Anlise da Quantidade de Ferro na Ferritina

Trabalho Prtico A

Qumica Bioinorgnica

Autores: Henrique Fernandes e Joo Rodrigues Turma: P1 Data da Realizao: 18 de maro de 2013, Data do relatrio: 16 de maro de 2013

2012/2013

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ndice

RESUMO ........................................................................................................................................ 2 REAGENTES E INSTRUMENTOS ............................................................................................ 2 REAGENTES ................................................................................................................................................ 2 INSTRUMENTOS ......................................................................................................................................... 3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ....................................................................................... 4 RESULTADOS EXPERIMENTAIS ............................................................................................ 4 [FE(O-FENANTROLINA)3]2+ .................................................................................................................... 4 [FE(FERROZINA)3]4-................................................................................................................................. 7 DISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSES .............................................................10 BIBLIOGRAFIA ..........................................................................................................................12 ANEXOS .......................................................................................................................................13

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Resumo
Com este trabalho pretende-se determinar a quantidade de ferro presente na ferritina, uma das protenas com a funo de armazenar o ferro que no est a ser usado pelas clulas, atravs de espectroscopia de UV-Visvel. A tcnica de espectroscopia pode ser usada aps previa desnaturao da protena (ferritina), seguida da reduo do Fe3+ a Fe2+ e complexao. A formao dos complexos que permitem a anlise por espectroscopia feita com o-fenantrolina, num dos ensaios, e com ferrozina em outro ensaio. Estes compostos tm capacidade de formar complexos com o Fe2+ de modo a se poder determinar a sua concentrao pela aplicao da lei de Lambert-Beer. Os resultados obtidos evidenciam que a ferritina tem a capacidade de acomodar 284 tomos de Fe3+ por molcula de ferritina, isto pela determinao feita recorrendo a ofenantrolina. Quando se recorreu ferrozina o valor superior, 430 tomos de Fe2+ por molcula de ferritina.

Reagentes e Instrumentos Reagentes

Ferritina [1] Perigosidade: Muito txico por ingesto. O contato com cidos desenvolve gases txicos. Muito txico para os organismos aquticos. Armazenamento: Deve ser armazenado hermeticamente e a uma temperatura entre 2 a 8C. Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO A) o-fenantrolina [2] Marca: Sigma-Aldrich Nome IUPAC: 1, 10-fenantrolina (C12H2N2) Perigosidade:

Precaues: Txico por ingesto. Eliminao: Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resduos perigosos. Evitar a libertao para o ambiente. Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO B) Ferrozina [3] Marca: Sigma-Aldrich Nome IUPAC: 4,4'-(3-(2-piridil)-trazina-5,6-diil)difenilsulfonato de sdio (C20H13N4O6S2Na2) Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO C)

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Qumica Bioinorgnica 2012/2013 Acetato de Sdio [4] Marca: Carlo ERBA Reagents Nome IUPAC: Acetato de Sdio (CH3COONa) Eliminao: Ligeiro contaminante da gua. Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO D) Soluo de Ferro(II) [5] Marca: Sigma-Aldrich Nome IUPAC: Sulfato de amnio e ferro(II) hexahidratado ((NH4)2Fe(SO4)2 * 6H2O) Perigosidade:

Provoca irritao cutnea e ocular grave. Eliminao: Ligeiro contaminante da gua. Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO E) cido diidroxifumrico [6] Marca: Sigma-Aldrich Nome IUPAC: cido (E)-2,3-diidroxibut-2-enico (C4H4O6) Massa Molecular: 148,07 g mol-1 Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO F)

Instrumentos
Balana analtica Marca e Modelo: Mettler AE260 Deltrange Alcance e Incerteza: Massas superiores a 60g: 205,0000,001g Massas inferiores a 60g: 60,00000,0001g Espectrofotmetro Marca e Modelo: Unicam UV/Vis Spetrometer Intervalo de leitura de comprimentos de onda: 190,0 a 1100,0 0,1 nm Incerteza na medida da absorvncia: 0,001

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Procedimento Experimental
O procedimento experimental est disponvel no protocolo fornecido. As alteraes a esse procedimento aparecem sub-citadas. A concentrao da soluo padro de Fe(NH4)2(SO4)2 . 6H2O usada foi de 1,00X10-4 mol dm-3 em vez dos 2,25X10-4 mol dm-3 citados no protocolo. Preparao da soluo de cido diidroxifumrico (DHF): Medir a massa de 0,0185g de DHF, dissolver o slido em gua desionizada, transferir para um balo volumtrico de 25,00cm3 e completar o volume. Homogeneizar e rotular.

