Artigo

Anlise Citogentica na Investigao de Incidentes Radiolgicos

Marcela Maria Pereira de Lemos Pinto, Ademir de Jesus Amaral Laboratrio de Modelagem e Biodosimetria Aplicada, Recife, PE Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

Resumo
Anlise citogentica na investigao de incidentes radiolgicos Em 2005, a NR 32 Segurana e Sade no Trabalho de Servio de Sade regulamentou a anlise de marcadores citogenticos modificados pela ao das radiaes ionizantes, como mtodo de monitorao do nvel exposio individual. Todavia, a carncia de informaes acerca do tema tem gerado a subutilizao dessa tcnica, sobretudo, em termos de investigao de exposies excessivas s radiaes ionizantes. Nesse contexto, o objetivo deste artigo foi discutir questes de interesse acerca da dosimetria citogentica, tais como relao dose-efeito, critrios de anlise para contagem das alteraes cromossmicas, mtodos de colorao, custos operacionais associados aos ensaios biodosimtricos e suas aplicaes. Palavras-chave: NR 32, dosimetria citogentica, dicntricos, translocaes e microncleos

Summary
Cytogenetic analyses in the investigation of radiological incidents In 2005, the NR-32 Regulatory Standard Safety and health at work in health service regulated the use of cytogenetic biomarkers related to ionizing radiation, as method to access radiation levels for individual monitoring. However, the lack of information about this subject has been responsible to underutilization of this technique, particularly in terms of investigation of radiation individual overexposures. In this context, the aim of this work was to present issues of interest related to cytogenetic dosimetry, such as dose-effect relationship, set up for chromosomal aberrations scoring, staining methods, evaluation of costs and applications. Keywords: NR-32, cytogenetic dosimetry, dicentrics, translocations and micronuclei

Introduo

Entretanto, tem-se verificado que o tema ainda pouco difundido entre os profissionais de sade, sendo esta a principal razo para que a dosimetria citogentica no seja, por exemplo, prescrita por mdicos do trabalho em casos de suspeita de exposio acidental. Em paralelo, raros so os laboratrios que dispem de infraestrutura e mo-de-obra capacitada para a realizao de anlises citogenticas para fins de investigao de acidentes radiolgicos. Nesse contexto, o objetivo deste artigo abordar os principais aspectos relacionados dosimetria citogentica, suas metodologias de anlise e importncia mdico-legal, no auxlio

de avaliaes de exposio individual s radiaes ionizantes. Efeitos biolgicos das radiaes ionizantes As radiaes ionizantes (RIs) so um fator de risco real sade, capazes de induzir uma srie de modificaes orgnicas por meio da quebra de ligaes fsico-qumicas dos componentes primrios da clula, como resultado de ionizaes dos tomos intracelulares (2). Na clula, o stio-alvo de ao das RIs a molcula do DNA, cuja interao promove uma srie de modificaes estruturais em sua cadeia polipeptdica. Dentre estas, a formao

Ministrio do Trabalho e Emprego aprovou em 2005 a Norma Regulamentadora

32 (NR 32) Segurana e Sade no estabelece procedimentos a serem seguidos no sentido de garantir a integridade fsica e mental do trabalhador da rea de sade. Dentre os vrios aspectos abordados, esta norma inclui a dosimetria citogentica como ferramenta de monitorao individual em caso de suspeita ou ocorrncia de exposio individual acidental s radiaes ionizantes, a critrio mdico (1).

