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2015-2016

Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa


ONCOBIOLOGIA

SETE CANCROS MORTAIS

Catarina Sofia Micaelo Fernandes

1
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
PREFÁCIO
Cancer got me.

Era uma vez uma pequena célula. Duas pequenas células. Quatro pequenas
células. Um bilião de células. Imortais. Malignas.

Saber que existem sementes da Imortalidade e do Mal espalhadas nos nossos


corpos finitos é demasiado avassalador para qualquer pessoa cujo guilty
pleasure seja a Ciência. Essa pessoa é a Catarina. Coisas a saber sobre a Catarina.

Gosta de Darwin. Lembrou-se que gosta de dodós e achou irrelevante


mencionar. Para continuar no âmbito das idiossincrasias irrelevantes, o seu
dinossauro favorito é o Oviraptor (“ladrão de ovos”, não podia ser mais sneaky).

A Catarina vive no Barreiro e estimou que vai perder 150 dias - 3600 horas - em
transportes para acabar o curso. Antes que perguntem, o que mais tem medo
que lhe roubem são os genes supressores tumorais.

Finalmente, como qualquer célula feliz, a Catarina ocasionalmente estabelece


relações heterotípicas com os seus puros. A Catarina quer imortalizar estas
metástases que invadem a sua vida.

Duarte Lopes Henrique Pina Mariana Marçal

Filipe Pereira Inês Abrantes Patrícia Filipe

Gonçalo Reis Joana Coelho Pilar Burillo

Guilherme Estrela Luís Brázio Sara Sereno

A Catarina gostaria ainda de agradecer à dadora das suas mitocôndrias e àquele


miúdo estranho que herdou os alelos recessivos.

Passem bem.

Catarina Sofia Micaelo Fernandes

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Conteúdo
EPIDEMIOLOGY, CARCINOGENESIS AND RISK FACTORS
The Nature of Cancer ................................................................................................................................... 6
Multi-Step Tumorigenesis ......................................................................................................................... 12
Prevention and Early Detection of Cancer ................................................................................................ 22
Gynecologic Malignancies – Cervical Cancer ............................................................................................ 24
Human Papillomavirus Infections ............................................................................................................. 26
Variation in cancer risk among tissues can be explained by the number of stem cell divisions ............. 28
Substantial contribution of extrinsic risk factors to cancer development ............................................... 30

ONCOGENESIS AND ENDOGENOUS FACTORS/ HEREDITY


Tumor Suppressor Genes .......................................................................................................................... 35
Maintenance of Genomic Integrity and the Development of Cancer ...................................................... 43
Genes, the Environment, and Disease ...................................................................................................... 50
The Practice of Genetics in Clinical Medicine ........................................................................................... 51
Lower Gastrointestinal Cancers – Colorectal Cancer ................................................................................ 53
Two Main Classes of Genes Are Critical for Cancer: Oncogenes and Tumor Suppressor Genes ............. 55
Cancer-causing Mutations Cluster in a Few Fundamental Pathways ...................................................... 56
Familial risk-colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines .......................................................... 57
Hereditary Colorectal Cancer Syndromes: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice
Guideline Endorsement of the Familial Risk–Colorectal Cancer: European Society for Medical Oncology
Clinical Practice Guidelines ........................................................................................................................ 60

CELL CYCLE AND CANCER, BIOLOGY OF METASTASES


Moving Out: Invasion and Metastasis....................................................................................................... 62
Gynecologic Malignancies – Ovarian Cancer ............................................................................................ 80
NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines®) - Ovarian Cancer: Including
Fallopian Tube Cancer and Primary Peritoneal Cancer ............................................................................ 82
Minireview: Human Ovarian Cancer: Biology, Current Management, and Paths to Personalizing
Therapy ...................................................................................................................................................... 85
Ovarian Cancer Development and Metastasis.......................................................................................... 88
Molecular Mechanisms of Platinum Resistance in Ovarian Cancer ......................................................... 92

SIGNAL TRANSDUCTION AND GROWTH FACTORS


Growth Factors, Receptors and Cancer ..................................................................................................... 96
Cytoplasmic Signaling Circuitry Programs Many of the Traits of Cancer ............................................... 106
The Rational Treatment of Cancer .......................................................................................................... 118
Chronic Myeloid Leukemia ...................................................................................................................... 130
Signal Transduction in Cancer ................................................................................................................. 132

PRIMARY TUMOR, MICROMETASTASES AND RELAPSE


Benign and Malignant Diseases of the Prostate – Prostate Cancer ....................................................... 142
Origins of Metastatic Traits ..................................................................................................................... 148

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Androgen deprivation therapy: progress in understanding mechanisms of resistance and optimizing
androgen depletion ................................................................................................................................. 155
A Preoperative Nomogram for Disease Recurrence Following Radical Prostatectomy for Prostate
Cancer....................................................................................................................................................... 159

TUMOR-HOST COMPETITION
Crowd Control: Tumor Immunology and Imunotherapy ........................................................................ 163
Cancer of the Skin – Melanoma .............................................................................................................. 185
Cutaneous melanoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up .... 192
Antibody therapies for melanoma: New and emerging opportunities to activate immunity (Review)
.................................................................................................................................................................. 196
The rapidly evolving therapies for advanced melanoma – towards immunotherapy, molecular
targeted therapy, and beyond ................................................................................................................ 202

IDENTIFICATION OF NEW STRATEGIES IN RISK STRATIFICATION AND TREATMENT


Breast Cancer ........................................................................................................................................... 208
Tailoring therapies—improving the management of early breast cancer: St Gallen International Expert
Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2015 ........................................................... 215
Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Breast Cancer: Ready for Prime Time? ........................................... 220
Clinical Utility of Circulating Tumor Cells in Metastatic Breast Cancer .................................................. 221

TUMOR MICROENVIRONMENT AND SIGNALLING


Cellular Oncogenes .................................................................................................................................. 223
Dialogue Replaces Monologue: Heterotypic Interactions and the Biology of Angiogenesis ................ 229

LIFE, DEATH AND ETERNAL LIFE


pRb and Control of the Cell Cycle Clock .................................................................................................. 245
p53 and Apoptosis: Master Guardian and Executioner .......................................................................... 263
Eternal Life: Cell Immortalization and Tumorigenesis ............................................................................ 280

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EPIDEMIOLOGY, CARCINOGENESIS AND
RISK FACTORS

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The Nature of Cancer
As células individuais têm uma grande autonomia e versatilidade. A maioria das células do
nosso organismo carrega o genoma completo, informação em excesso se considerarmos o que
cada célula vai requerer ao longo da sua vida. As células estaminais retêm a capacidade de
crescer e dividir, participando na morfogénese e manutenção tecidual, mesmo após o
desenvolvimento do organismo estar completo. Em simultâneo, esta autonomia e versatilidade
representam um perigo na medida em que se uma destas células ganhar acesso a informação
genómica anormal pode ter um comportamento inapropriado. Adicionalmente, a corrupção da
sequência genómica (mutações) pode levar à aquisição de fenótipos anormais – populações
proliferativas que não respeitam a estrutura e função fisiológica dos tecidos.

Os tumores têm uma microarquitectura menos organizada que o tecido normal circundante,
mas preservam algumas características histológicas do tecido de origem, podendo deduzir-se
qual o órgão onde surgiu o tumor primário (numa minoria dos casos, 2-4%, as características
diferenciadoras dos tecidos percursores estão ausentes nas células tumorais – tumores
anaplásicos/desdiferenciados). Os tumores que adquiriram a capacidade de metastizar são
classificados como malignos e são responsáveis por 90% das mortes por cancro. Os tumores
que crescem localmente são classificados como benignos (podem apresentar riscos pelos seus
efeitos compressivos ou efeitos endócrinos/hormonais, por exemplo).

O epitélio tem duas funções fundamentais – a primeira é protecção das camadas celulares
subjacentes dos conteúdos do lúmen da cavidade que selam ou do meio externo (caso da pele)
– acometida nos carcinomas de células escamosas (pele, cavidade nasal, orofaringe, laringe,
esófago, pulmão, cérvix); a segunda é a função especializada de secreção – comprometida nos
adenocarcinomas (pulmão, colon, mama, pâncreas, estômago, esófago, próstata, endométrio,
ovário). No geral, os carcinomas são responsáveis por 80% das mortes por cancro no mundo
ocidental.

Quanto aos tecidos não epiteliais, assinala-se o tecido conjuntivo de origem mesodérmica,
que origina 1% dos cancros – sarcomas (várias células mesenquimais podem estar envolvidas –
fibroblastos, adipócitos, osteoblastos, miócitos) – o tecido hematopoiético, também derivado
da mesoderme, cujos cancros contabilizam 7% da mortalidade por cancro – leucemias
(populações monoclonais em circulação) e linfomas (massas tumorais sólidas) – e ainda o
sistema nervoso central e periférico que ocasiona 1,3% dos cancros diagnosticados e 2,5% das
mortes por cancro – tumores neuroectodérmicos (gliomas, glioblastomas, neuroblastomas,
schwannomas, meduloblastomas).

Outros tumores incluem: o melanoma (origem na crista neural, mas sem relação com o
sistema nervoso); o carcinoma de pequenas células do pulmão (contém células com função
neurosecretora, com origem provável nas células epiteliais endodérmicas por
transdiferenciação) e os teratomas (origem nas células percursoras germinativas que falham a
migração durante o desenvolvimento embrionário e persistem em localizações ectópicas,
mantendo a pluripotência – diferenciam-se em diversos tecidos das três camadas embrionárias
tendo um crescimento benigno e localizado; as células deste tipo de tumor são wild-type).

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Crescimento hiperplásico - quando existe uma ligeira desregulação na proliferação
dum tecido e há crescimento excessivo de células “normais”.

C Metaplasia - determinados tipos celulares surgem fora da sua localização normal -


O células com aparência normal num sítio anormal, frequente nas transições epiteliais.
N
Displasia - a aparência citológica já é considerada anormal (variabilidade na forma
C
e tamanho nuclear, rácio núcleo-citoplasma alterado, actividade mitótica aumentada) –
E
transição entre crescimentos benignos e pré-malignos.
I
T Neoplasia - massas macroscópicas, como pólipos, papilomas ou verrugas traduzem
O um estado de maior anormalidade – expansão substancial.
S
Metástase - o grau seguinte de anormalidade é representado por tumores invasivos
– rompem a membrana basal e colonizam outros locais anatomicamente distantes do
organismo, tendo a capacidade de se adaptar ao novo ambiente tecidual (utilização
correcta do termo “cancro”; colectivamente, os crescimentos benignos e malignos
designam-se por neoplasias).

A classificação de tumores deve considerar 3 parâmetros: estado de diferenciação (epitelial


ou não, misto), a origem embrionária e o comportamento biológico (benigno ou maligno).

População tumoral monoclonal – em todas as


células tumorais estão presentes os mesmos População tumoral policlonal – a
marcadores genéticos/bioquímicos, ou seja, todas massa tumoral é composta por várias
subpopulações geneticamente distintas.
descendem duma célula ancestral comum.

As primeiras experiências que avaliaram a clonalidade tumoral basearam-se em eventos não


genéticos/epigenéticos, avaliando a repetição de padrões de expressão/silenciamento entre as
células da população tumoral (ex: G6PD no cromossoma X). A confirmação deste conceito foi
sustentada pela observação dos mielomas em que as células B produzem um anticorpo
idêntico, indicando a descendência de um percursor único entre a população linfocitária que,

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em circunstâncias normais, é francamente heterogénea. Outro exemplo da monoclonalidade
são as aberrações cromossómicas que podem ser visualizadas durante a metáfase e são
transversais a todas as células duma dada população tumoral.

Contudo, a monoclonalidade aparente dum tumor não deve ser encarada em termos
absolutos, pois durante o desenvolvimento a origem do tumor pode ter sido policlonal e no
momento presente o tumor estar a ser dominado pela subpopulação com menor tempo de
divisão. De modo semelhante, a heterogeneidade genética dum tumor não implica estritamente
uma origem policlonal, podendo ser o produto da instabilidade genética duma população
inicialmente homogénea.

O metabolismo energético das células tumorais difere das células normais. Warburg (1924)
descobriu que mesmo em condições de oxigenação óptimas muitos tipos de células tumorais
realizam a glicólise gerando lactato como produto final (como se estivessem sujeitas a
hipoxia/condições anaeróbicas) – “glicólise aeróbia”/efeito de Warburg. Esta metabolização
energeticamente ineficiente da glicose que ocorre em 80% dos cancros (2ATPs vs 36ATPs
resultantes da oxidação do piruvato no ciclo dos ácidos cítricos) é compensada por uma
importação intracelular de grande quantidade de glicose (expressão aumentada de GLUT1).
Ainda não é totalmente compreendido se este comportamento bizarro é um requisito para a
manutenção do fenótipo tumoral ou é apenas uma consequência da transformação celular.
Possíveis explicações incluem o acesso inadequado a oxigénio (nem sempre é verdade) e papéis
secundários à produção de ATP (intermediários da via glicolítica que são percursores de
moléculas envolvidas no crescimento celular/vias biossintéticas). As células tumorais destinam
apenas 1% da glicose importada à produção de ATP (em células normais representa 30% da
glicose importada).

A piruvato cinase catalisa a


última reacção da glicólise
(conversão de fosfoenolpiruvato a
piruvato). A isoforma M2 desta
enzima, que é também a isoforma
embrionária, é expressa nas células
tumorais e conduz à redução do
piruvato a lactato, enquanto a
isoforma M1 é expressa em tecidos
adultos e assegura que o piruvato é
mobilizado do citosol para a
mitocôndria. As mitocôndrias das
células tumorais são perfeitamente
funcionais. Em suma, o
crescimento tumoral depende da
expressão da PK-M2, do GLUT1 e da
lactato desidrogenase A.

O processo biológico implícito no risco de cancro – a divisão celular constante – levaria a


crer que as diferentes populações humanas tivessem incidências semelhantes de cancro. Entre
os tumores que ocorrem com frequências comparáveis a nível global destacam-se certos tipos
de tumores pediátricos (há uma forte aleatoriedade nestas ocorrências). No entanto, as taxas
de incidência variam dramaticamente para determinados tipos de cancro. Esta variabilidade
pode ser explicada por factores hereditários e ambientais. Experiências em migrantes
evidenciam a importância destes últimos.

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As taxas de incidência de vários
tipos de cancro em imigrantes
japoneses no Hawaii aproximam-se
das taxas observadas na população
nativa. Logo, as diferenças antes da
imigração não eram maioritariamente
devidas a diferenças no pool genético
da população japonesa em relação à
americana.

Tanto os agentes carcinogéneos químicos como físicos actuam como mutagénicos.

Theodore Boveri, 1914 – os cromossomas, que carregam a informação genética, são


aberrantes nas células cancerosas, que, consequentemente, são células mutantes (mais tarde,
em 1960, suportado pela observação do cromossoma Filadélfia, t9:22, em muitos casos de
leucemia mieloide crónica);

Herman Muller, 1927 – exposição a raio X origina mutações em Drosophila melanogaster;

Bruce Ames, 1975 – demonstrou que os carcinogéneos químicos actuam com diferentes
potências (experiências em roedores). Para medir essas potências mutagénicas utilizou uma
linhagem mutante de Salmonella incapaz de crescer em meios sem histidina – sendo esta
mutação “reversível”, dado que perante a exposição a um determinado carcinogéneo, o alelo
wild-type poderia aparecer (genótipo histidina independente), conferindo a capacidade de
crescimento em meio selectivo: contando-se as colónias bacterianas que “readquiriram” essa
resistência, estima-se a potência do agente carcinogéneo;

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Este ensaio de mutagénese tem uma fraqueza – alguns
compostos químicos actuam apenas como pro-carcinogéneos
e não como carcinogéneos, ou seja, é a sua metabolização
pelos seres vivos que gera os metabolitos (activação
metabólica) que agem como carcinogéneos finais (estado
mutagénico), o que torna difícil a comparação entre bactérias
e células de mamíferos. Solução: mistura prévia de fígado
homogeneizado de roedores (liberta as enzimas hepáticas)
com o composto inicial antes da mistura do composto com
Salmonella. Actualmente, sabe-se que a conversão metabólica
de pro-carcinogéneos em carcinogéneos é frequentemente
mediada por enzimas paradoxalmente envolvidas na
destoxificação de substâncias exógenas.

A conclusão mais importante do trabalho de Ames foi a


de químicos com elevado potencial mutagénico terem alto
potencial carcinogénico. Esta relação carcinogéneo-
mutagénico salientada em bactérias pode ser extrapolada
para mamíferos, dado o substrato biológico da
transformação ser idêntico – o DNA. O teste de Ames
utilizou-se como screening para prever a mutagenicidade de
vários compostos.

Aparentemente, todos os compostos mutagénicos serão prováveis carcinogénicos. Na


verdade, existem compostos carcinogénicos que não são necessariamente mutagénicos. Nos
anos 90, o teste de Ames demonstrou que até 40% das substâncias que eram carcinogéneos
conhecidos em roedores não tiveram um ensaio de mutagenicidade em Salmonella positivo.
Portanto alguns carcinogéneos actuam por intermédio de mecanismos não genéticos –
promotores de tumor.

Muitos dos carcinogéneos catalogados pelo teste de Ames são provenientes de alimentos
(exemplo: carnes vermelhas, que após cozinhadas geram aminas heterocíclicas, potentes
mutagénicos), incluindo plantas (meio de defesa da predação). No entanto, existe uma
complexidade intrínseca na análise deste efeito, visto que a quase totalidade destes compostos
oriundos da dieta sofrem metebolização gastrointestinal e/ou hepática, multiplicando o número
de espécies químicas distintas potencialmente envolvidas na carcinogénese. Existem ainda
diferenças bioquímicas acentuadas entre diferentes tipos celulares que não podem ser
desprezadas (por exemplo, os hepatócitos são mais capazes de inactivar substâncias que os
fibroblastos).

NOTA: Outros testes de mutagenicidade incluem: o sister chromatid exchange (SCE) – mede o crossing
over entre cromátides que permanecem emparelhadas na fase G2; unscheduled DNA synthesis assay
(UDS) - marcação do DNA em fase G1 e G2 (fases não replicativas) que permite verificar síntese de DNA
extemporânea, um bom indicador de reparação do dano genómico.

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É fundamental compreender que não existem testes satisfatoriamente elucidativos para a
identificação dos carcinogéneos. A maioria dos testes preditivos é elusiva – certas exposições
que epidemiologicamente têm significado não se traduzem em testes de carcinogenicidade
positivos (ex: tabaco) e o inverso também foi verificado.