Resultados Experimentais [Fe(o-fenantrolina)3]2+ Espectro de Absorvncia [Fe(o-fenantrolina)3]2+ A

0.3500 0.3000 0.2500 0.2000 0.1500 0.1000 0.0500 0.0000 400.0

509,0nm

450.0

500.0

550.0

600.0

650.0

700.0

750.0

800.0

/nm

Os valores usados para a construo do espectro encontram-se em tabela anexo a este documento (ANEXO G). | | (mol dm-3) Vfinal (cm3) | | (mol dm-3) 0,00 8,00X10-6 1,20X10-5 1,60X10-5 2,00X10-5 2,40X10-5 A509,0 0,000 0,115 0,166 0,220 0,282 0,331 0,177 0,139 0,158

(cm3) 0,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

1,00X10-4

25,00

Amostra 1 Amostra 2 Mdia das Amostras 1 e 2

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Qumica Bioinorgnica 2012/2013 Clculo da concentrao de Fe2+ | Exemplo de clculo: | | | | | | |

Reta de Calibrao A509,0 =f(cFe(II))

0.350 0.300 0.250

A509,0

0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

A509,0 = 1,38E+04 |Fe2+|+ 0,001 R = 0,99943

c (mol dm-3)

| ( )

| |

| |

Clculo da quantidade de Ferro na Ferritina | | |

( ) ( ) ( )

( )

( )

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) ( )

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[Fe(ferrozina)3]4-

Espectro de Absorvncia [Fe(ferrozina)3]4A

0.7000 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 400.0

560,0nm

450.0

500.0

550.0

600.0

650.0

700.0

750.0

800.0

/nm

Os valores usados para a construo do espectro encontram-se em tabela anexo a este documento (ANEXO H).

| | (mol dm-3)

1,00X10-4

(cm3) 0,000 0,120 0,180 0,240 0,300 0,360

Vfinal (cm3)

1,50

| | (mol dm-3) 0,00 8,00X10-6 1,20X10-5 1,60X10-5 2,00X10-5 2,40X10-5

A560,0 0,000 0,249 0,370 0,520 0,611 0,723 0,286 0,301 0,294

Amostra 1 Amostra 2 Mdia das Amostras 1 e 2 Clculo da concentrao de Fe2+ | Exemplo de clculo: | | | | |

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Reta de Calibrao A560,0 =f(cFe(II))

0.800 0.700 0.600 0.500

A560,0 0.400
0.300 0.200 0.100 0.000 0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

A560,0 = 3,02E+04 c + 0,0044 R = 0,99975

c (mol

dm-3)

| ( )

| |

| |

Clculo da quantidade de Ferro na Ferritina | | |

( ) ( ) ( )

( )

( )

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) ( )

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Discusso dos resultados e concluses

Os valores obtidos para o nmero de tomos de Ferro que so coordenados pela ferritina so bastante diferentes, quando se determinam por complexao com a ferrozina e com a o-fenantrolina. Quando se recorreu ferrozina, o resultado foram 430 tomos de Ferro que so coordenados por uma nica molcula de ferritina, j com recurso o-fenantrolina, o valor bastante inferior, 284 tomos de Ferro por molcula de ferritina. Uma boa medida da qualidade e validade das retas de calibrao traadas, que permite selecionar um dos valores obtidos em detrimento do outro o valor do coeficiente de extino molar para cada um dos mtodos. O coeficiente de extino molar obtido para o complexo de [Fe(ferrozina)3]4foi de , valor este que superior ao descrito pela literatura (27900 dm3 mol-1 cm-1). [7] Ora, isto faz com que a concentrao determinada por interpolao grfica seja inferior quela que seria de esperar e portanto o nmero de tomos e Ferro por molcula de ferritina seja inferior ao descrito nesta mesma fonte bibliogrfica. J, para o experimento com [Fe(o-fenantrolina)3]2+, o valor do coeficiente de extino molar obtido foi de , um valor prximo do que est descrito na literatura, 11500 dm3 mol-1 cm-1. [8] Fazendo o clculo dos desvios ao valor estabelecido na literatura, verifica-se que os ensaios com [Fe(ofenantrolina)3]2+ se afastam mais do que os com [Fe(ferrozina)3]4-, com erros de aproximadamente 20% e 8%, respectivamente. Assim podemos ter mais garantias do valor obtido experimentalmente com a ferrozina, do qual resultou o valor de 430 tomos de Ferro por molcula de ferritina, como supracitado.

Imagem 1 Estrutura da Ferrozina

Os valores para o coeficiente de extino molar, para os dois complexos formados ([Fe(o-fenantrolina)3]2+ e [Fe(ferrozina)3]4-) apresentam valores elevados, superiores a 1000 dm3 mol-1 cm-1, pelo que as transies envolvidas no aparecimento de bandas de absoro aos comprimentos de onda utilizados devem-se a transferncia de carga metal-ligando, que do origem a riscas de absoro na zona visvel do espectro electromagntico, conferindo cor s solues. Este fenmeno acontece quando estamos na presena de elementos metlicos com baixo nmero de oxidao, como o caso do Fe2+ e quando os ligandos so bons aceitadores . Pela anlise das estruturas
Imagem 2 Estrutura da o-fenantrolina

dos dois ligandos percebe-se que so bidentados e coordenam atravs dos seus tomos de Azoto, assinalados a vermelho. Ambos os ligandos so bons aceitadores , porque coordenam pelos tomos de Azoto e possuem orbitais vazias que podem receber densidade electrnica que , inclusive, estabilizada por ressonncia. Daqui verifica-se que que o coeficiente de extino molar para a o complexo de ferrozina seja superior ao Autores: Henrique Fernandes e Joo Rodrigues 10

