UNIME

GUIA PRÁTICO DE

HEMATOLOGIA

2010
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AULA 01 - CONFECÇÃO DO ESFREGAÇO HEMATOLÓGICO

MATERIAL - Lâminas de vidro secas e virgens/ Lápis Grafite/ Álcool/ Gaze/ Sistema Haemo Diff - sarstedt/
amostra de sangue.

PROCEDIMENTO

1) ESFREGAÇO SANGUÍNEO ESTENDIDO (OU GOTA ESTENDIDA)

O esfregaço sanguíneo pode ser feito com sangue não anticoagulado, ou anticoagulado. O uso do sangue
anticoagulado pelo EDTA é preferencial quando se objetiva uma distribuição mais uniforme das plaquetas.
Ele é feito para a análise das células sanguíneas e eventualmente para a pesquisa de alguns parasitas
(Plasmodium sp, Babesia sp, Trypanosoma sp, Leishmania donovani, Whuchereria bancrofti etc) bactérias
(Bartonella bacilliformis, Borrelia sp, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, etc) e fungos
(Candida sp, Histoplasma capsulatum, Penicillium marneffei etc) que podem ser encontrados livres entre as
células, ou dentro de eritrócitos, neutrófilos ou monócitos a depender do microorganismo. Ainda com uma
freqüência baixa podem ser observadas também células espiteliais, endoteliais e células malignas não
hematopoiéticas.
Para a obtenção de um bom esfregaço sanguíneo, são indispensáveis os seguintes requisitos: a lâmina
deverá estar limpa, seca e desengordurada, a gota de sangue não deve ser grande e o esfregaço deve ser
fino e homogêneo. Um bom esfregaço deve possuir: cabeça, corpo, franja e bordas.

Bordas

Cabeça Franja

Corpo

1. Esfregar uma gaze seca sobre as lâminas: distensora e a destinada ao esfregaço.

2. Usar um lápis grafite para fazer a identificação na lâmina destinada ao esfregaço sanguíneo,
escrevendo por extenso, na parte fosca da mesma.
3. Inverter o tubo de sangue com EDTA por no mínimo cinco vezes de forma lenta.
4. Colocar uma gota de sangue sobre a lâmina. Posicionar a lâmina distensora na frente do sangue
formando um ângulo entre 30 a 45º. O sangue preencherá todo o espaço angular formado entre as
duas lâminas. Mantendo o mesmo ângulo, movimentar a lâmina distensora para a frente, de forma
rápida, firme e uniforme, em um só movimento. Obs. Movimento muito rápido e ângulo maior que 40o
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deixam o esfregaço muito fino; em contrapartida, movimento lento e ângulo menor que 30o deixam o
esfregaço muito espesso.
5. Escrever a identificação na base do esfregaço com o auxílio de um lápis grafite. Ex: iniciais do paciente/
dia / no ID. Usar letras pequenas e legíveis de forma que não prejudique a observação do esfregaço ao
microscópio.
6. Deixar o esfregaço secar espontaneamente ao ar ambiente, sem agitar a lâmina.
7. O esfregaço está pronto.

2) ESFREGAÇO SANGUÍNEO TIPO GOTA ESPESSA

Destina-se á pesquisa de hematozoários.

1. Esfregar uma gaze seca sobre as lâminas: distensora e as destinadas ao esfregaço de gota espessa.
2. Identificar as lâminas da mesma forma descrita para o esfregaço ESTENDIDO.
3. Inverter o tubo de sangue com EDTA por no mínimo cinco vezes de forma lenta.
4. Colocar 01 gota de sangue na extremidade da lâmina e outra no centro da mesma.
5. Com a lâmina distensora, formar um ângulo inferior a 30º. Distender cada gota fazendo esfregaços
curtos e espessos.
6. Deixar o esfregaço secar espontaneamente ao ar ambiente.
Identificação

76 mm de comp. X 26 mm de largura.

OBSERVAÇÕES
 Esfregaços feitos com sangue capilar devem ser feitos através de fluxo espontâneo, sem
compressão local e sem contaminação com álcool.
 As lâminas devem ser conservadas sempre á temperatura ambiente.
 Não usar lâminas recicladas, arranhadas, com resíduos de detergentes, corantes, álcool e/ou
gorduras.
 Toda amostra biológica deve ser considerada como potencialmente infectante.
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AULA 02 - COLORAÇÃO DO ESFREGAÇO HEMATOLÓGICO

1. PRINCÍPIO
Romanowsky idealizou um método em que uma solução de corantes poderia corar diferentes estruturas.
Misturas dos corantes eosina e azul de metileno são preparadas segundo proposição de vários autores:
Leishman, May-Grunwald, Giemsa, Wright e outros (que dão os respectivos nomes ao corantes, segundo
Leishman, Giemsa, etc....). Estes corantes são dissolvidos em álcool (em geral metanol). Na solução
envelhecida, o azul de metileno se oxida em gradações diferentes, originando diversos “azures” de
metileno. Teremos então uma solução alcoólica de um complexo eosinato de azul e “azures” de metileno.

