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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS


DEPARTAMENTO DE CINCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS

QUANTIFICAO DE LEVEDURAS EM FERMENTO PARA


FABRICAO DE CERVEJA ARTESANAL

FABIO ALBINO SMANIA

FLORIANPOLIS - SC

2015
FABIO ALBINO SMANIA

QUANTIFICAO DE LEVEDURAS EM FERMENTO PARA


FABRICAO DE CERVEJA ARTESANAL

Trabalho de Concluso de Curso


apresentado ao Curso de Graduao
em Cincia e Tecnologia de Alimentos
da Universidade Federal de Santa
Catarina como requisito para obteno
do ttulo de Bacharel em Cincia e
Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Mrcio Jos Rossi

Florianpolis SC

2015
AGRADECIMENTOS

Agradeo a todos que contriburam para o desenvolvimento deste


trabalho de concluso de curso, em especial:
Aos meus pais, Artur e Elza, que me ajudaram em todos os sentidos e
sempre me apoiaram nos estudos e nas escolhas tomadas;
Ao Prof. Jos Fletes pelo auxlio nas anlises estatsticas;
A Dra. Gabriela Mller pela idealizao e toda a ajuda neste
trabalho;
Ao meu orientador Prof. Mrcio Jos Rossi;
Aos professores Clarice Logurcio Leite, Vetria Lopes de Oliveira,
Elza de Ftima Albino Smnia e Artur Smania Jr., pelas crticas
construtivas e sugestes que contriburam para a melhoria deste
trabalho;
Ao Prof. Pedro por ter consentido minha transferncia de Cincias
Contbeis para o nosso curso.
Ao Prof. Dr. Admir Jos Giachini por seu auxlio nas correes.

Dedico este trabalho a:


Meus pais, por toda a pacincia, carinho e compreenso, alm do
privilgio de estar com essas pessoas maravilhosas, amorosas e
dedicadas.
A Jacque, por ter estado sempre ao meu lado nos momentos alegres e
difceis desta jornada;
Aos professores Joel, Dorneles, Giordano, Edna, e Carmen, que por
demonstrao de capacidade intelectual me fascinaram;
As professoras Elane e Renata, que so um exemplo de mulheres
fortes e determinadas, pessoas que fazem o mundo girar dia aps dia
na construo, desenvolvimento e justia;
Aos professores Csar, Ernani e Pedro, que tem a habilidade de fazer
um contedo complexo se tornar simples e fcil. A curva de
aprendizado ser transformada em algo exponencial, onde cada
minuto da aula valia como uma hora.
Por fim gostaria de citar este poema, que foi diversas vezes atribudo
a uma menina com cncer terminal internada em um hospital em
Nova York.

Dana lenta
Alguma vez voc j viu
Crianas brincando de roda?
Ou ouviu o som da chuva
Batendo no cho?
J seguiu o voo errtico de uma borboleta?
Ou olhou para o sol dando lugar noite?
melhor desacelerar,
No dance to rpido.
O tempo curto
E a msica acaba.
Voc passa batido
Por cada dia?
Quando voc pergunta: como vai voc?
Ouve a resposta?
Quando acaba o dia,
Voc se deita em sua cama
Com a prxima centena de tarefas
Percorrendo sua cabea?
melhor desacelerar.
No dance to rpido.
O tempo curto,
E a msica acaba.
Alguma vez disse a seu filho,
Pode ser amanh?
E, na sua pressa,
Percebeu a tristeza em seu rosto?
J perdeu contato
E deixou morrer um amigo
Porque nunca teve tempo
De ligar e dizer "oi"?
melhor desacelerar.
No dance to rpido.
O tempo curto,
E a msica acaba.
Quando voc corre para chegar a algum lugar
Perde metade da graa em chegar l.
Quando se preocupa e atropela seu dia
como um presente que vai para o lixo sem ser aberto.
A vida no uma corrida
V devagar.
Oua a msica
Antes que ela acabe.

David L. Weatherford
RESUMO

Para conferir cerveja artesanal sabor e aroma agradveis ao paladar


do consumidor, necessrio empregar matrias-primas de boa
qualidade e controlar todas as etapas da sua fabricao. O objetivo
do presente trabalho foi estabelecer uma tcnica acessvel ao
cervejeiro artesanal, para padronizar a quantidade de levedura usada
no processo de fermentao da cerveja. O estudo foi desenvolvido
com os fermentos comerciais American Wheat, American Ale,
Belgian Stout, Safale S-04 e Safbrew WB-06. Os resultados
mostraram correlao entre o volume de sedimento e a contagem de
levedura em microscpio ptico. Os valores de R2 variaram de 0,775
a 0,988 e, os valores de r variaram de 0,880 a 0,994, quando os
fermentos foram analisados individualmente. Quando os resultados
obtidos com os cinco fermentos foram posicionados num mesmo
grfico, o valor de R2 foi de 0,746 e o de r foi de 0,863. Com o uso
da correlao resultante, atravs da equao da linha de ajuste dos
dados experimentais para cada fermento especfico, possvel
estimar a quantidade de levedura por mililitro de fermento. Dessa
forma, baseado no escopo desses experimentos, o cervejeiro
artesanal poder adicionar ao mosto um certo volume de fermento
equivalendo a uma quantidade pr-calculada de levedura para
propiciar a padronizao da fermentao e, consequentemente
agregar qualidade ao produto gerado.

Palavras-chave: Cerveja artesanal, levedura, fermento,


Saccharomyces cerevisiae.
ABSTRACT

Good quality of raw materials and control of every manufacturing


step are important conditions for flavor and pleasing aroma while
making craft beer. The aim of this study was to establish an
affordable procedure to standardize the amount of yeast (starter) used
during brewing. The study employed the industrial yeasts American
Wheat, American Ale, Belgian Stout, Safale S-04, and Safbrew WB-
06. The results showed significant correlations between the volume
of sediment and microscope yeast counts, with R2 values ranging
from 0.775 to 0.988, and r values from 0.880 to 0.994 when each
industrial yeast was analyzed separately. When the results obtained
with the five yeasts were plotted in the same graph, the R 2 value was
0.746 and r 0.863. With the resulting correlation, and by setting a
line equation of the experimental data for each specific yeast, it is
possible to estimate the amount of yeast per mL of brew. Based on
the experimental results, beer makers can add a certain amount of
starter to the brewing wort, which is equivalent to a precalculated
amount of yeasts, in order to standardize fermentation, and
consequently guarantee quality of the final product.

Keywords: Craft beer, yeast, ferment, Saccharomyces cerevisiae.


LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Detalhe de uma espiga de cevada .......................... 18


Figura 2 - Hidrlise do amido e correspondente teste do iodo
para verificar a completa converso........................................ 20
Figura 3 Flores de lpulo...................................................... 21
Figura 4 - Alfa-cidos constituintes do lpulo ....................... 22
Figura 5 Fotomicrografia de Saccharomyces cerevisiae ...... 24
Figura 6 Fermento cervejeiro em Becker antes da diluio . 36
Figura 7 Distribuio do fermento cervejeiro em tubos ....... 37
Figura 8 Diluio em srie do sedimento das clulas do
fermento cervejeiro .................................................................. 37
Figura 9- Contagem de leveduras em cmara de Neubauer .... 39
Figura 10 Correlao entre a quantidade de levedura e o
volume do sedimento para o fermento American Wheat...... 46
Figura 11 Correlao entre a quantidade de levedura e o
volume do sedimento para o fermento American Ale.......... 46
Figura 12 Correlao entre a quantidade de levedura e o
volume do sedimento para o fermento Belgian Stout........... 47
Figura 13 Correlao entre a quantidade de levedura e o
volume do sedimento para o fermento Safale S-04.............. 47
Figura 14 Correlao entre a quantidade de levedura e o
volume do sedimento para o fermento Safbrew WB-06....... 48
Figura 15 Representao grfica dos resultados obtidos
com todos os cinco fermentos usados no trabalho................... 48
LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Resultados obtidos com os experimentos sobre


a correlao entre o volume de fermento cervejeiro e o
nmero de leveduras por mililitro do sedimento ................. 42
SUMRIO

1. INTRODUO........................................................................13
2. OBJETIVOS.............................................................................15
2.1. Objetivo
geral......................................................................15
2.2. Objetivos especficos..........................................................15
3. REVISO DA LITERATURA................................................17
3.1. Insumos usados na fabricao de
cerveja............................17
3.1.1.Maltes e outros cereais................................................17
3.1.2.Lpulo ........................................................................20
3.1.3.gua............................................................................22
3.2. Produo de cerveja............................................................23
3.2.1.Leveduras para fermentao ......................................23
3.2.1.1.Influncia da levedura no sabor e aroma da
cerveja ........................................................ 25
3.2.2.Fermentao................................................................27
3.2.3.Pitiching rate..............................................................28
3.2.4. Microrganismos contaminantes ................................30
3.3. A cerveja no Brasil..............................................................31
3.4. Estatstica
preliminar ..........................................................33
4. MATERIAL E MTODOS.....................................................35
4.1. Equipamentos e materiais utilizados .................................35
4.2. Desenvolvimento do
experimento.......................................35
4.2.1. Leveduras...................................................................35
4.2.2. Preparo do sedimento de levedura ............................36
4.2.3 Diluio do sedimento celular ...................................37
4.2.4 Contagem de leveduras em cmara de Neubauer ......38
4.2.5 Correlao entre o volume de fermento e o nmero de
leveduras ...................................................................39
4.2.6 Anlise estatstica .......................................................39
5. RESULTADOS E DISCUSSO..............................................41
6. CONCLUSO...........................................................................49
7. REFERNCIAS .......................................................................51
APNDICE - Anlise de valores discrepantes..........................56
ANEXO A - Valores de T de Thompson ..................................64
ANEXO B - Valor absoluto mnimo para o coeficiente de
correlao linear r de Pearson ser significativo .........................66
13