RESUMO:

Todas as células do organismo são descendência do ovo fertilizado – os tumores não são
corpos estranhos, mas sim crescimentos derivados dos tecidos normais;

Muitos tumores são descendentes de uma única célula que cruzou a fronteira da
normalidade/malignidade, originando biliões de descendentes que constituem a massa
neoplásica;

Muitas correlações entre factores de estilo de vida e frequência de certos tipos de cancro
estão propostas, sem, no entanto, se conhecer os mecanismos biológicos e bioquímicos
subjacentes à maioria destas observações – mistérios etiológicos.

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Multi-Step Tumorigenesis
As células normais aproximam-se, de forma gradual, do fenótipo neoplásico – progressão
tumoral. Raramente, este processo progride de forma ao seu produto final, a massa tumoral,
ser clinicamente detectável. Este processo é impulsionado por mutações e alterações
epigenéticas nos genes que controlam os traços fenotípicos distintivos das células malignas,
por exemplo, a proliferação e a sobrevivência celular. É um processo sequencial e complexo em
que cada passo na progressão tumoral representa a ruptura duma barreira contra essa
progressão.

A maioria dos cancros demora décadas a desenvolver-se. Este conceito tem bases
epidemiológicas (por exemplo, a latência de 30 anos entre o princípio da generalização do fumo
de tabaco e o aumento de incidência de cancro do pulmão). Isto tem implicações consideráveis
em Saúde Pública, porque o surgimento tardio desta doença faz com que a sua prevenção
tivesse pouca tradução em termos de aumento da esperança média de vida. Obriga ainda ao
cálculo da incidência ajustada a idade para efectuar comparações entre diferentes populações.

Dada uma função que representa a probabilidade do evento do tipo an, significa que n+1
eventos independentes, com probabilidade de ocorrência semelhante ao longo do tempo, têm
de se verificar para que o outcome final – o diagnóstico de tumor – seja alcançado. Isto é uma
visão simplista da progressão tumoral porque alguns passos críticos podem propiciar-se mais
rapidamente e isso não é contabilizado na cinética da progressão tumoral, que reflecte apenas
a influência das etapas limitantes mais lentas. Portanto, é provável que o número de eventos
requeridos seja superior que o previsto pela fórmula an. Os últimos passos da progressão
tumoral provavelmente requerem menos tempo que as etapas prévias porque as células já
adquiriram várias mutações oncogénicas e aprenderam a proliferar mais rapidamente,
diminuindo o tempo entre cada expansão clonal e os seus genomas são mais mutáveis.

O cancro é inevitável. Virtualmente, se conseguíssemos excluir as mortes pelas restantes


doenças, todos morreríamos por cancro. Uma sequência de eventos improváveis é solicitada
para o aparecimento do tumor e a probabilidade de muitos destes eventos é similar entre os
humanos. Com o envelhecimento, todos nós teremos populações de células em localizações
diversas que completaram alguns destes passos. Todavia, eventualmente o indivíduo morre por
outra causa e não chega a viver o suficiente para todas estas etapas serem completadas. Ainda
assim, as autópsias revelam que 60-70% dos indivíduos que morrem em idade avançada portam
tumores não diagnosticados.

Embora hajam expressões matemáticas que calculam o risco de incidência de cancro ao


longo da vida a nível populacional, há certos indivíduos em que a probabilidade dos eventos
patogénicos ocorrerem é muito mais elevada (susceptibilidade genética ou ambiental). E
existem ainda cancros que não aumentam progressivamente com o aumento da idade
(exemplo: retinoblastoma – a população celular normal que pode servir como percursora das
células cancerosas corresponde às células indiferenciadas percursoras da retina, que se
diferenciam posteriormente em células pós-mitóticas que já não são alvo de transformação,
abolindo a formação de tumores após os 6/7 anos de idade; os cancros pediátricos têm uma
patogénese muito diferente dos típicos cancros adultos).

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Quanto ao aparecimento de cancro fortemente influenciado por exposições nocivas, a
duração da exposição é muito mais determinante do que a idade absoluta dos indivíduos
expostos.

Análises histopatológicas demonstram o caracter progressivo da formação tumoral. Há


estados crescentes de anormalidade desde, tecidos ligeiramente desviantes e dificilmente
distinguíveis da estrutura normal a situações caóticas de tecido altamente maligno. Estas
sucessões histopatológicas não devem ser consideradas a regra absoluta, pois há estados
intermediários que não evoluem para tumor e tumores que “escapam” a essas fases com
fenótipo intermédio.

No caso do cancro colo-rectal, a relação percursor/produto entre os adenomas e os


carcinomas tem melhor evidência histopatológica (em parte devido à acessibilidade do órgão)
e é sustentada: 1) pelo crescimento directo do carcinoma a partir do pólipo adenomatoso
(raramente observável visto que a expansão tumoral culmina precocemente com a obliteração
do adenoma, o percursor benigno); 2) pela observação de que a remoção de pólipos
adenomatosos encontrados em colonoscopias diminui em 80% a incidência de cancro nos
pacientes sujeitos a esse procedimento e 3) por estudos longitudinais (ex: pacientes com PAF).

As células vão acumulando alterações genéticas e epigenéticas ao longo da progressão


tumoral. Algumas mudanças podem relembrar o comportamento durante o desenvolvimento
embrionário, ou seja, mudanças nos programas de expressão génica, mais do que alterações
no próprio genoma. Outras mudanças gravitam em torno de alterações hereditárias cumulativas
no genoma, como mutações somáticas e eventos de metilação de promotores.

O paralelo entre a evolução genética e a progressão fenotípica neoplásica foi posto em


evidência para os carcinomas do cólon pelos investigadores da Johns Hopkins Medical School,
nos anos 80. Pesquisaram alelos mutantes de genes incluindo o oncogene ras e vários
supressores de tumor (avaliados por perda de heterozigotia, LOH, em certas regiões
cromossómicas) em amostras dum vasto espectro, desde o adenoma pequeno até ao
carcinoma.

As células adquirem um fenótipo cada vez mais neoplásico ao longo da


progressão tumoral, correspondendo a um aumento no nº de loci genéticos alterados
– activação de oncogenes + inactivação de genes supressores tumorais (em maior
escala). E ainda: hipometilação generalizada (instabilidade cromossómica).

5q – perda de APC; 17p – perda de p53; 18q - incerto

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A perda de APC (verifica-se em cerca de 80% dos cancros colo-rectais) costuma ser o evento
iniciador da progressão tumoral, pelos seus efeitos biológicos (i.e. aprisionamento nas criptas do
cólon e potenciação da função da β-catenina), mas os eventos seguintes, mesmo que se encontrem
todos presentes, não seguem necessariamente a sequência apresentada. Os eventos de progressão
maligna subsequentes à perda de APC podem seguir vias alternativas à activação do ras, mas que
conferem uma vantagem fisiológica semelhante à mutação deste oncogene.

Nota: Normalmente alelos ras mutados e alelos p53 mutados não coexistem.

Apesar destas modificações, a grande maioria dos tumores (95%) retém traços de
diferenciação – morfologias distintas e marcadores proteicos – o que permite identificar a
célula de origem. A perda de características dos programas de diferenciação tecido-específicos
é incompleta, mesmo sob a acção de efeitos oncogénicos desdiferenciadores (por exemplo,
perda de pRB ou ganho de função Myc).

A maioria dos tumores do cólon esporádicos inicia-se com a mutação no gene APC. No caso
da PAF (polipose adenomatosa familiar), os indivíduos herdam essa mutação num dos alelos e
como a perda de heterozigotia é relativamente frequente, a perda funcional total do APC nestes
indivíduos é francamente acelerada. Assumindo que esta etapa crítica já não está dependente
da ocorrência pouco frequente de mutações somáticas, a susceptibilidade ao aparecimento de
cancro está muito aumentada.
Field cancerization – ocasionalmente, em
órgãos afectados por tumores esporádicos
aparecem múltiplos tumores (pré-malignos ou
malignos) aparentemente independentes,
separados por epitélio normal, o que parece
extremamente improvável. De facto, existe
uma mutação ou conjunto de mutações
partilhada por estes tumores, produto de um
mecanismo de mutação somática. São células
que adquiriram vantagem proliferativa ou de
sobrevivência mas que morfologicamente
aparentam ser normais e que expandiram
ocupando uma área razoável. Duas células
clonais localizadas nesta área podem sofrer
mutações independentes e aí originar cancro.

O desenvolvimento de cancro parece ser regrado pela teoria evolucionária Darwiniana, se


tomarmos como unidade evolucionária a célula individual em competição com outras células
da população. As mutações criam variabilidade genética numa população celular criando a
matriz heterogénea para as forças selectivas actuarem, favorecendo a expansão de células e
da sua descendência que comportem alelos mutantes que conferem vantagens proliferativas e
de sobrevivência no microambiente tecidual. Quando os clones geneticamente avantajados
atingem um número muito elevado (106) torna-se provável ocorrer uma segunda mutação na
população clonal. Se o efeito desta segunda mutação for aditivo, uma subpopulação clonal pode
expandir-se e até anular a população percursora da qual se originou. Esta sequência de eventos
repete-se e de uma forma simplista, a progressão do cancro a nível genético e celular pode ser
explicada por uma sequência de 4 a 6 sucessões clonais, impulsionadas por mutações
específicas.

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Deve-se atentar nos seguintes aspectos: há alterações epigenéticas que têm um papel
proeminente na progressão tumoral e não são contempladas pelo modelo Darwiniano; o
número de alterações distintas pode ser o dobro do número de loci implicados, já que a
inactivação de um gene supressor de tumor, que representa a maioria das alterações genómicas
envolvidas na progressão tumoral, é um processo feito em dois passos (inactivação dos dois
alelos) e o número de mutações adquiridas pelas células durante o processo excede
largamente o número de mutações funcionalmente relevantes que efectivamente promovem
a progressão (nº de mutações passenger > nº de mutações driver).

Acrescenta-se ainda que nem todas as células da população clonal (pré-) neoplásica são
biologicamente equivalentes e capazes de desencadear uma nova onda de expansão clonal. O
uso da técnica FACS (fluorescence-activated cell sorting) em células de leucemia mieloide aguda
permitiu segregar duas populações: uma minoritária (1%), tumorigénica (quando injectada em
ratinhos imunocomprometidos) e com capacidade de autorrenovação e outra maioritária,
composta por células mais diferenciadas e com pouca capacidade proliferativa. Estas
observações são extrapoláveis a outros tipos de tumores e indicam que as populações
neoplásicas com origem em tecidos diferentes se organizam como os tecidos normais em que
há um pequeno pool de células pouco diferenciadas (estaminais) que conseguem gerar um
grande número de descendentes, com um potencial proliferativo limitado.

A célula estaminal possui divisão assimétrica, isto é, origina células filhas fenotipicamente
distintas: uma mantém a estaminalidade e a outra inicia o programa de diferenciação. A última,
denomina-se célula progenitora (ou “transit-amplifying cell”) e é intermediária entre a célula
estaminal e a sua descendente totalmente diferenciada. Amplifica a descendência por meio de
várias divisões simétricas até se obterem descendentes diferenciados/pós-mitóticos. Assim, a
célula estaminal só precisa de se dividir uma vez para originar inúmeras células descendentes,
podendo fazê-lo de forma periódica em vez de contínua. Estes princípios são aplicáveis à
organização das células neoplásicas. A célula iniciadora do tumor (“cancer stem cell”, CSC)
apropria-se dos programas de estaminalidade que operam nos tecidos normais, tendo
capacidade de autorrenovação e de gerar uma grande descendência que, embora
geneticamente idêntica, perdeu a capacidade de autorrenovação e subsequentemente, de
iniciar um tumor. Assumindo como verosímil esta organização hierárquica, permanece incerto
quais as subpopulações que adquirem mutações que despoletam novas expansões clonais,

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novas etapas na progressão tumoral. Será a célula de origem uma célula estaminal ou poderá
ser uma célula progenitora? E ainda: as CSCs costumam ser mais resistentes à quimioterapia e
radioterapia convencionais.

A sucessão clonal não é um processo linear devido à heterogeneidade intra-tumoral. Com


a progressão tumoral o genoma torna-se mais instável e as mutações e consequente
diversificação genética surgem a uma taxa superior ao previsto pela simples actuação da
selecção Darwiniana e pela eliminação dos clones menos adaptados. Em vez de se considerar
que a massa tumoral é composta por células geneticamente idênticas que participam numa
expansão clonal linear, deve-se ramificar as ondas de expansão clonal como resultado da
coexistência de subclones geneticamente distintos.

A hibridação genómica comparativa permite estudar o aumento ou diminuição de número


de cópias de vários segmentos cromossómicos. As flutuações observadas nas células tumorais
são o reflexo de mudanças na “dose” de genes oncosupressores e oncogenes e o número de
mudanças no número de cópias destes segmentos excede o número de sucessões clonais,
implicando a diversificação genética.

Entre outras fontes geradoras de diversidade genotípica intra-tumoral conta-se a


possibilidade de metástases distantes, alvos de evolução genética, retornarem ao local do
tumor primário e estabelecerem colónias.

Como fonte de diversidade fenotípica tem-se ainda a plasticidade epigenética, avaliada em


função da diversidade de expressão proteica numa população tumoral (por exemplo, de
receptores de VEGF e EGF). No glioblastoma, um tumor composto por vários tipos celulares
neuroectrodérmicos, as células neoplásicas podem transdiferenciar-se em células endoteliais,
de origem embrionária diferente, auxiliando o processo de angiogénese. Esta adopção de um
fenótipo diferente (activação de um programa de diferenciação diferente), através de
mecanismos epigenéticos, pelas subpopulações neoplásicas que partilham um genótipo comum
pode ser uma maneira de agirem de forma simbiótica e se adaptarem mais eficazmente ao
microambiente tumoral.

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O modelo Darwiniano do desenvolvimento tumoral é difícil de validar experimentalmente
porque: tal implicaria uma identificação precisa das alterações genéticas e epigenéticas
responsáveis por cada onda de expansão clonal, tarefa muito complexa dado o grande excesso
de alterações face ao número de sucessões clonais; genes supressores de tumor inactivados
por metilação não são identificáveis por sequenciação genómica, tendo de se avaliar o seu
silenciamento por análises do estado de metilação ou dos transcritos – genómica funcional – o
que ainda não distingue alterações resultantes de metilação patológica dos promotores da
metilação inerente a diferentes processos de diferenciação; as cinéticas dos eventos críticos
podem ser muito díspares (por exemplo, a perda de heterozigotia é 100 a 1000 vezes mais
frequente do que a activação ras) e a perda dos mecanismos de reparação pode acelerar os
eventos finais da progressão tumoral.

As células normais são resistentes à transformação maligna por um único gene mutado.
Experiências em que se transfectou um oncogene ras activado por uma mutação pontual,
oriundo dum carcinoma vesical humano, para fibroblastos normais NIH3T3 em roedores,
revelaram a transformação maligna destas células. No entanto, as células NIH3T3 não são
verdadeiramente normais – estão adaptadas ao crescimento indefinido em cultura. Quando
estas experiências se repetiram em células primárias, não imortalizadas, estas não foram
responsivas à transformação induzida pelo oncogene ras, embora expressassem a oncoproteína
codificada pelo gene mutado. Acresce-se ainda o exemplo de indivíduos que têm uma mutação
germline no receptor de factores de crescimento Kit que é expresso de forma constitutiva,
ligando-independente e que só desenvolvem tumores estromais gastro-intestinais décadas
depois. À semelhança deste exemplo, outras mutações germline só culminam no
desenvolvimento tumores (ex: leucemias na infância) após alguns anos de vida, o que sugere a
intervenção de múltiplas alterações genéticas.

Dois genes mutantes podem colaborar, de forma complementar, na transformação celular


que seria inviável caso somente um estivesse mutado, abordagem parecida à adoptada por
alguns vírus que contêm dois oncogenes. Convencionalmente, o par de genes divide-se em dois
grupos funcionais, um com propriedades ras-like (citoplasmático, afectando a cascata de
sinalização mitogénica) e outro myc-like (nuclear, perturbando o controlo do ciclo celular). Cada
um dos oncogenes perturba, portanto, uma subclasse específica dos circuitos regulatórios
celulares (pelo menos dois devem estar corrompidos). Cada um produz efeitos pleiotrópicos,
mas individualmente não é suficiente, não consegue evocar todos os efeitos necessários à
génese tumoral (é irracional em termos biológicos que uma única mutação num proto-oncogene
desencadeasse o processo tumoral, tal é intolerado pela natureza).

ras – independência de ancoragem, aparência arredondada, perda de inibição por contacto (≈raf, src, bcl-2)

myc – imortalização, redução da dependência de factores de crescimento (≈E1A)

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Embora muitos vírus de DNA estejam envolvidos na tumorigénese, nenhum consegue
transformar completamente uma célula infectada autonomamente. São requeridos
adicionalmente processos de mutação somática e metilação de promotores, para a conversão
tumoral (existem muitas pessoas infectadas por alguns destes vírus, mas poucas “contraem” os
tumores – ex: 90% das pessoas estão infectadas por EBV, mas poucas “contraem” o linfoma de
Burkitt).

As células humanas são muito resistentes à imortalização (em roedores algumas passagens
in vitro podem gerar linhas celulares imortais de forma espontânea, mas em humanos estas
células têm tendência a tornar-se senescentes). Também são igualmente resistentes à
transformação – a co-transfecção de dois oncogenes como ilustrada pelo esquema acima
(respeitante a roedores) falha o propósito de iniciar o processo transformante. Atente-se ainda
que o DNA telomérico humano é muito mais curto que o dos roedores (daí que para imortalizar
células humanas se introduza o gene hTERT, telomerase reverse transcriptase). O risco biológico
intrínseco de desenvolvimento de cancro é superior no humano face ao roedor: maior número
de divisões celulares (1016) somado com uma vida mais longa.

Pensa-se que cinco circuitos regulatórios estejam deturpados nas células com capacidade
de iniciação tumoral: a via sinalizadora mitogénica controlada pela Ras; o checkpoint do ciclo
celular controlado pela pRb; a via de controlo da p53; a via de manutenção telomérica,
envolvendo a hTERT e as vias de sinalização controladas pela proteína fosfatase 2A (mTOR, Myc,
βcatenina, PKB/Akt). Ainda assim, no caso dos cancros pediátricos não parece ter havido tempo
suficiente para acumular esta quantidade (5 hits) de aberrações – podem surgir directamente
de células embrionárias transformadas com recurso a menos alterações que as células
percursoras dos tumores adultos. Dentro do espectro das células embrionárias, as estaminais
são as únicas até ao momento que sendo geneticamente wild-type são tumorigénicas – geram
teratomas quando implantadas em hospedeiros singénicos. Quiçá as células embrionárias
tardias precisem de um número de alterações entre o número requerido pelas células
embrionárias estaminais, isto é, zero, e o número requerido pelas células humanas adultas,
cinco.

