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Enzimas Cap 06 - Sa Pereira P

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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E
SUA ESTABILIZAÇÃO
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E
SUA ESTABILIZAÇÃO

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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO
Heizir Ferreira de Castro, Gisella Maria Zanin, Flávio Faria de Moraes, Paula Sá-Pereira

SUMÁRIO
As vantagens das enzimas imobilizadas, em relação às solúveis, surgem de sua maior estabilidade e facilidade de separação do meio de reação, o que acarreta economia significativa no custo global do processo, desde que o procedimento de imobilização não seja muito dispendioso, haja boa recuperação da atividade enzimática e que a meia-vida operacional da enzima imobilizada seja suficientemente longa. Os métodos de imobilização variam da simples ligação por adsorção física em suportes diversos até a encapsulação em matrizes de sol-gel e granulação. Durante o uso das enzimas imobilizadas, efeitos de transferência de massa podem ocasionar gradientes adversos de substratos ou de pH, que podem reduzir a velocidade de reação e o rendimento em produto. Impurezas presentes no meio podem ocluir a enzima imobilizada e também reduzir a velocidade de reação e o rendimento em produto. A perda de atividade biocatalítica durante o processo de imobilização deve ser reduzida para compensar o custo extra da imobilização, o suporte poroso deve ser apropriado para facilitar a transferência de reagentes e produtos, e a purificação exaustiva da solução de substrato deve ocorrer para obter-se uma longa vida operacional. Este capítulo conceitua inicialmente os diversos termos relacionados com a técnica de imobilização, fornece uma classificação dos métodos e destaca ainda as vantagens e limitações do uso de enzimas. Na seqüência, apresenta os métodos de imobilização de enzimas, correlacionando-os com os tipos de suportes mais comumente utilizados. Aborda a interação enzima-suporte com base nos fatores que interferem no comportamento da enzima imobilizada;. discute a aplicação de enzimas imobilizadas em meio orgânico, bem como, a influência de aditivos como agentes estabilizantes da atividade catalítica da enzima imobilizada, e, finalmente, enfoca o tema das aplicações das enzimas imobilizadas. 123

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ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS – UMA PERSPECTIVA HISTÓRICA
A imobilização de enzimas começou a ser estudada no início do século passado, ao se observar que o carvão ativo, ao qual havia sido adicionada uma preparação biológica com atividade invertásica, mantinha a capacidade de hidrolisar sacarose mesmo após ser lavado (NELSON e GRIFFIN, 1916). Após esta observação inicial da imobilização de enzimas em suportes insolúveis, o assunto só foi novamente retomado após a Segunda Guerra Mundial. Em 1948, o bioquímico americano James Batcheller Sumner (1887-1955), ganhador do Prêmio Nobel de Química, em 1946, pelo isolamento e cristalização da enzima urease e pela identificação da sua natureza protéica, reportou sua imobilização. Na continuação dos estudos, pesquisadores alemães, em 1954, demonstraram que polímeros sintéticos, resinas diazotadas de poliaminoestireno, poderiam ser usados para imobilizar proteínas com atividade biológica. Eles usaram as enzimas pepsina, diastase, ribonuclease e carboxipeptidase (CHIBATA, 1978). Outros trabalhos subseqüentes incluíram a imobilização da catalase por ligação iônica em DEAE-celulose, da tripsina, da papaína, da amilase e da ribonuclease em gel de poliacrilamida, e a demonstração do método de ligações cruzadas, utilizando-se carboxipeptidase com glutaraldeído. A microencapsulação da carbono-anidrase foi descrita em 1964 e a preparação de lipossomas contendo glicoamilase em 1971, sendo que estas duas últimas preparações foram usadas com fins terapêuticos. A partir de 1960, houve um aumento significativo no número de publicações sobre imobilização de enzimas, tendo em vista as potenciais vantagens econômicas e operacionais que a técnica oferece para a tecnologia enzimática. Estes esforços resultaram no desenvolvimento, em 1969, por Chibata e colaboradores da companhia japonesa Tanabe Seiyaku Co., de um processo para a produção de L-aminoácidos, a partir de misturas racêmicas, usando L-aminoacilase imobilizada em DEAE-Sephadex. Quase simultaneamente foi colocado em operação, nos EUA, o processo de produção de xaropes de frutose a partir de amido de milho, utilizando glicose-isomerase imobilizada (CHIBATA, 1978). Até os meados da década de 1960, a maior parte dos trabalhos com enzimas imobilizadas era realizada por pesquisadores de áreas básicas, que perceberam que estes sistemas poderiam ser utilizados como catalisadores industriais altamente específicos e eficientes. Neste período, passou-se também a buscar suportes com boa resistência química e mecânica, de modo a prolongar o uso do biocatalisador. Foram estudados métodos diferentes de imobilização (combinação de métodos), e observou-se que as propriedades catalíticas de uma mesma enzima poderiam ser alteradas em função do método de imobilização utilizado e do suporte empregado. E finalmente, tiveram início os estudos da aplicação de enzimas imobilizadas em biorreatores contínuos (leito fixo e reatores agitados). Isto marca o inicio da contribuição dos engenheiros químicos para o projeto de biorreatores (VIETH, 1994). A importância de processos industriais com enzimas imobilizadas motivou a organização, em 1971, da primeira Conferência em Engenharia Enzimática, realizada em Henniker. Nela estabeleceu-se o uso do termo enzima imobilizada, empregado por Katchalski–Katzir, para os biocatalisadores ligados a suportes insolúveis ou confinados a es-

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paços físicos definidos, em contraposição ao uso de enzimas “fixadas” ou “insolubilizadas” ou “ligadas em matrizes”. Em 1985, houve um outro avanço significativo com o desenvolvimento em escala industrial de um processo em reator de membrana para a produção de aminoácidos a partir de cetoácidos, com duas enzimas imobilizadas e envolvendo a regeneração do co-fator. O processo, que foi desenvolvido por pesquisadores da Wandrey e Kula, na Alemanha, foi empregado em escala industrial naquele país pela companhia Degussa (HARTMEIER, 1988). O advento das enzimas imobilizadas abriu novos e promissores campos de atuação. Como exemplos, os eletrodos enzimáticos que proporcionam um número muito maior de análises em curtos espaços de tempo, característica esta muito valiosa para a moderna industria biotecnológica, e a reutilização da enzima por tempos prolongados de processo, implicando numa grande redução de custos.

ENZIMAS IMOBILIZADAS
As enzimas têm, intrinsecamente, excelentes propriedades como a atividade, a seletividade e a especificidade. Estas características permitem o desenho de processos de síntese de produtos muito complexos em condições ecossustentadas. Mas apesar do elevado potencial de aplicação das enzimas, devido à pressão dos consumidores, elas têm de ser otimizadas, de modo a cumprirem suas funções biológicas com eficácia e eficiência. A catálise de reações em processos metabólicos complexos pode ser regulada em vários níveis. E assim, algumas delas passam a ter as características adequadas para serem integradas em processos industriais. Enzimas na sua forma nativa (enzimas livres) têm sido usadas por séculos na indústria de alimentos e mais recentemente nas indústrias farmacêuticas e químicas. Sua estrutura e modo de ação vêm sendo gradativamente elucidados por métodos experimentais bem estabelecidos, como as técnicas clássicas de raios X e avançadas de ressonância magnética nuclear (RMN). Modernas metodologias de engenharia genética possibilitaram a produção de enzimas em grande escala ou a modificação de sua estrutura primária, alterando, portanto algumas de suas características físico-químicas e biológicas (MA et alii, 2003). De igual significância são as recentes técnicas de evolução direcionada, que permitem, via modificação do DNA, a preparação de enzimas especialmente dirigidas para uma determinada finalidade, isto é, enzimas que atuam em valores extremos de pH e temperatura, bem como em presença de meios não convencionais (solventes orgânicos, fase gasosa, CO2 supercrítico) (POWELL et alii, 2001). O valor de venda de enzimas para o uso em indústrias de alimentos, detergentes e especialidades químicas, que perfazia um total de aproximadamente US$ 700 milhões em 1992 (KATCHALSKI-KATZIR e KRAEMER, 2000), aumentou para US$ 2 bilhões em 2004 (RAJAN, 2004). De acordo com as projeções, o crescimento no mercado de enzimas é de aproximadamente 4-5% ao ano, acompanhado pela redução de preço, decorrente do grande número de empresas que comercializam enzimas com preços mais competitivos (RAJAN, 2004).