Trabalho de Servio de Sade que

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de quebras duplas ou DSBs (Double Strand Breaks) considerada o tipo de dano mais severo, responsvel pela produo de grande parte dos efeitos biolgicos radioinduzidos (3). Falhas no reparo das DSBs podem levar ao aparecimento de modificaes na estrutura da cromatina e, consequentemente, de anomalias ao nvel cromossmico, como por exemplo, cromossomos dicntricos, fragmentos acntricos e translocaes (4). O estudo das alteraes cromossmicas (ACs) e de seus subprodutos tem sido extensivamente utilizado e validado na dosimetria citogentica para deteco de exposies excessivas s RIs e estimativa da dose absorvida em clulas linfocitrias (5). A dose absorvida a grandeza fsica bsica utilizada nos programas de radioproteo na avaliao e gerenciamento dos riscos relacionados interao das RIs com a matria viva, sendo definida como a energia mdia depositada num certo volume irradiado. No Sistema Internacional (SI), a unidade da dose absorvida o gray (1 Gy = 1 J/kg) (6). Alteraes cromossmicas e microncleos em clulas linfocitrias A escolha dos linfcitos como modelo biolgico do nvel de exposio individual baseia-se no fato de que so clulas de fcil obteno (puno venosa), sensveis radiao, que retm as leses produzidas pela ao das RIs em seu DNA, por estarem predominantemente na fase quiescente do ciclo celular (G0) (7, 8). Ao nvel cromossmico, o acesso aos danos radioinduzidos obtido atravs do cultivo in vitro das clulas linfocitrias, cujas alteraes so classificadas em instveis e estveis, de acordo com o tempo mdio de vida e a viabilidade da clula portadora (9, 10).

Os tipos mais comuns de alteraes cromossmicas instveis (ACIs) so dicntricos (~60 %), cromossomos em anel (10 %) e fragmentos acntricos (Figura 1). Destas, os cromossomos dicntricos so considerados a assinatura biolgica das RIs devido sua elevada radioespecificidade e baixa incidncia na populao (1-2 dicntricos/1.000 clulas). As ACIs exibem um carter transitrio em virtude do grau de rearranjos e do tipo de deleo ocorrido na conformao original dos cromossomos (11, 12). Em geral, cerca de 50% das clulas portadoras so naturalmente eliminadas a cada ciclo mittico (M1, M2, M3 etc.), por meio de um processo denominado de apoptose ou morte celular programada (13). A apoptose acionada pela reduo do nmero diploide das clulasfilhas ao final da mitose, resultado da disperso de fragmentos acntricos no meio extracelular e da ruptura de pontes nucleoplsmicas, geralmente formadas por problemas na segregao dos cromossomos dicntricos ao final da telfase (citocinese). Dessa forma, o intervalo de tempo entre a irradiao e o incio dos ensaios biodosimtricos no deve exceder um perodo superior a trs meses, para que no haja perda de

informao e subestimao da dose absorvida (14). Em contrapartida, a presena de alteraes cromossmicas estveis (ACEs) no necessariamente letal clula, de modo que os elementos resultantes de eventos de insero e de rearranjos recprocos e no recprocos so continuamente transmitidos s clulas-filhas, a partir das clulastronco hematopoiticas (15, 16). Dentre as ACEs, as translocaes recprocas persistem por um tempo maior nos linfcitos irradiados, ao longo do processo de renovao celular, o que as torna biomarcadores de exposio mais apropriados que os dicntricos em investigaes retrospectivas (17). A hibridizao in situ fluorescente (FISH) comumente utilizada na deteco de segmentos translocados, atravs do emprego de sondas cromossmicas especficas (18, 19). A Figura 2 um exemplo de aplicao do FISH em uma metfase linfocitria normal, onde a estrutura dos pares cromossmicos marcados est preservada. Na figura anterior, caso fosse observada permuta entre os segmentos dos pares marcados, os cromossomos investigados teriam suas estruturas alteradas, caracterizando o fenmeno de translocao recproca.

Figura 1. Cromossomo dicntrico (a) e em anel (b) em metfases linfocitrias irradiadas. Os fragmentos acntricos aparecem em destaque