2. FASES DA COLORAÇÃO
Fixação: a preparação a ser corada deverá ser previamente fixada. O fixador rotineiro mais usado em
hematologia é o metanol, que deve ser aplicado sobre a lâmina por 01 a 03 minutos. O corante, preparado
em solução alcoólica, quando aplicado sobre a lâmina (nesse período de tempo) realiza esta etapa que é a
de fixação. A coloração obtém-se adicionando-se água de coloração (água tamponada, pH=7,0 ou água
destilada, recentemente fervida) sobre o corante, ionizam-se os sais contidos na solução. A lavagem é feita
após a coloração, as lâminas são lavadas sob jato de água corrente e em seguida secas ao ar.

3. NOMENCLATURA USUAL
Quando uma estrutura se cora, revelando a mesma cor do corante, diz-se que é uma coloração
ortocromática; quando a estrutura toma uma cor diferente daquela do corante, diz-se que é uma coloração
metacromática. As estruturas celulares que tem afinidade pelo azul de metileno são chamadas basófilas,
corado-se em azul; as que tem afinidade pelos azures são chamadas azurófilas, corando-se em púrpura
(metacromasia); as que tem afinidade pela eosina são chamadas acidófilas, corando-se em rosa e as que
tem afinidade pela mistura complexa são chamadas neutrófilas, corando-se em salmão.

4. METODOS
Leishman ou May-Grunwald-Giemsa, mod. por Rosenfeld (*)

- Fixação: sobre a extensão de sangue, secada ao ar, colocar um número x de

gotas (por ex. 30 gotas) do Corante de Leishman ou de Rosenfeld e aguardar alguns minutos (tempo
padronizado).

- Coloração: sem desprezar o corante, acrescentar um igual número de gotas de água de coloração,
homogeneizar e aguardar alguns minutos (tempo padronizado).
Lavar sob jato de água corrente. Secar ao ar.

Água de coloração (água tamporada – pH = 7,0)

KH2PO4................................................. 1 g
Na2HPO4. 2H2O.................................... 3 g
H2O destilada q.s.p................................ 1000 ml.

(*) Corante de May-Grunwald-Giemsa , mod. por Rosenfeld:

Giemsa........................................................... 0,97 g
May-Grunwald................................................ 0,53 g
Mentanol (p.a).qsp....................................... 1000ml
Homogeneizar. Armazenar em frasco âmbar. Filtrar antes do uso.
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AULA 03 - MORFOLOGIA DAS CÉLULAS SANGUÍNEAS

1. SÉRIE ERITROCITÁRIA

1.1. PROERITROBLASTO: célula oval ou arredondada com 20 a 25de diâmetro, citoplasma reduzido,
com basofilia atribuída ao RNA citoplasmático dos ribossomas (persistem até RETICULÓCITO). O núcleo
ocupa cerca de 8/10 da célula, apresenta cromatina delicada e com a 1 a 2 nucléolos.

1.2. ERITROBLASTO BASÓFILO: célula geralmente com cerca de 16 a 18de diâmetro, citoplasma
intensamente basófilo. O núcleo já não apresenta nucléolos visíveis (por coloração panóptica), a cromatina
se dispõe em conglomerados de formas diversas, freqüentemente pentagonais ou hexagonais, que se
distribuem no núcleo em forma semelhante aos raios de uma “roda de carroça”, mais ou menos regulares,
dando aspecto
característico.

1.3. ERITROBLASTO POLICROMÁTICO: neste estágio de maturação, a hemoglobina está presente em

grande quantidade, mas os ribossomas ainda persistem e conseqüentemente a coloração do citoplasma
varia de azul a cinza. A célula mede cerca de 9 a 12de diâmetro, o núcleo ocupa cerca de 25% da célula,
cora-se mais intensamente, conservando sempre o aspecto característico das condensações cromatínicas
dispostas como “ roda de carroça “.

1.4. ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO: nesta fase há uma grande diminuição do diâmetro: a célula
mede cerca de 8 a 9, atinge o fim de sua capacidade de síntese de DNA e é incapaz de atividade mitótica;
o citoplasma é saturado de hemoglobina com conseqüente acidofilia. O núcleo é constituído por massa
homogênea de cromatina, sem estrutura definida, de localização excêntrica, estágio que normalmente
precede sua expulsão.

1.5. RETICULÓCITO: “célula” anucleada que em coloração panótica, apresenta citoplasma acidófilo, mas
quando quando corada com corantes vitais (ex.: Novo Azul de Metileno ou o Azul de Cresil Brilhante)
apresenta um retículo basófilo (RNAm) neste citoplasma.

1.6. ERITÓCITO: é um disco bicôncavo, anucleado, com cerca de 7de diâmetro, de coloração róseo-clara
e com halo central mais claro.

2. SÉRIE PLAQUETÁRIA

2.1. MEGACARIOBLASTO: célula com cerca de 30 de diâmetro, citoplasma basófilo, relação N/C
elevada. A célula pode apresentar-se com 1 ou 2 núcleos de forma irregulares, cromatina frouxa, reticular e
geralmente com 2 ou 3 nucléolos.