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De particular interesse é o aumento do uso de enzimas imobilizadas, fisicamente confinadas ou localizadas numa certa região do espaço com retenção de sua atividade catalítica, podendo ser usada repetidamente e continuamente (WINGARD JR., 1972). Nesta técnica, a enzima fica retida no interior (poros) ou na superfície de um material que é utilizado como suporte. O complexo enzima–suporte mantém as características físicas do suporte e, ao mesmo tempo, retém a atividade biológica da enzima na forma solúvel. O termo “enzima imobilizada” inclui: 1. A modificação das enzimas de forma a torná-las insolúveis em água. 2. A utilização de enzimas na forma solúvel em reatores equipados com membranas de ultrafiltração, que permitem o escoamento dos produtos da reação, mas retêm a enzima no interior do reator. 3. A restrição da mobilidade da enzima pela ligação a outra molécula, que torna o sistema insolúvel no meio de reação (ZANIN e MORAES, 2004). O sistema imobilizado permite a condução de reações em reatores contínuos, com fácil separação de catalisador–produto, e o aumento da produtividade do processo (massa de substrato/massa de biocatalisador).

Classificação das Enzimas Imobilizadas
Na literatura especializada encontram-se diversas formas de classificação dos biocatalisadores imobilizados, todos em concordância com a definição apresentada. Zaborski (1973, 1976) propôs uma classificação que leva em consideração – o tipo de interação responsável pela imobilização - , que pode ser conseguida por meios químicos (com formação de, no mínimo, uma ligação covalente entre os resíduos terminais de uma enzima e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais moléculas de enzima) ou por meios físicos, que não envolvem ligações químicas, porém somente forças físicas (adsorção, interações eletrostáticas e outras) como também, a encapsulação ou microencapsulação em matrizes poliméricas; – a natureza dos suportes – que podem ser porosos ou não-porosos, orgânicos ou inorgânicos (VIETH, 1994; ZANIN e MORAES, 2004). Do ponto de vista prático, o método de classificação não altera o sistema obtido, uma vez que as técnicas mais utilizadas para a preparação dos biocatalisadores de aplicação comercial envolvem uma combinação de métodos básicos. A classificação dos métodos de imobilização de enzimas, mais aceita na literatura, foi proposta por Kennedy e Roig (1995), que considera a combinação da natureza da interação responsável pela imobilização e o tipo de suporte utilizado. Assim: a) Ligação em suportes – modificação da enzima, por meio de técnicas apropriadas, para torná-las imóveis no meio de reação () e cross-linking- ligação cruzada intermolecular ou reticulação. b) Enzimas solúveis sem derivatização- enzimas solúveis, utilizadas em reatores equipados com membranas semipermeáveis de ultrafiltração e fibras ocas que retêm a enzima no interior do reator.

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c) Enzimas solúveis com derivatização- enzimas cuja mobilidade foi restringida pela ligação com outra macromolécula, porém permanecendo o complexo solúvel em água. Outra forma sugerida na literatura para classificar as enzimas imobilizadas leva em consideração a necessidade da presença, ou não, de co-fatores para a melhor atuação da enzima. De um modo geral, as enzimas que não requerem co-fatores, ou aquelas cujos co-fatores estão ligados como um grupo prostético à apoenzima, são fáceis de imobilizar. Por outro lado, o processo de imobilização torna-se complexo, se a coenzima deve ser regenerada pela ação de uma segunda enzima, ou nos sistemas multienzimáticos que requerem a dissociação da coenzima. Portanto, de acordo com a complexidade da imobilização, pode-se ter os seguintes grupos: I) Enzima sem co-fator.

II) Enzima com grupo prostético. III) Enzima com dissociação de coenzima. IV) Sistema multienzimático com dissociação de coenzima. De maneira global, pode-se afirmar que os processos de imobilização desenvolvidos e descritos na literatura, até aproximadamente 1980, são todos pertencentes aos grupos (I) e (II), isto é, de primeira geração. A partir desse período, a ênfase maior tem sido para os sistemas de segunda geração, ou seja, sistemas multienzimáticos com coenzimas e regeneração de co-fatores (HARTMEIER, 1988).

Métodos de imobilização de enzimas
O objetivo deste tópico é apresentar, em linhas gerais, uma introdução às principais técnicas disponíveis para a preparação de enzimas imobilizadas. Para mais detalhes, recomenda-se a consulta de literatura especializada. Existem basicamente duas formas de reter uma enzima no interior dos biorreatores: a imobilização de enzima no interior de um suporte (encapsulação e retenção por meio de membranas); e, a imobilização na superfície de um suporte (ligação covalente e não-covalente). Estes métodos são bem revisados e discutidos na literatura (MESSING, 1975; MOSBACH, 1976; TREVAN, 1980; ROSEVEAR et alii, 1987; HARTMEIER, 1988; GEMEINER, 1992; ZANIN e MORAES, 2004). Para os vários métodos disponíveis no que respeita à estabilização de enzimas imobilizadas, duas vertentes têm de ser consideradas, a estabilidade no armazenamento e a estabilidade operacional. A estabilidade no armazenamento, ou tempo de meia-vida, refere-se à capacidade de uma enzima manter a sua capacidade catalítica durante o período entre a produção e o seu uso. A estabilidade operacional descreve a manutenção da atividade catalítica da enzima durante a reação. A estabilidade operacional pode ser ainda avaliada na ausência ou presença do substrato (LEMOS et alii, 2001; SÁ-PEREIRA et alii, 2003, 2004; CHANIOTAKIS, 2004).

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Suportes para a imobilização de enzimas
As propriedades das preparações de enzimas imobilizadas são influenciadas pelas propriedades da enzima e do material do suporte (TISCHER e KASCHE, 1999). A interação entre esses dois componentes proporciona um derivado imobilizado com propriedades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas (figura 6.1).

Enzima

Suporte

Propriedades Bioquímicas

Propriedades Bioquímicas

Tipo de reação e Cinética

Propriedades Mecânicas

Métodos de imobilização

Efeitos de trasferência de massa

Estabilidade operacional

Desempenho Consumo de enzima (U/kg de produto) Produtividade (kg produto/U)
Figura 6.1 Interação entre suporte e enzima.

Dentre os vários parâmetros que devem ser considerados os mais importantes são apresentados na tabela 6.1, os quais incluem pH, temperatura, força iônica, pressão, agitação, liberação de co-fatores e do substrato com a remoção dos produtos. Estes fatores influem no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade de transferência de massa e de reação intrínseca, e, portanto, afetam o comportamento da enzima imobilizada.

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Tabela 6.1 Fatores que influenciam o desempenho de um sistema de enzima imobilizada Enzima Propriedades Bioquímicas: Massa molecular, grupos funcionais da superfície protéica, pureza (funções de inativação ou proteção das impurezas) Parâmetros Cinéticos: Atividade específica, perfil de pH e temperatura, parâmetros cinéticos para a ativação e inibição, estabilidade térmica, pH, solventes, contaminantes e impurezas Suporte Características Químicas: Composição e base química, grupos funcionais, estabilidade química, contribuições da superfície do suporte, tais como: os micro-efeitos (pH, carga da superfície, natureza hidrofóbica e hidrofílica, efeito redutor e a presença de íons metálicos) Características Mecânicas: Diâmetro do poro, comportamento de compressão, tamanho da partícula; área superficial; volume acessível da matriz, resistência à compactação em operações em altas vazões para reatores de leito fixo; abrasão para reatores agitados e velocidade de sedimentação para leitos fluidizados. Características Morfológicas: Suportes não-porosos (baixa área superficial), porosos (grande área superficial), estrutura de gel Enzima Imobilizada Método de Imobilização: Fixação de proteína, eficiência da enzima ativa, parâmetros cinéticos intrínsecos Efeitos de transferência de massa: Partição (diferente concentração do soluto dentro e fora das partículas do catalisador), difusão interna (poros) e externa Estabilidade: operacional (expressa em tempo de meia-vida sob condições operacionais), estabilidade de estocagem Desempenho: Produtividade (produto formado por unidade de atividade ou massa de enzima), consumo de enzima (e.g. unidades por kg de produto)
Fonte: Tischer e Kasche (1999).