1. INTRODUO

A cerveja uma bebida antiga e sempre associada a


confraternizaes, festas e descontrao. H indcios que a
fabricao de cerveja venha ocorrendo desde a antiguidade, ou seja,
desde antes da era crist, entre os anos 8000 e 6000 a.C. (LEGRAS
et al., 2007; MORADO, 2009, pp. 20-24). A hiptese do uso da
cerveja na antiguidade foi em parte confirmada quando alguns dos
registros esculpidos pelos sumrios foram decifrados, como o caso
do Monumento Blau datado de 4000 a.C., o qual mostra a cerveja
sendo oferecida deusa Nin-Harra (MORADO, 2009, p. 24). No
Brasil a cerveja foi introduzida, no incio do sculo XIX, pela famlia
real portuguesa (CERVESIA, 2015). A cerveja uma bebida obtida
atravs da fermentao do mosto, que tem como principal
ingrediente o malte de cevada. Entretanto diversos insumos podem
compor o mosto cervejeiro, seja para o processo de fermentao ou
para conferir sabor e aroma bebida (MAFRA DE CARVALHO;
BENTO; SILVA, 2006; MEGA; NEVES; ANDRADE, 2011).
A escolha dos alimentos pelo consumidor geralmente
influenciada por trs fatores principais: a aparncia, o sabor e o
aroma do produto. Embora o sabor e o aroma nem sempre sejam
possveis de conferir na hora da compra so, entretanto fatores
decisivos para a fidelizao do consumidor. Assim, essas
caractersticas so qualidades fundamentais para diversos alimentos,
como por exemplo, a cerveja. No Brasil, a cerveja mais produzida e
consumida a cerveja do tipo Pilsen, que tem sabor e aroma suaves
(ARAJO; SILVA; MININ, 2003).
Todas as matrias-primas utilizadas na indstria cervejeira
influenciam no sabor da cerveja, durante a sua fabricao. No
entanto, as principais matrias-primas que conferem sabores e
aromas tpicos ao produto o lpulo e a levedura, pela produo de
diversos metablitos especficos durante a fermentao da cerveja.
Esses compostos so formados em pequenas quantidades, mas com
grande impacto no sabor da cerveja. So subprodutos do
metabolismo da levedura, que podem ter influncia positiva ou
negativa no aroma e sabor das cervejas. A sntese desses
subprodutos, entre outros fatores, est relacionada com a estirpe de
14

levedura e a quantidade de levedura (pitching rate) que adicionada


no incio da fermentao (RODRIGUES, 2014). Por essa razo,
importante conhecer o nmero de leveduras contido em cada
mililitro de fermento e ento calcular qual volume do inculo dever
ser adicionado ao mosto. O volume a ser usado depende do tipo de
levedura (Ale ou Larger), da temperatura de fermentao e da
densidade do mosto (ERTEN; TANGULER; CAKIROZ, 2007;
VERBELEN et al., 2009). Dessa forma, o objetivo do presente
trabalho foi desenvolver um mtodo prtico de fcil execuo, de
maneira que o cervejeiro artesanal possa adicionar ao mosto certo
volume de fermento, correspondente a taxa de inculo de levedura
cervejeira que ir propiciar uma maior padronizao da fermentao
e, consequentemente, agregar qualidade ao produto gerado.
15

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Desenvolver um mtodo prtico para a quantificao do fermento a


ser usado na fabricao de cerveja artesanal.

2.2. Objetivos especficos

a) Estimar o nmero de leveduras por mililitro de fermento;

b) Correlacionar o volume de fermento em tubo Falcon com a


contagem de leveduras em cmara de Neubauer;

c) Apresentar uma frmula para estimar o volume adequado de


fermento correspondente taxa de inculo a ser utilizado na
fermentao do mosto.
16

3. REVISO DA LITERATURA

3.1. Insumos usados na fabricao de cerveja

A cerveja tradicional produzida a partir de ingredientes


provenientes da natureza, tais como a cevada e outros cereais, lpulo,
levedura e gua. Na cerveja artesanal normalmente so adicionadas
outras matrias primas para conferir outros sabores e aromas, como
frutas, xaropes, madeira e especiarias.

3.1.1. Maltes e outros cereais

O cereal bsico para a produo de cerveja a cevada


(Hordeum vulgare). Entretanto, outros cereais so rotineiramente
usados para esse fim, como o milho (Zea mays), o arroz (Oryza
spp.), o trigo (Triticum spp.) e a aveia (Avena spp.). A cevada um
cereal rico em amido, que posteriormente hidrolisado,
disponibilizando glicose, frutose, sacarose, maltose e maltotriose,
que sero utilizadas pelas leveduras no processo de fermentao
(ALMEIDA, 2014; RODRIGUES, 2014). A cevada uma planta da
famlia Poaceae (gramneas) (Figura 1) e nativa de climas
temperados. Na Amrica do Sul, a Argentina o maior produtor,
sendo que no Brasil, produzida em algumas partes do Rio Grande
do Sul. Aps a colheita, os gros de cevada so enviados para
maltearias, onde so submetidos germinao controlada. Esse
processo induz os vegetais a incrementar seu arsenal enzimtico,
principalmente das amilases. Essas enzimas so responsveis por
hidrolisar o amido em acares fermentescveis e permitir a
utilizao pelos microrganismos. Portanto, so fundamentais para o
processo de fabricao de cerveja.
O gro da cevada, utilizado na fabricao da cerveja, tem a sua
estrutura modificada durante o processo de maltagem, ou seja,
converso do cereal natural em malte. A composio do malte
responsvel pela cor da cerveja e tambm influencia no paladar. Os
gros secos em temperaturas mais baixas produzem maltes que
resultam em uma cerveja dourada, com caractersticas suave, leve e
doce. Aumentando a temperatura de secagem podem ser obtidos
maltes com coloraes mais intensas e sabor seco. O malte tipo
17

Pilsen tem cor clara e aroma de cereal, enquanto que o tipo Pale ale
um pouco mais escuro. O malte caramelo lembra acar queimado
e o chocolate confere a cerveja aromas de caramelo queimado,
chocolate amargo ou caf (MORADO, 2009, p. 112). O tipo de malte
utilizado na fabricao de cerveja influencia no seu visual, ou seja, a
cor est diretamente relacionada ao malte e tambm ao tipo de
cerveja. H duas medidas para aferir a cor da cerveja: a EBC
European Brewing Convention e a SRM Standard Reference
Method. De maneira geral, a escala europeia classifica como cerveja
clara a que tiver cor correspondente a menos de 20 unidades EBC, e
como cerveja escura a que tiver cor correspondente a 20 ou mais
unidades. Os valores da escala SRM correspondem a
aproximadamente 40% dos valores EBC (MORADO, 2009, pp. 148-
149).

Figura 1 Detalhe de uma espiga de cevada

Fonte: http://br.freepik.com/fotos-gratis/campo-de-cevada_20894.
htm. Acesso em Maio de 2015.