2.2. MEGACARIOCITO BASÓFILO: a célula aumenta de tamanho, o citoplasma apresenta granulações e

intensa basofilia, presença de vários núcleos, a cromatina condensa-se e, em geral, não se observam
nucléolos na microscopia óptica.

2.3. MEGACARIOCÍTO ACIDÓFILO: a célula apresenta diâmetro de cerca de 50 , a relação

núcleo/citoplasma diminui, o citoplasma, agora abundante, torna-se acidófilo com inúmeras granulações, o
núcleo torna-se picnótico. As células mais maduras apresentam plaquetas em sua periferia. Geralmente um
megacariócito origina cerca de 2.000 plaquetas.

2.4. PLAQUETAS: são estruturas de forma estrelada, com diâmetro de 2 a 5geralmente; em casos
patológicos podem apresentar 10 a 20; apresentam região central mais escura e uma periférica mais clara,
com muitas granulações.
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3. SÉRIE GRANULOCÍTICA

3.1. MIELOBLASTO: apresenta diâmetrto de 20-25 ; célula de aspecto irregular, arredondada ou ovalada,
citoplasma basófilo (menos que o do Hemocitoblasto), com granulações azurófilas, relação
núcleo/citoplasma grande, núcleo de forma irregular (cromatina delicada), com2 a 3 nucléolos.
Origina as séries neutrófila, eosinófila e basófila. Os granulócitos neutrófilos, eosinófilos e basófilos
possuem as mesmas etapas de maturação, apresentando coloração do citoplasma e forma do núcleo
semelhantes, mas com diferentes granulações específicas citoplasmáticas.

GRANULAÇÕES ESPECÍFICAS
As granulações específicas dos neutrófilos apresentam-se pequenas, ás vezes pouco visíveis, dispersas
pelo citoplasma, que apresenta coloração vermelho salmão.
As granulações específicas dos eosinófilos, quando coradas por corantes panóticos, apresentam
variação de cor conforme o estado de maturação: no início são violáceas, depois tornam-se azul-violeta e
finalmente tomam a cor laranja. São muito maiores que as do neutrófilo, com 0,4 – 0,8de diâmetro, de
forma esférica ou ovóide, dispostas por todo
o citoplasma.
As granulações específicas dos basófilos, são na realidade metacromáticas, de cor violeta, de vários
tamanhos, podendo atingir 2de diâmetro, dispondo-se por todo o citoplasma e sobre o núcleo,
mascarando-o.

3.2. PROMIELÓCITO: apresenta cerca de 20de diâmetro, forma arredondada ou ovalada; com coloração
panótica. O citoplasma se apresenta basófilo, com granulações azurófilas e específicas (de neutrófilo ou
eosinófilo ou basófilo), núcleo pode apresentar forma ovalada, arredondada (cromatina delicada) , com ou
sem chanfradura e geralmente sem nucléolos evidentes.

3.3. MIELÓCITO: mede 12-18u de diâmetro; o citoplasma a partir deste estádio é acidófilo com granulações
específicas evidentes (de neutrófilo ou eosinófilo ou basófilo), por coloração panótica. Núcleo geralmente
arredondado, podendo apresentar chanfradura e com cromatina mais
condensada.

3.4. METAMIELÓCITO: mede cerca de 15u, citoplasma acidófilo, com granulações específicas evidentes
(de neutrófilo ou eosinófilo ou basófilo) por coloração panótica. Núcleo se apresenta reniforme e
cromatina condensada.

3.5. BASTONETE: mede cerca de 12 u, citoplasma acidófilo com

granulações específicas evidentes (de neutrófilo ou eosinófilo ou basófilo) por coloração panótica, núcleo
em forma de ferradura.

3.6. SEGMENTADO: mede cerca de 12 u, citoplasma acidófilo com granulações específicas evidentes (de
neutrófilo ou eosinófilo ou basófilo) por coloração panótica. Núcleo lobulado (a média para neutrófilos é
de 3 a 4 segmentos e para eosinófilos cerca de 2 segmentos).

4 SÉRIE MONOCITÁRIA

4.1. MONOBLASTO: célula grande (geralmente maior que o Hemocitoblasto), com cerca de 30u,
arredondada, citoplasma basófilo (azul claro), podendo apresentar algumas granulações azurófilas, núcleo
geralmente arredondado, podendo apresentar chanfradura, cromatina delicada, disposta em rede, com 1 a
2 nucléolos.

4.2. PROMONÓCITO: célula intermediária entre monoblasto e monócito.

4.3 MONÓCITO: apresenta diâmetro de 20 a 30 u, cotoplasma azulacinzentado

com um número variável de granulações azurófilas e vacúolos. Núcleo grande, freqüentemente chanfrado,
cromatina delicada e disposta em
rede.
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5 SÉRIE LINFÓIDE

5.1. LINFOBLASTO: apresenta diâmetro de cerca de 15-20u, citoplasma basófilo com halo claro
perinuclear podendo, raramente apresentar granulações azurófilas; relação núcleo/citoplasma grande;
cromatina nuclear delicada mas, com tendência a apresentar grumos, geralmente com 1 a 2 nucléolos..