De todos os fatores anteriormente citados, com exceção da enzima, a maior contribuição para o bom desempenho da enzima imobilizada é dada pelo suporte. Se, de um lado um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada, de outro uma escolha errada pode afetar adversamente não só o tempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema. Na seleção de um suporte para uma determinada aplicação, devem ser analisadas suas propriedades físicas e químicas, bem como as relativas à possibilidade de regeneração do material. ¡ Características morfológicas: para possibilitar a imobilização de quantidades significativas de enzima, o suporte deve possuir uma área superficial superior a 10 m2.g-1, o que equivale a se ter alta porosidade e poros de pequeno diâmetro. Naturalmente, o diâmetro dos poros deve permitir o fácil acesso da enzima e do substrato.

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¡ Características químicas: os suportes devem possuir grupos químicos que podem ser ativados ou modificados de modo a permitir a ligação da enzima em condições que não a desnaturem. ¡ Natureza hidrofílica: nos critérios de seleção do suporte de imobilização, deve ser levada em conta a sua afinidade pela água, porque a água do meio se particiona entre a matriz de imobilização, a enzima e o meio de reação, afetando o seu microambiente. São desejáveis suportes com características hidrofílicas de modo a se obter uma boa difusividade do substrato, além de permitir a estabilização da enzima. Suportes hidrofóbicos diminuem a estabilidade e a atividade da enzima imobilizada por um mecanismo semelhante à desnaturação das enzimas em solventes orgânicos. ¡ Insolubilidade: esta característica é essencial, não somente para prevenir a liberação da enzima do suporte, mas principalmente para evitar a contaminação do produto, pelo suporte dissolvido e pela enzima. Em alguns casos, principalmente quando o produto desejado é um alimento ou um fármaco, há a necessidade de estabilização da superfície do suporte, de modo a se evitar a liberação de íons tóxicos ou a formação de particulados finos. Estas situações são encontradas quando se utilizam pós de metais magnéticos ou sílica de porosidade controlada. Os pós liberam íons tóxicos e, portanto, devem ser recobertos com albumina. A sílica de porosidade controlada, por sua vez, se dissolve lentamente com o uso prolongado e o recobrimento da superfície com zircônia é recomendável de modo a estabilizar a superfície antes da derivatização (MESSING, 1978). ¡ Estabilização química, mecânica e térmica: já existem várias estratégias de estabilização enzimática, tais como a interação seletiva não covalente com polieletrólitos, baseadas em cargas de superfície (entrapment): uso de sais, polieletrólitos ou espaços confinados, cujas características físicas e químicas podem ser controladas diretamente na reação de catálise. Este controle baseia-se em múltiplas interações iônicas ou armadilhas físicas e na imobilização covalente de enzimas a outras proteínas ou superfícies sólidas, através de formação de ligações covalentes (intra e inter-enzimáticas), polimerização enzimática, ligação covalente com outras proteínas, imobilização em superfícies sólidas, estabilização da nanoconcavidade enzimática usando a mutagênese dirigida com alterações em locais específicos, aumento da lipofilia do centro activo e/ou remoção de grupos reativos. O suporte deve ser quimicamente resistente nas condições de ativação, durante o processo de imobilização e nas condições em que se processa a reação. A resistência mecânica deve permitir o uso de filtração, centrifugação e agitação, pois o processo de imobilização e o uso repetido e contínuo, algumas vezes, requerem o emprego dessas operações. A estabilidade térmica é outra característica importante. Suportes com grande coeficiente de expansão podem sofrer distorção ou destruir o sítio ativo da enzima sob expansão ou contração, quando submetido a variações de temperatura. Estas situações podem ocorrer quando se utiliza a imobilização em várias temperaturas, ou quando a

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enzima imobilizada é levada da situação de estocagem (normalmente em baixas temperaturas) diretamente às condições operacionais, ou vice versa. ¡ Estabilidade ao escoamento: partículas esféricas, rígidas e de tamanho uniforme, normalmente, são mais apropriadas para a utilização em reatores contínuos, por produzirem pequenas variações de pressão e possuírem boas características de escoamento do fluido intersticial. Uma estrutura rígida de poros (matriz rígida) protege a enzima de situações de escoamento turbulento. ¡ Resistência ao ataque microbiológico: o suporte deve ser resistente à degradação por microrganismos, de modo a evitar a liberação da enzima para a solução. ¡ Regenerabilidade: as leis ambientais sobre a poluição e o esgotamento das reservas naturais tornaram a regeneração e o reciclo necessidades prementes nos processos em larga escala.Por isto, tanto a possibilidade de regeneração como a reutilização da matriz devem ser consideradas na avaliação econômica do sistema com enzima imobilizada.Quanto à composição química os suportes são classificados em orgânicos (naturais e sintéticos) e inorgânicos (minerais e fabricados). Como exemplo de suportes orgânicos naturais podem ser citados os polissacarídeos (celulose, ágar, quitina, quitosana, amido, entre outros) e as proteínas (colágeno, albumina, gelatina, glúten, seda, entre outras). Dentre os sintéticos encontram-se o poliestireno, os poliacrilatos, os polivinílicos, o nailon, entre outros.Os suportes inorgânicos minerais mais utilizados são: areia, bentonita, horneblenda e pedra-pomes. Dentre os fabricados pode-se citar: vidro, cerâmica e sílica de porosidade controlada, aluminossilicatos, óxido de ferro, óxido de níquel, aços inoxidáveis, entre outros. Os suportes mais amplamente estudados e utilizados são os derivados de polissacarídeos, especialmente os extraídos de algas, como: agarose, alginato e K-carragenina. A celulose e seus derivados têm boas propriedades para a imobilização de enzimas. Outro suporte que apresenta boas características para a imobilização de enzimas é o carvão ativo, que pode ser obtido pela desidratação e carbonização, seguida de ativação, de materiais como casca de coco, madeira, carvão, coque, ossos animais e lignina (MESSING, 1978). Um suporte que tem merecido a atenção dos pesquisadores é a sílica xerogel obtida pela técnica sol-gel, que envolve a hidrólise e condensação de Si(OR)2 em presença de um trialcoxissilano (PIERRE, 2004; KANDIMALLA et alii, 2006). Na funcionalização obtém-se um material do tipo xSiO2.SiO3/2 – (CH2)n-L, onde é possível controlar a densidade do ligante (L) ancorado à superfície da sílica. Essa técnica tem sido utilizada, principalmente, para a imobilização da enzima lipase por apresentar boa retenção de atividade (REETZ et alii, 1996; SOARES et alii, 2004, 2005, 2006). Os suportes inorgânicos são mais apropriados para uso industrial por apresentarem elevada resistência mecânica, boa estabilidade térmica, resistência a solventes orgânicos e ao ataque por microrganismos. Eles são de fácil regeneração por pirólise e apresentam boa rigidez da matriz, sendo estáveis em uma ampla faixa de pressões, temperaturas e pH. Entretanto, a maioria das enzimas imobilizadas comercializadas é obtida com matrizes orgânicas devido, provavelmente, à variedade de grupos funcionais reativos que podem ser introduzidos nesses suportes.

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Os processos de imobilização de mais de uma enzima em um mesmo suporte têm se destacado porque constituem sistemas interessantes para o estudo e compreensão da forma como ocorrem as reações nos seres vivos, onde as enzimas agem de forma seqüencial. Embora os suportes e as técnicas de imobilização sejam as mesmas empregadas nos processos com uma única enzima, são parâmetros importantes nos processos multienzimáticos: a razão molar entre as enzimas e entre estas e o suporte, a resistência difusional no reator e a conversão em produto final (VIETH, 1994). Na seleção do suporte para a imobilização da enzima, os fatores de maior peso são as suas propriedades físicas, químicas e mecânicas. Idealmente um suporte deve ser quimicamente inerte, ter grande área superficial (>10 m2/g), ter resistência mecânica elevada e baixo custo de produção. Infelizmente, a combinação destas qualidades nem sempre é possível e um compromisso deve ser encontrado. Do exposto, pode-se inferir que não se conhece um suporte ideal e universal para a imobilização de enzimas, e este talvez nunca seja encontrado, devido à diversidade dos sistemas enzimáticos. Isto significa que é necessário avaliar criteriosamente todos os aspectos envolvidos e, então, decidir qual é o suporte mais apropriado para a aplicação desejada. Na otimização de um tipo de suporte para uma aplicação específica é importante conhecer a natureza catalítica da enzima, e e o tipo de reator que será utilizado.