NOTA: Nalguns tumores há mutações funcionalmente redundantes – afectam a mesma das cinco vias
chave. Noutros tumores, há mutações complementares – afectam duas vias distintas e são mutuamente
exclusivas.

Na tumorigénse há participação de agentes carcinogéneos não-mutagénicos. Tratamentos


com um agente iniciador, um carcinogéneo mutagénico (químico, físico ou infecioso), deixam
uma memória estável (provavelmente uma alteração genética) num cluster de células expostas
- iniciação. Quando estas células “iniciadas” são expostas a um agente promotor proliferam
vigorosamente (originam um papiloma, por exemplo) - promoção. Se a exposição ao promotor
for interrompida estas alterações proliferativas são reversíveis – sugere actuação do promotor
por mecanismo não genético. Não obstante, se a exposição ao agente promotor for prolongada,
algumas massas proliferativas podem evoluir para um estado promotor-independente –
sugestivo da ocorrência de uma segunda alteração genética independente. A partir desta fase,
evolução da carcinogénese pode ser acelerada pela reexposição ao agente iniciador, presumível
mutagénio – progressão.

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Nota: Carcinogéneo completo é um termo referente a agentes que são iniciadores e promotores em
simultâneo.

Iniciador – DMBA

Promotor – TPA

1ª mutação – ras

2ª mutação – p53

Agentes tóxicos também podem promover o aparecimento de tumores. Por exemplo, o


tabaco e as bebidas destiladas estão envolvidos no aparecimento de cancros da cabeça e do
pescoço. O tabaco (iniciador) possui componentes mutagénicos, mas o etanol (promotor) actua
sobretudo através dos efeitos citotóxicos nas células epiteliais, nomeadamente pela indução da
morte das células superficiais estimulando a resposta proliferativa das células estaminais
(basais) e aumentando, consequentemente, o índice mitótico.

NOTA: Outro exemplo: a síndrome hereditária de Kostmann, caracteriza-se pela produção duma
elastase mutante pelos neutrófilos que actua como um citotóxico endógeno, levando à deplecção da
população neutrofílica. A neutropenia estimula as células progenitoras mieloides a proliferar
excessivamente o que pode culminar no aparecimento duma leucemia mieloide aguda.

Agentes mitogénicos, como as hormonas esteroides (estrogénios, progesterona e


testosterona) também podem promover a carcinogénese (são promotores endógenos). O
cancro da mama está correlacionado positivamente com o número de ciclos menstruais ao
longo da vida e inversamente com a idade de aparecimento da menarca. As mulheres pós-
menopáusicas que sofrem de cancro da mama têm um nível circulante de estrogénios superior
ao das mulheres não afectadas.

Frequentemente, estados de inflamação crónica propulsionam a progressão tumoral. Os


promotores tumorais raramente actuam puramente através do seu efeito citotóxico ou
mitogénico. Mecanismos de inflamação são cruciais para impulsionar a expansão clonal. Quando
se introduzem células humanas de adenoma do cólon em ratinhos imunocomprometidos a
tumorigénese só é verificada quando se induz concomitantemente inflamação estromal.

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Exemplos: a inflamação intestinal crónica está relacionada com o desenvolvimento de
adenomas e carcinomas do cólon; infecções crónicas por HBV (acção sinérgica com aflatoxina-
B1, um iniciador) e HCV predispõem ao aparecimento de carcinomas hepatocelulares e a
infecção por H. pylori associa-se com o surgimento de linfomas MALT.

A promoção tumoral dependente de condições inflamatórias opera através de vias de


sinalização definidas. Uma das vias bioquímicas implicadas é a via da PKC (alvo do promotor TPA)
que activa a IKK (IkB cinase), que, por sua vez, fosforila e inactiva o IkB (inibidor do NF-kB; o NF-
kB migra assim para o núcleo activando programas tanscricionais anti-apoptóticos e
proliferativos; também induz expressão do TNFα, uma citocina que despoleta inflamação
localizada).

Demonstrou-se que esta via actua quer nas células epiteliais do tecido inflamado, quer nas
células estromais, estimulando a libertação de sinais pró-inflamatórios.

Tanto o NF-kB como o TNFα são indutores da via da Cox-2 que permite a biossíntese da
prostaglandina E2 (PGE2), uma molécula pró-inflamatória. Isto consubstancia o facto de os
fármacos anti-inflamatórios reduzirem a incidência de certos tipos de cancro (20% de redução
da mortalidade por cancro após 20 anos de toma diária de aspirina; prevenção de adenomas e
regressão de pólipos adenomatosos). O fenótipo adquirido pelas células sujeitas às
prostaglandinas inflamatórias é muito semelhante ao conferido pelos oncogenes. De facto, a
promoção tumoral pode criar uma fenocópia, isto é, um estado que relembra o gerado pelos
oncogenes, mas que tem mecanismos inerentes muito distintos. A colaboração sequencial
entre promotores e oncogenes é plausível – no princípio, as células estão dependentes dos
efeitos reversíveis do promotor tumoral até ocasionalmente adquirirem oncogenes adicionais,
tornando-se independentes dos efeitos iniciais.

A presença de promotores não genotóxicos é altamente definidora da velocidade de


progressão tumoral. Isto é deduzível a partir de três aspectos: os promotores incitam a
expansão clonal permitindo a existência de populações muito numerosas onde eventos
mutacionais improváveis se tornam possíveis; estes agentes favorecem a mutagénese de forma
indirecta, isto é, através da fomentação da replicação do DNA, que tem uma taxa de erro
própria e de divisões celulares defeituosas (perda de heterozigotia por erros de segregação
cromossómica, recombinação mitótica) e as mitoses repetitivas conduzem a um encurtamento
progressivo dos telómeros, levando a fenómenos de breakage-fusion-bridge (BFB).
Adicionalmente, a promoção tumoral que envolve inflamação recruta PMN que são fontes de
EROs e ERNs, com efeitos mutagénicos neste contexto.

RESUMO:

É possível que a maioria dos carcinogéneos actue como promotor tumoral e que, assim,
muitos tipos de cancro surjam sem contributo de substâncias genotóxicas exógenas, ou seja,

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o dano genético ser gerado integralmente por processos endógenos (diariamente, uma célula
pode sofrer 10000 lesões químicas de origem endógena);

O teste de Ames não tem utilidade para identificar promotores tumorais;

Os processos inflamatórios estão implicados na promoção de cancros virais (excelente


hipótese de prevenção oncológica) e não virais (possível alvo de terapêutica profilática);

Os promotores hormonais continuam a desempenhar um papel importante em tumores


malignos bem estabelecidos (tumores hormono-dependentes);

Na maioria das situações, as alterações iniciadoras são necessárias à manutenção do tumor,


findo o processo de progressão tumoral;

Contam-se entre os atributos das células malignas: dependência reduzida de factores


mitogénicos exógenos; resistência a sinais inibitórios de crescimento; capacidade de
multiplicação indefinida; baixa susceptibilidade à apoptose; angiogénese; metastização; evasão
à eliminação pelo sistema imunitário e instabilidade genómica;

Cada atributo é um produto multifactorial da alteração de vários genes (várias vias


envolvidas) e cada alteração num gene pode ter efeitos pleiotrópicos (vias interligadas entre
si).

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Prevention and Early Detection of Cancer
O melhor conhecimento do processo de carcinogénese tem permitido que a prevenção do
cancro e a detecção precoce se tenham expandido além da mera identificação e evitamento de
carcinogéneos. Intervenções específicas para prevenir o cancro nos indivíduos de alto risco e o
rastreio efectivo constituem os pilares da prevenção. A prevenção compreende identificação e
manipulação dos factores biológicos, genéticos e ambientais envolvidos na etiopatogénese do
cancro.

Educação e Hábitos Saudáveis: A educação pública para o evitamento dos factores de risco
identificados e a promoção de hábitos saudáveis contribuem para a prevenção e controlo do
cancro. Os dois principais factores de risco ambientais (e, portanto, modificáveis) são o tabaco
e a obesidade. O tabaco correlaciona-se com a incidência de cancros do pulmão, laringe,
orofaringe, esófago, rim, bexiga, estômago e pâncreas. A obesidade está associada com
aumento de risco para cancros do cólon, mama (mulheres pós-menopausa), endométrio, rim e
esófago. Destacam-se como medidas a adoptar: a cessação tabágica, o incremento da prática
de exercício físico e a modificação da dieta.

Quimioprevenção do Cancro: A quimioprevenção envolve a utilização de agentes químicos


naturais ou sintéticos para reverter, suprimir ou prevenir a carcinogénese antes do
desenvolvimento dum tumor invasivo/maligno, através de acções anti-mutagénicas, de
modulação hormonal, anti-inflamatórias, anti-proliferativas e pró-apoptóticas. Assim, o
cancro pode ser prevenido ou controlado ao se interferir com os factores que determinam a
iniciação (as alterações iniciais herdadas ou adquiridas através de acção de carcinogéneos
físicos, químicos ou infeciosos) e a promoção (a progressão através do processo carcinogénico
e as mudanças fenotípicas associadas). Exemplos: a utilização regular de AINEs pode prevenir a
formação de adenomas no cólon ou causar a regressão de pólipos adenomatosos; o tamoxifeno
(um anti-estrogénios com actividade de agonista estrogénico parcial nalguns tecidos, como o
endométrio e o osso) pode ser administrado em mulheres com alto risco de desenvolver cancro
da mama; as vacinas dirigidas a agentes infeciosos que causam cancro podem reduzir o risco de
aparecimento do cancro associado

Prevenção Cirúrgica do Cancro: A prevenção cirúrgica é destinada a indivíduos com risco


muito elevado de desenvolver cancro num dado órgão. Exemplos: realização de colectomia em
pacientes com PAF; mastectomia bilateral profilática em mulheres com predisposição genética
para o cancro da mama e ooforectomia profilática, em situações semelhantes.

Rastreio de Cancro: Quanto aos rastreios/diagnóstico precoce a sua avaliação deve ter em
consideração a potencial existência de vieses, nomeadamente de selecção (viés de participação
– a população que costuma cumprir o rastreio pode ser diferente da população alvo: são
pessoas com uma atitude mais conscienciosa perante a Saúde, o que pode influenciar um
melhor prognóstico e uma menor mortalidade – healthy volunteer effect; viés de casos
prevalentes/length bias – os testes de rastreio normalmente detectam melhor cancros com
crescimento mais lento e menos agressivos, que ficam sobre-representados – podendo até
haver sobre-diagnóstico, ou seja detecção de tumores que cumprem os critérios histológicos
mas que nunca serão clinicamente significativos ou causar morte, visto que os tumores
costumam aparecer em idades em que outras causas de morte são mais relevantes -, o que

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implica que os cancros diagnosticados no período inter-rastreios são normalmente mais
agressivos e com pior prognóstico) e viés de antecipação diagnóstica/lead-time bias (o teste
não influencia a história natural da doença, mas a sobrevida é aparentemente aumentada pelo
simples facto de o diagnóstico ocorrer mais precocemente e não por haver um prolongamento
da vida real).

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Gynecologic Malignancies – Cervical Cancer
Considerações Globais: O cancro cervical é a segunda neoplasia maligna mais comum e mais
letal nas mulheres a nível mundial, devido à prevalência da infecção com estirpes de HPV
(human papillomavirus) de alto risco e ao acesso limitado ao rastreio por esfregaço de
Papanicolau em regiões pouco desenvolvidas. O desenvolvimento de vacinas efectivas para os
tipos de HPV de alto risco torna imperativo criar estratégias para garantir a sua distribuição a
raparigas e rapazes antes do início da actividade sexual.

A Infecção por HPV e a Vacinação Preventiva: A infecção por HPV é o evento iniciador da
progressão neoplásica na grande maioria das mulheres com cancro cervical invasivo. Este vírus
de dsDNA infecta o epitélio perto da zona de transformação do cérvix. Mais de 60 tipos de HPV
são conhecidos e aproximadamente 20 tipos têm capacidade de gerar displasia de alto grau e
neoplasias malignas. O HPV-16 e o HPV-18 são os tipos mais frequentemente associados com o
surgimento de displasia de alto grau e são alvo das duas vacinas aprovadas (bivalente e
quadrivalente). A grande maioria dos adultos sexualmente activos é exposto ao HPV e a
maioria das mulheres livra-se da infecção sem nenhuma intervenção.

O genoma do HPV codifica sete genes early (E), destacando-se o E6 e o E7, cujos produtos se
conseguem ligar à RB e à p53, respectivamente, inibindo as funções de checkpoints do ciclo
celular destas proteínas regulatórias. Estas acções conduzem à imortalização do epitélio, mas
não à sua transformação.

Há uma minoria de mulheres que falham em combater a infecção, com subsequente


integração do genoma do HPV nas células do hospedeiro. Tipicamente, após alguns anos,
algumas destas mulheres desenvolvem displasia de alto grau. O intervalo entre a progressão da
lesão displásica até ao carcinoma compreende anos e esta progressão requer a aquisição de
mutações genéticas pelas células epiteliais infectadas e imortalizadas.

Os factores de risco para a infecção por HPV incluem o número elevado de parceiros sexuais,
a idade precoce da primeira relação sexual e a história pessoal de doença venérea. O tabaco é
um cofactor – as fumadoras têm maior risco de desenvolver displasia pela infecção por HPV.

As vacinas actualmente aprovadas incluem as proteínas late (L) recombinantes L1 e L2 do


HPV-16 e 18. A vacinação antes do início da actividade sexual reduz dramaticamente a taxa de
infecção por ambos os tipos, conferindo protecção parcial a outros tipos de HPV. Como o risco
de infecção por HPV não é completamente eliminado, as mulheres vacinadas continuam a ser
alvo de rastreio. A descida abrupta da incidência de cancro cervical com a generalização do teste
do esfregaço Papanicolau favorece a sua efectividade. Até mesmo a inspecção visual do cérvix
com pré-aplicação de ácido acetético demonstrou uma redução de 30% na morte por cancro
cervical. O teste molecular, utilizando PCR, aumenta a sensibilidade de detecção da
incorporação do HPV, mas identifica muitas mulheres com infecções transitórias que não
justificam a intervenção médica.

Apresentação Clínica: A maioria das neoplasias cervicais são carcinomas de células


pavimentosas associados com a infecção por HPV. Eventualmente, podem surgir
adenocarcinomas também relacionados com a infecção no canal endocervical. O objectivo

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primário do esfregaço Papanicolau é a detecção de displasia cervical pré-invasiva assintomática
do epitélio. Os carcinomas invasivos costumam já apresentar sintomas.

Tratamento: Os tumores cervicais de estádio I estão confinados ao cérvix e podem ser


tratados cirurgicamente (ex: traquelectomia), enquanto os de estádio II se estendem até à parte
superior da vagina ou ao tecido mole paracervical, devendo ser tratados com combinação de
quimio e radioterapia. Os tumores de estádio III implicam a parte inferior da vagina ou as
paredes pélvicas e os de estádio IV invadem a bexiga ou o recto ou outros locais distantes.

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Human Papillomavirus Infections
Harold zur Hausen postulou que a infecção por HPV estava associada com o aparecimento
de cancro cervical. A infecção genital por HPV é extremamente comum e as suas manifestações
vão desde a infecção assintomática, passando pelas verrugas genitais e pelas lesões displásicas
até aos cancros invasivos do ânus, do pénis, da vulva, da vagina e do cérvix, bem como da
orofaringe.

Patogénese: O HPV é um vírus de dsDNA cujo genoma consiste numa região de genes early
(E), numa região de genes late (L) e numa região não codificante de elementos regulatórios. As
proteínas E1, E2, E5, E6 e E7 são expressas precocemente, sendo necessárias para a replicação
viral e para a transformação celular. As proteínas E6 e E7 favorecem a transformação maligna
ao se ligarem às proteínas regulatórias do ciclo celular RB e p53, respectivamente, conduzindo
à sua degradação. A tradução dos transcriptos L1 e L2 ocorre mais tardiamente (codificam
proteínas da cápside viral).

Aproximadamente 40 tipos de HPV são encontrados no tracto anogenital. O HPV-6 e o HPV-


11 causam o aparecimento de verrugas genitais e contabilizam cerca de 10% das lesões cervicais
de baixo grau, sendo considerados tipos de baixo risco. O HPV-16 e o HPV-18 causam o
surgimento de lesões displásicas e cancros invasivos do cérvix, constituindo tipos de alto risco.

O HPV tem como alvo os queratinócitos basais, expostos após microtrauma. O ciclo de
replicação é completado à medida que os queratinócitos se vão diferenciando. A infecção é
transmitida pelo contacto com vírus contidos nos queratinócitos que descamam ou vírus livres
a partir dum indivíduo afectado.

A resposta imunitária celular tem um papel muito importante no controlo da progressão


natural da infecção por HPV. A examinação histológica de lesões de indivíduos que
experienciaram regressão de verrugas genitais evidencia a presença dum infiltrado inflamatório
constituído por células T (os linfócitos T CD4+ têm um papel particularmente relevante,
evidenciado pelas taxas de infecção superiores em indivíduos imunocomprometidos, em
especial os infectados por HIV) e macrófagos. Esta resposta pode evitar a progressão da doença
cervical. Os anticorpos séricos surgem em cerca de 60 a 70% dos indivíduos e a protecção contra
uma reinfecção específica está associada com a presença de anticorpos neutralizantes contra
um determinado tipo, que atingem o epitélio cervical através de transudação e exsudação.

Epidemiologia e História Natural das Neoplasias Malignas associadas ao HPV: O HPV é


transmitido por via sexual. Até 40% das mulheres jovens apresentam evidência de infecção por
HPV. O número de parceiros sexuais correlaciona-se positivamente com a probabilidade de
infecção por HPV.

O HPV é o agente etiológico major da quase totalidade dos cancros cervicais. O tempo
compreendido entre a infecção e o diagnóstico de cancro do cérvix pode exceder as duas
décadas. Os picos de incidência situam-se na quinta e sexta década (uma década mais cedo nas
mulheres que vivem em países pobres). As portadoras de tipos oncogénicos de HPV têm o maior
risco de desenvolver displasia cervical de alto grau e, subsequentemente, cancro. O HPV-16 é
especialmente virulento e causa 50% dos cancros cervicais. Conjuntamente com o HPV-18
contabiliza 70% dos carcinomas cervicais pavimentosos e 85% dos adenocarcinomas cervicais

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(bem como 90% dos cancros anais). Os restantes 30% de cancros cervicais são causados por
outros tipos oncogénicos. Conquanto a infecção por um tipo de HPV oncogénico seja necessária
para o desenvolvimento duma neoplasia maligna, apenas 3-5% das mulheres afectadas irão
desenvolver este tipo de cancro, mesmo na ausência de rastreio. Outros cancros associados ao
HPV incluem o cancro vaginal e vulvar, o cancro do pénis e o carcinoma de células pavimentosas
da orofaringe. A infecção por HIV acelera a progressão natural das infecções por HPV.