5.2. PROLINFÓCITO: é uma célula intermediária entre linfoblasto e linfócito; apresenta diâmetro de 10 a
18u, relação núcleo/citoplasma grande mas tende a ser menor que a do LINFOBLASTO; citoplasma
basófilo, podendo também apresentar algumas granulações azurófilas. O núcleo se apresenta arredondado
ou oval, com cromatina mais condensada que a do linfoblasto, mas mais delicada que a do linfócito;
geralmente apresenta um
nucléolo.

5.3. LINFÓCITOS: no sangue periférico podem ser observadas as formas: pequeno linfócito (7-8u de
diâmetro) e grande linfócito (10u de diâmetro).

PEQUENO LINFÓCITO: célula arrendondada, apresenta relação núcleo/citoplasma grande (o núcleo ocupa
9/10 da célula); por isso, geralmente, o citoplasma não é visualizado; o núcleo apresenta cromatina
densa.

GRANDE LINFÓCITO: é uma célula arredondada, citoplasma basófilo (azul claro), geralmente com
granulações azurófilas; núcleo arredondado (freqüentemente apresenta-se ligeiramente excêntrico); relação
núcleo/citoplasma menor do que a do pequeno linfócito.
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AULA 04 - ERITROSSEDIMENTAÇÃO

Sinonímia: Velocidade de Hemossedimentação dos Eritrócitos; Velocidade de Sedimentação Globular.

É um teste inespecífico na documentação de processo inflamatório, infeccioso ou neoplásico, servindo também

para inferência de sua intensidade e, considerando-se as limitações, da resposta à terapêutica.

A velocidade com que as hemácias sedimentam em um tubo depende do volume e da forma dos eritrócitos e
das proteínas do plasma. O VHS não mede a viscosidade sangüínea, mas é influenciado por proteínas
plasmáticas na seguinte escala comparativa de valores: fibrinogênio(10), -globulina(5),  e -globulinas (2)
e albumina(1). Fatores que reduzem a sedimentação das hemácias incluem a rigidez e alterações morfológicas
celulares. Fatores que aumentam o VHS incluem estados de hemodiluição e a eventual presença de proteínas
plasmáticas assimétricas e de alto peso molecular que se ligam à membrana celular, o que reduz o potencial
zeta e facilita a formação do rouleaux, constituído por hemácias empilhadas e aderidas. Dessa forma, a simples
observação de rouleaux num esfregaço de sangue já é indicativo de VHS anormal.

A eritrossedimentação foi introduzida em 1918 por Fahraeus, em estudos sobre a gravidez. Em 1920
Westergreen descreveu a técnica hoje adotada universalmente. Posteriormente outros métodos foram propostos
como o de Wintrobe em 1935. No método de Westwergreen mistura-se 1,6ml de sangue venoso mais 0,4ml de
citrato de sódio a 3,8% e coloca-se num tubo transparente com diâmetro interno de 2,5mm e graduado em
milímetros. A marca zero da graduação fica na extremidade superior, exatamente a 200mm da ponta da pipeta.
A técnica exige que o tubo com a amostra de sangue seja mantido exatamente na vertical e permaneça em
repouso pelo menos durante uma hora. A leitura é dada pela altura da coluna de plasma, no limite de separação
com as hemácias sedimentadas. O resultado, expresso em milímetros por hora (mm/h), mede a
eritrossedimentação, hemossedimentação ou VHS. O método de Wintrobe possui duas utilidades básicas: para
VHS segundo Wintrobe e para fazer o macro-hematócrito. Possui duas escalas, uma crescente e uma
decrescente, para se fazer as leituras nos próprios tubos. Os valores normais diferem dos valores do método de
Westergren porque o tubo tem metade do comprimento e graduações diferentes.

Em geral, o VHS encontra-se aumentado nos processos inflamatórios (aumento de fibrinogênio e das proteínas
de fase aguda; aumento de imunoglobulinas), na presença de proteínas plasmáticas anormais (mieloma múltiplo),
nas neoplasias (associação de mecanismos), lipemias, anemias (hemodiluição), hiperproteinemias,
hiperfibrinogenemias e gravidez. Também elevam o VHS o aumento da viscosidade sanguinea, a alcalose, a
presença de macrocitose, esferócitos, microcoágulos. Encontra-se diminuído na presença de crioaglutininas,
microcitose, anisocitose, esferocitose, drepanócitose e a poliglobulia. Pacientes com hemólise ou coagulação
intravascular disseminada podem ter VHS normal, devido à redução de haptoglobina ou do fibrinogênio.Também
diminuem o VHS a acidose e o resfriamento do sangue.
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Recomendações para colheita: Jejum de 4 horas recomendável, mas não obrigatório / Anotar uso dos medicamentos
utilizados nos últimos 14 dias.

Interferentes: Volume desproporcional entre o anticoagulante e o sangue colhido / Garroteamento prolongado / Punção
traumática / Lipemia.