Imobilização no Interior de um Suporte
Este método está fundamentado na diferença de tamanho entre as moléculas do catalisador e do soluto, e aqui duas aproximações têm sido adotadas: a formação de uma estrutura porosa na presença da enzima, envolvendo-a em uma estrutura tridimensional, ou a retenção do biocatalisador por uma membrana porosa. Em ambos os casos a enzima tem sua mobilidade mantida, pois não são envolvidas ligações físicas ou químicas entre a enzima e o suporte. Conseqüentemente, somente substratos de baixo peso molecular podem ser empregados com este tipo de enzima imobilizada. Este método inclui a encapsulação em gel e em fibras e a microencapsulação, como mostrado na figura 6.2 (ROSEVEAR et alii, 1987). O método de encapsulação em gel envolve a retenção da enzima no interior de uma matriz polimérica insolúvel no meio de reação. A maior parte dos métodos baseia-se na mistura do biocatalisador com um fluido precursor do gel e subseqüente gelificação por polimerização ou precipitação, ficando a enzima distribuída no interior da matriz. As matrizes preferidas são normalmente as do tipo hidrogel, que podem ser obtidas nas mais variadas formas. A preparação de enzimas imobilizadas no interior de fibras pode ser realizada pela dissolução de um polímero, como o acetato de celulose, em um solvente orgânico imiscível em água seguida da emulfisicação da solução formada com a solução aquosa que contém a enzima. Em seguida estruda-se a emulsão em um líquido coagulante (tolueno ou éter de petróleo) que precipita o polímero na forma de filamentos. No interior do polímero são retidas as microgotas contendo a enzima (FERNANDES e CABRAL, 2006).

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CAPÍTULO 6 ¡ IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO

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Enzimas insolúveis

Enzimas solúveis

Encapsulamento

Ligação

sem derivação

com derivação

em gel

em fibras

microencapsulação

ligação simples

reticulação

adsorção

ligação iônica

quelação

ligação covalente

Figura 6.2 Classificação dos métodos de imobilização.

As principais vantagens da encapsulação de enzimas incluem a grande área superficial para contato entre o substrato e a enzima no interior de um volume relativamente pequeno, e a possibilidade de imobilização simultânea de diferentes enzimas em uma única etapa. Como principais desvantagens, têm-se: a) A restrição de que os biocatalisadores somente podem ser utilizados com substratos de baixo peso molecular. b) A possível inativação da enzima durante o procedimento de imobilização. c) A alta concentração de enzima necessária para garantir a encapsulação. d) Os possíveis efeitos de inibição por produtos ou substrato no interior da matriz porosa. O laboratório de investigação japonês Toyota Center R&D Labs desenvolveu uma nova estratégia de estabilização de enzimas, com aplicação na indústria de automóveis, por imobilização em suportes com mesoporos, o FSM-16 (Folded Sheet Mesoporous Material), que apresenta resultados surpreendentes.

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ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

A atividade enzimática e a termoestabilidade em solventes orgânicos foi significativamente aumentada porque o poro do FSM-16 corresponde ao tamanho molecular da enzima (LI e TAKAHASHI, 2000; TAKAHASHI e MIYZAKI, 2000).

Imobilização sobre um Suporte
A enzima pode ser permanentemente fixada na superfície de um suporte por meio de interações como a adsorção física, a ligação iônica, as ligações covalentes e a ligação a um metal (quelação), como mostrado na figura 6.2. O método de imobilização por adsorção física é a técnica mais antiga de produção de enzimas imobilizadas, assim como, a mais simples. Consiste em se colocar em contato a solução da enzima em água com o suporte (superfície adsorvente), em determinadas condições de pH, temperatura e agitação. Após a imobilização o suporte é lavado para remoção das moléculas de enzima que não foram adsorvidas (MESSING, 1978). O princípio envolvido nesse tipo de método é a atração da enzima pela superfície do suporte por meio das forças de Van der Waals, que são fracas, o que permite a desadsorção da enzima durante a utilização. Para minimizar este problema é recomendável lavar a enzima imobilizada com solução de substrato nas mesmas condições de pH e temperatura empregados no meio de reação. O processo de adsorção não é específico e algumas vezes pode provocar a inativação parcial ou total da enzima. Neste caso, somente suportes com alta afinidade pela enzima podem causar a menor desnaturação da enzima. Os suportes mais utilizados são: alumina, carvão ativo, argila, colágeno, vidro, terra diatomácea e hidroxiapatita (MESSING, 1978). O método de imobilização por ligação iônica baseia-se na atração da enzima pelo suporte sólido que contém íons residuais. A principal diferença entre a adsorção física e a ligação iônica é a energia da ligação envolvida entre a enzima e o suporte, as interações íon–íon são mais fortes do que as forças de Van der Waals, porém mais fraca que a ligação covalente (FERNANDES e CABRAL, 2006). A preparação do derivado imobilizado é feita da mesma forma que no processo de adsorção física, isto é, coloca-se em contato a solução enzimática com o suporte. Também, neste caso, pode ocorrer a liberação da enzima pelo suporte, o que contamina o produto final e reduz a atividade específica do biocatalisador. Dado o caráter iônico da ligação e as condições amenas de imobilização, ocorre pouca mudança conformacional na enzima, o que conduz à obtenção de derivados imobilizados com altas atividades enzimáticas. Enzimas imobilizadas ativas podem ser obtidas utilizando-se a técnica da ativação da superfície do suporte com metais de transição (ligação com metais ou quelação), formando ao final, um quelato entre a enzima e a superfície ativa do suporte. Os principais sais de metais utilizados para o processo de ativação são: TiCl3, TiCl4, Ti2(SO4)3, FeCl3, FeCl2, FeSO4, ZnCl4, SnCl2, SnCl4 e VCl3 (Zanin e Moraes, 2004). Esta técnica tem sido utilizada para ativar tanto materiais orgânicos (papel de filtro, quitina, quitosana, ácido algínico), e inorgânicos (Celite, vidro, sílica de porosidade controlada, horneblenda, lã de vidro e alumina, entre outros). Embora a preparação de enzimas imobilizadas por este método seja bastante simples, estando envolvidas somente duas etapas (ativação do

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suporte e imobilização da enzima), a estabilidade operacional obtida, quando se trabalha com substratos de alta massa molecular, é baixa, devido aos metais envolvidos. Também foram observados casos em que houve dessorção da enzima, que resulta da fraca interação entre a enzima e o metal (suporte ativado). Por este motivo alguns autores consideram este método como de quelação (ligação covalente parcial) e outros, como de adsorção.Os métodos de adsorção, ligação iônica e ligação metálica são de fácil aplicação, entretanto eles não são muito utilizados em processos em grande escala, devido às forças de ligação fracas, o que possibilita a perda da enzima do suporte. O método da ligação covalente baseia-se na formação de uma ligação forte entre a enzima e o suporte. Este método de imobilização é o mais difundido e o mais estudado. A seleção das condições de imobilização é mais difícil do que nos outros métodos. O método é, freqüentemente, mais complexo e utiliza condições menos brandas do que os demais. Como a ligação formada é forte, a enzima imobilizada obtida por este método é estável, isto é, não se solta do suporte em presença do substrato ou de soluções de alta concentração iônica. A ativação do grupo ligante é freqüentemente realizada no suporte a fim de reduzir o risco de diminuição da atividade catalítica da enzima. As reações de ativação do suporte podem ser por: diazotização, formação de ligação amida, alquilação e arilação, formação de base de Schiff, reação de Ugi, reações de amidinação, troca do dissulfeto-tiol, interações enzima-mercúrio e ligação induzida por radiação (KENNEDY e WHITE, 1985; HARTMEIER, 1988; FERNANDES e CABRAL, 2006). Os materiais inorgânicos mais comumente utilizados na imobilização de enzimas são: cerâmica, vidro, sílica e metais. Muitos métodos de ligação covalente de enzimas em suportes inorgânicos envolvem a utilização de derivados de silano contendo um grupo orgânico funcional (método de silanização). Às vezes, os suportes silanizados podem reagir diretamente com as enzimas, mas na maior parte dos casos, estes grupos funcionais devem ser modificados para produzir intermediários reativos. O reagente mais utilizado é o glutaraldeído, devido à simplicidade do método e obtenção de preparações enzimáticas ativas e estáveis (WEETALL, 1975, 1976; ZANIN e MORAES, 2004; FERNANDES e CABRAL, 2006). Para conseguir preparações com alta atividade, algumas vezes, são utilizadas técnicas que procuram evitara inativação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da enzima. Dentre estas se pode citar: a ligação covalente da enzima na presença de um inibidor competitivo ou do substrato, a ligação reversível de um complexo enzima-inibidor, a modificação química de uma enzima solúvel, induzindo a ligação com o suporte pelos novos grupos introduzidos, e a ligação multipontual da enzima ao suporte. Os suportes orgânicos não necessitam da etapa de silanização, uma vez que dispõem de grupos funcionais capazes de promover a ligação enzima-suporte. Porém, as enzimas imobilizadas são mais ativas e estáveis quando se introduz um espaçador entre a enzima e o suporte. Como espaçador pode-se empregar a hexametilenodiamina (HEMDA), que tem a função de aumentar a mobilidade da enzima. Amiloglicosidase, lipase e ciclodextrina-glicosil-transferase, dentre outras enzimas, têm sido imobilizadas em quitina e quitosana, obtendo-se boa recuperação de ati-