Como mencionado anteriormente, podem ser usados outros


cereais, distintos da cevada, na fabricao da cerveja. Esses so
usados como fonte suplementar de carboidratos e a finalidade
principal reduzir os custos do processo. Na maioria dos pases,
onde a cerveja uma das principais bebidas alcolicas, como na
18

Alemanha, na Blgica e na Repblica Tcheca, a incluso desses


adjuntos ao mosto controlada por legislao prpria e a
porcentagem permitida varivel para cada pas. Em nosso pas, a
quantidade mnima de malte de cevada exigida para a fabricao da
cerveja deve corresponder a pelo menos 55% em relao s fontes de
acares fermentveis (BRASIL, 2009).
A Lei Pureza (Reinheitsgbot) foi a referncia mais famosa
sobre a padronizao da cerveja e foi promulgada em 1516, a qual
estabelecia que os nicos ingredientes que poderiam compor a
cerveja seriam a gua, a cevada e o lpulo. At aquele momento
ainda no tinha sido atribudo levedura o processo de fermentao
da cerveja, por isso essa no tinha sido includa na legislao. Essa
lei era a garantia de que as cervejas alems seriam de alta qualidade,
excluindo do rol das cervejas as bebidas que usavam na sua
fabricao o trigo, o arroz, o milho, alm de adjuntos como o acar
e frutas. Logo que promulgada, essa lei era restrita a Baviera,
entretanto em 1906 a normativa se estendeu por toda a Alemanha.
No final do sculo XX, devido a competitividade com o mercado
externo, os cervejeiros alemes tiveram que abdicar dessas diretrizes
e passaram a permitir o uso de diferentes matrias primas na
fabricao da cerveja. O intuito dessa mudana era baratear o
produto, alm de atender a exigncia de alguns consumidores que
eram adeptos de outros estilos de cerveja. Entretanto, ainda hoje
algumas cervejarias alems costumam indicar nos rtulos de suas
cervejas a alta qualidade do produto, mencionando que o mesmo foi
fabricado segundo as determinaes da antiga Lei da Pureza
(MORADO, 2009, pp. 41-42).
Para a transformao do amido do malte em dextrinas e
acares simples fundamental a presena de enzimas. As principais
enzimas provenientes do malte so a fitase, que quebra a fitina em
fitato. As proteases, que transformam protenas de alto peso
molecular em aminocidos essenciais para a multiplicao das
leveduras. As amilases (beta e alfa) que so enzimas diastsicas,
quebram o amido (Figura 2), sendo a beta-amilase pela extremidade
das ramificaes (em acares menores que so fermentveis), e a
alfa-amilase quebra o amido pelo centro, gerando acares de peso
molecular distintos, que algumas vezes no so fermentescveis.
19

Figura 2. Hidrlise do amido e correspondente teste do iodo para


verificar a completa converso.

Fonte: http://www.hominilupulo.com.br/wp-content/uploads/20
-11/12/Iodine_test.jpg

3.1.2. Lpulo

O lpulo uma planta da famlia das Cannabaceae (Figura 3),


e a parte utilizada para a fabricao de cerveja so suas flores
oriundas de plantas fmeas, uma vez que contm maior quantidade
de lupulina, que uma substncia amarga que confere o sabor tpico
cerveja. O lpulo pode ser utilizado com duas finalidades: amargor
e aroma. Para conferir amargor o lpulo adicionado no incio da
fervura e para conferir aroma nos minutos finais da mesma, onde so
extrados os leos essenciais que permanecem na bebida gerando
20

diferentes aromas, com ctrico, terrosa, de frutas, entre outros


(MORADO, 2009, pp. 116-118). Dependendo do estilo da cerveja,
que est sendo produzida escolhida uma ou mais variedades de
lpulo e esse adicionado em porcentagens distintas, para aproximar
o mximo possvel cerveja que est sendo produzida com o sabor
previamente estabelecido nos manuais (MORADO, 2009, pp. 116-
118). A maior parte do lpulo utilizado pelos cervejeiros brasileiros
oriunda da Alemanha, Estados Unidos e Repblica Checa.

Figura 3 Flores de lpulo

Fonte: http://pixabay.com/pt/l%C3%BApulo-planta-humulus-59996/
Acesso em Maio de 2015.

Os alfa-cidos so encontrados na resina das plantas fmeas de


lpulo, nas glndulas das flores e so os compostos que que iro
gerar amargor na cerveja. Para tal, os alfa cidos devem
ser isomerizados para formar iso-alfa-cidos atravs da fervura do
mosto. Iso-alfa-cidos so solveis em gua, diferente do seu outro
ismero. Iso-alfa-cidos tm poder bacteriosttico sobre
diversas bactria Gram-positivas, como dos gneros de Lactobacilus
e Pediococcus (Langezaal et al., 1992).
Nos lpulos as partes responsveis por amargor so os alfa-
cidos humuleno, cohumuleno e adhumuleno, que so os principais
constituintes (Figura 4). O percentual de adhumuleno o mais
constante, compondo de 10 a 15% do total. Os valores de humuleno
21

e cohumuleno no possuem constncia, sendo de 20 a 70%,


dependendo da variedade do lpulo.

Figura 4. Alfa-cidos constituintes do lpulo

Fonte: Chemistry and Analysis of Hop and Beer Bitter Acids, pg. 33, vol.
27.

3.1.3. gua

A gua um constituinte importantssimo na qualidade final


da cerveja produzida, uma vez que corresponde pelo menos a 90%
do seu volume. Uma boa gua fundamental para se obter uma boa
cerveja. Assim, cidades que dispe de gua de alta qualidade tornam-
se beros e incubadoras de cervejarias. Em Pilsen, na Repblica
Tcheca, a gua famosa por ser leve e produzir cervejas delicadas e
refrescantes. J em Munique, a composio mineralizada da gua
permitiu criar cervejas lagers mais densas. Na Inglaterra, gua rica
em sulfatos favorece a produo de cervejas amargas. Os sais
minerais presentes na gua podero conferir diferentes sabores a
cerveja, como amargo, salgado ou neutro. Alm desses fatores, o pH
adequado da gua, auxilia no desenvolvimento das leveduras,
importante para a hidrolise enzimtica de carboidratos presentes no
mosto, alm de estar relacionado com a extrao de algumas
substncias a partir da matria prima usada na fabricao de cerveja
(MORADO, 2009, p. 115).
22

3.2. Produo de cerveja

O processo da produo de cerveja comea com a adio de


gua ao malte e adjuntos j modos. O teor de pureza da gua, bem
como a presena de certos minerais na mesma importante para a
boa qualidade da cerveja. Essa mistura ento cozida e, durante o
processo, o amido do malte hidrolisado em acares, resultando
num lquido turvo e grosso, denominado de mosto. So removidos os
slidos do mosto e, aps iniciar a fervura so adicionados os lpulos
de amargor e, no final da fervura, os lpulos responsveis pelos
sabores e aromas da cerveja (MEGA; NEVES; ANDRADE, 2011).
Outros adjuntos, como especiarias, so adicionados segundo as
caractersticas do produto desejado. Alm dos fatores j mencionados
acima, a qualidade da cerveja produzida, bem como a preservao de
suas caractersticas organolpticas, ainda depender da temperatura
de fermentao e de maturao e, das condies de armazenamento
do produto (MORADO, 2009, pp. 124-141).

3.2.1. Leveduras para fermentao

O principal microrganismo utilizado na fermentao de mosto


para a produo de cerveja a levedura Saccharomyces cerevisiae
(Figura 5) (LEGRAS et al., 2007), o qual um fungo pertencente ao
Filo Ascomycota, Ordem Saccharomycetales e famlia
Saccharomycetaceae (CARLILE; WATKINSON; GOODAY, 2001,
pp. 554-555).
Na indstria cervejeira, algumas estirpes de Saccharomyces
tm sido designadas como S. pastorianus e esto relacionadas com a
produo de cerveja do tipo Larger, ou seja, cerveja cuja
temperatura tima de fermentao varia entre 8 e 15 C, e essas so
consideradas cervejas de baixa fermentao. J as estirpes que
fermentam o mosto preferencialmente em temperaturas entre 15 e 25
C so consideradas propriamente estirpes de S. cerevisiae, e as
cervejas resultantes so consideradas de alta fermentao, ou seja,
cervejas tipo Ale (WHITE e ZAINASHEFF, 2010). Numa reviso
publicada por Wendland (2014) discutida a evoluo das estirpes
de Saccharomyces que realizam fermentao do tipo Lager e a
23

distribuio dessas entre as espcies S. carlsbergensis e S.


pastorianus, com base em caractersticas genotpicas e de
fermentao. Entretanto, segundo Carlile, Watkinson e Gooday,
(2001, pp. 487-488), estudos taxonmicos enquadram todas as
leveduras cervejeiras como da espcie S. cerevisiae.

Figura 5 Fotomicrografia de Saccharomyces cerevisiae

Fonte:https://www.google.it/search?
q=figura+de+saccharomyces+cerevisiae+gratis&espv=2&biw=1366&bih=6
67&tbm=isch&imgil.
Acesso em Maio de 2015.