Valores de Referência:
Método de Wintrobe
Homens – 0 a 15 mm/ 1a. Hora.
Mulheres – 0 a 25 mm/ 1a. Hora.
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Exames correlacionados: dosagem de fibrinogênio, alfa-1-glicoproteína ácida, hemograma, ASLO,

proteína C reativa e mucoproteínas.

Toda amostra biológica deve ser considerada como potencialmente infectante.

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AULA 05 – TEMPO DE PROTROMBINA

PRINCÍPIO DO TESTE
O teste consiste na comparação da velocidade de formação da fibrina entre o plasma de referência e
plasmas de pacientes, representando a medida da atividade dos fatores do complexo protrombínico (fatores
ll, V, Vll, X). Baseia-se na medida do tempo de coagulação do plasma depois de se adicionar uma fonte de
fator tissular (tromboplastina) e cálcio.
A recalcificação do plasma na presença de fator tissular gera o Fator X ativado e posteriormente um
coágulo de fibrina.
A formação de fibrina é macroscopicamente demonstrada pelo aparecimento de um coágulo.

APLICAÇÃO CLÍNICA
O teste é muito empregado para monitorar pacientes fazendo uso de anticoagulantes orais devido à
redução na atividade dos fatores vitamina K dependentes (II, VII, IX, X, Proteína C e Proteína S).

SIGNIFICADO CLÍNICO
O tempo de protrombina (TP) é empregado para avaliar as alterações congênitas e adquiridas de fatores da
via extrínseca da coagulação, no controle da anticoagulação oral e como teste de triagem pré-operatória.
O TP está prolongado nas deficiências de fatores da via extrínseca da coagulação (I, ll, V, Vll e X), durante
o uso de anticoagulantes orais, na presença de inibidores específicos circulantes, em doenças hepáticas,
nas desordens do metabolismo da vitamina K (deficiência de síntese ou absorção), na doença hemorrágica
do recém-nascido, icterícia obstrutiva, distúrbio da absorção intestinal, antibioticoterapia, insuficiência
hepática, fibrinólise e coagulação intravascular.
O teste é muito empregado para monitorar pacientes fazendo uso de anticoagulantes orais devido à
redução na atividade dos fatores vitamina K dependentes (II, VII, IX, X, Proteína C e Proteína S).

AMOSTRA
Colher sangue em citrato pela manhã após jejum de 4 horas, salvo orientações médicas.

COMPONENTES DO KIT
Tromboplastina - Contém extrato liofilizado de cérebro de coelho e cloreto de cálcio ajustado para atender
os requerimentos do teste.

PREPARO DE AMOSTRAS DE REFERÊNCIA

Preparar um pool (referência) misturando plasmas citratados obtidos de, no mínimo 3 indivíduos sadios.
Não usar plasmas de portadores de doenças hepáticas ou de mulheres grávidas ou em uso de
contraceptivos orais.

TÉCNICA DE ANÁLISE
1- Realizar o teste em tubos de vidro rigorosamente limpos.
2- A temperatura do banho-maria deve estar entre 36,5-38,5 ºC.
3- Incubar 200 µL do Reagente de Trabalho (Tromboplastin reconstituído) em tubos de ensaio 12 x 75
durante 2 minutos (mínimo) e 15 minutos (máximo).
4- Adicionar 100 µL do plasma a ser medido (referência ou paciente) e simultaneamente, disparar o
cronômetro. Misturar suavemente e manter no banho-maria por 9 segundos.
5- Remover o tubo, incliná-lo periodicamente e observar a formação de coágulo. Travar imediatamente o
cronômetro e anotar o tempo.

CÁLCULOS E RESULTADOS
Calcular a média do tempo da determinação de TP das duplicatas para cada plasma e anotar.

Os resultados do Tempo de Protrombina (TP) podem ser expressos em Atividade% do normal ou em RNI
(Relação Normalizada Internacional).

1- Relação dos Tempos de Protrombina (RP)

RP = Tempo em segundos (TP) do plasma do paciente dividido pelo Tempo em segundos (TP) do plasma
de referência.
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2- Atividade de Protrombina (A%)

Utilizar a tabela anexa.
Tabela 1 - Cálculo da Atividade (A%) - Conversão de TP em segundos para Atividade (A%).
Relacionar o tempo em segundos do plasma de referência com o tempo em segundos do plasma do
paciente e encontrar o valor de Atividade (%).

3- Relação Normalizada Internacional (RNI)

Para obter os resultados em RNI, temos 2 processos:

3a- Utilizar a tabela anexa.

Tabela 2 - Cálculo da RNI - Conversão da Relação do TP para RNI.

Relacionar a Relação dos Tempos de Protrombina (RP) calculada no item 1 de Cálculos e Resultados com
o ISI (Índice Internacional de Sensibilidade) informado no rótulo do produto.

Atenção: O ISI pode variar de lote a lote.

Exemplo
TP do plasma de referência = 12 s
TP do plasma do paciente = 13 s
1- RP = 13  12 = 1,08  1,1

2- Utilizando a Tabela 1 – Interconversão de Tempo (s) X Atividade% .