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vidade em relação à enzima solúvel (BON et alii, 1984; ZANIN et alii, 1998; PEREIRA et alii, 2001; SOBRAL et alii, 2003a,b; GOMES et alii, 2004). Uma enzima insolúvel pode ser obtida pela formação de ligações cruzadas intermoleculares (reticulação ou cross-linking) entre moléculas da enzima sem a presença de um suporte sólido. Sempre que possível, deve-se escolher um reagente que promova a ligação entre grupos não envolvidos na catálise e que esteja em concentração suficiente para a completa imobilização com retenção da atividade. O glutaraldeído tem sido o reagente bifuncional mais amplamente utilizado (FERNANDES e CABRAL, 2006). Em algumas situações, quando se deseja obter enzimas imobilizadas com maior atividade, ou aumentar a resistência mecânica dos suportes, é recomendável a utilização de uma combinação de métodos para a imobilização de enzimas. Por exemplo, pode-se melhorar a estabilidade da enzima imobilizada por adsorção promovendo-se uma ligação cruzada entre as moléculas da enzima com o glutaraldeído.

Imobilização Multipontual
A imobilização multipontual de uma enzima consiste na formação de várias ligações covalentes entre uma molécula de enzima e vários grupos ativos do suporte. Para se obter derivado estável pela técnica de imobilização multipontual, deve-se selecionar um suporte morfologicamente apropriado. Suportes porosos, cuja estrutura interna tem grande área superficial, como por exemplo, sílica, alumina e géis de agarose, promovem congruência geométrica entre a enzima e o suporte, aumentando a rigidez de uma pequena parte da área superficial da enzima (10 a 20%), que é transladada para toda a estrutura terciária, devido às fortes interações entre todas as partes da molécula de proteína (GUISÁN et alii, 1991). A ligação da enzima ao suporte dá-se entre grupos amino da enzima e grupos aldeído alifáticos pequenos do suporte. Géis glioxil-agarose (Ag-O-CH2-CHO) possibilitam multiinteração enzima-suporte intensa, sem distorção da estrutura da enzima, devido à ausência de impedimentos estéricos para a reação química amina-aldeído, estabilidade dos grupos aldeídos e reversibilidade de cada ligação unipontual amina-aldeído. Com o uso do sistema insolubilização-estabilização de enzimas proposto por Guisán (1988) e controle das variáveis que definem a intensidade das multiinterações enzima (amino) suporte (aldeído), a saber, a densidade superficial dos grupos aldeído no gel ativado, o tempo de contato enzima insolubilizada-suporte ativado, a temperatura e o pH, é possível preparar derivados mais ativos e mais estáveis com, por exemplo, penicilina G-acilase (BLANCO e GUISÁN, 1989), quimotripsina (GUISÁN et alii, 1991), esterase termofílica (FERNADEZ-LAFUENTE et alii, 1995), carboxipeptidase A (PEDROCHE et alii, 2002), alcalase (TARDIOLI et alii, 2003b) e lipase (PALOMO et alii, 2005). A tabela 6.2 mostra a atividade recuperada e o fator de estabilidade de diversas enzimas imobilizadas em gel glioxil-agarose (MATEO et alii, 2005). A atividade recuperada variou de 60 a 100% e a estabilização, de acordo com o tempo de meia vida do biocatalisador, em muitos casos foi 1.000 a 10.000 vezes mais alta do que a conseguida para a enzima imobilizada unipontualmente.

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Tabela 6.2 Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas enzimas imobilizadas multipontualmente em glioxil-agarose Enzima Tripsina Quimotripsina Penicilina G acilase (E. coli) Lipase (C. rugosa) Lipase (B. thermocatenulatus) Esterase (B. stearothermophilus) Termolisina (B. thermoproteolyticus) Glutamato racemase Alcalase Uroquinase
a: comparada com enzimas imobilizadas unipontualmente. Fonte: Mateo et alii (2005).

Atividade Recuperada (%) 75 70 70 50 75 70 100 70 54 80

Fator de Estabilidade 10.000a 60.000a 8.000a 150a 500a 1000a 100a 1000a 500 10

Imobilização pela tecnologia de granulação
Um novo método, já patenteado, de imobilização baseia-se na interação entre a enzima e um ligador líquido que são vaporizados por atomização sobre um suporte de sílica, cujas partículas têm diâmetros inferiores a 100 mm – o mesmo que um grão de areia. Durante a granulação, as partículas de sílica aglomeram-se e transformam-se em partículas porosas de maiores dimensões, com a enzima distribuída uniformemente sobre toda a área da superfície da sílica. O diâmetro médio das partículas é de cerca de 600 mm e a área da superfície é de cerca de 50 m2 por grama. Isto cria uma grande área de contato entre o substrato e a enzima. Muito embora os granulados de sílica sejam porosos, eles são mecanicamente estáveis (NOVOZYMES, 2002).

Imobilização de Enzimas em Meio Orgânico e na Presença de Aditivos
As moléculas de água, que estão ao redor da enzima em meio aquoso, têm papel importante na estabilidade protéica devido, principalmente, às interações hidrofóbicas, além das forças de van der Waals, pontes salinas e pontes de hidrogênio. Desta forma, pequenas variações no meio reacional, tais como: temperatura, pH, força iônica entre outras, podem induzir modificações estruturais na enzima desativando-a (YAMANE et alii, 1990). Esta desnaturação decorre da exposição da parte hidrofóbica da enzima à água, o que promove um aumento do nível de hidratação da enzima. Assim, não é surpresa que a manipulação da natureza do meio e da quantidade de água ao redor da enzima tenha um profundo efeito sobre a estabilidade. A remoção da água da superfície da enzima conduz à reorganização das moléculas de água, devido ao aumento do

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número de ligações hidrogênio intramoleculares, o que contribui para a estabilização e o aumento da rigidez da enzima. Este efeito pode ser alcançado pelo uso de aditivos hidrofílicos, como os polióis e polissacarídeos, como mostra na figura 6.3 a e b. Esses aditivos agem como reguladores da estrutura da enzima em meio aquoso (YAMANE et alii, 1990). As principais desvantagens, associadas ao uso de solventes orgânicos como meios de bioconversão, são o aumento das limitações difusionais à transferência de massa de substratos e produtos, uma vez que se introduz mais uma fase (orgânica) além da fase aquosa (e de uma fase sólida se a enzima estiver imobilizada), e a toxicidade do solvente orgânico para a enzima. Por outro lado, quando a água é substituída por um solvente orgânico, alterações na conformação nativa da enzima podem ocorrer, tanto na estrutura terciária como nas mais proeminentes estruturas secundárias (a-hélice e a conformação b), acarretando, desta maneira, a sua desestabilização. Com o objetivo de assegurar uma conformação enzimática cataliticamente ativa em meio orgânico, a molécula de enzima deve ter uma camada de hidratação definida (FABER, 1997), que reduz o contato do solvente com a superfície da proteína e contribui para o aumento de sua flexibilidade interna.
a) Água

Enzima

b) Polióis Água

Enzima

Enzima

Figura 6.3a Desnaturação da enzima em solução aquosa. (b) Efeito de polióis na estabilização das enzimas.