Durante o crescimento vegetativo, S. cerevisiae pode assumir


duas formas morfologicamente distintas, denominadas de formas
leveduriforme e filamentosa. A alternncia entre essas formas
depende das condies nutricionais e ambientais (EDGINGTON et
al., 1999; SILVA et al., 2007). Essas leveduras apresentam em sua
parede celular uma famlia de protenas denominada de protenas
Flo, as quais esto relacionadas com fenmenos como floculao,
aderncia a substratos, formao de biofilmes e crescimento
filamentoso (BESTER; JACOBSON; BAUER, 2012). O controle da
sntese dessas protenas na superfcie das leveduras de grande
importncia para os processos fermentativos industriais, uma vez que
durante a fermentao desejvel que alta concentrao de leveduras
fique em suspenso e, ao final do processo floculem e sedimentem
para serem facilmente removidas. A sedimentao natural com
consequente clareamento do produto final, sem o uso de outros
processos onerosos, uma condio almejada pela indstria
(GOVENDER et al., 2008).
24

3.2.1.1. Influncia da levedura no aroma e sabor da cerveja

A procedncia e caractersticas da levedura cervejeira


dependero das caractersticas da cerveja a ser produzida, da
liberdade de trabalho do mestre cervejeiro e das condies de
trabalho da cervejaria. Esses organismos podem ser adquiridos junto
a colees de cultura, obtidos da natureza ou ainda constituem
estirpes manipuladas geneticamente por profissionais vinculados a
uma dada cervejaria (WHITE e ZAINASHEFF, 2010, pp. 41-44).
A levedura a parte mais importante da fermentao. Alm de
converter acar em etanol e dixido de carbono, ainda sintetiza uma
srie de substncias que influenciam no sabor e aroma da cerveja
(CARLILE; WATKINSON; GOODAY, 2001, pp. 487-488). Essas
caractersticas organolpticas esto associadas aos produtos gerados
pelo metabolismo da levedura durante a fermentao. O principal
acar fermentescvel que compe o mosto cervejeiro a maltose,
seguido de pequenas quantidades de glicose e maltotriose. A
levedura utiliza inicialmente a glicose, pela facilidade de absoro,
uma vez que este carboidrato entra na clula por difuso facilitada.
Todas as leveduras cervejeiras podem utilizar a glicose e a maltose,
mas nem todas utilizam a maltotriose (WHITE e ZAINASHEFF,
2010, pp. 22-23). A utilizao dos acares est primariamente
relacionada com o crescimento celular e manuteno da espcie e,
como consequncia do crescimento microbiano h o enriquecimento
do mosto com os compostos formados durante o metabolismo, alm
da liberao de fraes celulares originrias da lise da levedura. A
sntese e liberao dos subprodutos da fermentao podem estar
relacionadas com tempo e a temperatura de fermentao, a estirpe e
quantidade de levedura (BRIGGS et al., 2004, p. 470; RODRIGUES,
2014).
O etanol o produto mais importante derivado da fermentao
de aucares. Em concentraes baixas ele favorece o sabor e
intensifica certos aromas, enquanto que em quantidades excessivas
25

prejudica a percepo de todas as caractersticas organolpticas da


cerveja (MORADO, 2009, p. 155; WHITE e ZAINASHEFF, 2010,
p.266.
Os steres apresentam um papel importante na caracterstica
das cervejas, principalmente no tipo Ale. Essas molculas resultam
da reao entre cidos orgnicos e alcois e confere a cerveja um
aroma frutado. Os steres mais comuns encontrados nas cervejas so
o acetato de etila (gosto de solvente), caproato de etila (lembra
ma), acetato isoamlico (sabor de banana) (BRIGGS et al., 2004, p.
477; WHITE e ZAINASHEFF, 2010, p. 266).
Uma cerveja pode apresentar mais de 40 diferentes tipos de
alcois superiores, sendo os mais encontrados o n-propanol, lcool
isoamlico e isobutanol. Esses alcois apresentam sabor semelhante
ao do etanol, embora, dependendo da concentrao, podem
apresentar sabor de solvente (BRIGGS et al., 2004, p. 475; WHITE e
ZAINASHEFF, 2010, p. 266).
O diacetil confere a cerveja aroma e sabor amanteigado.
permitido, em baixas concentraes, em alguns estilos de cerveja e
agrada ao paladar de muitos consumidores. Entretanto, muitos
cervejeiros consideram o diacetil como uma falha na produo da
cerveja, independente da concentrao que esteja presente (WHITE e
ZAINASHEFF, 2010, p. 268).
Durante a fermentao so formados vrios cidos orgnicos,
tais como actico, lctico, butrico e caprico. Esses compostos
apresentam aroma e sabor de vinagre e ou vmito, entretanto so
importantes para a formao dos steres (BRIGGS et al., 2004, pp.
471). As leveduras produzem tambm grandes quantidades de
compostos sulfricos durante a fermentao. Felizmente esses
compostos so volteis e acabam sendo liberados juntamente com o
CO2. Os principais compostos dessa classe encontrados na cerveja
so sulfeto de dimetila, dixido de enxofre e sulfato de hidrognio.
Esses compostos podem emprestar para a cerveja um sabor de
fsforo queimado, porm, alguns desses conferem a cerveja
propriedades antioxidantes como o sulfeto de dimetila (BRIGGS et
al., 2004, p. 478).
Os principais compostos fenlicos sintetizados por leveduras
o 4-vinil-guaiacol, o qual confere a cerveja um aroma de plstico e
tambm de antissptico (WHITE e ZAINASHEFF, 2010).
26

Quando ocorre a autlise de grande nmero de leveduras, a


cerveja poder apresentar aroma e sabor de fermento biolgico.
Alguns fatores podem contribuir para a lise celular, entre esses a
supresso de nutrientes (como a deficincia de aminocidos),
elevadas temperaturas, desidratao da levedura e altas
concentraes de etanol (BRIGGS et al., 2004, pp. 4469, 470, 492;
WHITE e ZAINASHEFF, 2010, p. 280-281). Alm desses fatores,
uma varivel que contribui grandemente para esse fenmeno o
excesso de leveduras usadas na carbonatao da cerveja, ou seja,
uma concentrao de leveduras superior a 10 6 clulas/mL presente na
refermentao (WHITE e ZAINASHEFF, 2010, p. 271).
Imediatamente aps a lise celular, ocorre a liberao de compostos
intracelulares para o meio, acompanhado da perda da integridade da
membrana celular e hidrolise de algumas estruturas da parede celular
da levedura, as quais permanecem no produto, conferindo a este
aroma e sabor de fermento (ARAJO; SILVA; MININ, 2003;
BRIGGS et al., 2004, p. 499).

3.2.2. Fermentao

A fermentao da cerveja consiste basicamente na


transformao, pela levedura, do acar em dixido de carbono e
etanol. Muitos outros compostos tambm so formados em pequenas
quantidades nessa etapa, como subprodutos do metabolismo da
levedura, mas de grande importncia no sabor da cerveja
(MORADO, 2009, pp. 134-135; RODRIGUES, 2014).
Para a elaborao de uma cerveja de boa qualidade, vrios
aspectos devem ser observados dentro da fase fermentativa, tais
como: a seleo do microrganismo, a quantidade e estado fisiolgico
do inculo, a cintica fermentativa, a ausncia de contaminantes, a
temperatura e a relao do volume de mosto versus quantidade de
levedura (Pitching rate), entre outros. Assim para cada estilo de
cerveja deve ser selecionado o microrganismo que poder conferir a
esta sabor e aroma caractersticos ao produto final. Embora todas as
estirpes de S. cerevisiae faam basicamente o mesmo trabalho de
transformar carboidratos em etanol e gs carbnico, o sabor do
27

produto obtido difere de uma estirpe para outra, em funo de


pequenas diferenas bioqumicas de metabolismo e consequente
formao de substncias capazes de conferir aroma e sabor, mesmo
estando presentes em quantidades muito pequenas (MAFRA de
CARVALHO; BENTO; SILVA, 2006). importante ainda salientar
que cada estirpe de levedura cervejeira, utilizada na fermentao
pode diferenciar-se de outras estirpes usadas para o mesmo fim, em
funo de possveis alteraes genotpicas e fenotpicas,
proporcionadas pelos inmeros repiques que so realizados com as
mesmas. Legras et al. (2007) estudaram 651 isolados S. cerevisiae,
oriundos de 56 diferentes reas geogrficas, atravs da genotipagem,
e observaram que esses isolados podiam ser divididos em subgrupos
distintos, como levedura do po, da cerveja, do vinho e do saqu.
Nesse estudo, tambm foi observado que as leveduras do po
exibiram uma alta porcentagem de combinaes de alelos
intermedirios com as leveduras de cerveja e de vinho. Alm disso,
os autores tambm demonstraram que existia similaridade gentica
entre as leveduras de uma mesma regio geogrfica, quando
comparadas com regies distintas, sugerindo que poderia estar
acontecendo a domesticao das mesmas, em virtude dos inmeros
subcultivos em condies ambientais e de manipulao semelhantes.