Atividade de Protrombina (A%) = 82%

3- Utilizando a Tabela 2 – Convesão para RNI

Se ISI = 1,22  1,2
RP calculado = 1,1
RNI = 1,12

3b- A RNI pode também ser calculada através das seguintes fórmulas:
RNI = RPISI ou RNI = antilog (log RP x ISI)

VALORES DE REFERÊNCIA
Os valores de TP dependem do reagente utilizado e, portanto, estão sujeitos a variações significativas entre
os laboratórios. Portanto, é importante que os resultados sejam expressos em RNI para corrigir essa
variabilidade de resultados entre os laboratórios.

1- Tempo de Protrombina (TP): 10 a 14 segundos.

2- Atividade (A%) de Protrombina: 70 a 100%. Valores acima de 100% não têm significado patológico.

3- RNI: entre 1,0 e 1,08.

Monitoração Laboratorial de Terapia com Anticoagulantes Orais

Para maximizar os efeitos terapêuticos desejados e minimizar

sangramentos, a OMS recomendou o emprego da Relação Normalizada
Internacional (RNI) para padronizar o teste de tempo de protrombina e o
respectivo tratamento. Os resultados em RNI corrigem a variabilidade
existente entre os diversos reagentes de tromboplastina utilizados nos
laboratórios. O Índice Internacional de Sensibilidade (ISI) é a medida da
sensibilidade entre tromboplastina/instrumento para fatores de coagulação.
Os valores de ISI são determinados por comparação a um material de
referência de tromboplastina primária. Reagentes com alta sensibilidade
possuem valores de ISI baixos. A tabela fornecida na Instrução de Uso
original é para determinar o RNI relativo ao TP obtido com o Tromboplastin
em diferentes valores de ISI. É aconselhável que pacientes em terapia
estabilizada com anticoagulante oral devam ter seu RNI mantido entre 2,0 e
3,5 dependendo da indicação clínica.
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AULA 06 – TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA

PRINCÍPIO DO TESTE
O tempo de tromboplastina parcial ativada ( TTPA ) é um teste que avalia o sistema intrínseco da
coagulação. O TTPA consiste na determinação do tempo de coagulação de um plasma a 37º C após
recalcificá-lo com cefalina e cálcio. O teste TTPA é sensível as deficiências de atividades dos fatores II, V,
VIII, IX, X, XI, XII devido desordens hereditárias de coagulação, doenças hepáticas, deficiência de vitamina
K e vários fármacos.
O reagente contém substitutos de fosfolípides plaquetários que, juntamente com um ativador solúvel, ácido
elágico, proporciona condições ótimas para a ativação por contato dos fatores da coagulação (via
intrínseca).

APLICAÇÃO CLÍNICA
Apesar de ser sensível a deficiências de todos os fatores da coagulação, com exceção do fator VII, o TTPA
detecta desordens hemorrágicas secundárias principalmente à deficiência dos fatores VIII, IX, XI, XII e Pré -
calicreína. O TTPA pode ser utilizado também com sucesso para monitorar pacientes em terapia com
heparina. O sistema é suficientemente sensível para discriminar diferentes concentrações deste
anticoagulante, apresentando prolongamento do tempo de coagulação proporcional à concentração de
heparina no plasma.

SIGNIFICADO CLÍNICO
Níveis de fatores entre 15% e 30% do normal prolongam o TTPA. O TTPA é usado para detecção de
deficiências ou inibidores dos fatores da coagulação da via intrínseca ou comum, além de se prestar para
monitorização da anticoagulação com heparina e para rastreamento do anticoagulante lúpico. Distúrbios da
via intrínseca da cascata da coagulação são caracterizados pelo TTPA prolongado e o Tempo de
Protrombina (TP) normal. Formas hereditárias incluem a deficiência dos fatores VIII ou IX (hemofilias A ou B
respectivamente), fator XI, pré-calicreína, cininogênio de alto peso molecular e fator XII. A deficiência dos
três últimos fatores não está associada com quadro de manifestação hemorrágica, constituindo-se apenas
uma anormalidade laboratorial. Distúrbios adquiridos que cursam com TP normal e TTPA prolongado
incluem o inibidor lúpico ou inibidores dos fatores VIII, IX e XI, além do uso de heparina. Distúrbios da via
comum causam o prolongamento do TP e TTPA, os quais, quando hereditários, indicam formas raras de
deficiência de um dos seguintes fatores: fator X, fator V, protrombina ou fibrinogênio. Por outro lado,
deficiências adquiridas de alguns destes fatores geralmente são acompanhadas por outras anormalidades
na via extrínseca ou intrínseca, como ocorre nas hepatopatias, na coagulação intravascular disseminada
(CIVD) e na deficiência de vitamina K. Além disso, quando oTPe oTTPA estão prolongados, torna-se
importante a realização da dosagem de fibrinogênio e do tempo de trombina (TT), pois pode tratar-se de
afibrinogenemia, hipofibrinogenemia ou disfibrinogenemia.

AMOSTRA
Colher sangue em citrato pela manhã após jejum de 4 horas, salvo orientações médicas.