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Outra maneira de proteger a configuração nativa da enzima é a insolubilização em suportes sólidos (MATTIASON e ADLERCREUTZ, 1991). Uma grande variedade de materiais naturais e sintéticos, orgânicos ou inorgânicos, com diferentes tamanhos, formas e densidades, foram estudados para a imobilização de enzimas para uso em solventes orgânicos (BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). No caso particular da enzima lipase, estudos comparativos mostram diferenças acentuadas no desempenho da mesma fonte de lipase imobilizada em diferentes suportes (tabela 6.3) e evidenciaram que, apesar das várias experiências reportadas na literatura, a imobilização de lipases ainda é um desafio complexo, uma vez que a extensão da imobilização depende da estrutura da enzima, do método de imobilização e do tipo de suporte (RESLOW et alii, 1988; BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). Em muitos casos, suportes que proporcionam uma elevada atividade e estabilidade da enzima mostram sérias limitações de resistência mecânica e à pressão, que os tornam inviáveis para a utilização em alguns tipos de biorreatores (ISON et alii, 1994).
Tabela 6.3 Propriedades catalíticas da lipase microbiana de Candida rugosa imobilizada em diferentes suportes Característica Método de imobilização Rendimento de imobilização (%) Atividade da enzima (U/mg) pH ótimo Temperatura ótima (°C) Inativação térmica a 50°C (h-1) Estabilidade operacional Hidrólise (t1/2 a 37°C, h) Esterificação (t1/2 a 37°C, h) Referência nd 620 Oliveira et alii, 2000 5,0 83 Pereira et alii, 2001 3,3 426 21 32 3,5 302 65 135 Soares et alii, 2004, 2005, 2006 42 110 7,5 50 Nd STY-DVB Quitosana Quitina SPC Celulignina Sílica xerogel Encapsulação 64 193 8,0 40 0,79 32 129 7,5 55 0,19

Adsorção 17 51 6,0 45 0,63 26 60 7,5 45 1,07

Ligação covalente 18 51 7,5 50 0,26

Gomes et Soares et Gomes et alii, 2004 alii, 1999 alii, 2005, 2006

STY-DVB: copolímero de estireno-divinilbenzeno; SPC: sílica de porosidade controlada; nd: não determinado. Sílica xerogel obtida pela técnica sol-gel empregando tetraetil ortosilicato (TEOS) como precursor.

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O aumento da estabilidade é observado em algumas preparações de lipases quando imobilizadas, possivelmente devido à capacidade do suporte em reter a quantidade correta de água para manter ativa a enzima sem aumentar a flexibilidade que proporciona a desnaturação. Gray et alii (1990) estudaram a imobilização da lipase de Candida rugosa em vários suportes e encontraram atividades, em muitos casos, muito superiores as observadas na enzima livre. A atividade da lipase imobilizada especialmente em suportes hidrofóbicos, como o polietileno, foi superior à da enzima livre. Isto foi explicado pelo efeito de orientação promovido pela estrutura do suporte, que provavelmente forneceu à enzima uma melhor exposição ao substrato (BALCÃO et alii, 1996). Dentre os métodos de imobilização, a adsorção física é talvez o procedimento de imobilização mais simples e de menor custo. A especificidade do substrato permanece inalterada, existindo ainda a possibilidade de regeneração do suporte. A adsorção da lipase pode ser efetuada em meio aquoso ou por imersão do suporte em ácidos graxos ou óleo antes de sua exposição à solução da enzima livre. Geralmente adotam-se procedimentos experimentais semelhantes na adsorção física da lipase em suportes hidrofóbicos ou hidrofílicos. Pequenas variações incluem a suspensão do suporte na forma de pó em uma mistura água/álcool desgaseificada, lavagem com água e tampão em uma coluna empacotada e finalmente percolação da solução de lipase através de uma coluna (BALCÃO et alii, 1996). No procedimento de ligação cruzada, as moléculas de lipase são quimicamente ligadas umas às outras, por meio de vários reagentes bifuncionais. Um procedimento comum consiste de uma etapa preliminar que envolve a imobilização da enzima em uma resina de troca iônica (Dowex ou Amberlite), para obter alta “carga” da enzima, seguida por uma ou mais etapas, nas quais formam-se as ligações covalentes. Essas etapas incluem o contato da resina pré-tratada com glutaraldeído, dissolvido em um tampão adequado, para formar uma base de Schiff (produto da reação com os grupos amino), seguido do tratamento com uma solução de sulfito de hidrogênio para reduzir o excesso de glutaraldeído e da base, ou alternativamente, seguido pela lavagem com uma solução de fosfato tamponada. A imobilização de lipase em Amberlite foi obtida pela formação de ligações cruzadas dessas resinas adsorvidas pela enzima com (HEMDA) e glutaraldeído (VILLENEUVE et alii, 2000). Embora seja extensa a literatura referente à imobilização de lipases, são poucos os dados relativos à estabilidade operacional desses derivados. Isto pode estar associado à baixa estabilidade operacional das lipases imobilizadas, que atinge, em alguns trabalhos, cerca de 50 a 70% de redução em menos de cinco bateladas consecutivas (BALCÃO et alii, 1996). Para superar essas limitações, diversas tentativas têm sido descritas na literatura. Controle das condições em que se efetua a imobilização, por exemplo, na presença de aditivos, solventes orgânicos ou substrato, podem geralmente conduzir a preparações mais estáveis (VILLENEUVE et alii, 2000). Segundo Rocha et alii (1998), existem diversas formas de aumentar a atividade lipolítica do sistema imobilizado, inclusive o uso de aditivo. A maior parte dos estudos envolve a imobilização simultânea do aditivo em processo de adsorção simples (ou por pocesso parcialmente modificado por precipitação da enzima, por evaporação da água ou por liofilização). Alguns efeitos são atribuídos a esta nova técnica:

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a) Proteção da inativação da enzima durante a etapa de imobilização (WEHTJE et alii, 1993; TRIANTAFYLLOU et alii, 1995). b) Retenção da camada de água ao redor do biocatalisador (TRIANTAFYLLOU et alii, 1995). c) Efeitos dispersantes das moléculas da enzima e facilitadores de transporte de massa, quando aditivos são usados como matrizes de imobilização. Às vezes, o papel destes aditivos (proteínas, sacarídeos, polióis e sais) pode ser desempenhado pelas impurezas inativas incluídas na solução enzimática bruta. O aditivo pode estar presente ou ausente no meio durante a reação. O contato do aditivo com o suporte e com a enzima pode apresentar comportamento antagônico, isto é, a interação do sistema (aditivo+suporte+enzima) pode ser suficiente, ou também pode apresentar efeito negativo na reação de síntese ou resistência na transferência de massa. A influência do aditivo na atividade enzimática ainda não é totalmente compreendida (ROCHA et alii, 1998). A seleção do aditivo adequado é função do tipo de enzima e do método de imobilização utilizado. No caso específico das lipases, que exigem uma interface água-solvente, para sua total atividade catalítica, o uso de aditivos macromoleculares mostra efeitos estabilizantes significativos na atividade da enzima, por meio do revestimento da interface, impedindo desta forma, alterações da estrutura protéica. Segundo Bosley (1991), caseína, gelatina, albumina de ovo e albumina bovina são aditivos eficientes para a imobilização de lipases em vários suportes. Resultados semelhantes foram descritos por Reetz et alii (1996). É também recomendado o uso de outros tipos de aditivos macromoleculares, como por exemplo, polietilenoglicol (PEG) e polivinilálcool (PVA). Em ambos os artigos, o uso de aditivos de baixa massa molecular (sorbitol, glicerol e triglicerídeos) foi descartado. Outro parâmetro que interfere na eficiência de um determinado aditivo é sua forma de adição no procedimento de imobilização, isto é, em que etapa esta adição é mais indicada e qual a quantidade de aditivo necessária para promover um grau satisfatório de estabilização. Com relação ao primeiro fator, o estudo detalhado realizado por Wehje et alii (1993) sugere que a adição de aditivos deve ser efetuada antes da adição da enzima ou simultaneamente com a enzima. A adição de aditivos após a imobilização da enzima no suporte não mostrou nenhum efeito benéfico. Quanto à quantidade de aditivo, os autores também recomendam uma avaliação experimental em função do tipo de aditivo usado, tendo em vista, que o efeito do aditivo depende do seu tamanho molecular. Esse fato é exemplificado na tabela 6.4 que reúne dados de atividade hidrolítica e de recuperação da lipase de Candida rugosa, após imobilização em sílica de porosidade controlada, na ausência e presença de diversos agentes estabilizantes.