Manifestações Clínicas da Infecção por HPV: Incluem verrugas anogenitais, infecções


cervicais subclínicas (o cérvix pode aparentar normalidade ou revelar proliferações papilares na
zona de transformação) e cancro cervical sintomático (zona erodida a ulcerada, facilmente
sangrável).

Prevenção da Infecção por HPV: Vacinas: As vacinas efectivas utilizam partículas vírus-like
que consistem na proteína major da cápside L1. Estas partículas contêm os mesmos epítopos
que o virião HPV, mas não comportam o material genético e, por isso, não conseguem transmitir
a infecção. A sua imunogenicidade advém do desenvolvimento de anticorpos neutralizantes
dirigidos aos epítopos exibidos nas cápsides virais. São vacinas muito eficazes contra a infecção
pelos tipos contemplados (na vacina bivalente, o HPV-16 e o HPV-18 e na quadrivalente, os
mesmos, para além do HPV-6 e do HPV-11). No entanto, não evidenciam efeito terapêutico
contra a infecção activa ou contra a doença. Os dados provenientes de ensaios clínicos sugerem
que ambas as vacinas oferecem protecção cruzada contra outros tipos não vacinais de HPV.
Vacinas de segunda geração que incluam outros tipos oncogénicos de HPV (31, -33, -35, -45, -52
e -58) estão a ser desenvolvidas. Após a vacinação, o rastreio pelo teste do Papanicolau continua
a ser recomendado para detectar a doença causada por outros tipos oncogénicos de HPV.

Prevenção da Doença Associada ao HPV: Depois da ocorrência de infecção por HPV a


prevenção da doença associada baseia-se no rastreio. Cerca de 75% das mulheres que vivem
nos países desenvolvidos foram alvo de rastreio nos últimos 5 anos, enquanto apenas 5% das
mulheres que vivem nos países em desenvolvimento estão nas mesmas circunstâncias. O
método por excelência utilizado para o rastreio do cancro cervical é a citologia via esfregaço
Papanicolau. A realização concomitante dum teste para detectar o DNA viral não é
recomendada em mulheres jovens, as quais poderão obter resultados positivos que não se
correlacionam com a presença de uma neoplasia intra-epitelial de alto grau.

Tratamento das Lesões associadas ao HPV: Nenhuma modalidade terapêutica provou


eliminar o HPV do tecido adjacente ao tecido infectado. A eficácia dos tratamentos é limitada
pelas recorrências frequentes, devidas a reinfecção a partir dum parceiro infectado, a
reactivação dos vírus latentes ou ainda a auto-inoculação a partir das células vizinhas
infectadas. Os objectivos do tratamento pautam-se pela prevenção da transmissão viral, pela
erradicação de lesões pré-malignas e pela redução de sintomas.

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Variation in cancer risk among tissues can be
explained by the number of stem cell divisions
Alguns tipos teciduais originam células cancerosas com muito maior frequência que outros
(desde P=6,9% para o cancro do pulmão a P=0.00072% para a cartilagem laríngea).

Algumas diferenças são parcialmente explicadas por exposição a factores extrínsecos. No


entanto, estas exposições não conseguem clarificar diferenças significativas entre o risco de
cancros a nível do tracto alimentar (desde P=4,82% no intestino grosso a P=0,20% no intestino
delgado; acrescenta-se ainda que os tumores epiteliais do intestino delgado são 3x menos
comuns que os tumores cerebrais, embora esse epitélio esteja submetido a níveis muito mais
elevados de agentes mutagénicos ambientais). Outro elemento de variação do risco é a
hereditariedade (5 a 10% dos cancros têm um componente hereditário). Ainda assim, para uma
mesma mutação, por exemplo, no gene APC (mutado na polipose adenomatosa familiar, PAF),
responsável pela predisposição para cancro colo-rectal e do intestino delgado, os cancros
ocorrem com maior frequência no intestino grosso.

Um terceiro determinante tem de ser tido em atenção para explicar estas diferenças tecido-
específicas – os efeitos estocásticos relacionados com o número de divisões cumulativo das
células estaminais em cada tecido ao longo da vida. O cancro resulta de alterações genéticas e
epigenéticas adquiridas e a taxa de mutabilidade endógena de todos os tipos de células
humanas aparenta ser idêntica, o que permite conceptualizar esta teoria para órgãos onde o
número e a dinâmica das células estaminais esteja bem descrito (31 tipos de tecido). A maioria
das células nos tecidos está parcial ou totalmente diferenciada, têm uma vida curta e são
improváveis iniciadoras de tumor. Por outro lado, as células estaminais, com capacidade de
autorrenovação e de manutenção da arquitectura tecidual, têm essa capacidade iniciadora.

Este artigo evidencia a correlação quantitativa forte (0,81), aplicável a cancros com ordens
de incidência muito díspares, entre o risco de muitos tipos de cancro e o número de divisões
das células estaminais que mantêm a homeostasia tecidual, sugerindo que apenas um terço
da variação do risco de cancro a nível tecidual é atribuível a factores ambientais ou a
predisposições herdadas. A maioria do risco será devido a “bad luck” – mutações aleatórias que
surgem durante a replicação do DNA em células normais não cancerosas.

28
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Um “extra risk score” (ERS), produto do risco de cancro pelo número total de divisões de
células estaminais foi calculado para distinguir estes efeitos replicativos estocásticos de outros
factores causativos ambientais e hereditários (alto ERS – 9 tipos tumorais, maior ligação a
factores externos, tumores D/determinísticos vs baixo ERS – 22 tipos de tumor, maior ligação
factores replicativos, tumores R/replicativos). Conquanto o contributo dos determinantes
clássicos (ambiente e hereditariedade) aparenta ser mínimo para os tumores R, até para os
tumores D os determinantes replicativos parecem ser essenciais, sendo os determinantes
clássicos aditivos neste caso.

Verde – tumores R (ERS negativo); Azul – tumores D (ERS positivo)

Por exemplo, na PAF o cancro colo-rectal é 30x mais frequente que o cancro duodenal. A
explicação pode residir na existência de 150x mais divisões de células estaminais no cólon em
relação ao duodeno. O risco seria muito mais reduzido se as células epiteliais do cólon não se
dividissem constantemente. Em ratinhos com a mutação no APC o padrão exibido é o inverso:
tumores do intestino delgado são mais frequentes e é precisamente o epitélio do intestino
delgado que está sujeito a mais divisões celulares.

Outro exemplo é o caso dos melanócitos e das células basais da epiderme que estando ambos
expostos ao mesmo carcinogéneo (radiação UV), é mais provável o surgimento dum carcinoma
de células basais do que um melanoma, visto este primeiro tipo celular sofrer maior número de
divisões celulares.

Ainda suportando esta tese, salienta-se a relação exponencial estabelecida entre a idade e
a incidência de cancro. Propõe-se então que o factor estocástico subjacente à importância das
divisões das células estaminais para a carcinogénese sejam as mutações somáticas. Esta
proposta põe em causa o sucesso da prevenção primária, principalmente em tumores R (cujo
foco passaria assim a ser a prevenção secundária).

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Substantial contribution of extrinsic risk factors
to cancer development
As investigações recentes evidenciam a correlação (0,81) entre o risco específico de
desenvolvimento de cancro num tecido e o número de divisões das células estaminais
específicas desse tecido (bem como o tamanho baseline da população de células estaminais), o
que implica um risco de cancro intrínseco e inevitável (“bad luck hypothesis”). Este artigo estima
que a carga associada a factores de risco intrínsecos é modesta (10-30%) e que as taxas de
acumulação de mutações endógenas por processos intrínsecos (erros aleatórios na replicação
do DNA) não são suficientes para contabilizar os riscos de cancro reais/observados. A
predominância do contributo de factores extrínsecos (radiação UV, radiação ionizante,
carcinogéneos) corrobora a importância da prevenção.

Incontroláveis Modificáveis
Prevenção

3 - Acumulação de erros – sobretudo mutações “driver” (conferem vantagem selectiva


a um clone no seu microambiente, aumentando a sobrevivência e expansão)

NOTA: Actualmente acredita-se que a génese do cancro está na transformação maligna de células
progenitoras teciduais e de células estaminais (e não tanto de células teciduais diferenciadas que sofrem
desdiferenciação).

Argumentos a favor:

As análises de correlação não conseguem discernir entre a contribuição dos factores


intrínsecos e extrínsecos (influenciam a divisão das células estaminais em simultâneo)

Linha azul: acção de um mutagénio


potente (ex: radiação) que quadruplica o
risco de todos os cancros. A proporção de
cancro associado a processos intrínsecos
será minima (no máximo 25%, se
assumirmos que todo o risco original era
devido a estes processos). Todavia, a
análise de regressão da situação original
(linha preta, Tomasetti & Vogelstein) e
hipotética - risco de cancro vs nº divisões
de células estaminais - revela uma
correlação idêntica (0,81 – declive).

A linha limite de risco intrínseco é mais baixa. Numa abordagem baseada nos dados
existentes, estimou-se o risco intrínseco tendo em conta os limites inferiores da correlação entre
o risco de cancro vs divisões das células estaminais nesse tecido – o valor de risco mais baixo
para um dado número de divisões de células estaminais. A base para esta abordagem reside
na suposição que cancros com o mesmo número de divisões de células estaminais devem
partilhar o mesmo risco intrínseco basal, se a relação for causal. Se a incidência de determinados
tipos de cancro é mais elevada do que essa linha base (ex: cancro do pulmão em fumadores)

30
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isso implica determinantes biológicos adicionais – factores de risco extrínsecos. De facto, a
maioria dos tipos de cancro tem um excesso de risco relativo à linha base de risco intrínseco
muito significativo.

Estimativa de risco
baseada no total de
divisões das células
estaminais teciduais
(Tomasetti & Vogelstein)

Tracejado vermelho –
linhas de regressão de
risco intrínseco

Pontos azuis - cancros


com risco extrínseco
considerável (baseado em
estudos epidemiológicos)

(%) – percentagens de
risco extrínseco

Riscos extrínsecos vs turnover celular: Analisaram-se os dados com base no número total
de divisões das células teciduais (e não só na dinâmica de divisão das células estaminais) que
ccc
depende da homeostasia tecidual e do turnover dos tecidos – risco de cancro vs total de divisões
celulares (correlação de 0,75). Esta abordagem considera cada célula em divisão como uma
potencial célula iniciadora de cancro, admitindo que a génese do desenvolvimento tumoral
pode residir em células em diferentes graus hierárquicos – desde a célula estaminal, à célula
progenitora (comprometida com uma linhagem celular) e mesmo à célula diferenciada. Para
discriminar o risco atribuível a factores intrínsecos, consideraram-se os riscos mais baixos de
cancro para um dado número de divisões celulares. As conclusões finais são semelhantes a
(%
quando se evidenciam apenas as divisões de células estaminais – mais de 90% do risco não é
imputável a factores intrínsecos (nota: nesta análise inclui-se o cancro da mama e da próstata,
cancros com elevada incidência e não reportados na análise original). Independentemente de
analisarmos só uma subpopulação (ex: células estaminais) ou todas as células em divisão os
factores de risco intrínseco não desempenham um papel causal major.

Estimativa baseada no
total de divisões celulares
teciduais

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Evidências epidemiológicas: Um número vasto de estudos epidemiológicos estabeleceu a
evidência robusta que muitos cancros têm uma proporção de risco atribuível a exposições
ambientais substancial. Variações geográficas na incidência de cancro da mama (5x maior na
Europa Ocidental do que na Ásia Oriental ou África Central) e da próstata (25x maior na Austrália
do que na Ásia Central e do Sul) e estudos em imigrantes que imigraram de países com baixa
incidência de um determinado tipo de cancro para países onde a incidência é superior e
adquiriram um risco maior de desenvolver esse tipo de cancro, consubstanciam a evidência do
contributo de factores extrínsecos. No entanto, estes actuam de forma multifactorial – um
único factor de risco extrínseco não contabiliza a carga etiológica total de risco extrínseco de
um tipo de cancro.

Exemplos: cancro colo-rectal (75% atribuível à dieta), melanoma (65-86% exposição solar),
carcinomas basais e escamosos (90% radiação UV), cancro esofágico, cabeça e pescoço (75%
tabaco e álcool), cancro do colo do útero (90% HPV), cancro anal (90% HPV), cancro orofaríngeo
(70% HPV), carcinoma hepatocelular (80% HBV e HCV) e cancro gástrico (65-80% H. pylori).

Dados do Surveillance, Epidemiology, and End Results Program (SEER) (EUA, 1973–2012)
demonstram que enquanto alguns tipos de cancro têm vindo a diminuir ou a manter a
incidência (bexiga, esofágico) outros têm vindo a aumentar a incidência (melanoma, pulmão,
tiroide, rim, fígado…). Estes aumentos sugerem a preponderância de riscos relacionados com
ambientes em mudança. A maioria destes cancros (excepção – intestino delgado) localiza-se
acima da linha de risco intrínseco proposta ajustada às divisões celulares.

Análise das “assinaturas” mutacionais do cancro (as “impressões digitais” deixadas no


genoma por diferentes processos mutagénicos): Revelaram cerca de 30 “assinaturas” distintas.
Duas “assinaturas” mutacionais (1A e 1B) correlacionam-se fortemente com a idade, sugerindo
uma taxa de aquisição constante – processos intrínsecos. Todas as restantes mutações não têm
correlações consistentes com a idade (aquisição em diferentes fases da vida), sugerindo
exposição a carcinogéneos extrínsecos (radiação UV, tabaco). A maioria dos cancros tem uma
grande proporção de mutações extrínsecas (100% mieloma, pulmão e tiroide; 80-90% - bexiga,
colo-rectal e útero).

Modelos teóricos para o risco intrínseco: Numa outra abordagem, modelou-se o risco de
cancro por processos intrínsecos, variando o numero de hits (k, mutações em genes driver)
necessários para o estabelecimento de cancro. Derivou-se a distribuição de probabilidades de
propagação das mutações em genes driver de uma geração celular para a próxima e
estabeleceu-se a relação entre as divisões celulares e o risco intrínseco devido a erros/mutações
- theoretical lifetime intrinsic risk (tLIR) – usando o número de células estaminais teciduais, bem
como o número total de células teciduais (sobrestimação). Se apenas 1 hit for requerido o risco
ao longo da vida para quase todos os tipos de cancro aproxima-se de 100% - uma mutação não
é suficiente para o aparecimento de cancro, senão, teoricamente toda a gente teria todos os
tipos de cancro. Se 2 hits forem necessários o risco intrínseco de cancro diminui para cancros
com um baixo número de divisões de células estaminais, mas mantem-se muito elevado para
cancros com um elevado número de divisões celulares (esta hipótese não parece apropriada
para cancros como o carcinoma de células basais, o adenocarcinoma do cólon, o melanoma, a
LMA e cancro do intestino delgado e do duodeno). A hipótese mais razoável é a dos 3 hits, para
a qual os modelos de risco intrínseco ficam abaixo das linhas de risco intrínsecas. Quantos mais

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hits forem implicados (+3), mais desce o risco intrínseco. Este modelo demonstra que o risco
de cancro devido a erros/mutações é baixo para quase todos os cancros que requerem mais de
duas mutações (ainda mais baixo do que o estimado pela linha de risco intrínseco). Mesmo
ajustando a diferentes taxas de mutação em genes driver nas células estaminais em divisão
celular, para um k=3, a contribuição de factores de risco extrínsecos situa-se entre os 70-90%.

Tracejado verde - linhas de risco intrínseco estimadas em relação ao nº de células estaminais teciduais

Tracejado azul - linhas de risco intrínseco estimadas em relação ao nº de células homeostáticas teciduais

Tracejado vermelho - linhas base de risco intrínseco

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ONCOGENESIS AND ENDOGENOUS
FACTORS/ HEREDITY

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Tumor Suppressor Genes
Os oncogenes explicam como é conduzido o processo de proliferação celular – as proteínas
por eles codificadas participam na recepção processamento dos sinais estimulatórios de
crescimento com origem no ambiente extracelular. Quando mutadas, o fluxo de sinais fica
adulterado, isto é, em vez de esporádico é emitido continuamente. Este processo promotor de
crescimento é contrabalançado por outros intervenientes no sistema biológico anti-
crescimento – os genes supressores de tumor (TSGs). O seu envolvimento na tumorigénese é
explicado por eventos de perda/inactivação.

O estudo de vírus indutores de tumor sugere que as alterações provocadas pela integração
do genoma viral nas células normais actuam de modo dominante, culminando na transformação
celular – os oncogenes introduzidos ditavam o comportamento da célula mesmo na presença e
expressão de genes supressores.

Foram realizadas experiências de fusão em que células de diferentes fenótipos/genótipos


foram colocadas em cultura em monocamada numa placa de Petri e a fusão das suas
membranas celulares foi induzida por um agente fusogénico (químico ou glicoproteína viral),
originando uma célula grande com citoplasma único – sincício. Se mais células se fundirem ao
sincício, a célula gigante multinucleada resultante denomina-se policarion. Se as duas células
fundidas forem diferentes, a célula hibrida formada é um heterocarion – tem 2 núcleos
geneticamente distintos.

Pode haver selecção somente deste último tipo de células de


fusão com utilização de marcadores selectivos – se cada um dos
genomas conferir resistência a um antibiótico diferente, a co-
administração dos dois antibióticos seleciona só as células que
incorporaram os dois tipos de genoma. Células com vários núcleos
são geneticamente inviáveis, mas células com dois núcleos
conseguem proliferar, sendo que os dois conjuntos cromossómicos
partilham o mesmo aparelho mitótico – a célula filha terá um único
núcleo com componentes cromossómicos das duas células fundidas.

À medida que se dividem, estas linhas celulares híbridas


perdem gradualmente componentes cromossómicos, uma vez
que têm material cromossómico supranumerário. Uma vez que
esta perda ocorre de acordo com o que é preferencial
(“dominante”), seria de esperar que em híbridos de células
normais + tumorais o fenótipo dominante canceroso prevalecesse
com o decorrer das divisões celulares. Mas quando estas células
híbridas foram injectadas em animais revelaram ser não
tumorigénicas: o fenótipo celular maligno é recessivo. (Excepção:
se a célula parental transformada proviesse duma infecção viral,
o fenótipo da célula tumoral era dominante.)