COMPONENTES
Ácido Elágico, Fosfolípide de Cérebro de Coelho

PREPARO DE AMOSTRAS DE REFERÊNCIA

Preparar um pool (referência) misturando plasmas citratados obtidos de, no mínimo 3 indivíduos sadios.
Não usar plasmas de portadores de doenças hepáticas ou de mulheres grávidas ou em uso de
contraceptivos orais.
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TÉCNICA DE ANÁLISE

- TTPA ( reagente pronto para uso ) : homogeneizar o frasco antes do uso.

- Solução de Cloreto de Cálcio 0,025M : pronto para o uso.

Reagente de TTPA 100 μL

Plasma 100 μL

Homogeneizar e incubar de 3 a 5 minutos à 37º C em

banho-maria
Cloreto de Cálcio (pré-
aquecido ) 100 μL

Simultaneamente acionar o cronômetro e agitar o tubo dentro do banho-maria por aproximadamente 30

segundos. Retirar o tubo do banho e continuar agitando o tubo suavemente até o momento da formação do
coágulo. Parar imediatamente o cronômetro e anotar o tempo de coagulação.

INTERVALO DE REFERÊ NCIA

Interpretação dos resultados

Os resultados podem ser expressos de modo distintos:
1 – como tempo de tromboplastina parcial ativada em segundos;
2 – como relação entre o tempo obtido com o desconhecido e o tempo de um plasma controle.
Tempo do desconhecido
R = --------------------------------------
Tempo do teste

Cada laboratório deverá definir seus próprios valores normais a partir de plasmas de referência ou pool de
plasmas frescos normais.

Valores de referência
O intervalo de valores obtidos em indivíduos normais variam entre 30 – 43 segundos e dependem do kit.
Consideram-se fora do normal os valores superiores à 6 segundos de um plasma controle.
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AULA 07 – CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA

1. SIGNIFICADO CLÍNICO:

O sistema de classificação ABO demonstra o fenótipo do indivíduo resultante de herança genética. Os

quatro mais comuns grupos deste sistema são A, B, AB, O, referindo-se a presença de determinado
antígeno na superfície das hemácias. O sistema Rh refere-se, por sua vez, a presença ou ausência do
antígeno “D”, sua presença indica o fenótipo Rh positivo e sua ausência, Rh negativo. O sistema ABO
é o sistema sanguíneo mais antigênico por ter maior capacidade de produção de anticorpos, sendo
sempre requisitado como pré-operatório, na terapia transfusional, e também na gestação como exame
pré-natal para evitar a incompatibilidade materno-fetal com desenvolvimento de doença hemolítica peri-
natal, nas anemias hemolíticas auto-imunes e na exclusão de paternidade. Além da importância na
transfusão sanguínea é muito importante nos transplantes renais, cardíacos, de fígado e de medula
óssea.

2. PRINCIPIO ANALÍTICO:

As hemácias contendo antígenos de superfície presente na membrana dos eritrócitos (aglutinógenos)

A, B e Rh(D), sofrem aglutinação quando em presença de anticorpos específicos (aglutininas) dirigidas
contra eles. Assim,as hemácias dos grupos sangüíneos A,B e AB sofrem aglutinação pela presença
dos anti-soros Anti A, Anti B e anti-A/anti-B, respectivamente. A ausência de aglutinação corresponde
ao grupo 0 (zero), também conhecido como O. Para a detecção do antígeno D (Rh) o princípio é o
mesmo, utilizando-se de um anti-soro anti-Rh. A presença ou ausência de aglutinação caracteriza as
hemácias testadas como Rh-positiva (presença) e Rh-negativa (ausência).
Este teste tem como princípio a interação antígeno-anticorpo, evidenciada através da aglutinação das
hemácias que formam grumos a partir da ligação de anticorpos específicos a antígenos presentes na
sua membrana. Na primeira etapa os anticorpos se ligam aos antígenos “sensibilizando” as hemácias,
na segunda etapa os anticorpos formam “pontes” entre as hemácias sensibilizadas resultando na
aglutinação propriamente dita. Esta reação pode variar de intensidade.
Quando os antígenos não estão presentes na amostra em teste, a reação de aglutinação não
ocorrerá.

3. AMOSTRA:
a) Tipo de amostra: sangue total venoso, arterial, ou sangue de cordão com anticoagulante EDTA.
b) Preservação da amostra: 02 dias em geladeira.
c) Tratamento ou Pré-Tratamento da Amostra: Não se aplica.