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Assim como os dicntricos, os MNs so eliminados ao longo das divises celulares e por isso sua aplicao restrita a exposies recentes. Contudo, importante destacar que os MNs podem ser gerados tanto pela ao de agentes genotxicos clastognicos (e.g. radiaes ionizantes) quanto aneugnicos (e.g. agrotxicos e pesticidas) e, portanto, no so to Figura 2. Metfase linfocitria hibridizada com sondas para os pares 2 (verde) e 3 (vermelho) Microncleos Os microncleos (MN) so um subproduto da perda ou fragmentao cromossmica, formados por falhas no mecanismo de reparo do DNA e pela no disjuno das cromtides-irms (defeitos nas fibras do fuso mittico e cinetcoros danificados), respectivamente (20). Ao final da diviso celular, o material gentico perdido ou fragmentado volta a descondensar-se e adquire morfologia ovoide semelhante do ncleo principal da clula, que pode ser visualizada atravs da adio da citocalasina-B ao meio de cultura (21). A citocalasina-B atua no bloqueio da citocinese, impedindo a separao das clulas-filhas e assim gerando unidades bi, tri ou polinucleadas (Figura 3). Estabelecimento da relao dose-efeito A correlao existente entre o nmero de aberraes produzida in vivo e a frequncia obtida in vitro em amostras de sangue uniformemente irradiadas foi inicialmente observada em estudos experimentais, realizados em indivduos acidentalmente expostos s RIs (11, 23). A partir da, curvas dose-efeito foram construdas em funo das caractersticas fsicas da radiao incidente (alcance e poder de ionizao), das condies de exposio (aguda ou crnica) e do tipo de irradiao (parcial ou de corpo inteiro). Isto porque, para uma mesma dose, radiaes com diferentes LET (transferncia linear de energia) apresentam distintas eficincias biolgicas na produo de quebras cromossmicas e na distribuio dessas alteraes radioespecficos (22).

nas clulas afetadas (Figura 4). Para radiaes de baixo LET (e.g. radiao gama e raios-X), que possuem alto poder de penetrao e cuja ionizao se d de forma espaada, a curva dose-efeito descreve uma equao polinomial do 2 grau denominada linear-quadrtica: Y = A+ D + D2 Onde: Y a frequncia do biomarcador (dicntricos, translocaes ou MNs) nas clulas analisadas A a frequncia de aberraes devido radiao natural e so os coeficientes linear e quadrtico, respectivamente D a dose de radiao Para radiaes de alto LET (e.g. nutrons, partculas alfa e elementos de fisso), que possuem alto poder de ionizao e cuja deposio de energia ocorre de forma densa ou localizada, o componente quadrtico desaparece e a curva passa a apresentar uma resposta linear (Y = A+ D). Alm do LET, o intervalo de tempo entre cada exposio precisa ser considerado na obteno da relao doseefeito, visto que altas taxas de dose (dose/unidade de tempo) implicam em maior probabilidade de ocorrncia de danos biolgicos, como resultado de uma menor eficincia do sistema de reparo (24). Na prtica, observa-se que para as radiaes de baixo LET a diminuio da taxa de dose ou fracionamento da dose total acarreta na gradativa reduo do nmero de ACs e MNs por clula, de tal forma que a curva dose-efeito passa a ser linear. Este raciocnio no , todavia, aplicvel s radiaes de alto LET, que naturalmente j exibem esse tipo de resposta.

Figura 3. Clulas linfocitrias bi (a) e polinucleadas (b) geradas aps a adio de citocalasina-B em meio de cultivo. A presena de microncleo est indicada pela seta na clula binucleada (a)

Preferencialmente, cada laboratrio deve proceder com as etapas necessrias ao processo de construo

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da curva de calibrao, atravs da contagem de um nmero suficiente de clulas, a fim de que a estimativa da dose de radiao absorvida alcance um limite de confiana de 95%. Como regra geral, tem sido proposta a contagem de at 1.000 clulas linfocitrias na investigao de incidentes radiolgicos que envolvam baixas doses ( 1 Gy). Esse nmero, entretanto, pode ser significativamente reduzido caso a dose de radiao recebida seja superior a 1 Gy (25). importante lembrar que na execuo dos ensaios biodosimtricos devem ser seguidas as boas prticas laboratoriais, alm de que, fundamental que sejam realizadas peridicas intercomparaes dos resultados obtidos, com base nos critrios de contagem adotados por cada laboratrio (26, 27). Tcnicas citogenticas clssicas e moleculares utilizadas na dosimetria citogentica Na dosimetria citogentica, o mtodo de rotina empregado na anlise das ACIs e MN a colorao convencional com Giemsa, que cora uniformemente toda a extenso dos cromossomos e o interior dos ncleos interfsicos. Embora a colorao Giemsa seja