3.2.3. Pitching rate

Pitching rate (PR) refere-se, basicamente, quantidade de


levedura que adicionada no mosto e geralmente expresso em
clulas por mililitros do mesmo. Para que uma fermentao tenha um
bom desenvolvimento e seja reprodutvel, necessrio o uso de um
PR adequado. A quantidade de levedura a ser usada varia de acordo
com a densidade do mosto e o tipo da levedura (Ale ou Larger).
Como na fabricao da cerveja a fermentao uma das etapas mais
demoradas, um dos objetivos das cervejarias reduzir esse tempo.
Uma das possibilidades sugeridas por Branyik et al. (2005) foi o uso
de leveduras imobilizadas, entretanto essa metodologia resultou em
problemas de engenharia e no perfil dos metablitos derivados da
fermentao. Outra alternativa que vem sendo usada com essa
finalidade, e com algum sucesso, o aumento da quantidade de
28

levedura usada na fermentao, isto , um aumento do PR alm do


considerado timo. Tem sido constatado que um inculo mais
concentrado de leveduras resulta numa fermentao mais rpida.
Alm disso, o aumento do PR pode conferir ao processo algumas
consequncias benficas e outras indesejveis com relao ao perfil
de metablitos finais da fermentao. Erten, Tanguler e Cakevoz
(2007) monitoraram a evoluo da fermentao pela aferio da
concentrao de acares no mosto e contagem de leveduras. Os
autores observaram que com o uso de um PR elevado a fermentao
ocorreu em menor espao de tempo. Com relao aos metablitos
oriundos do metabolismo dos nutrientes presentes no mosto,
encontraram baixas concentraes de 2-metil-1-butanol (lcool amil
ativo) e 3-metil-1-butanol (alccol isoamilico) e altas concentraes
de 2-metil-1-propanol (isobutanol). Com o uso de valor de PR abaixo
do normalmente usado, foram observadas altas concentraes de
diacetil e 2,3-pentanodiona, e no houve alteraes nas
concentraes de steres, com exceo do acetato isoamlico, cuja
concentrao declinou com o aumento do PR. A quantidade de
leveduras a ser usada ainda dependente da densidade inicial (OG,
de original gravity) do mosto, alm da temperatura de fermentao.
Para leveduras Ale se utiliza o valor de 0,75 milhes de clulas por
mililitro de mosto e para leveduras Larger se utiliza o dobro do
nmero de clulas, ou seja, 1,5 milhes de clulas por mililitro
(ERTEN; TANGULER; CAKIROZ, 2007; RODRIGUES, 2014;
VERBELEN et al., 2009).
O teor alcolico final da cerveja est relacionado com o valor
de OG e pela diferena entre o OG e a densidade ao final da
fermentao. A OG medida antes da adio de levedura ao mosto e
a densidade final, no final do processo fermentativo. Ainda nesse
sentido, estudos realizados por Verbelen et al. (2009) mostraram que
a fermentao iniciada com um PR elevado proporciona um
crescimento celular mais lento, embora o processo fermentativo seja
mais rpido. Observaram ainda ausncia de diferenas significativas
com relao vitalidade e viabilidade das clulas e, que a sntese de
cidos graxos insaturados, que ocorre na fase lag, foi reprimida.
Houve ainda indicao de que as clulas sofreram moderado
estresse, devido superpopulao, que foi evidenciada pela
expresso dos genes HSP104 e HSP12, que codificam protenas de
29

defesa ao estresse, conhecidas como protenas de choque trmico,


podendo levar essa populao de leveduras a excreo de
componentes celulares importantes como aminocidos e protenas,
no caso a proteinase A podendo causar autlise das leveduras.

- Clculo da estimativa de levedura no fermento: A estimativa do


nmero de microrganismos em um determinado material pode ser
realizada com o uso de diferentes metodologias, como contagem
microscpica, citometria de fluxo, densidade ptica em
espectrofotmetro, contagem em placas, entre outras tcnicas
(BRIGGS et al., 2004, pp. 486-489; DE ANGELIS e VALSECHI,
2008; FARTHING; RODRIGUEZ; THORNTON, 2007;
LOURENO, 2009). Entretanto, a contagem de leveduras em
microscpio ptico ainda uma metodologia universalmente usada,
por ser de fcil execuo, confivel e baixo custo, alm de permitir
observar possveis alteraes morfolgicas nas clulas e
contaminantes (BRIGGS et al., 2004, pp. 486, 518). Caso o objetivo
seja analisar a viabilidade das leveduras, ou seja, a porcentagem de
clulas vivas, um dos mtodos mais usados a contagem de colnias
na superfcie de meio slido. Entretanto, para determinar a vitalidade
celular, ou seja, o estado fisiolgico da clula, os mtodos
geralmente envolvem estudos relacionados com o contedo de ATP
celular, potencial da membrana mitocondrial e atividade enzimtica
(TREVORS et al, 1983; KWOLEK-MIREK; ZADRAG-TECZA,
2014).

3.2.4. Microrganismos contaminantes

A cerveja uma bebida que apresenta condies desfavorveis


para a multiplicao de microrganismos contaminantes, sendo
reconhecida como um produto de considervel estabilidade
microbiolgica. Porm, alguns gneros de microrganismos, incluindo
bactrias Gram-positivas (Lactobacillus e Pediococcus), Gram-
negativas (Pectinatus e Megasphaera) e leveduras selvagens
(Saccharomyces e no-Saccharomyces) podem se multiplicar nessa
bebida, conferindo caractersticas indesejveis, tais como turbidez e
mudanas sensoriais, que prejudicam a qualidade do produto final.
30

(DRAGONE et al., 2007). Para evitar a contaminao por


microrganismos indesejveis recomendado que em todas as etapas
da fabricao de cerveja sejam adotadas tcnicas de assepsia, como o
uso de mscaras, luvas, desinfeco dos utenslios e aparelhos que
entraro em contato com o produto principalmente aps a fervura do
mosto, incluindo a fermentao e o envasamento do mesmo
(BRIGGS et al., 2004, pp. 650, 655).

3.3. A cerveja no Brasil

A revoluo cervejeira no Novo Mundo surgiu em seguida


quela do vinho. A diferena primordial, que diferenciaria a
expanso do consumo do vinho com relao ao da cerveja, seria que
a matria prima do vinho, as uvas, necessitam de um terroir
(conjunto de fatores especficos de terreno que proporcionam
caractersticas singulares) mais restritivo, enquanto a cevada um
gro mais robusto e resiste a diferentes terroir situados pelo planeta.
Desta forma, a cerveja constitui um produto mais barato e pode ter
seu uso amplamente difundido (JACKSON, 2010, pp. 12-13). No
Brasil, durante muitos anos, a produo de cerveja ficou restrita a
poucas fbricas e, a cerveja produzida era predominantemente tipo
Pilsen. Entretanto, atualmente microcervejarias comearam a ser
estabelecidas. Essas novas microempresas, devido s limitaes
oramentrias, necessitam de intermedirios para a aquisio de seus
insumos, inclusive a compra da levedura usada na fermentao. Essa
prtica de comrcio acaba encarecendo o produto e refletindo num
maior custo ao consumidor (ARAJO; SILVA; MININ, 2003).
No Brasil, a cerveja foi introduzida, de fato, pela Famlia Real
portuguesa no incio da dcada de 1.800. Entretanto, essa bebida, j
havia circulado em nosso territrio, por curto perodo de tempo, nos
anos 1654. A partir de 1.830 surgiram as primeiras cervejarias
artesanais nacionais, entretanto a produo da bebida era restrita
devido as dificuldades de importao da cevada e lpulo e do
processo de refrigerao. Entre as cervejarias fundadas nessa poca
podem ser citadas a Cervejaria Brasileira (RJ), Henrique
Schoenbourg (SP), George Heinrich Ritter (RS), Gabriel Albrecht
Schmalz (SC). Em 1.888 foram fundadas as cervejarias que depois se
tornaram expoentes nacionais Cia. Cervejaria Brahma e a Cia.
31

Antarctica Paulista. Em 1966 foi fundada a Cerpa, em 1967 a Skol e


em 1980 a Cervejaria Kaiser. Em 1999 ocorreu a fuso entre as
Cervejarias Antarctica e Brahma, dando origem a AmBev, que
posteriormente se juntou a belga Interbrew, dando origem a maior
produtora mundial de cerveja a InBev (MORADO, 2009, pp. 56-
57).
O perfil sensorial da cerveja no Brasil o de uma cerveja mais
leve e mais refrescante, menos encorpada, menos amarga e com
menor teor alcolico. Produtos com essas caractersticas vm sendo
distribudos pelas principais cervejarias no Brasil e, refletem uma
combinao entre o perfil da cerveja europeia e o da americana. A
tendncia que esse padro de cerveja seja preservado, uma vez
que esse produto representa 94% das vendas nacionais. Ainda dentro
desse perfil podemos encontrar as cervejas denominadas Standard e
Premium. A opo de consumo por um dos estilos est relacionada
renda per capita do pblico alvo. Geralmente, cervejas Premium so
mais consumidas nas regies Sul e Sudeste (MEGA; NEVES;
ANDRADE, 2011). O Brasil o terceiro pais que mais consome
cerveja no mundo (12,2 bilhes de litros) e o dcimo stimo quando
analisado o consumo per capita. Esse montante est muito abaixo
dos principais pases consumidores, como por exemplo, um consumo
de 82 litros inferior ao praticado na Repblica Tcheca, que o
primeiro pas em consumo. O baixo consumo per capita o ponto
crucial para despertar nos cervejeiros a pretenso por um espao
maior no mercado produtivo (DRAGONE et al., 2007; SEBRAE,
2014). Ultimamente tm surgido em vrios pases do mundo e,
tambm no Brasil, um movimento cervejeiro que almeja uma bebida
mais encorpada, intensa e com propriedades organolpticas
associadas (MEGA; NEVES; ANDRADE, 2011). A congruncia
dessas informaes vem estimulando a montagem de
microcervejarias, que tm como proposta uma cerveja mais
elaborada, mais encorpada, de sabores e aromas que atraem o
consumidor. Atualmente no Brasil existem cerca de 200
microcervejarias investindo nessa inovao, as quais representam
apenas 0,15% do mercado total de cervejas, com perspectivas de
alcanar 2% do mercado total nos prximos 10 anos (SEBRAE,
2014).
32

