CLONAGEM ANIMAL POR

TRANSFERÊNCIA NUCLEAR
Marco M
M Mello
ll (mmello@ufrrj.br)
( ll @ f j b )
Instituto de Zootecnia – UFRRJ
Departamento
p de Reprodução
p ç e Avaliação
ç Animal - DRAA
 CLONAGEM ANIMAL

Derivado do grego (klon) = broto

DEFINIÇÃO DE CLONES:
População de moléculas, células ou organismos que
se originaram de uma única célula e que são
idênticas à célula original e entre elas.
 • Gêmeos idênticos (univitelinos)

• Separação de blastômeros

• Bipartição (Bissecção) embrionária

• Transferência Nuclear
GÊMEOS IDÊNTICOS
SEPARAÇÃO DOS BLASTÔMEROS

Steen Willadsen - anos 70 e 80

Will d
Willadsen, 1979
1979, 1982
Willadsen & Fehily, 1983
 BIPARTIÇÃO
EMBRIONÁRIA
Á

Moustafa & Hahn, 1978 (camundongo)

Ozil et al., 1982; Williamns et al., 1982 (bovino)
BIPARTIÇÃO EMBRIONÁRIA
 CLONAGEM ANIMAL
TRANSFERÊNCIA NUCLEAR

Remoção do DNA de um oócito maturo e

introdução do núcleo de uma célula
somática
áti (2n)
(2 )

E b i á i
Embrionária Fetal Adulta
 APLICAÇÕES DA CLONAGEM

Produção
ç de animais transgênicos
g ((Bioreatores,
modelos experimentais, xenotransplantes).

Multiplicação de cópias de animais com

características
t ísti s genéticas
néti s desejáveis
d s já is

Preservação de raças ou espécies

é ameaçadas de
extinção
ç
 APLICAÇÕES DA CLONAGEM

Pesquisa básica: herança do DNA mitocondrial;

reprogramação do DNA; métodos de ativação,
diferenciação celular etc

Produção
P d ã d
de Cél l
Células T
Tronco d
de origem
i
embrionária (clonagem terapêutica)
QUAL FOI O PRIMEIRO ANIMAL
CLONADO?
 HISTÓRICO
• 1938 - Estudo
E t d de
d diferenciação
dif i ã celular
l l em
anfíbios (SPEMANN)

• 1952 - Primeiros experimentos

p de clonagem
g
em anfíbios (BRIGGS e KING)

• 1981 - Relato de Transferência Nuclear em

mamíferos - blastômeros de 2 células em
camundongos (ILLMENSEE e HOPPE)
 HISTÓRICO
1986 - Produção de clones ovinos - blastômeros de 8-16
células (WILLADSEN)

1987 - Produção de clones bovinos (PRATHER et al.)

al )

1988 - Produção de clones coelhos (STICE E ROBL)

1989 - Produção de clones suínos (PRATHER et al)

 HISTÓRICO
• 1996 - Nascimento da Dolly a
partir de células somáticas
adultas
d lt (WILMUT ett all.))

• 1997 - Nascimento de
camundongos a partir de
células da granulosa
((WAKAYAMA
K et al.))
 Murinos - 1997 Bovinos - 1998 Caprinos - 2000

Ovinos - 1996

Mouflon - 2001 Gaur - 2001

Suínos - 2000

Felinos - 2002 Banteng - 2003

Leporinos - 2002
Mula (fetal) - 2003 Equinos - 2003 Cervo (white-tailed) - 2003 Rato - 2003

Gato selvagem -
2004
Caninos - 2005
 NO BRASIL
S L

• 2001 - Nascimento
N i t d
da Vitó
Vitória
i
appartir de célula embrionária
(EMBRAPA - DF)

• 2002 - Nascimento do
Marcolino a partir de
células
él l f
fetais (FMV -
(FMVZ
USP))
 NO BRASIL
BR L
• 2002 - Nascimento da Penta
a partir de células adultas
((FCAV - UNESP))

2003- Nascimento da Bela da

USP a partir
ti dde célula
él l adulta
d lt
(FMVZ - USP)
 ETAPAS DA CLONAGEM
1) Enucleação do oócito (citoplasma receptor)

2) Transferência da célula doadora de núcleo

para o oócito enucleado (reconstrução)

3) Fusão da célula doadora com o citoplasma

(eletrofusão)
 ETAPAS DA CLONAGEM

4)) At
Ativação
vação

5) Cultivo dos embriões clonados

6) Transferência para receptoras

FONTE
F N E DE OÓCITOS

OVÁRIOS
Á DE MATADOURO
FONTE DE OÓCITOS

OVÁRIOS DE MATADOURO
 CITOPLASMA RECEPTOR
• Oócitos em MII enucleados com auxílio de
micromanipulador
 ENUCLEAÇÃO
POR ASPIRAÇÃO:
remoção de p
parte do
citoplasma
adjacente ao 1o CP
COLORAÇÃO HOECHST

CORANTE
DNA
ESPECÍFICO
QUE
FLUORESCE
QUANDO
EXPOSTO À
LUZ UV
ENUCLEAÇÃO CONVENCIONAL
 MÉTODO
É
ALTERNATIVO

Fenda
 RECONSTRUÇÃO
Ã
• Transferência do núcleo da célula doadora
para o citoplasma receptor (eletrofusão ou
microinjeção)