simples, de rpida execuo e de baixo custo associado, a identificao de dicntricos por vezes laboriosa, principalmente quando h sobreposio das cromtides-irms dos cromossomos metafsicos. Por outro lado, este tipo de colorao no permite a distino dos MNs quanto sua origem de formao (aneugnica ou clastognica) (28). Com a utilizao do Bandeamento C e da Hibridizao in situ fluorescente (FISH), a identificao da regio centromrica dos dicntricos, bem como a excluso dos MNs aneugnicos, pde ser realizada de forma mais rpida e precisa, contribuindo assim para uma maior preciso das anlises dosimtricas (29, 30). Adicionalmente, a tcnica de FPG (Fluorescence plus Giemsa) tem permitido restringir a contagem de clulas somente para aquelas que esto no primeiro ciclo de diviso (M1), atravs da adio da 5-Bromo-2-desoxiuridina ou BrdU ao cultivo celular (31). Na anlise das ACEs, a tcnica de bandeamento G foi inicialmente introduzida no intuito de se avaliar as modificaes estruturais sofridas no DNA das clulas irradiadas, com base no padro de bandas longitudinais de cada par cromossmico (32). Essa metodologia, entretanto, revelou-se

demasiadamente subjetiva e laboriosa, o que inviabilizou sua aplicao na triagem de grandes populaes (33, 34). Atualmente, as ACEs so analisadas por FISH, um procedimento mais simples e direto, que utiliza sondas especficas para os cromossomos do grupo A (pares 1, 2 e 3) e B (4 e 5). Os cromossomos-alvo so escolhidos com base na hiptese de que a frequncia de translocaes est diretamente relacionada ao contedo de DNA de cada cromossomo (35). Considerando que ainda no h consenso a respeito dessa teoria, o emprego do FISH multicolor ou SKY (Spectral Karyotyping) tem ganhado fora no campo dosimtrico, pois possibilita a marcao de todos os pares cromossmicos, a deteco de rearranjos mltiplos, envolvendo dois ou mais cromossomos, e de alteraes mnimas, produzidas normalmente aps altas doses de radiao (36, 37). A Tabela 1, adaptada de Lonard et al. (2005) e Fernandes et al. (2008), resume as vantagens e limitaes de cada tcnica com relao ao tempo, custo e preciso apresentados nos ensaios biodosimtricos. Uso da dosimetria citogentica em incidentes radiolgicos Exposies acidentais Acidentes que envolvem exposio aguda de grande parte do corpo (>50 %), a alto nveis de radiao, esto comumente associados a uma srie de manifestaes clnicas adversas, tais como febre, nuseas, vmitos e diarreia. Por essa razo, os indivduos afetados precisam ser rapidamente diagnosticados e tratados conforme a dose de radiao absorvida (38). Quando a coleta de sangue ocorre at trs meses aps o incidente, o

Figura 4. Curva dose-efeito com relao qualidade da radiao (24)

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Tabela 1. Relao custo-benefcio relativa s tcnicas citogenticas avaliadas (11, 29)

Mtodo Colorao convencional Bandeamento C FPG Bandeamento G Biomarcador Dicntricos Microncleos Dicntricos Microncleos Dicntricos Translocaes Dicntricos FISH Microncleos Translocaes SKY Translocaes ++++ + ++++ ++++ ++++ ++ +++ ++++ Tempo de execuo + Tempo de anlise +++ Custos + Preciso ++

++ ++ +

+ ++ ++++

++ ++ ++

+++ +++ ++

+ Baixo; ++ Mdio; +++ Alto; ++++ Elevado

Tabela 2. Caractersticas dos ensaios biodosimtricos (40, 41, 42)

Biomarcador Nvel basal 1-2 em 1.000 cls ~ 8 em 1.000 cls 2-0 em 1.000 cls Cultivo celular 48-51 h Contagem de clulas 500 1.000 cls. 1.000 cls. Tempo de anlise 4-5 dias Limite de deteco de dose 0,1-5 Gy Tcnicas de anlise citogentica Colorao convencional Bandeamento C Fish Colorao convencional Bandeamento C Fish Bandeamento C Fish Sky

Dicntricos

Microncleos

48 h

4 dias

0,3-5 Gy

Translocaes

72 h

100 - 500 cls.