4. MATERIAL REQUERIDO:
 Tubos de ensaio 5 ml.
 Galeria para tubos de ensaio.
 Ponteiras.
 Pipeta automática de 50Ul.
 Pipeta automática de 500uL.
 Centrífuga
 Banho-maria
 Anti-soro anti-A
 Anti-soro anti-B
 Anti-soro anti-Rh (D)

5. PROCEDIMENTO – PROVA EM TUBO

 Em tubo previamente identificado com no. e ordem do paciente, aliquotar 100 µl de sangue total e
ressuspender em 2 ml de solução fisiológica 0,9% NaCl , homogeneizando e em seguida levar a
centrifugação por 2 minutos 1500RPM.
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 Decantar o sobrenadante após a centrifugação e repetir a operação de lavagem por mais duas
vezes;
 Preparar uma suspensão de hemácias 5% (50 l da papa de hemácias + 950 l de solução
fisiológica).
 Identificar 03 novos tubos com a mesma identificação do item 7,1 mais as letras A, B e D. Transferir
50µl da suspensão 5% em cada tubo.
 Adicionar 01 gota de cada anti-soro Anti-A, Anti-B e Anti-Rh em seu respectivo tubo previamente
identificado, homogeneizar e levar a centrifugação por 02 min a 1500RPM. OBS: Mantenha o conta-
gotas ou a pipeta na posição vertical para que o volume dispensado seja exato e não escorra pelas
paredes do tubo.

LEITURA:
Agite o tubo de hemólise para ressuspender o botão de hemácias e, ao mesmo tempo, observe como
as hemácias se desprendem. Só analise depois de suspender todas as hemácias do botão.
1- Se aglutinar apenas no tubo A, o tipo sanguíneo é A
2- Se aglutinar apenas no tubo B, o tipo sanguíneo é B
3- Se aglutinar nos tubos A e B, o tipo sanguíneo é AB
4- Se não aglutinar em nenhum dos tubos, o tipo sanguíneo é O.
5- Se houver aglutinação no tubo Rh o paciente é Rh Positivo.
6- Se não houver aglutinação no tubo Rh então fazer o teste de D.Fraco (antigamente chamado de
D.U., porém este termo está em desuso).

Teste de D Fraco.
1- Identificar 1 tubo com o número do paciente
2- Colocar 100 µl da suspensão de hemácias à 5% no tubo
3- Colocar 2 gotas do soro Anti-D e homogeneizar.
4- Colocar em Banho-Maria à 37º C por 20 minutos.
5- Adicionar solução salina a 0,95% até aproximadamente 1 cm da borda do tubo
6- Centrifugar o tubo a 3.400 r.p.m. entre 1 a 2 minutos.
7- Decantar completamente o sobrenadante por inversão do tubo.
8- Repetir os procedimentos 5, 6 e 7 por mais duas vezes.
9- Colocar 2 gotas do soro de Coombs
10- Centrifugar por 15 segundos a 3.400 r.p.m.

Leitura:
- Agite o tubo de hemólise para ressuspender o botão de hemácias e, ao mesmo tempo, observe como
as hemácias se desprendem. Só analise depois de suspender todas as hemácias do botão.
- Se houver aglutinação no tubo então o paciente é Rh Positivo.
- Se não houver aglutinação no tubo então ele é Rh Negativo..
- Efetuar a leitura e anotar o resultado no mapa de trabalho. O técnico ou bioquímico libera os
resultados.

6. PROCEDIMENTO – PROVA EM LÂMINA

 Colocar três pequenas gotas de sangue (aproximadamente 25µl) homogeneizado com distância de
aproximadamente 02cm entre elas numa lâmina ou placa de vidro, bem limpa e seca;
 Colocar uma gota dos anti-soros anti-A, anti-B e anti-Rh rente às gotas de sangue;
 Homogeneizar com o auxílio de uma ponteira ou um palito;
 Promover movimentos de oscilação da placa/lâmina e aguardar 01 minuto até a leitura;
 Efetuar a leitura e liberar/transcrever os resultados .

7. CÁLCULO/LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS:

 Interpretação dos resultados

Positivo : Células aglutinadas.
Negativo : Ausência de aglutinação

Obs. Se necessário, observar a presença/ausência de aglutinação em microscópio sob aumento 100 X.

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 Reações específicas para grupos sanguíneos ABO.

PROVA DIRETA

Anti-A Anti-B
A ++++ -
B - ++++
AB +++++ -
O - -

REAÇÕES ESPECÍFICAS PARA D (RHO)

D(Rh) positivo D fraco (Du) D(Rh) negativo

++++ +/- a +++ -

8. INTERFERENTES:
 Lavagem inadequada das hemácias.
 Bactérias ou outras formas de contaminações.
 Resíduos de fibrina nas suspensões.
 Suspensões de hemácias muito concentradas.
 Os antígenos do sistema ABO somente estarão totalmente desenvolvidos após os 2
anos de idade, podendo haver discrepâncias antes dos 2 anos.
 Existem subgrupos A1 e A2 e subgrupos A1B e A2B que dificultam a interpretação e
necessitam de soros específicos. De 1 a 8% dos indivíduos A2 podem apresentar no
plasma anticorpos anti-B e anti-A1. No caso do subgrupo A2B de 22 a 35% dos
indivíduos podem apresentar o anticorpo anti-A1 no plasma..
 Pacientes com mieloma múltiplo, presença da geléia de Wharton, uso de expansores
plasmáticos formam Rouleaux, dificultando a interpretação dos resultados
 Doença hemolítica do recém-nascido, anemia hemolítica auto-imune, reação transfusional
hemolítica uso de medicamentos, podem causar problemas de leitura de resultados.
 Amostras hemolisadas não podem ser analisadas