• Tipos celulares: embrionárias (blastômeros),

f t i e adultas
fetais d lt (fibroblasto,
(fib bl t cumulus,l etc.)
t )
CULTURA DE FIBROBLASTO

Após
p ± 15 dias
(confluência)
 CARÊNCIA
Ê DE SORO

Cultivo em meio
com 0,5% de soro
por 2 - 5 dias.
RECONSTRUÇÃO
RECONSTRUÇÃO
E N UÇ
 RECONSTRUÇÃO

Zona pelúcida
Fibroblasto em G0

Pipeta de
reconstrução
Pipeta de
contenção Espaço
p ç perivitelínico
p
RECONSTRUÇÃO
RECONSTRUÇÃO

Complexo citoplasma
receptor e núcleo
doador (CCN)

Contato entre membranas

ELETROFUSÃO
 ELETROFUSÃO
• CCNs
CCN em solução
l ã
eletrofusão (5 min)

• Posicionar CCNs
entre eletrodos
(contato das
membranas tem que
ser p
paralelo aos
eletrodos)
ELETRÔDOS
Eletrofusão
+

1 a 2 pulsos de 140V por 20 µs

ELETROFUSÃO
 ELETROFUSÃO

Visualização da fusão após 1 hora

 SUCESSO
E NA ELETROFUSÃO
E E Ã

• Tipo
p celular ((tamanho)
m ) e Contato entre
membranas ! ! !

• Câmara de eletrofusão

• Meio de fusão (Zimmermman, Manitol

0,28M)

• Resultados: 10 - 60%
 ATIVAÇÃO ARTIFICIAL
• R
Retomada
t d d
da meiose
i e i í i
início d
do
desenvolvimento embrionário
• ↑ [Ca] intracelular
• Métodos utilizados: físicos e/ou químicos
(estímulo elétrico,
elétrico álcool,
álcool cálcio,
cálcio estrôncio
etc)
• Melhores resultados com combinação de
estímulos
stímul s (físico
(físic e químico)
químic )
 CULTIVO EMBRIONÁRIO
• Embriões reconstruídos
são cultivados por 7 a 9
di em estufa
dias f CO2, 39oC
com alta umidade

•Condições
C ndi õ s idênti
idênticass às d
da
FIV ((meios q
quimicamente
definidos ou co-cultivo com
células
él l dad granulosa)
l )
 EFICIÊNCIA DA TÉCNICA
(60%)
100 OÓCITOS 60 OÓCITOS

(50%)
(40%)
12 FUNDIDOS 30 ENUCLEADOS

(30%)

3 - 4 BLASTOCISTOS
 DESENVOLVIMENTO PÓS
TRANSFERÊNCIA
Ê
• Técnica extremamente ineficiente

• Taxa p
prenhez até 90 dias: < 30%

• Taxa nascimentos < 3% (Westhusin et al.,

al 2001)

• Al
Alta mortalidade
lid d pós
ó parto: problemas
bl renais,
i
cardio-pulmonar, imunológico, síndrome da prole
gigante (“large offspring syndrome”)
 DESENVOLVIMENTO PÓS
TRANSFERÊNCIA
• P
Principais
i i i causas das
d baixas
b i t
taxas: f lh na
falha
expressão de genes (reprogramação
nuclear), placentação anormal, falha no
reconhecimento
h materno da gestação.
 Primeira gestação

Cesariana
i aos 290 dias.
di
Bezerro de 34 Kg.
14 meses
 Segunda gestação

A B

Fi
Figura A: Ú
Útero com hidroalantóide
hid l óid Figura B:
Fi B Feto
F t abortado
b t d aos 229 di
dias
de gestação.
 Terceira gestação

Figura: Feto aos 252 dias de

gestação.
Amostra de DNA ((Bezerro,, Receptoras,
p , Fetos e Células doadoras))
Análise de regiões microsatélites (11 marcadores) para determinação da identidade
genética

Bezerro (Marcolino) Feto 1 Feto 2

 QUESTÕES
Õ IMPORTANTES
•Idade biológica dos clones
E d dos
Estudo d telômeros
lô
Clone apresenta idade da célula doadora de núcleo?

•Os clones são idênticos?

Fenotipicamente não.
não
Mutações das células doadoras, herança mitocondrial,
influência dos ambientes in vitro e in vivo.
 CLONAGEM
HUMANA

Clonagem reprodutiva

Produção de indivíduos geneticamente idênticos

Clonagem terapêutica

Produção de embriões para obtenção de células

tronco (Stem cell - ES)
 O QUE SÃO CÉLULAS ES
(CÉLULAS TRONCO)?

São células de origem embrionária que

permanecem indiferenciadas em cultura
por tempo indeterminado. São
TOTIPOTENTES
TOTIPOTENTES, ou seja,
j podem
d se
diferenciar em qualquer tipo de tecido.
tecido
 IMPORTÂNCIA DAS
CÉLULAS TRONCO

Tratamento de doenças degenerativas

• Mal de Parkinson
• Alzheimer

Lesões medulares (traumas)

Lesões cardíacas (infarto)