2-3 dias

0,25-2 Gy

mtodo de referncia, amplamente validado como biomarcador do nvel de exposio individual, a contagem do nmero de dicntricos (13, 14). No entanto, se o incidente tiver envolvido centenas ou milhares de pessoas, a frequncia de microncleos pode ser utilizada primeiramente como um mtodo de triagem, visto que um biomarcador de anlise mais simples e rpida que os dicntricos (28, 39). Aps perodos prolongados (>3 meses), o uso de translocaes na dosimetria retrospectiva representa mais fidedignamente a dose absorvida (32). Esta metodologia, entretanto, no recomendada para indivduos com idade avanada, pois a produo de

translocaes tambm afetada por fatores como senescncia, tabagismo e pela ao de agentes qumicos, como por exemplo, agrotxicos (42). Exposies ocupacionais A maior parte dos incidentes ocupacionais est associada a exposies crnicas no uniformes com baixas doses de radiao, que resultam na diminuio do nmero de ACs nas clulas analisadas em relao frequncia esperada aps uma exposio aguda, para a mesma dose (11). Nesses casos, para que a dose absorvida no seja subestimada, extrapolaes matemticas so necessrias. Em geral, os mtodos propostos por Dolphin (Qdr) e por Lea e Ca-

tcheside (Funo G[x]) so utilizados para corrigir a heterogeneidade da irradiao e a influncia da taxa de dose, respectivamente (24). Por outro lado, se as radiaes ionizantes atingirem apenas uma pequena frao do corpo (< 10 %), a dosimetria citogentica ser ineficaz na avaliao dosimtrica, uma vez que o nmero de clulas irradiadas desprezvel. Na Tabela 2, so apresentadas as particularidades de cada ensaio biodosimtrico, incluindo o limite de deteco de dose para radiaes de baixo LET. Como discutido, o emprego da dosimetria citogentica como ferramenta de investigao em sade

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ocupacional particularmente importante em questes mdico-legais (percias trabalhistas) e no controle de qualidade da dosimetria fsica, onde a monitorao individual realizada com auxlio de dispositivos sensveis radiao, genericamente denominados de dosmetros (43). Isto porque, enquanto os dosmetros fsicos medem grandezas operacionais que so utilizadas para o estabelecimento de nveis de referncia, a fim de limitar a probabilidade de ocorrncia de efeitos biolgicos; os dosmetros biolgicos so o produto da interao das RIs e por isso refletem com maior preciso os efeitos resultantes da exposio a esse agente genotxico (44). Laboratrios de dosimetria citogentica No Brasil, o Instituto de Radioproteo e Dosimetria (IRD) o instituto de referncia nacional em termos de aplicao da dosimetria citogentica para fins de proteo do trabalhador. Em contrapartida, o Laboratrio de

Modelagem e Biodosimetria Aplicada (LAMBDA), situado no Departamento de Energia Nuclear da Universidade Federal de Pernambuco, desenvolve atividades de pesquisa e inovao em dosimetria citogentica, objetivando a otimizao do monitoramento de indivduos expostos s RIs, em condies normais como em aplicaes mdicas e exposies ocupacionais ou em situaes acidentais. Nesse sentido, resultados promissores vm sendo obtidos em complementaridade s tcnicas biodosimtricas convencionais atravs de tcnicas moleculares, tais como citometria de fluxo e PCR - Polymerase Chain Reaction (45, 46, 47, 48).

Sade no Trabalho de Servio de Sade na monitorao individual. Todavia, o pouco conhecimento de seus aspectos metodolgicos e aplicaes tem resultado na subutilizao dos biomarcadores citogenticos na investigao de incidentes radiolgicos. Atividades de difuso de conhecimento e de pesquisas associados dosimetria citogentica em muito auxiliaro os profissionais de Segurana e Sade Ocupacional, em uma das etapas-chave do gerenciamento das prticas que envolvem exposio individual s radiaes ionizantes: o controle de exposies a nveis considerados seguros e a tomada de deciso em casos de acidentes radiolgicos. Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel superior (CAPES) pelo apoio financeiro. Correspondncias para: Marcela Maria P. L. Pinto

Concluso
A dosimetria citogentica uma importante ferramenta na avaliao de exposio individual s radiaes ionizantes, tendo se tornado uma exigncia normativa conforme estabelece a NR 32 Segurana e

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