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de alta eficincia
O que cromatografia lquida?
AMOSTRA SOLVENTE
Coluna
Ao da
contendo fase
gravidade!
estacionria.
Tempo
Tipos de cromatografia lquida:
CROMATOGRAFIA LQUIDA
PLANAR COLUNA
Historia da HPLC:
- Dcada de 60 : O comeo da HPLC como High pressure LC!
- Dcada de 70 : Com a melhora do material da coluna e da
instrumentao, HPLC passa a ser High Performance LC!
- Dcada de 80: A partir dessa dcada houve um boom do HPLC
- 2006- Evoluo da tcnica: UPLC, RRLC, UFLC...
Vantagens da HPLC
FE utilizada inmeras vezes.
Alta resoluo.
Boa detectabilidade:
Fluorescncia: 10-12 g;
Automatizao
Limitaes da HPLC
Alto custo do instrumento
Bomba.
Injetor.
Coluna.
Detector.
Instrumentao para HPLC
Instrumentao para HPLC
Reservatrio para a fase mvel
Filtro do reservatrio :
Captar a fase mvel e evitar que partculas suspensas na FM obstruam
os capilares ou contaminem a bomba.
Filtros de 10 a 40 um
Limpeza peridica!!
Caractersticas da fase mvel
Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao
Degaseificao da FM:
REQUISITOS:
Tipos de bombas:
Pneumtica
Deslocamento
Recproca
Bomba pneumtica
Vantagens:
Baixo custo
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixo volume
No permite gradiente
Vantagens:
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixo volume
No permite gradiente
Bomba recproca
Vantagens:
Permite gradiente
Desvantagem:
Fluxo pulsado
Alto custo
Sistema de bombeamento
Isocrtico :
+ A composio da fase mvel permanece constante ao longo da
anlise.
+ Capaz de separa um nmero limitado de analitos.
Gradiente
+ A composio da fase mvel varia durante a anlise.
+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes
na amostra , muito diferente.
+ Separao de amostras complexas.
Separao isocrtica e por gradiente
AMOSTRADOR AUTOMTICO
- As amostras so postas em um frasco localizado
dentro do amostrador.
- O amostrador automtico :
1- Mede o volume correto para injeo.
2- Injeta a amostra.
3 Prepara o injetor para uma prxima amostra
Sistema de Injeo
Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo
Bomba
Coluna
LOAD Bomba
Coluna
Sobrecarga de Volume da amostra
Para aproveitar de todos os pratos que uma
colina possui, no se deve injetar um volume
maior que 1% do volume da coluna vazia.
(L)=(raio)2(comprimento)(0,01)
Instrumentao para HPLC
Coluna
Geralmente em ao inox ( mais popular, maior presso)
+ Coluna de vidro reforado (at 600 psi, utilizada para biomoleculas)
+ PEEK polmero ( biocompatvel e quimicamente inerte com a maioria
dos solventes)
+ Preo: > US$ 200.00
Tipos de colunas
+ Analticas : dimetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250
mm.
+ Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.
Protege a coluna
Custo reduzido
Pr-coluna!
Coluna
Fase estacionria.
+ As colunas so recheadas com partculas porosas com dimetro
de 1,8 5 m.
HPLC
solutos neutros;
Fase reversa:
fase estacionria apolar;
OH Ciano (-C2H4CN)
Si R= Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (C3H6NH2)
CROMATOGRAFIA DE FASE
NORMAL
Polaridade do soluto: Nos trabalhos pioneiros usou-se
a > b > c fases altamente polares, como
Polaridade da fase mvel
gua e trietilenoglicol
adsorvidos sobre slica ou
alumina e solventes apolares,
c b a
como hexano ou ter
isoproplico, eram usados como
tempo fase mvel; por razes histricas,
este tipo de cromatografia
chamado de fase normal
c b a
tempo
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da fase mvel tem
o efeito de diminuir o tempo de eluio
Fase reversa
CROMATOGRAFIA DE FASE
REVERSA
Polaridade do soluto: a > b > c
Na cromatografia de fase reversa, a
Polaridade da fase mvel
tempo
a b c
tempo
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior
solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da fase mvel aumenta-se
o tempo de eluio
Efeito do comprimento da cadeia na
reteno.
Tipos de cromatografia lquida:
Inica:
A fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno e
divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos, como por exemplo,
-SO-3 trocadores fortes de ction
-CO-2 trocadores fracos de ction
-NR+3 trocadores fortes de nions
-NH2R+ trocadores fracos de nions
Excluso:
A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das
molculas.
A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho
controlado. Onde, as molculas menores penetram a maioria dos poros.
Instrumentao para HPLC
Caractersticas de um detector
Resposta Rpida
No destruir a amostra
Caractersticas de um detector
Resposta Rpida
Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrer uma
alterao na quantidade de energia que incide sobre o sensor.
http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html
filtrao
em gel
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aplicaes
Figura 28-1 Skoog p642 vp
HPLC x GC
Comparao entre as caractersticas de GC e HPLC
Fator GC HPLC
voltil e termicamente
Requisito p/ amostra solvel na fase mvel
estvel
Tipos de amostra gases, lquido e slidos lquidos e slidos
Quantidade mnima
10-12 g (ECD) 10-9 g (UV)
detectvel
minutos at poucas minutos at muitas
Tempo de anlise
horas horas
Pratos tericos por
2.000-300.000 500-25.000
coluna
Capacidade analtica at 200 componentes at 50 componentes
Tempo de treinamento
cerca de 3 meses pelo menos 6 meses
do operador
(a) (b)
(c) (d)