Qumica Bioinorgnica 2012/2013 da o-fenantrolina, pois para a mesma estrutura, a densidade electrnica que a ferrozina capaz de aceitar pelas orbitais muito mais estabilizada por ressonncia, dada o maior nmero de anis capazes de aumentar o nmero de estruturas de ressonncia que promovem a deslocalizao da carga. Isto faz com que a probabilidade de ocorrem transferncia de carga metal-ligando seja maior para o complexo de ferrozina, e portanto o coeficiente de absortividade tambm sejam maior, pois este uma medida da probabilidade de ocorrer a transferncia de carga. Mesmo dando nfase ao valor de tomos de Ferro coordenados pela ferritina obtido com ferrozina, o valor inferior ao descrito na literatura e ao valor mximo que a protena capaz de acomodar, isto pode ser explicado por alguns fatores no controlveis durante a realizao do trabalho, como a quantidade insuficiente de cido, que possa no ter desnaturado toda a protena; insuficiente quantidade de DHF (cido dihidroxifumrico) foi insuficiente para reduzir todo Fe3+ a Fe2+, que seria posteriormente coordenado para doseamento espectroscpico. Para alm disso, no se sabe qual o grau de saturao da soluo de ferritina usada, pois caso a concentrao de Fe3+ na soluo de ferritina seja baixa, o nmero de tomos de Ferro determinado ser incondicionalmente inferior. Um forma de optimizar esta tcnica era recorrer a uma fase de saturao da protena com Fe3+, seguindo-se a adio de quantidades em largo excesso de cido para desnaturar e reduzir o Ferro.

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Bibliografia
[1] Ferritintype IV from Human liver; F6754 [Online]; Sigma-Aldrich: Portugal, 16 de fevereiro de 2013. http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&langua ge=pt&productNumber=F6754&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fw ww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Ff6754%3Flang%3Dpt [2] 1,10-Fenantrolina 99+%; 131377 [Online]; Sigma-Aldrich: Portugal, 16 de fevereiro de 2013. http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&langua ge=pt&productNumber=131377&brand=ALDRICH&PageToGoToURL=http%3A%2F%2 Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Faldrich%2F131377%3Flang%3Dp t [3] cido 3-(2-piridil)5, 6-difenil.-1,2,4-triazina-4,4-dissulfnio, sal sdico; 82950 [Online]; Sigma Aldrich: Portugal, 16 de fevereiro de 2013. http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&langua ge=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fw ww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpt [4] Acetato de Sdio; 1270903 [Online]; Carlo ERBA Reagents: Portugal, 16 de fevereiro de 2013. http://www.carloerbareagents.com/ChemicalsPrices.aspx?id=478167 [5] Sulfato de Amnio e ferro(II) hexahidratado; 215406 [Online]; Sigma-Aldrich: Portugal, 16 de fevereiro de 2013. http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&langua ge=pt&productNumber=215406&brand=SIAL&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fww w.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsial%2F215406%3Flang%3Dpt [6] Dihydroxyfumaric acid hydrate; D113204 [Online]; Sigma-Aldrich: Portugal, 16 de fevereiro de 2013. http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&langua ge=pt&productNumber=D113204&brand=ALDRICH&PageToGoToURL=http%3A%2F% 2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Faldrich%2Fd113204%3Flang%3 Dpt [7] Maureen J. Donlin; Regina F. Frey; Christopher Putman; Jody K. Proctor; James K. Bashkin. Analysis of Iron in Ferritin, the Iron-Storage Protein. Journal of Chemical Education 1998, 75, 437-441 [8] Terence G. Hoy; Pauline M. Harrison; Mohammad Shabbir; Ian G. Macara. The Release of Iron from Horse Spleen Ferritin to 1,10-Phenanthroline. Biochem. J 1974, 137, 67-70 [9] Microsoft Excel Mac 2011, 14.3.2; Microsoft Corporation, 2010 [10] StatPlus Mac LE 2009, 5.8.2.0; AnalystSoft, Inc., 2009 [11] ChemBioDraw, 12.0.3.1216; CambridgeSoft, 2010

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Anexos

Anexo A MSDS da Ferritina Anexo B MSDS da 1,10-Fenantrolina Anexo C MSDS da Ferrozina Anexo D MSDS do Acetato de Sdio Anexo E MSDS do Sulfato de Amnio e Ferro (II) Hexaidratado Anexo F MSDS do cido dihidroxifumrico Anexo G Tabela de resultados utilizados na construo do espectro de absorvncia do complexo com o-fenantrolina Anexo H Tabela de resultados utilizados na construo do espectro de absorvncia do complexo com ferrozina

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