De acordo com o que foi apresentado acima e segundo


Sanderson, Oriente e Boldo (2010), a qualidade da cerveja produzida
reflexo da somatria de todas as etapas do processo produtivo.
Consequentemente, quando se controlam as etapas do processo, o
produto resultante dele tambm estar controlado. Assim para a
produo de uma cerveja de excelncia alm do uso de insumos de
boa procedncia se deve aferir, com instrumentos, o efetivo
desenvolvimento do processo. Nas grandes cervejarias, a automao
permite o controle de todas as etapas da produo da cerveja.
Entretanto, nas microcervejarias normalmente o controle manual,
em funo dos custos de equipamentos sofisticados e da
caracterstica da cerveja artesanal, onde o mestre cervejeiro tem
maior poder e liberdade para interferir no aroma e paladar do produto
final, a cerveja. Nesse sentido, no presente trabalho foi proposta uma
metodologia de fcil execuo e que no requisita o uso de
equipamentos especficos, para quantificao de leveduras usadas na
fermentao da cerveja. Assim, ser possvel o desenvolvimento de
uma fermentao reprodutvel e que mantenha as caractersticas
organolpticas esperadas para o tipo de cerveja produzido.

3.4. Estatstica preliminar

A estatstica, quando utilizada de forma adequada, uma


ferramenta importante para avaliar se os dados de um estudo
cientifico guardam semelhana na distribuio de seus escores. Em
algumas situaes importante estabelecer se h correlao entre os
pontos referentes s variveis X e Y, os quais podem estar
apresentados num diagrama de disperso que um grfico em que
cada um dos eixos corresponde as variveis correlacionadas, sendo
que na correlao linear o grfico aproxima-se de uma reta
(CORREA, 2003, p. 106). Para poder explorar a correlao entre as
variveis importante obter a equao da reta para que se possa
interpolar e extrapolar valores (BARBETTA; REIS; BORNI, 2004,
p. 326; CORREA, 2003, p. 112).

Equao da reta: y1 = + x1 + 1
33

O nvel de intensidade que ocorre na correlao entre as


variveis pode ser indicado pelo coeficiente de correlao linear e,
uma das opes usar o modelo desenvolvido por Pearson e que
recebe o nome de coeficiente de correlao linear de Pearson (r), o
qual mede o grau de ajustamento dos valores em torno da reta e, que
pode ser determinado com o uso da equao a seguir (CORREA,
2003, p. 109).

Usando a equao de Pearson para um conjunto de dados


qualquer, o valor de r calculado se incluir no intervalo de 1 a -1.
Sendo positivo quando a correlao for positiva e negativo quando a
correlao for negativa. Quanto mais forte a correlao for, mais
prximo de 1 ou -1 ser o valor de r. Quando no houver correlao,
r ser prximo de 0 (BARBETTA; REIS; BORNI, 2004, pp. 319 e
320). Aps ser calculado o valor de r importante confirmar se o
mesmo representa uma variabilidade entre as variveis ou correlao
entre as mesmas. Para isso, aplica-se um teste estatstico para
verificar duas hipteses. A primeira (Ho) que considera que as
variveis X e Y no so correlacionadas e a segunda (H 1) que aceita
que as variveis X e Y so correlacionadas. Para isso poder ser
calculado o valor de p (equao a seguir). Se o valor p calculado
(usando como distribuio de referncia o t de Student com gl = n-2)
for menor ou igual ao nvel de significncia estabelecido, pode-se
concluir que h uma correlao linear entre as variveis. Caso
contrrio, no h evidncia suficiente para apoiar a concluso de uma
correlao linear. A tabela 10, do Apndice, apresenta uma forma
mais rpida para se obter esse valor, onde para cada n corresponde
um valor absoluto mnimo de r para rejeitar Ho (BARBETTA; REIS;
BORNI, 2004, p. 322).
34

A correlao linear uma correlao entre duas variveis e


muitas vezes podem ser encontrados pontos discrepantes entre os
dados obtidos (ANBARASI et al., 2011). Os pontos discrepantes so
mais bem visualizados nos grficos de resduos. Esses pontos podem
representar um comportamento atpico e no um erro aleatrio.
Dessa forma, o grfico ser deslocado erroneamente em relao a
esse ponto gerando um resultado menos preciso. Por tal motivo
aceitvel a retirada desse ponto para uma maior validade no modelo
estatstico apresentado (BARBETTA; REIS; BORNI, 2004, p. 340).
35

3. MATERIAL E METODOS

4.1. Equipamentos e materiais utilizados

Foi utilizado um microscpio ptico marca Olympus modelo


CBA, um agitador magntico marca FANEM modelo 258 e um
refrigerador convencional. Como diluentes foi utilizado uma soluo
de cido sulfrico a 5% (v/v) em gua destilada. Tambm foram
utilizadas vidrarias e outros materiais como bales volumtricos com
capacidade para 500 mL, pipetas graduadas, basto de vidro,
pipetadores de 1 e 20 mL, ponteiras, cmara de Neubauer, barras
magnticas, frascos tipo Becker com capacidade para 50 e 500 mL,
pisseta plstica, tubos tipo Falcon, tubos de ensaio, estantes e
esptulas. Sempre que pertinente, foram adotadas tcnicas asspticas
como a esterilizao e a desinfeco para evitar a contaminao do
fermento e do mosto fermentado.

4.2. Desenvolvimento do experimento

4.2.1. Leveduras

No presente experimento foram utilizados cinco fermentos


diferentes de Saccharomyces cerevisiae, usados na produo de
cerveja artesanal: American Ale TM (Wyeast Laboratories), American
WheatTM (Wyeast Laboratories), Belgian Stout TM (Wyeast
Laboratories), Safale S-04 (Fermentis) e Safbrew WB-06
(Fermentis).
Na anlise foi usada a biomassa de levedura que foi recolhida
aps o processo fermentativo e foi fornecida por cervejeiros
artesanais. Essa biomassa tambm denominada de lama densa ou
levedo. Foi coletada a parte intermediaria do sedimento, uma vez
que nessa frao encontra-se uma menor quantidade de trub
(protenas aglutinadas durante a fervura) e lpulo, alm das
leveduras apresentarem melhor vitalidade (BRIGGS et al., 2004, pp.
500-505; RODRIGUES, 2014). A recuperao da biomassa ocorreu
aps diferentes perodos de fermentao, dependendo do tipo de
36

cerveja e de fermento industrial usado no processo (entre 6 e 14


dias). Doravante, essa biomassa ser denominada de fermento.
Assim, aps a coleta, os fermentos foram mantidos sob-refrigerao
at o momento do uso.

4.2.2 Preparo do sedimento de levedura

Para cada experimento foram usados 150 mL de fermento,


sendo recolhido do fermentador aps o trmino da fermentao. O
fermento foi deixado em repouso, por aproximadamente 8 horas,
para sedimentao das clulas e o sobrenadante foi eliminado. A esse
sedimento foi adicionado mosto (obtido antes do processo
fermentativo), como meio nutritivo, e a suspenso foi mantida em
refrigerador at o momento do uso (BRIGGS et al., 2004, pp. 500-
505, 545, 588). Durante esse perodo de repouso ocorreu a
sedimentao das clulas. Para o desenvolvimento do experimento, o
sobrenadante foi novamente retirado e o fermento foi distribudo em
5 tubos Falcon at ser atingida as marcas de 5, 10, 20, 30 e 40 mL
(Figura 6). Posteriormente, foi adicionada gua destilada as
suspenses at a marca dos 50 mL, agitou-se e deixou-se novamente
em repouso na geladeira por um perodo de 8 h, para a sedimentao
das clulas. Durante esse perodo, ajustou-se o volume com gua
destilada, uma vez que a sedimentao das clulas resultou numa
diminuio do volume inicial. Passado as 8h foi registrada a
quantidade de sedimento em mililitro (Figura 7).

Figura 6 Fermento cervejeiro em Becker antes da diluio


37

Figura 7 Distribuio do fermento cervejeiro em tubos

4.2.3 Diluio do sedimento celular

Aps a aferio do volume do sedimento celular, o contedo


total do tubo Falcon foi transferido para um balo volumtrico, no
qual foi adicionado gua destilada em quantidade suficiente para
completar 500 mL. A partir dessa suspenso foram feitas diluies
decimais seriadas (Figura 8), at o contedo contido no tubo mostrar-
se lmpido a olho nu. O penltimo tubo foi utilizado para a contagem
de leveduras em cmara de Neubauer. Para a diluio seriada foi
usado a soluo de cido sulfrico a 5% (v/v), para evitar a
floculao das leveduras e, consequentemente, facilitar a contagem
microscpica das mesmas (ANALYTICA-EBC, 2011).