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Tabela 6.4 Rendimento de imobilização da lipase de Candida rugosa em sílica de porosidade controlada na presença de diferentes aditivos Aditivo Controle Lecitina Albumina Ciclodextrina Polietilenoglicol (MM 10000) Polietilenoglicol (MM 1500)
Fonte: Soares et alii, 2001.

Atividade lipolítica U/mg 58 50 78 36 42 104

Recuperação de enzima (%) 19 17 26 12 14 35

Ressaltamos que há extensa literatura disponível para o aprofundamento do estudo do uso de enzimas em meios orgânicos, assim como sobre a imobilizaçãona presença ou ausência de aditivos (REETZ et alii, 1996; GONÇALVES et alii, 1999; PEREIRA et alii, 2001; SOARES et alii, 2001, 2003).

VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
A imobilização da enzima tem um efeito benéfico na sua estabilidade, em função das interações físicas e químicas entre o suporte e as moléculas da enzima. A imobilização, também auxilia a dispersão homogênea da enzima no meio, essencial, para a condução de reações enzimáticas (DE CASTRO e ANDERSON, 1995; VILLENEUVE et alii, 2000). Do ponto de vista comercial, as principais vantagens da utilização de enzimas imobilizadas, em relação às enzimas solúveis são, praticamente, as relativas à catálise heterogênea. São vantagens: a) Aproveitar a atividade catalítica por um maior período de tempo, uma vez que a enzima não deve ser desnaturada ao final do processo em batelada. b) Operar de forma contínua possibilita o melhor controle das variáveis do processo, pois o biocatalisador é retido no interior do biorreator e o substrato passa pelo leito catalítico em escoamento contínuo, ou, então, transfere-se o biocatalisador para novas bateladas que contêm uma solução de substrato novo (processo em bateladas repetidas). c) Facilitar a separação do catalisador e do produto da reação, já que a enzima imobilizada, não é solúvel no meiode reação, é retida no interior do biorreator, e o substrato não convertido e o produto são retirados sem contaminação do biocatalisador. d) Reduzir o volume de reação, porque a enzima imobilizada e retida no biorreator permite alta concentração enzimática em menor volume de reator, isto é, alta atividade por unidade de volume, muito superior a que se seria obtida com

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a enzima livre. Isto conduz a uma alta produtividade volumétrica (kg) por volume de reator (m3) e por hora. Além disto, como o substrato e produto são expostos a condições de reação mais brandas por um menor tempo de reação, impede-se a ocorrência de reações indesejáveis e a contaminação do meio de reação. e) Alterar, em alguns casos, as propriedades catalíticas da enzima em relação a sua forma solúvel, como por exemplo, conferir-lhe maior estabilidade ao pH e à temperatura, reduzir os efeitos de inibição pelo substrato e produto que são removidos continuamente do biorreator. f) Facilitar a interrupção da reação, quando se atinge um determinado grau de conversão, pela remoção do biocatalisador, se a operação está sendo realizada em batelada, ou pelo ajuste do tempo de residência, se é utilizado um reator contínuo (MESSING, 1975; ROSEVEAR et alii, 1987; HARTMEIER, 1988; TISCHER e WEDEKIND, 1999). O sucesso da tecnologia de imobilização mostra que, de modo geral, as vantagens superam as limitações. Porém, alguns fatores devem ser apontados, não como desvantagens do processo, mas sim como pontos a serem evitados. Dentre estes fatores podem ser citados (ROSEVEAR et alii, 1987):

Perda da atividade durante o processo de imobilização
A estabilidade termodinâmica e cinética das enzimas e as diferenças nas sequências de aminoácidos e respectivas estruturas tridimensionais, entre as enzimas intrinsecamente termoestáveis e as termolábeis, justificam a sua performance e o seu elevadíssimo interesse industrial. Vários são os exemplos de tentativas bem sucedidas de aumentar a estabilidade das proteínas modificadas por metodologias de design específico (na molécula de DNA ou na própria enzima) ou por evolução dirigida. A relação que existe entre termoestabilidade elevada das enzimas isoladas de hipertermófilos e a sua baixa actividade específica continua a ser um entrave ao aparecimento mais frequente de novas enzimas no mercado, das quais se exige o binômio elevada termoestabilidade -alta atividade catalítica. Nem todas as enzimas de hipertermófilos têm nível de termoestabilidade suficiente para manter suas estruturas e funções fisiológicas quando sujeitas a altas temperaturas. Assim, são necessários fatores extrínsecos como chaperoninas moleculares e solutos compatíveis, os osmólitos (STERNER e LIEBL, 2001). A imobilização da enzima envolve o manuseio do biocatalisador (enzima–suporte), o que adiciona custos ao processo e invariavelmente resulta em inativação parcial da enzima. Para melhor aproveitamento da técnica, recomenda-se utilizar elevadas concentrações de enzima em relação ao suporte. Como os métodos de imobilização, de modo geral, envolvem interações fracas (forças de VAN DER WAALS), ou fortes (ligação covalente), entre a frágil estrutura da enzima e o suporte, ocorre invariavelmente alteração da estrutura tridimensional da proteína, resultando em menor atividade. Além disso, também podem ocorrer alterações de orientação e acesso do substrato ao sítio ati-

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vo, reduzindo a atividade da enzima, ou ainda levando à redução aparente da especificidade ao substrato. Isto poderia ser vantajoso porque diminui os efeitos de inibição pelo substrato. Porém, como a maior parte dos processos enzimáticos envolve a transformação de macromoléculas, a redução da especificidade é uma desvantagem. Para se superar esse problema, busca-se a proteção do sítio ativo da enzima durante o processo de imobilização, o que pode ser conseguido empregando-se altas concentrações de substrato ou um inibidor de sítio ativo. Nestes casos, as substâncias protetoras devem poder ser facilmente removidas ao final do processo de imobilização.

Efeitos difusionais (transferência de massa)
A enzima, com sua mobilidade restringida pelo fato de estar ligada a um suporte, perde parte da acessibilidade ao substrato, o que leva à aparente redução da atividade, neste caso provocada por restrições difusionais, ou seja, limitações do acesso do substrato ao sítio ativo devido à presença da matriz sólida. Pode, também, ocorrer acúmulo de produto na proximidade do sítio ativo, o que pode afetar a cinética da reação, pela redução da velocidade de reação, ou alterar o pH no microambiente da enzima. Estes efeitos devem ser evitados ou diminuídos pela escolha criteriosa do suporte, ou pelas condições de operação do biorreator. De um modo geral, pequenas partículas de suporte reduzem a resistência à difusão intrapartícula, enquanto altas vazões de fluido (vazões) reduzem os efeitos difusionais interpartículas. Estes dois fatores, são, normalmente, incompatíveis (partículas pequenas promovem uma alta queda de pressão ao longo do leito, reduzindo a vazão de fluido), portanto, a aplicação específica determinará o grau de compromisso desejável entre estes fatores.

Características físicas do biocatalisador e do fluido
Normalmente as enzimas imobilizadas devem ser utilizadas quando o substrato é solúvel. Quando as enzimas estão retidas no interior de matrizes porosas, os poros devem facilitar o livre acesso do substrato e reter ao mesmo tempo a molécula de enzima no seu interior.