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Argumentos a favor da existência de TSG: é mais fácil inactivar um gene por processos
mutacionais (vários locais visados por mutações pontuais ou delecções de sequências
codificantes) do que hiperactivar um gene (ex: o gene ras só é activado por mutações pontuais
nos codões 12, 13 ou 61).

Argumentos contra: os mamíferos têm um genoma diploide – se os alelos envolvidos na


tumorigénese forem recessivos o tumor não beneficia nada da inactivação duma cópia, devido
à existência do alelo dominante – o fenótipo dum alelo mutante inactivado é recessivo na
presença dum alelo wild-type intacto (antagoniza o fenótipo canceroso). Seriam requeridas duas
alterações genéticas independentes, o que é complexo e improvável (P=Pmutação2=(10-6)2=10-12),
para além de serem necessárias várias alterações genéticas.

Estudos no retinoblastoma (tumor dos percursores das células fotorreceptoras):

Forma esporádica – em famílias sem


história prévia de retinoblastoma, as crianças
têm um único tumor num dos olhos – RB
unilateral. Se removido, a criança não
costuma ter risco futuro aumentado de RB ou
de outro tumor.

Forma familiar – múltiplos focos de tumor


surgem nos dois olhos – RB bilateral. Apesar
da cura, há risco 500x superior de
osteossarcoma na adolescência e de outros
tumores na idade adulta. É transmitida para a
geração seguinte segundo o comportamento
dum alelo mendeliano dominante.

Estudando-se a cinética das duas formas, tornou-se evidente que a taxa de aparecimento
dos tumores familiares era consistente com a ocorrência dum evento aleatório único enquanto
os tumores esporádicos eram produto da ocorrência de dois eventos aleatórios. Este último
caso é explicado pela necessidade de duas mutações somáticas (2 hits) sucessivas na linha
celular retinal que inactivem as duas cópias funcionais do gene Rb. Contudo, na primeira
situação, uma das mutações no gene Rb já foi transmitida pela célula germinativa de um dos
progenitores – só é precisa uma mutação somática (1 hit) para ocorrer o knock out do alelo WT.

O comportamento do gene Rb é típico dos genes supressores de tumor. A doença, num


indivíduo com uma mutação herdada, comporta-se de forma dominante (ao nível do
organismo), mas o alelo mutante actua de forma recessiva (ao nível da célula).

As células cancerosas incipientes têm maneiras de eliminar as cópias WT dos TSGs. Dada a
probabilidade de ocorrência de dois eventos mutacionais independentes ser 10-12 por geração
celular e dada a população alvo ser relativamente pequena no RB parece improvável que as duas
cópias pudessem ser eliminadas. Todavia, presumindo que numa célula ocorre a primeira

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inactivação do gene Rb (P=10-6), tornando-se heterozigótica, verifica-se troca de informação
genética entre os cromossomas homólogos (entre o alelo WT e o defeituoso) durante a fase G2
ou M. Normalmente, a recombinação entre os cromossomas só ocorre durante a meiose. Este
tipo de recombinação que ocorre durante a proliferação celular entre um cromatídeo do
cromossoma WT e outro cromatídeo do cromossoma emparelhado mutante designa-se
recombinação mitótica (P=10-5 a 10-4 – muito superior à P de inactivação mutacional). A troca é
recíproca, mantendo a morfologia dos cromossomas participantes intacta. Célula mutante
homozigótica
Célula WT
homozigótica

Antes da recombinação mitótica os dois cromossomas homólogos eram bastante diferentes


– um de origem materna e outro de origem paterna, heterozigóticos em muitos dos loci
genéticos. Se a recombinação mitótica for conducente a homozigotia do locus Rb, os genes na
vizinhança desse locus também perdem a heterozigotia – perda de heterozigotia (LOH, loss of
heterozygosity).

Outra forma de alcançar a perda de heterozigotia é pelo processo de conversão génica


(frequência superior à recombinação mitótica) – uma cadeia de DNA a ser replicada troca
subitamente de cadeia molde, formando um híbrido com a cadeia de DNA complementar
pertencente ao cromossoma homólogo. Esta cadeia em formação volta a utilizar como molde
de síntese a cadeia original (“copy choice”).

*gene
mutado

Se ocorrer uma delecção duma região cromossómica sem reposição por uma cópia
duplicada do cromossoma homólogo resulta em hemizigotia dessa região cromossómica (os
genes dessa região só estão presentes numa cópia), o que em termos funcionais se traduz
também por perda de heterozigotia se a célula conseguir sobreviver.

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Em muitos tumores, a perda de heterozigotia ainda pode ser conseguida pela perda dum
cromossoma inteiro, pela não disjunção e consequente segregação inapropriada dos
cromossomas durante a mitose (uma das células retém ambos os cromatídeos irmãos de um
dado cromossoma). A célula filha que herdou 3 cromossomas/triploide (2 idênticos e 1 não
idêntico) pode perder o cromossoma diferente, mantendo dois cromossomas iguais.

Outras alterações genéticas que corrompam a estrutura cromossómica e afectem o cariótipo


das células, como translocações entre cromossomas não homólogos despoletadas por double-
strand breaks, são também possíveis fontes de perda de heterozigotia.

NOTA: Em ratinhos, o emparelhamento dos cromossomas que facilita a recombinação mitótica


depende da identidade, em termos de sequência nucleotídica, dos dois DNAs. Pode perspectivar-se que
estes eventos também sejam mais frequentes em populações endogâmicas humanas, em que os
cromossomas são geneticamente mais semelhantes.

Como os eventos de perda de heterozigotia acontecem com uma frequência muito superior
aos eventos mutacionais, é previsível que a maioria dos RB apresente LOH no loci Rb e nos loci
circundantes do que dois alelos mutantes Rb distintos, inactivados por eventos independentes.

NOTA: O gene Rb localiza-se em 13q14. O gene que codifica a enzima esterase D já estava
caracterizado antes do gene Rb e localiza-se na mesma região cromossómica. Tem dois alelos que migram
distintamente no gel de electroforese. A análise de células tumorais de crianças heterozigóticas para este
locus revelou perda de um dos alelos – perda de heterozigotia. Mais tarde o próprio gene Rb foi
identificado e os alelos mutantes costumavam estar presentes em configuração homozigótica.

Os eventos de perda de heterozigotia podem ser utilizados para “descobrir” genes


supressores de tumor. Um oncogene detecta-se pela sua presença (por exemplo, num genoma
viral ou amplificação de segmentos cromossómicos). Contrariamente, um gene supressor de
tumor evidencia a sua existência pela sua falta.

Outras estratégias que não a observação de delecções e a presença de um gene contíguo


conhecido são necessárias para identificar estes genes. Como já referido, há tendência a
ocorrerem perdas de heterozigotia durante o desenvolvimento tumoral e a região que flanqueia
o TSG também ser afectada. Uma estratégia plausível baseia-se na existência de segmentos de
DNA mapeados ao longo do genoma sem relação óbvia com nenhum gene em particular. Uma
vez que diferentes versões alélicas permitem ou não a clivagem por enzimas de restrição, estes
marcadores genéticos polimórificos foram denominados RFLPs (restriction fragment lenght
polymorfism). Estes marcadores RFLP foram utilizados para avaliar a perda de heterozigotia em
várias regiões cromossómicas, notando-se que havia perda de heterozigotia a uma taxa

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especialmente alta em regiões onde se encontram os genes supressores de tumor (alteração
favorável à célula tumoral). De modo semelhante, os SNPs (single-nucleotide polymorphisms)
podem ser detectados por PCR. Num indivíduo, aproximadamente dois terços dos SNPs
apresentam uma configuração heterozigótica (verdadeiramente úteis para os estudos de perda
de heterozigotia) – resulta num marcador SNP a cada kilobase. A maior densidade genómica
que os RFLPs permite que os SNPs tenham uma função localizadora mais precisa.

NOTA: Em cancros colo-rectais, a localização dos TSG utilizando RFLPs, por intermédio da avaliação da
perda de heterozigotia em braços cromossómicos, levou a uma subestimação do envolvimento do
cromossoma 5q, onde se localiza o gene APC, que está mutado em quase todos os cancros deste tipo. De
facto, este gene é muito extenso e é alvo frequente de mutações independentes nos dois alelos.

Muitas das células num indivíduo que herdou um TSG mutante vão sofrer perda de
heterozigotia neste locus, mas uma pequena minoria vai adquirir as alterações genéticas
adicionais necessárias a um tumor clinicamente detectável. No entanto, nem todas as formas
familiares de cancro podem ser confinadas à herança de um alelo TSG mutado. Linhas
celulares germinativas mutantes de uma segunda classe de genes também causam
predisposição para cancro. São genes que preservam a integridade do genoma, diminuindo a
probabilidade de ocorrerem mutações ou outras anomalias cromossómicas – genes de
manutenção. Enquanto os TSGs controlam directamente a proliferação, a diferenciação ou a
morte celular (gatekeepers), os genes de manutenção afectam indirectamente a biologia
celular pelo controlo da taxa de aquisição de alterações (caretakers).

Os proto-oncogenes mutantes raramente são transmitidos pela linha germinativa. Estas


mutações podem surgir durante a gametogénese, mas como os oncogenes se comportam como
genes dominantes é provável que perturbem o normal desenvolvimento tecidual de forma
incompatível com a embriogénese. Mesmo as mutações no oncogene ras que são hereditárias
diferem das que são somaticamente adquiridas (têm efeitos funcionais mais subtis).

A metilação dos promotores representa um mecanismo importante para inactivar os TSGs.


Nas células dos mamíferos, a metilação (ligação covalente de um grupo metil a uma base de
citosina) é encontrada nas sequências CpG. Se a metilação ocorrer no promotor dum gene
supressor de tumor pode reprimir a transcrição (via reconfiguração das proteínas da cromatina
por acção das histonas desacetilases). Ainda assim, o nível de metilação no genoma da célula
cancerosa diminui ao longo da progressão tumoral. Esta hipometilação deve-se sobretudo à
perda de metilação em sequências repetidas, sem funções biológicas, o que pode
correlacionar-se com instabilidade cromossómica. No entanto, as ilhas CpG ficam
inapropriadamente metiladas nos genomas das células cancerosas e são precisamente estas
regiões que estão relacionadas com os promotores dos TSGs (também com outros
promotores), silenciando estes genes. Tumores com hipermetilação CpG extensiva exibem o
“fenótipo metilador das ilhas CpG”. O envolvimento de alguns TSGs na carcinogénese é
unicamente explicado pela metilação dos seus promotores, o que cria dificuldade adicional em
reconhecer este tipo de genes (não pode ser avaliado por sequenciação; algumas metilações
reflectem o normal programa de diferenciação e poucos dos genes metilados contribuem para
a causalidade do tumor). A eliminação dos TSGs por metilação pode ocorrer se as duas cópias
forem metiladas separadamente ou se uma cópia for metilada e a segunda perdida por perda
de heterozigotia, com duplicação do alelo metilado (esta última hipótese é frequente pois a

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metilação parece ser menos frequente do que a LOH). Salienta-se ainda que a metilação de
genes críticos parece ser frequentemente um evento precoce, antes das alterações histológicas.
Nestes genes incluem-se novamente os genes de manutenção (exemplo: pensava-se que a
inactivação do gene BRCA1 nunca contribuía para os cancros da mama esporádicos, porque não
se encontravam alelos mutantes nesta forma de tumor; no entanto, recentemente descobriu-
se que mais de metade destas formas têm cópias inactivadas de BRC1 por metilação de
promotor).

Os TSGs e as proteínas por eles codificadas só têm em comum a sua acção anti-tumoral. Uns
suprimem a proliferação em resposta a sinais inibitórios de crescimento e a sinais indutores de
diferenciação (por exemplo, o gene Rb). Outros controlam o ciclo celular em resposta a
desregulação metabólica e danos genómicos (por exemplo, o gene p53).

O gene NF1 é um regulador negativo da sinalização Ras. A neurofibromatose tipo 1 é um


tipo de síndrome de cancro familiar comum (caracteriza-se pela presença de tumores benignos,
neurofibromas, à volta dos nervos periféricos; eventualmente poderá haver progressão maligna
– neurofibrossarcomas; outros tumores de linhas embrionárias distintas podem surgir).
Semelhante ao caso do RB familiar, um gene NF1 mutante é transmitido através da linha
germinativa (50% dos pacientes não apresentam história familiar – o alelo mutante é
consequência duma mutação de novo na linha germinativa, mais frequente durante a
espermatogénese). A neurofibromina, codificada pelo gene NF1, funciona como uma GAP
(GTPase-activating protein), estimulando a actividade GTPase intrínseca da Ras e a conversão
ao seu estado ligado a GDP, inactivo. O gene NF1 é expresso em todo o organismo,
especialmente no SNC e no SNP. Quando as células são estimuladas a crescer, degradam
temporariamente a NF1, assumindo níveis normais após a estimulação. A perda da função NF1
mimetiza funcionalmente a hiperactivação da Ras por oncogenes ras mutantes. Os percursores
das células de Schwann são os alvos primários da LOH nos neurofibromas e orquestram o
desenvolvimento destes crescimentos histologicamente complexos pela indução da co-
proliferação de outros tipos celulares via parácrina. O facto de as células não neoplásicas
(particularmente os mastócitos recrutados) só terem uma cópia WT do gene NF1 (menor
quantidade de proteína funcional) pode deixá-las hiper-responsivas aos sinais parácrinos
estimuladores de crescimento – fenómeno de haploinsuficiência. Há questões ainda por
responder, como o porquê de entre as 14 Ras-GAPs codificadas no genoma humano só a
mutação do NF1 estar envolvida no aparecimento de neurofibromas.

A expressão do gene Apc facilita a saída de células das criptas do cólon. A polipose
adenomatosa familiar (PAF) constitui o paradigma das síndromes de cancro do cólon
hereditárias. Centenas de pólipos adenomatosos desenvolvem-se na superfície luminal do
cólon. No cólon existem células epiteliais com funções absortivas e secretoras, com origem em
células estaminais profundas, localizadas nas criptas preenchidas por mucina. Desde que a célula
migra até à superfície luminal e morre passam entre 3 a 4 dias. As células que adquiriram
mutações neste intervalo estão muito provavelmente destinadas a morrer. Nesta óptica, as
únicas mutações que podem despoletar o desenvolvimento de cancro são aquelas que
aprisionam a célula nas criptas intestinais, possibilitando a acumulação de outras mutações.

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Quando o factor de crescimento Wnt (libertado pelas A acumulação de β-catenina é a consequência mais
células estromais) se liga ao seu receptor na superfície importante da inactivação do APC, observada em 90% dos
celular, a degradação da β-catenina é interrompida, carcinomas do cólon. Nos restantes 10%, o resultado é
permitindo a sua acumulação e migração nuclear, onde se funcionalmente equivalente embora por vias diferentes –
associa a proteínas de ligação ao DNA (Tcf ou Lef), formando inactivação do promotor do gene APC por metilação ou não
factores de transcrição heterodiméricos, que participam degradação da β-catenina por alteração das sequências alvo
em complexos multi-proteicos que modificam a cromatina, de sinalização para destruição. Os percursores dos
resultando na activação de programas de expressão génica enterócitos retêm o fenótipo stem cell-like, ficando
específicos (responsáveis pela manutenção do fenótipo sequestrados nas criptas um grande número de células
estaminal – maior proliferação e menor diferenciação). O indiferenciadas, que proliferam e acumulam outras
APC regula negativamente os níveis de β-catenina mutações.
citosólicos (via ubiquitina-proteassoma) e não é expresso a
níveis detectáveis na base das criptas, favorecendo a
acumulação intracelular de β-catenina e a sua migração
para o núcleo. Contudo, aquando do início da migração os
níveis de APC aumentam e a sinalização estromal
parácrina Wnt reduz-se, diminuindo a acção da β-catenina.

O APC também regula os microtúbulos que formam o fuso mitótico e o citoesqueleto e a sua
perda pode resultar em instabilidade cromossómica significativa (aneuploidias), bem como a
motilidade celular através da formação de protusões citoplasmáticas.

A proteína VHL modula a resposta à hipoxia. A síndrome de Von Hippel-Lindau caracteriza-


se pela predisposição hereditária a vários tumores (carcionoma renal de células claras,
feocromocitoma, hemangioblastomas). As mutações germinativas no gene VHL encontram-se
presentes na quase totalidade dos pacientes. A função do produto deste gene, a pVHL, é a
destruição dos HIFs (hypoxia-inducible factor) via ubiquitina-proteassoma. Em normoxia, a
pVHL provoca a degradação da subunidade α do HIF-1 (resíduos de prolina oxidados, permitindo
o reconhecimento), factor de transcrição que se mantém assim inactivo (ciclos fúteis – síntese
seguida de rápida degradação). Este ciclo é interrompido em condições de hipoxia, em que
ocorre a formação de HIF-1 funcional e expressão dum conjunto de genes (VEGF, PDGF, TGF-α)
implicados na angiogénese, eritropoiese (HIF-2 estimula EPO no rim), glicólise e transporte

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intracelular de glicose. Em muitos tumores a pVHL não é detectável ou está inactiva (por
exemplo, por alteração do domínio de reconhecimento), o que resulta numa actividade
constitutiva do HIF-1, estimulando a proliferação celular. Todavia, à semelhança da proteína
APC, a pVHL tem outras funções biológicas não relacionadas.

NOTA: Em células cancerosas, o aumento de actividade da PI3K e concomitante sobre-regulação da


via Akt/PKB, que posteriormente actua via cinase mTORC1, culmina numa produção aumentada de
mRNA HIF-1α.

RESUMO:

Alguns TSGs actuam especificamente nas últimas etapas da progressão tumoral (progressão
maligna) – “metastasis suppressor genes”;

Alguns TSGs codificam micro-RNAs com poder de regulação pleiotrópico;

Em certos casos, a perda duma única cópia dum TSG é vantajosa para a célula;

A inactivação de TSGs pode deixar as células cancerosas particularmente vulneráveis a


fármacos de baixo peso molecular, que visem as vias das quais estas células estão dependentes,
ou seja, as vias normalmente infra-reguladas pelos TSGs;

A perda de TSGs ocorre mais frequentemente que a activação de proto-oncogenes a


oncogenes, no contexto do desenvolvimento tumoral.

