Clonagem Animal

M.Sc. Celso Henrique Souza Costa Barros

Mdico Veterinrio Doutorando em Cincia Animal

rea: Reproduo e Sanidade Animal
Clonagem Animal
Introduo

Tipos de clonagem
Transferncia nuclear
Problemas de viabilidade embrionria, fetal e
neonatal
Consideraes finais

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 Introduo
Definio

A clonagem por transferncia nuclear se baseia na

substituio da cromatina de um ocito maturado, ou seja, no
estdio que estaria apto a ser fecundado, pelo ncleo de uma
clula retirada de outro animal a ser clonado

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 Introduo
Aplicaes

Preservao de espcies em extino

Criao de animais transgnicos
Animais de alto valor zootcnico
Gerao de clulas ou tecidos para fins teraputicos

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 Introduo
Limitaes

uma biotcnica limitada devido a elevada taxa de

mortalidade embrionria e fetal.
Aps a transferncia nuclear e reprogramao
nuclear dos ocitos no readquirirem o
desenvolvimento embrionrio.

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Introduo
Importncia

Melhoramento gentico
Biotecnologia
Biomedicina
Pesquisa fundamental

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Tipos de Clonagem

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Clonagem por Transferncia
Nuclear
Etapas:
Maturao oocitria

Enucleao ou remoo da cromatina dos ocitos

receptores

Preparao e transferncia da clula doadora de ncleo

e fuso com ocitos receptores

Ativao dos ocitos receptores

Reconstruo, cultivo e transferncia de embries para

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receptoras
Clonagem por Transferncia
Nuclear

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Transferncia Nuclear

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Seleo de Ocitos

Qualidade de ocitos Fundamental para

reprogramao dos ncleos transferidos e suportar
perodo inicial do desenvolvimento embrionrio

Etapas:
Maturao oocitria
Enucleao
Ativao
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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Maturao oocitria
Conduzir ocitos at estdio de metfase II
In Vivo
Coleta de ocitos/ovidutos ps-ovulao
Qualidade ocitos
In Vitro
Meio TCM-199
18 a 24 h

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 Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Enucleao

Definio
Retirada das clulas do cumulus, aps criteriosa

seleo de ocitos, incluindo aspecto do citoplasma

e presena de um corpsculo polar, e exposio dos
ocitos s substncias desestabilizadoras do
citoesqueleto.

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 Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Enucleao

Definio
Microaspirao

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Enucleao passos

Separao cummulus

TCM-199+ Hialuronidase (1 mg/mL)

Vrtex 3 a 5

Seleo de ocitos
Presena do corpusculo polar
Indicador de Metfase II

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Enucleao processo

Citocalasina
B (5 a 10 g/mL)
D (1 a 2 g/mL)
Desestabilizao filamentos de actina
Elasticidade dos ocitos para micromanipulao
Corantes para visualizao da cromatina
Hoechst 33342 1 a 10 g/mL- luz UV
Remoo 30% - citoplasma- prximo ao (1 CP)

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Enucleao

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Enucleao processo

Problemas
volume retirado do ocito
Luz Ultravioleta = prejuzo oocitrio

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Ativao

Induo da degradao de complexos enzimticos

responsveis por manter os ocitos no estdio de
metfase II.

A ativao permite a finalizao do processo meitico,

conduzindo os ocitos ao incio do desenvovimento
embrionrio.

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Ativao
MPF-Fator intracelular promotor da fase M (bloqueia
meiose em metfase II)
Degradado sptz
Sptz (influxo de Ca2+)

Processos artificiais

Solues com Ca2+

Agentes
Influxo de Ca2+ extracelular
Liberao de Ca2+ intracelular
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 Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Ativao
Processos artificiais
Solues com Ca2+
5 M de ionomicina (4)
Agentes
Estimulao eltrica
Etanol 7% (5)
Cloreto de estrncio

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Transferncia nuclear: Preparao
dos ocitos receptores
Ativao eficcia
Inibio reorganizao de MPF
Evita bloqueio do desenvolvimento embrionrio
Solues inibidoras de MPF
Inibio da sntese proteca (Ciclohexamida)
Inibio de enzimas cinases (Roscovitina)

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Transferncia nuclear: Preparo
das clulas doadoras de ncleo
Clulas doadoras embrionrias
Digesto zona pelcida
3 mg/mL pronase; pH 2,5

Separao blastmeros
PBS (15)
Citocalasina/tripsina (pipetagem)
Auxiliar na separao

Incluso blastmeros

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Transferncia Nuclear

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 Transferncia Nuclear
Reconstruo de embries (fuso de membranas)
Eletrofuso
Condutividade eltrica
Meio de Zimmermann
Corrente alternada (alinha)
Alinha clula
doadora e 600 1000 kHz
ocito receptor 5 a 6 V
Corrente direta (poros)
Formao de
poros para 1 3 pulsos
fuso de clulas 0,6 a 3,6 kV/cm 25
Transferncia Nuclear
Reconstruo de embries (fuso de membranas)

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Transferncia Nuclear

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Transferncia Nuclear

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Problemas de viabilidade
embrionria, fetal e neonatal
Mortalidade embrionria

Anomalias encontradas pr-implantao

Cromossmicas
Formao deficiente do fuso mittico

Problemas Placentrios
Irrigao sanguinea insuficiente
Aumento da espessura do tecido placentrio
Formao de hidroalantide
Reduo do nmero e aumento de tamanho dos
placentomas
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Problemas de viabilidade
embrionria, fetal e neonatal
Sade neonatal

Sndrome do bezerro grande

Deficincias cardacas, respiratrios e imunolgicas
Infeces umbilicais;
Tolerncia estresse trmico
Broncopneumonia

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Consideraes Finais

Resultados insipientes
Clonagem humana

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