Figura 8 Diluio em srie do sedimento das clulas do fermento


cervejeiro
38

4.2.4 Contagem de leveduras em cmara de Neubauer

A contagem microscpica das leveduras foi realizada a partir


do penltimo tubo da diluio serial descrita acima. Desse tubo foi
retirada, com o auxlio de uma micropipeta, uma alquota de 10 L a
qual foi usada para carregar a cmara de Neubauer. Para isso, a
ponteira foi posicionada entre a cmara de Neubauer e a lamnula e,
por capilaridade a suspenso foi transferida para a cmara, at o
preenchimento de toda a rea de contagem (Figura 9). A contagem
foi realizada com o auxlio de microscpio ptico, com aumento de
400x. Foram contados os quadrados 1, 6, 12, 19 e 25 de um
quadrante (ANALYTICA-EBC, 2011; MONGELO, 2012). Para
estimar o nmero de leveduras por mililitro do sedimento foi levado
em considerao rea total do quadrante e a distncia entre a
lamnula e a cmara. Como foram contados 5 quadrados de um total
de 25 existentes em um quadrante, ento o valor obtido com a
contagem foi multiplicado por 5 (Fator de multiplicao). Como o
quadrante usado para contagem possui 1 mm 2 de rea e a lamnula
dista 0,1 mm da lmina, ento o volume da suspenso usado para
contagem correspondeu a aproximadamente 0,1 mm 3. Para expressar
o resultado em leveduras por mL, esse valor foi multiplicado por 10 4,
ou seja, 104 foi considerado o fator de correo da cmara de
Neubauer para que o resultado fosse expresso em nmero de
leveduras por mililitro da suspenso. Com base nessas informaes,
o nmero de leveduras por mililitro de sedimento do fermento, foi
calculado segundo a equao a seguir (ANALYTICA-EBC, 2011):

Clulas/mL = N x FM x FC x FD
39

Onde: N=nmero de clulas contadas em cinco quadrados; FM=fator


de multiplicao (5); FC=fator de correo de 0,1 mm 3 para 1,0 cm3
(104); FD=fator de diluio.

Figura 9- Contagem de leveduras em cmara de Neubauer

4.2.5 Correlao entre o volume de fermento e o nmero de


leveduras

Uma correlao entre os volumes do fermento sedimentado


em tubo Falcon e o respectivo nmero de leveduras, contadas em
cmara de Neubauer, foi obtida atravs do ajuste linear dos dados.
Para isso, foi usado o programa Excel, na qual gerou a equao da
regresso e o coeficiente de determinao (R 2). A equao poder
ser aplicada para estimar a quantidade de levedura utilizando a
medida mais simples de realizar, que o volume de sedimento do
fermento.

4.2.6 Anlise estatstica


40

Para a anlise estatstica foram utilizados diferentes mtodos,


como: clculo do desvio padro, estudo da correlao entre o volume
de sedimento de fermento e nmero de leveduras por mililitro,
clculos do coeficiente de determinao (R 2) e coeficiente de
correlao linear de Pearson (r) e estudo de pontos discrepantes (no
grfico de disperso em que constam todos os dados obtidos com os
cinco fermentos estudados) (BARBETTA; REIS; BORNI, 2004).
41

5. RESULTADOS E DISCUSSO

Os resultados obtidos que correlacionam o volume do


sedimento dos fermentos usados para a fabricao de cerveja
artesanal e a contagem de clulas, em cmara de Neubauer, com
auxlio de microscpio ptico esto apresentados na Tabela 1 e nas
Figuras de 10 a 14. A metodologia utilizada neste trabalho, para
estimar o nmero de leveduras no sedimento de fermento, foi
adotada porque segundo Briggs et al. (2004, pp. 486, 518) esse
mtodo rpido, preciso e reprodutvel, alm de proporcionar
informaes adicionais como possveis alteraes na morfologia
celular e a deteco de microrganismos contaminantes com
morfologia celular distinta das leveduras. Na Figura 15 foram
posicionados todos os dados obtidos nos cinco experimentos
realizados, cujos resultados individuais esto expressos nas Figuras
de 10 a 14. Como pode ser observado, os valores de R2 (Coeficiente
de determinao) variaram de 0,775 a 0,988 e, os valores de r
(Coeficiente de correlao ou Coeficiente de Pearson) variaram de
0,880 a 0,994, quando os fermentos foram analisados
individualmente. Quando os resultados obtidos com os cinco
fermentos foram agrupados em um nico grfico (22 pares ver
Apndice) foi obtido um R 2 de 0,746 e r 0,863. importante
salientar que a linha de tendncia tanto mais confivel quanto mais
prximo de 1 for o seu valor de r (CORREA, 2003). Na literatura foi
observado que para valores de R2 superiores a 0,56 e r superiores a
0,75 as correlaes foram consideradas de moderadas a fortes.
Segundo Doria Filho (1999) valor de r superior a 0,75 indica que h
forte correlao entre as variveis. Para Ferrari et al. (2011) valor de
R2 entre 0,54 e 0,86 (r entre 0,73 e 0,93) significa correlao
moderada e forte correlao para R 2=0,87 (r=0,93). Para Segura,
Lilley e Dupree (2010) r de 0,9 o valor aceito para ser considerado
forte correlao entre as variveis. Na figura 13, onde os dados de
todos os fermentos foram analisados simultaneamente, o valor de R 2
foi 0,746, correspondendo ao valor r de 0,863. Nesse caso
especificamente, considerando-se o nmero de pares correlacionados
(n=22) (BARBETTA; REIS; BORNI, 2004, pg. 407; ver Anexo B),
observa-se que o r obtido ocorreu para p < 0,01 e,
consequentemente, pode-se considerar que h uma correlao
42

estatisticamente significativa (BARBETTA; REIS; BORNI, 2004


pp. 316-351).
43

Tabela 1 Resultados obtidos com os experimentos sobre a correlao entre o volume de fermento cervejeiro e o nmero
de leveduras por mililitro do sedimento.

continua...
Volume de Mdia Leveduras
Fermento fermento (mL) de N
DP FM FC FD R2 r
/mL
6 127 5 5 104 102 6,35.108
15 35 2 5 104 103 1,75.109 44
Belgian Stot 21 59 8 5 104 103 2,95.109 0,902 0,950
30 92,5 3,5 5 104 103 4,63.109
37,5 84 4 5 104 103 4,20. 109

6 15 1 5 104 103 7,50.108


12,5 40 3 5 104 103 2,00.109
Safale S-04 0,828 0,910
20 48 3 5 104 103 2,40.109
31 227 24 5 104 103 1,14.1010

8 223,5 0,5 5 104 102 1,12.109


12 231 10 5 104 102 1,16.109
Safbrew WB-06 0,912 0,955
40 88,5 1,5 5 104 103 4,43.109
45 144,5 1,5 5 104 103 7,23.109

6 61,5 16,5 5 104 102 3,08.108


11 82,5 6,5 5 104 102 4,13. 108
American Wheat 19 24,5 2,5 5 104 103 1,23.109 0,988 0,994
30 38 3 5 104 103 1,90.109
38 50 6 5 104 103 2,50.109

4 73 1 5 104 102 3,65.108


11 32,5 2,5 5 104 103 1,63.109
45

Mdia de N=mdia de duas repeties, do nmero de leveduras contadas em 5 quadrados da cmara de Neubauer;
DP=desvio padro da mdia; FM=fator de multiplicao; FC=fator de correo; FD=fator de diluio; R 2= Coeficiente de
determinao; r=Coeficiente de Pearson.
46

Segundo os dados obtidos no presente trabalho, sugere-se que


sejam utilizadas as frmulas especficas para cada fermento para
estimar com mais segurana o nmero de clulas presentes no
mesmo, com base no volume do sedimento. Entretanto, se for usada
a frmula genrica, ou seja, a obtida com a plotagem dos dados dos
cinco fermentos, ainda existe uma forte correlao entre as variveis.
evidente que quanto maior o nmero de pontos de toque, ou seja,
que sustentam a linha de ajuste, mais consistente a linha de
tendncia. Correa (2003) enfatiza que uma reta com pelo menos
quatro pontos claramente vlida e credvel.
As diferenas entre os valores de r obtidos para os fermentos
podem estar relacionadas, pelo menos com dois fatores. O primeiro a
considerar so as impurezas, como pequenas quantidades de trub e
lpulo que podem ter permanecido no fermento. Segundo Briggs et
al. (2004, p. 486) essa interferncia pode ser minimizada pela
alcalinizao do fermento. A alterao de pH promove a
solubilizao de parte dos produtos slidos agregados ao fermento e,
consequentemente, facilita a sua eliminao, limpando o fermento. O
segundo ponto a ser considerado a possibilidade de diferentes
modelos de compactao das leveduras no sedimento em decorrncia
das diferenas que podem ocorrer na composio das estruturas
externas desses organismos, que podem conferir a essa levedura
caractersticas distintas de adeso clula/clula e de maneira de
proliferao de forma agregada. Assim, as leveduras que floculam
com maior intensidade tendem a formar sedimentos mais densos e,
ento, apresentarem uma maior quantidade de clulas por mililitro de
biomassa (BRIGGS et al., 2004, p. 393).
Dos cinco fermentos utilizados neste estudo, o Safale S-04
o nico que contem uma levedura de alta floculao (FERMENTIS,
2015) e esse fermento foi o que apresentou a maior concentrao de
levedura por mililitro de sedimento (Tabela1). A formao de
agregados, em decorrncia da adeso clula/clula est relacionada
com as caractersticas genotpicas e fatores ambientais (CECCATO-
ANTONINI, 2008). A expresso de protenas floculantes de parede
celular Flo1, Flo5, Flo9 e Flo10 (TEUNISSEN; STEENSMA, 1995)
e a presena do lcool isoamlico (CECCATO-ANTONINI;
SUDBERY, 2004) no meio, promovem a formao de agrupamentos
celulares. Embora no sejam conhecidas as protenas presentes na
47

