e para tratar o glaucoma (para reduzir a
pressexcessivamente alta no olho, devido a um acmulo de fluido intra-ocular). A
anidrase carbnica desempenha um importante papel, nestes e em outros processos de
secreo porque ela participa na regulao do pH e do teor de bicarbonato em um grande
nmero de fluidos do corpo. A curva experimental da velocidade inicial da reao (como
porcentagem de Vmx) versus [S] para a reao catalisada pela anidrase carbnica
ilustrada a seguir. Quando o experimento repetido na presena de acetazolamida, obtmse a curva inferior. Atravs da inspeo das duas curvas e do seu conhecimento das
propriedades cinticas dos inibidores competitivos e mistos competitivos, determine a
natureza da inibio provocada pela acetazolamida. Explique.
17. O pH timo da lisozima. O stio ativo da lisozima contm dois resduos de
aminocidos essenciais para a catlise: Glu35 e Asp52. Os valores de pKa das cadeias
carboxlicas laterais desses dois resduos so 5,9 e 4,5, respectivamente. Qual o estado de
ionizao (protonado ou no protonado) de cada um desses resduos em pH 5,2, o pH
timo da lisozima ? Como os estados de ionizao destes dois resduos de aminocidos
podem explicar o perfil pH-atividade da lisozima mostrado a seguir ?