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Maintenance of Genomic Integrity and the
Development of Cancer
O facto de a formação de um tumor ser um processo com múltiplas etapas reflecte a
multiplicidade de linhas de defesa que salvaguardam a estabilidade das moléculas de DNA. A
explicação para que surjam cancros, apesar de existirem inúmeras barreiras, relaciona-se com
um aumento da taxa mutacional. As células tumorais são mais mutáveis – mutator phenotype.

Os tecidos estão organizados para minimizar a acumulação progressiva de mutações. O


compartimento de células estaminais numa dada população é muito diminuto. Estas células,
com fenótipos pouco distintivos, conseguem originar uma descendência muito elevada de
células diferenciadas em estado pós-mitótico, a partir duma única divisão celular. Assim, uma
vez que a linha das células estaminais representa o único repositório estável de informação
genética num tecido, os seus genomas devem ser especialmente protegidos da corrupção.

Primeiramente, as transit-amplifying cells


são o verdadeiro cerne da actividade mitótica
tecidual, protegendo as células estaminais do
potencial mutagénico inerente à divisão
celular. Adicionalmente, as células estaminais
têm uma localização anatómica privilegiada
nos tecidos. São as células epiteliais mais
diferenciadas que constituem a interface com
as cavidades e estão mais vulneráveis às
agressões e ambientes mutagénicos, tendo por
isso uma vida curta.

Em teoria, este compartimento é inesgotável. No entanto, a eventual perda duma célula


estaminal é possível e provoca a divisão simétrica duma célula estaminal (ambas as células
filhas retêm o fenótipo da célula mãe), o que pode ter implicações na manutenção genómica.

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Excluindo como alvos prováveis da carcinogénese as células de vida curta (mais
diferenciadas), o foco recai sobre as células de vida mais longa. Ora, as células com vida mais
longa num dado tecido são precisamente as células estaminais. Um dos exemplos de como o
alvo inicial da carcinogénese são as células estaminais provém da leucemia mieloide crónica
(CML), onde se observa o cromossoma Filadélfia, resultante duma translocação reciproca que
funde os genes bcr e abl. Muitos tipos celulares hematopoiéticos (quer linfoides, quer mieloides)
apresentam o cromossoma Ph1, o que sugere que a célula onde ocorreu inicialmente a
translocação era um progenitor comum pluripotente localizado na medula óssea.

O bloqueio da diferenciação e impedimento da saída das células estaminais dos seus


compartimentos são importantes para o sucesso da tumorigénese. Contudo, na maioria dos
casos o alvo principal não é a célula estaminal pluripotente, mas sim uma das células dela
derivada - commited progenitors/transit-amplifying stem cells -, com capacidade de
autorrenovação significativa mas limitada. A sua transformação em célula tumoral requer a
reaquisição da capacidade de autorrenovação ilimitada (a desdiferenciação “fixa” a mutação
no compartimento celular estaminal). Esta concepção é mais atraente porque há muito mais
células neste pool, aumentando a probabilidade de ocorrência duma mutação e estas células
dividem-se activamente. Alguns carcinogéneos citotóxicos (promotores) podem matar algumas
células estaminais que têm de ser repostas através da desdiferenciação de células progenitoras
que podem já ter sofrido mutações associadas à replicação, que assim se introduzem no pool de
células estaminais e nele se estabelecem a longo prazo.

Entre os mecanismos protectores da integridade do genoma contam-se: a entrada das


células estaminais em apoptose em resposta a danos genéticos extensos, em vez da tentativa
de reparação destes erros; a excreção activa de substâncias utilizando bombas (Mdr1, multi-
drug resistance 1, explorada pelas células cancerosas para adquirir resistência às moléculas
quimioterapêuticas) e a localização assimétrica do DNA replicado - as cadeias recém
sintetizadas, potencialmente mal copiadas, são preferencialmente alocadas na célula filha que
se torna uma célula progenitora, enquanto o DNA parental não replicado é alocado na célula
filha que permanece uma célula estaminal (mecanismo ainda controverso).

O design do compartimento celular estaminal e o


comportamento dessas células ilustra as estratégias biológicas
para proteger os genomas das células estaminais, que constituem
as linhas “germinativas” dos tecidos – a primeira linha de defesa
contra o dano genómico. A segunda linha de defesa é bioquímica
e depende da habilidade de algumas proteínas reconhecerem e
repararem moléculas de DNA danificadas.

Os processos mutagénicos concentram-se em três categorias:


erros replicativos durante a fase S (inclui-se a incorporação de
nucleótidos quimicamente alterados); alterações químicas
espontâneas dos nucleótidos e finalmente, acção de mutagéneos.

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Há duas estratégias fundamentais para reparar
erros originados pelo primeiro processo: proofreading
realizado pelas próprias polimerases enquanto
polimerizam a nova cadeia 5’-3’ (perante um erro
utiliza a actividade endonuclease 3’-5’ para digerir o
segmento recém sintetizado e voltar a copiá-lo) e
actuação de enzimas mismatch repair (MMR) (actuam
em erros que escaparam ao proofreading; cruciais no
caso de sequências repetitivas – a cadeia parental e a
cadeia nascente desalinham e a polimerase sintetiza
versões mais curtas ou longas destas repetições; estas
sequências, chamadas microssatélites, são, por
conseguinte bastante instáveis; também são muito
sensíveis a ansas geradas pela incorporação errada de
nucleótidos em sequências não repetitivas). A taxa de
erro é assim muito reduzida: de um erro em cada 105
nucleótidos polimerizados, o proofreading corrige 1
em 100 desses erros e por sua vez as enzimas MMR
corrigem 99 em cada 100 dos que escaparam ao
proofreading – taxa de mutação final corresponde a 1
em cada 109 nucleótidos sintetizados.

NOTA: Mutações em diferentes polimerases


predispõem para o aparecimento de cancros em locais
diferentes.

As células e o seu genoma são alvo do ataque constante dos processos bioquímicos
endógenos, que podem ter uma contribuição para a mutação genómica superior à respeitante
aos agentes mutagénicos. Designadamente, os processos de oxidação que utilizam
intermediários gerados pelas reacções mitocondriais, conforme o oxigénio é reduzido
progressivamente a água. Estas EROs originadas podem evadir-se da mitocôndria, alcançando o
citosol. A estas, acrescem-se os oxidantes resultantes de reacções peroxissomais, da
peroxidação lipídica espontânea e, em casos extraordinários, da inflamação circundante. No
conjunto, as EROs podem ligar-se covalentemente às bases do DNA, provocar quebras de cadeia
simples ou duplas, induzir locais abásicos e formação de ligações cruzadas entre o DNA e
proteínas. Por exemplo, a formação de 8-oxo-dG pode precipitar um evento de transversão (G
emparelha com A, que após replicação irá emparelhar com T).

A estrutura de cadeia em dupla hélice do DNA protege as bases e as suas cadeias laterais
amina reactivas, dirigidas para o interior da molécula, dos agentes mutagénicos. Ainda assim, a
acção de hidrogeniões e iões hidroxilo pode desencadear processos de depurinação (10000
bases purina perdidas por dia por célula) e depirimidinação (em menor grau). A desaminação
pode levar à substituição duma citosina por um uracilo, que vai ser lido como se fosse uma
timina na replicação de DNA subsequente, originando uma mutação de transição C-T. A
desaminação espontânea da forma metilada da citosina, nas ilhas CpG, ocorre com frequência
superior, originando timina, um produto de desaminação que é simultaneamente um

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componente normal do DNA, que pode escapar à detecção pelos mecanismos de reparação.
Outra ameaça à incorrupção genómica são as DSBs (estima-se que ocorram 10 DSBs por cada
fase S, perto das forquilhas de replicação, devido à susceptibilidade do DNA em cadeia simples
não replicado da cadeia parental). Todos estes eventos contabilizam cerca de 100000 bases
alteradas por genoma celular em cada dia – excede largamente o dano dos agentes
mutagénicos exógenos.

Ocasionalmente, as células estão sob a ameaça dos mutagéneos exógenos. Mais de 80% da
energia transportada pelos raio-X é despendida na ionização de moléculas de água, a nível
celular, resultando em radicais livres que geram EROs capazes de criar quebras de cadeia simples
e duplas. A radiação UV prima, por sua vez, em gerar dímeros de pirimidinas estáveis. Muitas
das queratoses (lesões benignas) e dos carcinomas de células basais contêm alelos p53 mutantes
com substituições de dipirimidinas (concretamente substituições CC>TT, porque a célula possui
enzimas próprias para lidar com o dímero TT).

Os agentes alquilantes podem ligar-se de forma covalente às bases do DNA, suscitando


perda de bases ou erros de leitura durante a replicação (alguns destes agentes são utilizados em
quimioterapia, podendo induzir o aparecimento doutro tumor num segundo local anatómico).

A destoxificação de substâncias exógenas (ex: benzopireno, acetaldeído) pelas enzimas do


citocromo p450 pode, em vez de gerar espécies químicas inofensivas e rapidamente excretáveis,
paradoxalmente, converter pro-carcinogéneos em carcinogéneos finais muito reactivos, que se
ligam covalentemente às bases do DNA, formando aductos de DNA. O benzopireno está
presente no fumo do tabaco e quando activado forma aductos em locais preferenciais, que são
“hot spots” mutacionais (transversões G>T) em alelos p53 mutantes em cancros do pulmão
associados ao tabaco. A aflatoxina 1 (origem fúngica) é activada pelos citocromos hepáticos e
forma aductos com as bases de guanina, que acabam por ser substituídas por timina (aumento
de risco de carcinoma hepatocelular). As aminas heterocíclicas (HCAs), formadas pela cozinha
de carnes a temperatura elevada, são oxidadas pelos citocromos em compostos genotóxicos.
Conclui-se, que a natureza e o padrão das mutações podem fornecer pistas acerca da
identidade dos agentes mutagénicos que contribuíram para a sua ocorrência.

As células têm uma grande variedade de defesas contra as acções mutagénicas. A primeira
barreira é física (exemplo: as radiações UV só são nocivas para a pele e para a retina pigmentar;
a primeira ainda está protegida pela melanina). Quanto aos carcinogéneos químicos,
multiplicam-se as correntes de defesa. Há enzimas que convertem as EROs e os radicais livres
a espécies menos reactivas, enzimas glutatião-S-transferases que se ligam a compostos
electrofílicos e os destoxificam (expressão abolida em alguns tumores; o revés da moeda pode
ser a sua acção de destoxificação de agentes quimioterapêuticos, anulando o efeito do
tratamento).

Se os agentes genotóxicos não forem interceptados antes do ataque ao DNA, existem


diversas frentes de defesa que permitem repor a estrutura de DNA quimicamente alterado. A
mais simples é encabeçada por enzimas que catalisam a reacção inversa à que alterou a base
(ex: DNA alquiltransferase). Outras enzimas mais especializadas actuam através da remoção da
base alterada (base-excision repair, BER) ou do nucleótido inteiro (nucleotide-excision repair,
NER), mecanismos que operam usualmente em lesões endógenas e exógenas, respectivamente

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(as lesões exógenas estão mais associadas à distorção estrutural da hélice de DNA – aductos
de DNA, dímeros de dipirimidinas). A BER é liderada por glicosilases e actua, por exemplo, em
casos de incorporação de um uracilo na molécula de DNA por desaminação duma citosina. O
açúcar remanescente é clivado enzimaticamente, produzindo um nick (quebra) de cadeia única,
que é reparado por uma polimerase e por uma ligase. O NER envolve a excisão de 25 a 30
nucleótidos a montante e a jusante da alteração, polimerização desse segmento a partir da
cadeia não danificada e, finalmente, junção pela DNA ligase. As reacções que constituem o NER
são de dois tipos: transcription-coupled repair (TCR), envolvendo a cadeia molde dos genes
activamente transcritos, e global genomic repair (GGR), implicando a cadeia complementar à
cadeia molde dos genes activamente transcritos, bem como as regiões não transcritas do
genoma. A p53 estimula a expressão de várias proteínas comprometidas com este último tipo
de reparação. Existe ainda outro tipo de reparação – error-prone DNA replication – em que a
maquinaria de replicação (polimerases bypass, com erros de 1 em 100 nt) encontra uma base
danificada e incorpora aleatoriamente uma das quatro bases do DNA (o processo pode ser
aprimorado com a consulta da sequência wild-type presente no cromatídeo irmão).

O Xeroderma pigmentosum é uma síndrome em que os indivíduos têm um risco muito


elevado de desenvolver carcinomas das células escamosas e basais. Os dois alelos mutantes
herdados dividem-se em oito grupos de complementaridade (ao fundir duas células de dois
indivíduos com XP a célula híbrida pode reparar normalmente o DNA, indicando defeitos
distintos das células parentais). Sete (XPA a XPG) codificam proteínas do complexo
multiproteico NER e o oitavo (XPV) codifica a polimerase error-prone pol-ɳ (incorpora na
maioria das vezes duas adeninas perante uma cadeia molde com um dímero de timinas). O facto
de estes genes estarem envolvidos em mecanismos de reparação ubíquos mas as lesões serem
maioritariamente cutâneas, sugere que a radiação UV é o mutagéneo ambiental mais relevante
e a fonte da maioria das lesões que requerem reparação por NER.

Outra síndrome relacionada com aumento de susceptibilidade para desenvolver cancro,


causada por defeitos herdados nos mecanismos de reparação do DNA é a síndrome de Lynch
ou HNPCC (hereditary non-polyposis colon cancer), responsável por 2 a 3% dos cancros do cólon
(também cancros do endométrio, ovário e estômago). A instabilidade genética associada a esta
síndrome permite que a progressão adenoma-carcinoma ocorra em cerca de 2 a 3 anos (o
normal é entre 8 a 10 anos). De facto, esta progressão é tão acelerada que os crescimentos pré-
malignos não costumam ser detectados no cólon destes indivíduos. A maioria (85-90%) dos
casos tem por base mutações nos genes que codificam proteínas MMR – MSH2 e MLH1.
Herdam um alelo defeituoso e os genomas das células tumorais surgem, na maior parte dos
casos, por perda de heterozigotia. A incapacidade de detectar mismatches é conducente a uma
grande instabilidade das sequências microssatélites (exemplo: o gene que codifica TGF-βRII
tem sequências microssatélites intragénicas - a perda de nucleótidos repetidos pode levar a
alterações no quadro de leitura e consequentemente, originar um receptor disfuncional que não
se liga aos factores anti-mitogénicos com efeitos anti-crescimento; o gene BAX, que codifica
uma proteína anti-apoptótica, também pode ser silenciado pela mesma lógica; até mesmo genes
que codificam proteínas MMR podem ser inactivados por defeitos MMR). Para além da perda
da função reparadora, estas células também não costumam reconhecer danos que, em
circunstâncias normais, levariam à paragem do ciclo celular entre G2 e a fase M e até mesmo à
apoptose.

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Outro exemplo clássico são os genes BRCA1 e BRCA2. Uma vez herdada uma cópia mutante
de um dos alelos destes genes, verifica-se uma susceptibilidade aumentada ao aparecimento de
cancro da mama e do ovário (e da próstata em caso de mutação BRCA2). A perda somática
(sobretudo por metilação do promotor) destes genes também parece ser importante para o
desenvolvimento das formas esporádicas destes cancros. Estes genes estão incumbidos de
manter a integridade genómica, são “caretakers” (codificam proteínas de reparação do DNA).
As proteínas BRCA1 e 2 localizam-se no núcleo formando complexos com uma série de outras
proteínas. Tratamentos que suspendem a actividade das forquilhas replicativas durante a fase
S, deixam as cadeias simples de DNA não replicado muito vulneráveis a DSBs, que costumam ser
reparadas por mecanismos de reparação homóloga. As proteínas BRCA1 formam clusters nas
zonas das forquilhas replicativas quando estas situações acontecem (bem como a BRCA2).
Quando as DSBs são induzidas intencionalmente a BRCA1 também se co-localiza com este tipo
de lesões. Se o mecanismo de reparação homóloga estiver comprometido, o processo de
reparação deixa de ter por base a consulta da informação das sequências WT presentes no
cromatídeo irmão e passa a fundir os dois segmentos de DNA gerados pela DSB por NHEJ (non-
homologous end joining).

NOTA: Há outros aspectos envolvendo a proteína BRCA1 que estão a ser estudados: a sua associação
com reguladores da transcrição, a função localizadora dos centrómeros, a regulação da motilidade celular
e o facto de, na sua ausência, as células das mulheres serem incapazes de inactivar apropriadamente um
dos cromossomas X. Outra particularidade é o seu envolvimento na monoubiquitilação da histona 2A,
culminando na formação de heterocromatina (na falta de heterocromatina, sequências silenciadas
começam a ser expressas, culminado numa destabilização generalizada do genoma).

O cariótipo das células cancerosas é frequentemente modificado através de alterações na


estrutura cromossómica. As aberrações cromossómicas são muito frequentes nos tumores. A
reparação ineficiente de DSBs pode traduzir-se por translocações cromossómicas. A maquinaria
de rearranjo cromossómico dirigida à sequência que codifica o TCR pode inadvertidamente
catalisar recombinações intercromossómicas. Outra fonte de translocação são os eventos de
breakage-fusion-bridge, incentivados pelo colapso telomérico, após múltiplas divisões celulares.
Inicialmente pensava-se que as translocações eram quase exclusivas dos tumores
hematopoiéticos, mas já foram observadas em tumores sólidos.

Em cerca de 25% dos cancros


ósseos há sequências devastadas por
rearranjos cromossómicos, resultantes
da junção de inúmeros fragmentos
cromossómicos gerados por um evento
catastrófico único.

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O cariótipo das células cancerosas é frequentemente modificado através de alterações no
número de cromossomas. Estas alterações estão presentes em 85% das células afligidas por
instabilidade cromossómica. Os cariótipos aneuploides das células cancerosas podem ser
interpretados como uma consequência do caos inerente à progressão maligna ou como um
processo deliberado, essencial à tumorigénese. Em cancros colo-rectais observou-se que as
ocorrências de instabilidade de microssatélites e de instabilidade cromossómica eram quase
mutuamente exclusivas. Isto sugere que a mutabilidade dos genomas pode ser adquirida por
quer uma quer outra das circunstâncias. No entanto, os tumores hematopoiéticos parecem
prescindir destes dois tipos de instabilidade. Fontes de aneuploidias são a não disjunção dos
cromatídeos irmãos durante a segregação cromossómica, a ligação inapropriada dos
cinetocoros às fibras do fuso mitótico ou defeitos na própria organização do fuso mitótico (ex:
centrossomos supra-numerários com mitoses multipolares – HPV E7).