Estabilidade do biocatalisador
O custo da imobilização deve ser compensado pela longa vida do biocatalisador. O suporte deve manter suas propriedades físicas (resistência mecânica e ao ataque por reagentes químicos) durante o tempo de meia-vida estimado. Normalmente, os substratos utilizados nas reações enzimáticas contêm substâncias em suspensão, lipídios, que podem se adsorver ao suporte e bloquear os poros, diminuindo a acessibilidade do substrato à enzima e promovendo uma redução aparente do tempo de meia-vida da enzima imobilizada. Neste caso, as soluções de substrato devem ser purificadas antes da alimentação do biorreator.

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APLICAÇÕES DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS
As enzimas imobilizadas têm uma série de características especiais que tornam suas aplicações mais promissoras em relação às enzimas solúveis. Existem, na literatura, muitos trabalhos e livros que apresentam e discutem o uso das enzimas imobilizadas nos campos industrial, analítico, médico, química fina, entre outros (tabela 6.1) (CHIBATA, 1978; CHEETHAM, 1985; ROSEVEAR et alii, 1987; TANAKA et alii, 1993; VELIK e MCLEAN, 1994; CABRAL et alii, 1994; FERNANDES e CABRAL, 2006). Dentre as aplicações de enzimas imobilizadas em larga escala, e que são consideradas um sucesso, pode-se citar: a produção de xaropes de glicose e frutose a partir de amido de milho; a produção do ácido 6-amino penicilínico (CABRAL et alii, 1994), penicilina semi-sentitética, com a enzima penicilina-G ou L-acilase, cuja produção mundial é da ordem de 5 x 103 ton/ano; a produção de acrilamida empregando células imobilizadas; a produção de aspartame com a termolisina imobilizada; e a hidrólise da lactose presente no soro de queijo. A tabela 6.5 apresenta as principais aplicações comerciais das enzimas imobilizadas. O uso uso em escala industrial de enzimas imobilizadas incluem atualmente a produção de milhões de toneladas de xaropes de frutose (HFCS) em biorreatores que operam por 1 000 a 2 000 horas seguidas com um rendimento de 2 000 a 4 000 kg/kg de enzima. Milhares de toneladas desta enzima imobilizada são produzidas por quase uma dezena de empresas espalhadas pelo mundo. Segue-se a essa enzima, considerando a importância industrial, a penicilina-acilase usada para a produção do ácido 6-aminopenicilânico (6APA), precursor de mais de 15 penicilinas semi-sintéticas disponíveis no mercado. Nesta tecnologia os biorreatores operam 2 000 a 4 000 horas seguidas com rendimentos de 1 000 a 2 000 kg/kg de enzima. Aproximadamente 3 500 toneladas de 6APA são produzidas anualmente, sendo utilizadas 30 toneladas de preparação enzimática. De importância industrial equivalente são as enzimas imobilizadas usadas para a produção de vários L-aminoácidos (como a L-alanina, a L-isoleucina, a L-metionina, a L-fenilalanina, o L-triptofano e a L-valina usados para aumentar o valor nutricional dos alimentos) e para a hidrólise de lactose. Os sistemas de enzimas imobilizadas têm também espaço definido em metodologias analíticas, porque são usados na confecção de biossensores (BON e PEREIRA, 1999). Os biossensores enzimáticos tornam-se cada vez mais úteis em aplicações analíticas, devido à possibilidade de se combinar a seletividade e sensibilidade da enzima com a simplicidade dos transdutores eletroquímicos (FERRAZ et alii, 2006). Hoje em dia o mercado dos biossensores é dominado pelos biossensores de glicose, eletrodos enzimáticos produzidos em massa para um diagnóstico rápido dos níveis de glicose sanguínea para diabéticos (NEWMAN e SETFORD, 2006). As etapas fundamentais no desenvolvimento de um biossensor são a imobilização e estabilização das enzimas ou outras proteínas sobre a superfície da matriz (KLIBANOV, 1979). Materiais que possam permitir a imobilização de espécies mediadoras e moléculas biológicas são de grande potencial para o desenvolvimento de sensores e biossensores. Como citado, dentre os materiais inorgânicos, a sílica-gel tem um grande potencial

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de aplicação em eletroquímica, entretanto essa é uma área de pesquisa relativamente recente e que tende a crescer, como descreve Walcarius (1998) em sua recente revisão sobre o uso de materiais à base de sílica nos estudos sobre eletrodos modificados e direcionados para aplicações eletroanalíticas (GUPTA e CHAUDHURY, 2007).
Tabela 6.5 Exemplos de aplicações comerciais de enzimas imobilizadas Enzima Glicose isomerase (5.3.1.5 ) b-galactosidase (5.3.1.5) Lipase ( 3.1.1.3) Nitrila hidratase (4.2.1.84) Amilocilase (3.5.1.14) Substrato Glicose Lactose Triglicerídeos Acrilonitrila D,L Aminoácidos Produto Xarope de frutose Glicose e galactose (leite livre de lactose) Análogos de manteiga de cacau Acrilamida L-amino ácidos (alanina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano e valina Soluções de galactose e sacarose Glicose/frutose mistura (açúcar invertido) L-acido aspártico (usado na síntese do aspartame) Aspartame D- glicose Remoção do “chill haze” em cervejas Ácido 6-aminopenicilânico (precursor das penicilinas semi-sintéticas) Ácido L-DOPA

Rafinase (3.2.1.22) Invertase (3.2.1.26) Aspartame amônia liase (4.3.1.1) Termolisina (3.4.24.27) Glicoamilase (3.2.1.3) Papaína (3.4.22.2) Penicilina amidase (3.5.1.11)

Rafinose Sacarose Amônia e ácido fumárico Peptídeos Amido Proteínas Penicilina G e V

b-tirosinase

Pirocatenol

As aplicações mais recentes de biocatalisadores imobilizados incluem a produção de substâncias de alto valor agregado por bioconversão regioespecífica ou estereoespecífica. São exemplos, o tratamento seletivo de poluentes específicos, para resolver problemas ambientais, a análise contínua com alta sensibilidade e especificidade de compostos de interesse, a conversão de energia em sistemas biológicos e, finalmente, em medicina, a confecção de órgãos artificiais e a formulação de fármacos à base de enzimas (BON e PEREIRA JR., 1999).

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PERSPECTIVAS
Embora seja grande o número de trabalhos publicados no campo da imobilização de enzimas os processos que as utilizam em escala industrial são poucos e isto se deve principalmente aos seguintes fatores: o suporte e os reagentes para a imobilização são caros; a ainda baixa eficiência dos métodos de imobilização; a relativamente baixa estabilidade operacional da enzima imobilizada; o fato de os equipamentos requeridos para a operação contínua serem, via de regra, mais sofisticados e pouco versáteis; a pequena demanda dos produtos, que, normalmente, não incentiva a produção em larga escala; e a baixa eficiência das enzimas imobilizadas para produtos de alto peso molecular. Para viabilizar a aplicação industrial, é necessário otimizar os seguintes parâmetros: custo de imobilização, retenção da atividade enzimática, estabilidade da enzima à temperatura e ao pH, a estabilidade operacional e projeto do biorreator; além da obtenção de suportes mais resistentes e baratos. A tecnologia de imobilização reune os conhecimentos da química, da bioquímica, da biologia molecular e celular aos da engenharia, buscando sempre se ampliar as aplicações das enzimas na conversão de matérias-primas, normalmente de baixo custo, em produtos de maior valor agregado. Dessa forma, a imobilização de enzimas é realizada não só com o propósito de atender aplicações puramente científicas, onde são utilizadas como modelos para estudar a relação entre a atividade catalítica e a estrutura protéica, mas principalmente visando o uso comercial em processos contínuos. As estratégias de posicionamento da indústria de enzimas imobilizadas dependem diretamente do avanço de investigação em áreas relacionadas com a estabilização enzimática, entre elas aa investigação do uso de proteínas de proteção, como as chaperoninas (MOSKOVITZ e SREBNIK, 2005). Outras estratégias têm sido abordadas com êxito como a aplicação de modelos de inativação, a modificação química e a estabilização com aditivos e solutos compatíveis (O’FAGAIN, 2003; SÁ-PEREIRA et alii, 2004). A área que mais se destaca é a engenharia de proteínas que tem contribuído decisivamente para o desenvolvimento de novos processos de estabilização enzimática.

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