parede celular das estirpes usadas no trabalho, e nem tenha sido


estudado a presena do lcool isoamlico no mosto, esses fatores, se
presentes, podem ter contribudo para os diferentes tipos de
compactao de sedimento e, consequentemente diferente contagem
de clulas dos fermentos.
O presente estudo no visou estimar o nmero de clulas
viveis dentre a contagem total de leveduras presentes no fermento.
Entretanto, Erten, Tanguler e Cakiroz (2007) observaram que nos
inculos estudados, as clulas viveis corresponderam entre 89,2 e
92,0 % do total de clulas, e ainda segundo Rodrigues (2014)
aceitvel que a padronizao da taxa de inculo ocorra dentro de
uma ordem de grandeza de 3 (10 a 30.10 6 clulas/mL). Sendo assim,
com o uso da metodologia descrita no presente trabalho aliada aos
dados disponveis na literatura, o cervejeiro artesanal poder agregar
considervel ganho de qualidade ao seu produto.
48

Figura 10 Correlao entre a quantidade de levedurae o volume do


sedimento para o fermento American Wheat.

Figura 11 Correlao entre a quantidade de levedura e o volume do


sedimento para o fermento American Ale.
49

Figura 12 Correlao entre a quantidade de levedura e o volume do


sedimento para o fermento Belgian Stout.

Figura 13 Correlao entre a quantidade de levedura e o volume do


sedimento para o fermento Safale S-04.
50

Figura 14 Correlao entre a quantidade de levedura e o volume do


sedimento para o fermento Safbrew WB-06.

Figura 15 Representao grfica dos resultados obtidos com todos


os cinco fermentos usados no trabalho.
51

6. CONCLUSO

Com os resultados obtidos no presente trabalho foi possvel


gerar frmulas matemticas especficas para cada fermento usado, as
quais podem ser empregadas para estimar o nmero de leveduras em
um determinado volume de fermento e, com esse dado, poder ser
calculado o volume desse fermento a ser usado em uma dada
fermentao.
A melhor correlao obtida, entre o volume de fermento e a
contagem de leveduras, foi para o fermento American Wheat (r =
0,994). Quando os resultados obtidos com os cinco fermentos foram
analisados em um mesmo grfico, o coeficiente de correlao (r)
encontrado foi 0,863.
O mtodo prtico proposto para estimativa do nmero de
leveduras poder ser disponibilizado aos cervejeiros artesanais que
no contam com condies adequadas para a manipulao de
microrganismos, de forma que possam aperfeioar o uso do
fermento, diminuindo o custo e melhorando a qualidade de seus
produtos.
52

8. REFERNCIAS

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56
57

APNDICE - Anlise de valores discrepantes

Qualquer aplicao estatstica que analisa uma srie de dados


reais provavelmente encontrar algum valor discrepante (outliers). A
definio intuitiva de um outlier seria "uma observao que desvia
muito das outras observaes a ponto de gerar suspeitas que essa foi
gerada por um mecanismo diferente". Uma inspeo da amostragem
contendo outliers mostraria caractersticas como um grande salto
numa escala padronizada com os valores entre observaes
"outlying" e "inlying", e o desvio entre outliers e o grupo de inliers.
No presente trabalho, a identificao (dados mostrados abaixo) e
remoo do ponto discrepante (outlier), grifado em vermelho, foi
realizada de acordo com Hawkins (Hawkins, D. M., Identification of
Outliers. Chapman and Hall, New York, 1980). Disponvel em
http://www.eng.tau.ac.il/~bengal/outlier.pdf. Acesso em Agosto de
2015.

x: mL y: Clulas Delta
6 6,35.108x 2,05.109
15 1,75.109 9,40.108
21 2,95.109 2,50.109
30 4,63.109 1,94.109
37,5 4,20.109 1,51.109
6 7,50.108 1,94.109
12,5 2,00.109 6,92.108
20 2,40.109 2,92.108
31 1,14.1010 8,71.109
8 1,12.109 1,57.109
12 1,16.109 1,53.109
40 4,43.109 1,74.109
45 7,23.109 4,54.109
6 3,08.108 2,38.109
11 4,13.108 2,28.109
58

19 1,23.109 1,46.109
30 1,90.109 7,92.108
38 2,50.109 1,92.108
4 3,65.109 2,33.109
11 1,63.109 1,06.109
18 2,60.109 9,18.108
30 2,08.109 6,12.108
37,5 4,23.109 1,54.109
X

Quartil 1 1,00.109 Mdia 2,69.109


Quartil 3 4,00.109 Desvio Padro 2,55.109
IQR 2,00.109 Tau 1,89985
TAU*Desvio 4,84.109
Cerca superior 7,00.109
Cerca inferior -3,00.109

XObserv Previsto Resdu Resduo


ao (a) y: os s
Clulas padro
1 6,08.108 2,66.10 1%
7

9
2 1,84.10 - -5%
8,90.10
7

9
3 2,66.10 2,91.10 16%
8

4 3,89.109 7,41.10 40%


8

5 4,91.109 - -39%
7,10.10
8

8
6 6,08.10 1,42.10 8%
59
8

7 1,50.109 5,03.10 27%


8

8 2,52.109 - -7%
1,20.10
8

9
9 4,03.10 7,37.10 400%
9

10 8,82.108 2,38.10 13%


8

11 1,43.109 - -15%
2,70.10
8

12 5,26.109 - -45%
8,30.10
8

9
13 5,94.10 1,29.10 70%
9

14 6,08.108 - -16%
3,00.10
8

9
15 1,29.10 - -48%
8,80.10
8

9
16 2,39.10 - -63%
1,20.10
9

17 3,89.109 - -108%
2,00.10
9

9
18 4,98.10 - -135%
2,50.10
9

8
19 3,35.10 2,99.10 2%
7

20 1,29.109 3,38.10 18%


8
60

21 2,25.109 3,51.10 19%


8

22 3,89.109 - -98%
1,80.10
9

9
23 4,91.10 - -37%
6,80.10
8
61

Pode-se observar nos grficos abaixo, relacionados aos


resduos e ajustes de linha, um ponto que se comporta de forma
atpica. Isso causa a elevao errnea da curva de
probabilidade normal. O que juntamente com os clculos
realizados previamente justificam sua remoo.
62

A tabela a seguir foi gerada depois da remoo do ponto


discrepante.
Xx: y: Clulas
mL
6 6,35.108
15 1,75.109
21 2,95.109
30 4,63.109
37,5 4,20.109
6 7,50.108
12,5 2,00.109
20 2,40.109
8 1,12.109
12 1,16.109
40 4,43.109
45 7,23.109
6 3,08.108
11 4,13.108
19 1,23.109
30 1,90.109
38 2,50.109
4 3,65.108
11 1,63.109
18 2,60.109
30 2,08.109
37,5 4,23.109

X
Resumo dos resultados aps remoo do
ponto discrepante:
Estatstica de regresso
R mltiplo 0,86
63

R-Quadrado 0,75
R-quadrado ajustado 0,73
8,99.10
8
Erro padro
Observaes 22
ANOVA

sign
gl SQ MQ F
4,73.101 4,70.101
9 9
Regresso 1 58,62 0,0
1,62.101 8,08.101
9 7
Resduo 20
6,35.101
9
Total 21
64

Os grficos a seguir foram gerados aps a retirada do ponto


discrepante:
65

ANEXO A - Valores de T de Thompson utilizados para


identificar os pontos discrepantes (ANBARASI et al., 2011).
66
67

ANEXO B Valor absoluto mnimo para o coeficiente de correlao


linear r de Pearson ser significativo.

N P = 0,05 P = 0,01
5 0,878 0,959
6 0,811 0,917
7 0,754 0,875
8 0,707 0,834
9 0,666 0,798
10 0,632 0,765
11 0,602 0,735
12 0,576 0,708
13 0,553 0,684
14 0,532 0,661
15 0,514 0,641
16 0,497 0,623
17 0,482 0,606
18 0,468 0,590
19 0,456 0,575
20 0,444 0,561
21 0,433 0,549
22 0,423 0,537
23 0,413 0,526

n = nmero de pares correlacionados.


Fonte: Tabela modificada de Barbeta, Reis e Borni (2004).