RESUMO:

Em termos evolucionários, a instabilidade genética é uma balança entre a necessidade de


gerar diversidade e concomitantemente manter a viabilidade e capacidade de reprodução das
espécies;

A estabilidade aparente da molécula de DNA reflecte um equilíbrio dinâmico entre os


ataques a que está sujeita e as defesas vigilantes codificadas pelos genes “caretakers”;

Sem aumento da instabilidade genómica e consequente aumento da taxa mutacional os


intervalos entre as sucessões clonais seriam demasiado longos para a formação dos cancros;

A acção dos promotores tumorais também comprime o intervalo entre as sucessões clonais;

As CSCs são os repositórios da informação genética do tumor a longo prazo;

Comummente, sinais de stress replicativo e a inactivação do gene p53, com aumento da


tolerância a esse stress, são achados iniciais no processo de progressão tumoral;

Mesmo para as células cancerosas podem existir alterações genómicas incompatíveis com a
sobrevivência;

A inactivação de alguns genes de reparação pode ser desvantajosa para as células


cancerosas quando sujeitas a quimioterapia (algumas proteínas codificadas por estes genes
contrariam os efeitos dos agentes terapêuticos);

A instabilidade genómica não confere nenhuma vantagem proliferativa ou de sobrevivência


imediata – é antes um investimento a longo prazo.

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Genes, the Environment, and Disease
Erros na reparação do DNA: As mutações causadas por defeitos na reparação do DNA
acumulam-se à medida que as células somáticas se dividem. Várias doenças genéticas que
envolvem as enzimas de reparação do DNA salientam a sua importância.

Os pacientes com xeroderma pigmentosum têm deficiências no reconhecimento de dano do


DNA ou na via de reparação NER (nucleotide excision repair). A pele exposta é extremamente
sensível aos efeitos mutagénicos da radiação UV.

A síndrome de Lynch/HNPCC é caracterizada pela transmissão autossómica dominante da


predisposição para o aparecimento de lesões no cólon proximal e de cancro do cólon, em idade
jovem (< 50 anos), estando associada a outras neoplasias malignas do útero e do ovário, entre
outras. A causa predominante são mutações num dos vários genes mismatch repair (MMR),
incluindo o MLH1, o MSH2, o MLH6, o MSH6, o PMS1 e o PMS2. As proteínas codificadas por
estes genes detectam mismatches nucleotídicos e reconhecem desalinhamentos no
emparelhamento das cadeias de DNA, associados a repetições trinucleotídicas (slipped-strand
mispairing). As mutações germline nestes genes conduzem a instabilidade de microssatélites,
acelerando a aquisição de mutações. O rastreio genético é utilizado para famílias em risco,
permitindo o acompanhamento através da realização rotineira de colonoscopia e a
implementação de estratégias de prevenção utilizando AINEs.

Anexo – Tipos de Mutações:

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The Practice of Genetics in Clinical Medicine
Aplicações da Genética Molecular na Medicina Clínica: Os testes genéticos para
anormalidades herdadas associadas com risco para uma determinada doença são cada vez mais
utilizados. As alterações germline incluem anomalias cromossómicas, mutações genéticas
específicas, com padrões de transmissão dominantes ou recessivos e SNPs com menor
contribuição para o risco duma dada doença. Podem conferir susceptibilidade individual para o
aparecimento de determinados tipos de cancro. O reconhecimento da etiologia genética duma
dada patologia tem impacto na prevenção, no rastreio e no tratamento dessa doença. Como
tal, são realizados testes genéticos em indivíduos selecionados que visam estimar o risco
genético para uma patologia e alterar o curso natural da doença, através do acompanhamento
especializado.

Doenças Genéticas Comuns: As doenças hereditárias que se manifestam no adulto seguem


vários padrões de hereditariedade. Algumas são condições autossómicas dominantes, incluindo
muitas síndromes de susceptibilidade aumentada para o desenvolvimento de cancro, como o
cancro hereditário da mama e do ovário (devido a mutações germline nos genes BRCA1 e
BRCA2) e a síndrome de Lynch (causada por mutações germline nos genes de mismatch repair
MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Em ambos os exemplos, as mutações herdadas estão associadas
com uma elevada penetrância dos cancros associados, embora o risco ao longo da vida não seja
100%. Outras doenças hereditárias são transmitidas de modo autossómico recessivo, como o
cancro do cólon associado ao MYH. A existência de múltiplos padrões de hereditariedade para
uma mesma doença, adiciona complexidade adicional à avaliação dos pacientes e familiares com
esta condição. Por exemplo, o cancro do cólon pode estar associado a uma única mutação
germline num gene MMR (S. de Lynch, autossómico dominante), a mutações bialélicas no gene
MYH (autossómico recessivo) e ainda à combinação de múltiplos SNPs (poligénico/
multifactorial).

História Familiar: A avaliação de risco deve firmar-se na história familiar, destacando-se o


número e a proporção de indivíduos afectados, bem como atentar na idade precoce de
aparecimento da doença, na presença de doenças pouco habituais (por exemplo, o surgimento
de cancro na mama num homem) e na presença de múltiplas doenças potencialmente
relacionadas no mesmo indivíduo (por exemplo, uma mulher com história de cancro do cólon
e cancro do endométrio). Note-se que algumas doenças são mais prevalentes em certos grupos
étnicos (por exemplo, 2,5% dos judeus Ashkenazy têm mutações BRCA1 e BRCA2). Os factores
de risco não hereditários (ambientais, estilo de vida) devem ser documentados, para não
confundirem a análise. É importante notar que a penetrância das doenças genéticas costuma
ser incompleta (não existe um clássico padrão de hereditariedade mendeliano) e que os genes
associados a algumas destas doenças exibem expressividade variável (por exemplo, a mutação
do gene BRCA2 predispõe para o aparecimento de diferentes neoplasias malignas na mesma
família, incluindo o cancro da mama, do ovário, da próstata, do pâncreas e da pele). Além disso,
para doenças comuns como o cancro da mama pode dar-se o caso de alguns membros da família
não portadores do alelo de susceptibilidade desenvolverem a doença, de forma esporádica –
fenocópias.

Testes Genéticos: Tradicionalmente, os testes genéticos são dirigidos inicialmente aos genes
mais prováveis de estarem na origem do fenótipo. No caso das doenças que exibem

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heterogeneidade genética (ou seja, mutações em genes diferentes resultam num fenótipo
semelhante), os padrões de transmissão, o risco de desenvolver a doença e até o tratamento
podem diferir significativamente, consoante o gene afectado. A escolha sequencial dos genes a
testar, baseada nas características particulares da história familiar e na prevalência relativa da
doença genética, tem vindo a expandir-se, acompanhando o desenvolvimento tecnológico das
técnicas de sequenciação, que permitem testar vários genes ou até todo o exoma.

Entre as principais limitações na precisão e interpretação dos testes genéticos incluem-se


testes que só detectam algumas mutações mais comuns (um resultado negativo deve ser
entendido como a possibilidade de o indivíduo ter uma mutação não incluída no teste; a menos
que haja uma mutação descrita na família, um resultado negativo é classificado como não
informativo) e por vezes detectam-se variantes não classificadas, ou seja, variações na
sequência dum gene cujo efeito funcional não está estabelecido.

A utilidade clínica dum teste genético advém da possibilidade de interferir positivamente


com o curso da doença e pode ser menor em testes preditivos de predisposição que apenas
traduzam um risco baixo a moderado de desenvolver a doença (ao contrário dos testes pré-
sintomáticos, que se aplicam a doenças com penetrância total). A estratégia óptima de testar
uma família começa pelo teste do indivíduo afectado, em primeiro lugar, de modo a tentar
identificar a mutação que possa direcionar o teste para os outros familiares em risco. Os testes
genéticos devem ser oferecidos às crianças se daí advir benefício (por exemplo, as crianças com
PAF devem ser seguidas através de colonoscopia precocemente, porque desenvolvem pólipos
durante a adolescência que podem progredir para cancro invasivo na segunda década de vida).

Follow-up após o Teste Genético: Dependendo da doença, pode ir desde a mera vigilância
da situação e evitamento de riscos a intervenções médicas específicas, como o rastreio, a
quimoprevenção (por exemplo, quimioprevenção com tamoxifeno em pacientes com mutações
BRCA1 e BRCA2) ou a cirurgia profilática (por exemplo, salpingo-ooforectomia ou mastectomia
em pacientes com mutações BRCA1 e BRCA2). Portanto, os testes genéticos oferecem a
possibilidade de intervir precocemente e de forma dirigida, reduzindo a morbilidade e a
mortalidade.

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Lower Gastrointestinal Cancers – Colorectal Cancer
Incidência: É o segundo cancro mais mortal. A taxa de incidência tem diminuído,
provavelmente devido ao incremento das práticas de rastreio. A mortalidade também
acompanha a tendência de diminuição, devido à detecção precoce e ao melhoramento do
tratamento.

Pólipos e Patogénese Molecular: Independente da etiologia, a maioria dos cancros colo-


rectais surge a partir de pólipos adenomatosos, protusões da superfície mucosa. São lesões pré-
malignas, embora apenas uma minoria evolua para cancro (<1%). A maioria dos pólipos não se
associa a sintomas e permanece clinicamente indetectável. O sangue oculto nas fezes é
encontrado em menos de 5% dos pacientes com pólipos. As alterações moleculares que
ocorrem durante a progressão adenoma-carcinoma reflectem a existência de múltiplas etapas
na evolução da mucosa colónica normal até ao carcinoma invasivo (incluem: mutações pontuais
activadoras do oncogene K-ras e perda alélica do gene APC e do gene p53). Clinicamente, a
probabilidade de um pólipo adenomatoso originar cancro depende da aparência grosseira da
lesão (existem pólipos pedunculados e sésseis, sendo que os últimos se associam mais
frequentemente com o desenvolvimento de cancro invasivo), das características histológicas
(os adenomas vilosos tornam-se malignos com uma frequência 3x superior à dos adenomas
tubulares) e do seu tamanho (risco substancial, superior a 10%, em lesões com dimensões
superiores a 2,5 cm). Após detecção dum pólipo adenomatoso, todo o cólon deve ser
visualizado endoscopicamente, porque lesões síncronas são identificadas em cerca de um terço
dos casos. A colonoscopia deve ser repetida periodicamente, porque esses pacientes têm uma
probabilidade aumentada (30-50%) de desenvolver outro adenoma e têm maior predisposição
para o aparecimento de carcinoma colo-rectal. Normalmente, os pólipos adenomatosos
requerem mais de cinco anos até crescerem significativamente (não é necessário realizar
colonoscopia com uma frequência superior a 3 anos para a maioria dos pacientes).

Etiologia e Factores de Risco: A etiologia


deste tipo de cancro está muito relacionada
com factores ambientais, principalmente
com a dieta (consumo calórico excessivo,
sobretudo de carne e gordura).

Factores Hereditários e Síndromes: Até 25% dos pacientes com cancro colo-rectal têm
história familiar positiva, sugerindo predisposição hereditária.

Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) - É uma condição rara, caracterizada pelo


aparecimento de milhares de pólipos adenomatosos ao longo do cólon. A predisposição é
transmitida como um traço autossómico dominante e está associada com uma delecção em 5q,
incluindo o gene APC, quer nas células neoplásicas (que adquirem adicionalmente uma mutação
somática), quer nas células normais (que herdam a mutação germline). Esta perda alélica resulta
na ausência do produto dum gene supressor de tumor que normalmente inibe o crescimento
neoplásico. A presença de tumores ósseos e nos tecidos moles, de hipertrofia congénita do
epitélio pigmentar retinal, de tumores mesentéricos desmoides e de cancros da ampulares, para
além de pólipos colónicos caracteriza a síndrome de Gardner. O aparecimento de tumores
malignos no SNC define a síndrome de Turcot. Em todas as condições, a existência de pólipos
colónicos nos indivíduos afectados é evidente pelos 25 anos de idade. Se a polipose não for

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tratada cirurgicamente o cancro colo-rectal irá desenvolver-se em quase todos os pacientes
até aos 40 anos de idade. A colectomia permanece o método de prevenção primária por
excelência. A proctosigmoidoscopia anual (em vez da colonoscopia, mais invasiva) pode ser
suficiente para vigiar situações de risco (descendência de indivíduos afectados), uma vez que os
pólipos têm uma ampla distribuição. Se a mutação causativa no gene APC estiver identificada
no indivíduo afectado, os portadores podem ser identificados pelo teste genético do DNA
extraído de células mononucleares do sangue periférico.

Polipose associada ao MYH (MAP) - É uma síndrome autossómica recessiva rara causada
por mutação bialélica no gene MUT4H. A apresentação clínica desta condição é variável. A
vigilância colonoscópica é recomendada, iniciando-se entre os 25 e os 30 anos.

Cancro Colo-rectal Hereditário sem Polipose (HNPCC) - A síndrome de Lynch tem carácter
autossómico dominante e define-se pela presença: de três ou mais familiares com cancro colo-
rectal, um dos quais é um familiar de 1º grau em relação aos outros dois; de um ou mais casos
de cancro colo-rectal diagnosticados antes dos 50 anos de idade e do envolvimento de pelo
menos duas gerações. Muito frequentemente, os cancros surgem no cólon proximal. Apesar
de terem uma aparência histológica pouco diferenciada, estes tumores têm melhor
prognóstico do que os tumores esporádicos que surjam em pacientes de idade comparável. As
famílias afligidas por esta síndrome incluem membros com múltiplos cancros primários,
atentando-se que nas mulheres a associação de cancro colo-rectal com carcinomas do ovário
ou do endométrio é notória. Outros cancros reportados incluem cancros gástricos, do intestino
delgado, génito-urinários, pancreático-biliares e cutâneos/sebáceos. Recomenda-se que os
membros destas famílias realizem colonoscopia anual ou bianual, começando aos 25 anos de
idade, complementada com US pélvica e biópsia do endométrio, nas mulheres. A síndrome de
Lynch é causada por mutações germline, com destaque para os genes MLH1 e MSH2. Estas
mutações comprometem a fidelidade da replicação do DNA e resultam em instabilidade
genómica devido aos defeitos na reparação do DNA, culminando em crescimento celular
anormal e desenvolvimento tumoral. O teste das células tumorais através de análise molecular
do DNA ou de imunohistoquímica, pode auxiliar na identificação dos indivíduos afectados.

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Two Main Classes of Genes Are Critical for Cancer:
Oncogenes and Tumor Suppressor Genes

Oncogenes > mutação com ganho funcional > proteína hiperactiva (dominante)

Genes supressores de tumor > mutação ou silenciamento epigenético com perda funcional
(recessivo)

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Cancer-causing Mutations Cluster in a Few
Fundamental Pathways
É a hiper ou hipoactividade das vias que interessa na progressão tumoral e não o modo
como essa finalidade é alcançada.

Activação de oncogene

Inactivação de gene supressor de tumor

Codificam proteínas envolvidas: na sobrevivência,


crescimento e proliferação celular; na reparação e resposta
ao dano do DNA; na modificação da cromatina; na regulação
do ciclo celular e da apoptose e na adesão celular.

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Familial risk-colorectal cancer: ESMO Clinical
Practice Guidelines
Síndrome de Lynch: É a síndrome hereditária de cancro colo-rectal mais comum (1-3%). É
transmitida de forma autossómica dominante e está associada com mutações nos genes de
mismatch repair (MMR) (podem ser detectadas por imunohistoquímica) – MLH1 (CCR precoce),
MSH2 (cancros extracolónicos), MSH6 (cancro endometrial) e PMS2 – cursando com
instabilidade de microssatélites (MSI) e inactivação de genes supressores de tumor que contém
sequências de DNA desse tipo nas suas regiões codificantes (ex: TGFβ-R2, BAX). Os portadores
destas mutações têm risco muito aumentado (30-70%) de desenvolver cancro colo rectal e do
endométrio (também do tracto urinário, intestino delgado, ovário, gástrico, pâncreas, tracto
biliar, cérebro e pele).

Recomendações para testes de rastreio molecular e genéticos: Mais de 90% dos casos
apresentam MSI e/ou perda da proteína codificada pelo gene envolvido, o que permite que o
rastreio molecular seja uma boa estratégia para identificar candidatos para posteriormente
testar mutações germline. Em termos de custo-efectividade, devem-se selecionar os indivíduos
com menos de 70 anos ou aqueles que tendo idade superior preencham um dos critérios das
guidelines Bethesda. A análise de MSI é equivalente à imuno-histoquímica, sendo a vantagem
da última o maior direcionamento da análise subsequente das mutações (avalia-se a perda de
expressão duma proteína o que é sugestivo do defeito genético subjacente). Se nenhuma
mutação germline for detectada num paciente com suspeita de S. de Lynch, deve proceder-se à
análise de epimutações constitucionais.

NOTA: Em 10-15% dos casos de CCR esporádico há MSI e perda de expressão de MLH1 por metilação
do promotor; associada frequentemente à mutação somática BRAF V600E.

Incidência e tipo de mutações: MLH1 e MSH2 – 80%; MSH6 – 10 a 12%; PMS2 - 2%–3%.
Envolvem mutações frameshift, nonsense, sequências de splicing (proteínas truncadas ou
instáveis), delecções ou rearranjos – os testes genéticos devem incluir sequenciação de DNA
bem como análise de rearranjos.

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Redução do risco: opções preventivas não cirúrgicas:

Vigilância: Para a redução do risco da progressão adenoma-carcinoma, deve realizar-se


colonoscopia com periodicidade de 1 a 2 anos, a partir dos 20-25 anos de idade. A examinação
ginecológica, a ultrassonografia pélvica, o exame CA-125 e a biópsia por aspiração podem ser
utilizadas no rastreio anual do cancro do endométrio e do ovário em mulheres a partir dos 30-
35 anos. Para prevenção do cancro gástrico, deve-se rastrear a presença de H. Pylori e, caso
positiva, erradicar o microrganismo. Em determinados casos, poderá ser realizada endoscopia
alta a cada 1 a 3 anos.

Quimioprevenção: Dados do Colorectal Adenoma/Carcinoma Prevention Program (CAPP2)


demonstraram que a toma diária de 600mg de aspirina durante dois anos está associada a
redução de 60% na incidência de cancros relacionados com a S. de Lynch.

Redução do risco: opções cirúrgicas profiláticas:

As opções profiláticas cirúrgicas incluem a cirurgia ginecológica (histerectomia e/ou


salpingooforectomia bilateral) em mulheres com idade superior a 35 anos.

Tratamento do cancro: Deve ponderar-se a extensão da colectomia, já que estes indivíduos


apresentam risco aumentado de desenvolver um segundo CCR.

Outras síndromes: A Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) é uma doença autossómica


dominante caracterizada pela presença de múltiplos adenomas colo-rectais, sendo responsável
por cerca de 1% dos casos de CCR. Entre as manifestações extra-colónicas contam-se pólipos
gástricos e duodenais, tumores desmoides, tumores cerebrais, tumores da tiroide, osteomas,
hipertrofia congénita do epitélio pigmentado da retina, dentes supranumerários, quistos
epidermoides, entre outras.

Diagnóstico, Genética e Rastreio: O diagnóstico é realizado com base na identificação de


mais de 100 adenomas colo-rectais (menor número em formas mais atenuadas).

As mutações no gene APC podem estar presentes em mais de 80% dos indivíduos. Mutações
entre os codões 1250-1464 estão associadas com um fenótipo mais severo. Em 30-40% dos
casos a história familiar é negativa, sugerindo mutações de novo.

Os testes genéticos devem visar primeiramente o indivíduo afectado e, se detectada a


mutação causativa, oferecer-se diagnóstico pré-sintomático aos familiares em risco. O rastreio
genético é justificado pela elevada penetrância desta doença (completa, na forma clássica),
dado que virtualmente todos os afectados desenvolverão carcinoma entre a 4ª e a 5ª década
de vida, se não forem realizadas as devidas medidas profiláticas. Se a mutação não for
identificada, os familiares em risco devem realizar sigmoidoscopia bianual até aos 40 anos,
com intervalos de 3 a 5 anos entre os 40 e os 50 anos e de forma descontinuada a partir dos 50
anos se não se tiver desenvolvido polipose. Nos portadores de mutação identificada, a
sigmoidoscopia deve ser efectuada bianualmente, com início aos 12-14 anos. Uma vez
detectada a presença de adenomas a colonoscopia realiza-se anualmente até submissão à
colectomia. O rastreio de manifestações extra-colónicas deve iniciar-se aquando da detecção
da polipose ou entre os 25-30 anos (endoscopia gastro-duodenal a cada 5 anos; ultrassonografia
cervical anual, para despiste de cancro da tiroide).

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Tratamento: Baseia-se na polipectomia endoscópica e na ressecção cirúrgica (com remoção
ou não do recto). A quimioprevenção, nomeadamente o uso de AINEs demonstrou reduzir em
número e em extensão a presença de adenomas colo rectais.

RESUMO:

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Hereditary Colorectal Cancer Syndromes: American Society of
Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Endorsement of the
Familial Risk–Colorectal Cancer: European Society for Medical
Oncology Clinical Practice Guidelines
Entre 5 a 6% dos casos de CCR estão associados com mutações germline que conferem uma
predisposição hereditária para o aparecimento deste tipo de cancro. A possibilidade de
associação a uma síndrome de cancro hereditário deve ser avaliada para cada paciente no
momento do diagnóstico de CCR, dado que tal pode constituir uma oportunidade de
intervenção junto do paciente e da sua família. O rastreio deve incluir a revisão da história
pessoal e familiar e ter como critérios o teste de deficiências no MMR e/ou MIS, antes da
avaliação genética formal ser recomendada.

Este artigo é uma aprovação das guidelines da European Society for Medical Oncology
(ESMO), com revisão pela American Society of Clinical Oncology (ASCO).

REVISÕES:

Síndrome de Lynch: A mutação EPCAM/TACSTD1 (delecções em indivíduos que exibem


perda de expressão da proteína MSH2 sem mutações neste gene, por indução de
hipermetilação) foi adicionada nesta revisão.

A utilidade do rastreio contemplando a análise de MSI e técnicas de IHC pode estender-se ao


rastreio do cancro do endométrio.

Consideram-se os dados referentes à possibilidade de vigilância dos cancros do aparelho


ginecológico e à toma preventiva de aspirina insuficientes.

PAF: A revisão recomenda o início mais precoce – 10/11 anos - da sigmoidoscopia bianual
em portadores de mutação no gene APC.

Os adenocarcinomas do duodeno e da ampola gástrica são a 2ª causa de morte entre os


indivíduos com PAF, por isso, a vigilância endoscópica do tracto digestivo alto deve ser mantida
mesmo após a colectomia.

Na maioria dos indivíduos com formas moderadas a base genética subjacente não é passível
de identificação.

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CELL CYCLE AND CANCER, BIOLOGY OF
METASTASES

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Moving Out: Invasion and Metastasis
O tumor primário pode só se tornar aparente quando já tem um número muito elevado de
células - 1cm3 de tecido tumoral pode conter até 109 células. Em muitos casos, as repercussões
negativas na função tecidular advêm dos efeitos mecânicos compressivos dos tumores
primários. No entanto, os tumores primários são responsáveis apenas por cerca de 10% das
mortes devidas a cancro. Os restantes 90% das mortes são resultantes dos produtos mais
agressivos da progressão tumoral: as metástases, crescimentos tumorais em locais
anatomicamente distantes do local de origem do tumor primário. São provenientes de células
que abandonaram a massa tumoral primária e, por intermédio das vias de condução do
organismo – a hematogénica e a linfática – atingiram novos locais onde conseguiram formar
colónias.

Alguns tumores têm elevada tendência a metastizar (ex: melanoma) e outros não (ex:
carcinoma de células basais, astrocitomas). Nalguns tumores, a disseminação de células
tumorais já ocorreu quando se detecta o tumor primário, embora as colónias possam ser
pequenas e inaparentes – micrometástases. Para além disso, existe um tropismo inerente ao
processo de metastização – os tumores com origem num dado órgão metastizam
preferencialmente em determinados órgãos. As metástases podem representar um
compromisso significativo das funções vitais. Tomando como exemplo o cancro da mama, um
tumor primário confinado à mama não representa grande ameaça à vida. Todavia, os órgãos
habitualmente alvo de metastização - osso, cérebro, fígado e pulmão – são mais determinantes
na não sobrevivência da mulher.

A cascata invasão-metástase depende de uma série de processos biológicos complexos. No


caso dos carcinomas, associados a 80% das mortes por cancro, camadas de células epiteliais
repousam sobre uma matriz estromal profunda, da qual estão separadas pela membrana basal,
um tipo especializado de MEC construída por proteínas secretadas pela camada epitelial
suprajacente e pela camada estromal subjacente. A disrupção da membrana basal constitui um
prelúdio da invasão do estroma adjacente e, portanto, da transição benigno-maligno. Isto
resulta não só do facto de haver dissolução da barreira física como também da própria
degradação dessa barreira que liberta factores de crescimento e sobrevivência que eram
sequestrados por esta matriz proteica.

Mesmo antes da corrupção da membrana basal, as células tumorais já podem ter induzido a
angiogénese no lado estromal, enviando factores angiogénicos para as células endoteliais do
estroma através da matriz porosa. Mas apenas através da invasão do compartimento estromal
é possível o acesso directo aos vasos sanguíneos e linfáticos. A proximidade destes vasos
garante um acesso vantajoso a nutrientes e oxigénio, bem como a própria entrada em
circulação de células individuais ou pequenos agregados (invasão colectiva, preservando as
junções celulares) que se libertam da massa neoplásica – intravasamento. A invasão local é
dependente da secreção de proteases que remodelam a MEC (pelas próprias células do
carcinoma: MMP-2 e 9; e pelas células estromais). A intravasão parece ser estimulada pela
libertação de EGF pelos macrófagos (tríades de células do carcinoma Mena+, células endoteliais
e macrófagos – TNEM, tumor microenvironment of metastasis).

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A migração iniciada por este processo constitui um grande risco para as células cancerosas.
Tal como as células normais, podem continuar a depender da ancoragem a um substrato sólido,
morrendo por anoikis (apoptose despoletada pela falta de ancoragem). Adicionalmente, o
processo de migração implica a cessação do suporte estromal, que beneficia as células do
carcinoma por providenciar factores mitogénicos e tróficos. A circulação sanguínea representa
por si só um ambiente hostil, onde as células cancerosas ficam sujeitas a forças de cisalhamento
(sobrevivência aumentada se protegidas por um coat plaquetário). Em suma, uma pequena
proporção das CTCs (circulating tumor cells) consegue efectivamente estabelecer uma colónia
num local distante. Ainda assim, o seu tempo em circulação pode ser tão curto que não chegam
a percepcionar a falta de ancoragem e de suporte estromal – são demasiado grandes e
indeformáveis para serem acomodadas na microcirculação (às vezes apresentam-se sobre a
forma de agregados multicelulares), tendo tendência a ficar presas nos capilares pulmonares,
onde podem metastizar directamente ou prosseguir a migração, por mecanismos pouco
conhecidos (hipóteses: por perda de citoplasma ou por bypass capilar – migram através de
shunts artério-venosos), para outros locais do corpo.

O primeiro passo para a metastização num local distante parece ser o simples
aprisionamento físico nos pequenos vasos, após o qual escapam do lúmen vascular,
penetrando no tecido vizinho – extravasamento. Esta penetração pode ser imediata e depender
de mecanismos biológicos e bioquímicos semelhantes aos necessários ao processo de
intravasamento ou ser subsequente a uma proliferação luminal que oblitera o vaso e destrói a
parede vascular, atingindo o parênquima.

Carcinoma in
Ruptura da
situ
membrana
basal

Cascata invasão-metástase:

1ª fase: disseminação física das células cancerosas desde o tumor primário até ao
parênquima dum tecido distante

2ª fase: colonização dependente da adaptação das células cancerosas disseminadas


ao microambiente do novo tecido

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Micro-trombo: a trombina quebra muitas
das ligações proteicas das células endoteliais
à MB vascular, causando a sua retracção e
consequente exposição da MB ao ataque das
proteases produzidas pelas células invasoras

A colonização representa o passo mais complexo e desafiante da cascata invasão-metástase


– ineficiência metastática. Uma vez chegadas ao parênquima tecidual, as células metastizantes
podem formar pequenos agregados de células cancerosas disseminadas (DTCs, disseminated
tumor cells) – micrometástases. O crescimento de metástases microscópicas até
macroscópicas denomina-se colonização. Considerando a colonização o passo limitante do
processo como um todo, entende-se que um número elevadíssimo de micrometástases possa
persistir durante um longo período de tempo até que alguma seja capaz de expandir até
constituir uma massa clinicamente detectável. Este passo está dificultado pela falta de suporte
fisiológico (factores de crescimento e sobrevivência) o que condiciona a morte ou a
sobrevivência como micrometástases para a maioria das células. Por exemplo, em relação ao
cancro da mama, mais de 30% das mulheres possuem centenas a milhares de micrometástases
na medula óssea aquando da apresentação clínica inicial, mas apenas metade destas
desenvolverá doença metastática. Todavia, o simples facto de o tumor ter células neoplásicas
em circulação indicia um mau prognóstico. O número de DTCs (na medula óssea; representa a
acumulação durante um período extenso) parece ter melhor utilidade como marcador
prognóstico do que a concentração de CTCs (no sangue; pode ser muito influenciada por
processos cinéticos complexos).

A existência de micrometástases quiescentes é suportada por experiências com partículas


fluorescentes (a fluorescência reduz-se a metade a cada divisão celular). A conservação da
fluorescência total pelas células presentes nas micrometástases permite inferir que estas células
conseguem permanecer num estado viável de não-divisão durante longos períodos. No entanto,
a colonização parece estar dependente dum segundo tipo de micrometástases que proliferam
gerando variedade genética e epigenética necessária à evolução celular e consequente
capacidade de adaptação ao microambiente.

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Aproximadamente 30% dos pacientes cujos
carcinomas da mama, próstata ou cólon foram
cirurgicamente removidos apresentam doença
residual mínima, isto é, evidenciam
micrometástases na medula óssea, no sangue ou
nos gânglios linfáticos. Nesta fase há
heterogeneidade genética entre as
micrometástases (origem no tumor primário
heterogéneo). Contudo, quando as massas
metastáticas se tornam aparentes, as
micrometástases apresentam um perfil genético
mais homogéneo. Portanto houve um clone que
conseguiu colonizar eficazmente e cuja expansão
é acompanhada de uma onda secundária de
disseminação de células cancerosas com origem
no próprio clone, que rapidamente se tornam
representativas da maioria das micrometástases.
São geneticamente semelhantes porque
descendem da mesma população celular clonal.
Além disso, estas células herdaram a capacidade
de colonizar e o tempo de crescimento até à fase
de metástases macroscópicas pode estar assim
significativamente encurtado – metastatic shower
(elevado número de metástases síncronas
francamente proliferativas).

NOTA: Nos pacientes com cancros terminais as metástases são frequentemente muito heterogéneas,
o que pode sugerir um modelo alternativo de evolução do processo metastático ou ser apenas
consequência de múltiplas ondas secundárias de metastização durante a última fase da doença.

A transição epitélio-mesenquimal (EMT) e perda de


expressão de E-caderina permite que as células dos carcinomas
se tornem invasivas. A organização em camadas dos tecidos
epiteliais é incompatível com a motilidade e invasibilidade
demonstradas por algumas neoplasias malignas. Para adquirir
este potencial, as células têm de perder características do
fenótipo epitelial (alterações morfológicas, mudanças no
programa transcripcional), submetendo-se a uma transição
epitélio-mesenquimal. Em condições normais, a EMT é um
evento que ocorre durante passos morfogenéticos da
embriogénese, bem como durante o processo de cicatrização.
A semelhança entre estes processos normais e o processo
patológico da invasão tumoral sugere que a reorganização
celular assumida pelas células invasivas depende da reactivação
do programa comportamental latente cuja expressão costuma
estar confinada à embriogénese e a tecidos adultos danificados.
Este modelo implica que as múltiplas mudanças fenotípicas não
precisam de ser adquiridas separadamente mas como um todo.
Entre as alterações encontradas ao nível da expressão génica
salientam-se, fundamentalmente, a repressão da expressão de
E-caderina - passando a expressar-se N-caderina, um marcador
fibroblástico - e de citoqueratinas – induzindo a expressão de

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vimentina, filamento intermédio do citoesqueleto das células mesenquimais. Além disso, as
células cancerosas passam a secretar fibronectina, uma proteína da MEC.

A perda E-caderina tem o papel dominante na EMT. Em circunstâncias normais esta proteína mantém
adesão intercelular e a integridade estrutural da camada epitelial através da formação de pontes
homodiméricas entre os domínios extracelulares que sobressaem da superfície de células adjacentes. Os
domínios intracelulares estão ancorados às fibras de actina através de complexos de α e β-catenina, que
mantêm forças constantes de resistência mecânica que impedem a desagregação. A β-catenina também
funciona como um intermediário da via Wnt. A perda de E-caderina resulta na libertação de β-catenina e
acumulação citoplasmática com posterior migração nuclear sob a influência da sinalização Wnt. No núcleo
associa-se a factores de transcrição (ex: Tcf/LEF), induzindo a expressão de genes que orquestram a EMT.

Nota: O promotor do gene CDH1, que codifica a E-caderina, encontra-se frequentemente metilado em
carcinomas invasivos (também é alvo de repressores transcripcionais ou eventos mutacionais, noutros casos).
Adicionalmente, alelos mutantes germline do gene CDH1 resultam em cancro gástrico familiar.

A N-caderina que surge em substituição da E-caderina participa em ligações homofílicas


(liga-se a outras moléculas de N-caderina), aumentando a afinidade das células cancerosas
pelas células estromais que exibem esta molécula na sua superfície. Todavia, a expressão de N-
caderina não provoca a agregação excessiva das células cancerosas entre si – as ligações
intermoleculares homodiméricas são mais fracas do que as estabelecidas entre as moléculas de
E-caderina, permitindo a motilidade celular ao invés da imobilização.

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Os melanócitos normais expressam E-
caderina, mantendo as junções de adesão
com os queratinócitos circundantes na
epiderme.

As células do melanoma expressam N-


caderina, o que facilita a invasão do estroma
dermal e a associação com fibroblastos e
células endoteliais (reactivação do programa
biológico que permitiu o comportamento
migratório dos seus antecessores, as células
da crista neural).

As EMT são influenciadas por sinais contextuais experienciados no microambiente tumoral.


Esta indução por sinais extracelulares é deduzível a partir do comportamento durante o
desenvolvimento embrionário, em que as EMT ocorrem em localizações precisas dependendo
da acção combinada de sinais de múltiplas células que convergem nesses locais. A localização
das células no tumor corrobora esta perspectiva. As células na periferia da massa tumoral, em
contacto próximo com o estroma vizinho, activam os programas de EMT, ao contrário das
células residentes no cerne do tumor. De notar que o fenótipo EMT é reversível: quando
concluídos os múltiplos passos da cascata de invasão-metástase é frequente a reversão para
o fenótipo epitelial através da transição mesênquimo-epitelial (MET).

As metástases assemelham-se a nível histopatológico ao tumor primário. No tumor primário,


o estroma reactivo fomenta a EMT nas células do carcinoma. Quando estas abandonam o tumor
primário este tipo de sinalização pode ser perpetuada pelas plaquetas que envolvem as células
cancerosas no lúmen vascular, preservando o estado mesenquimatoso. Contudo, após
extravasamento para o local das futuras metástases, o estroma encontrado pode ser
completamente normal, permitindo a reversão fenotípica (no início as micrometástases estão
muito enriquecidas em células cancerosas mesenquimais/stem cell-like; progressivamente o
compartimento epitelial vai aumentando proporcionalmente, o que é crítico para o crescimento
metastático). A EMT requer, portanto, uma manutenção activa. Se a colonização for bem-
sucedida, pode eventualmente formar-se um estroma reactivo, reiniciando o ciclo.

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NOTA: Anticorpos contra citoqueratinas (marcadores do tecido epitelial) são utilizados para detectar
micrometástases de carcinomas primários na medula óssea (tecido mesenquimatoso).

Demonstrar as frentes invasoras dos tumores por técnicas histopatológicas é difícil, porque
quando sofrem a EMT as células tornam-se indistinguíveis das células mesenquimatosas do
estroma (há marcadores “especiais” que devem ser utilizados como aos anticorpos que
permitem inferir a localização intracelular da β-catenina).

O envolvimento de sinais contextuais é explicado quer pela libertação de sinais


heterotípicos pelo estroma (TGF-β, Wnts, TNF-α, EGF, HGF, IGF-1, PGE2), quer pela falta de
interacções homotípicas entre as células epiteliais nas frentes tumorais. Complementarmente,
as alterações genéticas e epigenéticas adquiridas pelas células cancerosas durante a
tumorigénese aumentam a responsividade a esta variedade de sinais contextuais (por exemplo,
as células que perderam a função p53 parecem ser mais responsivas aos sinais indutores de
EMT).

Numa experiência, células epiteliais mamárias murinas Ras-transformadas foram expostas


a TGF-β. As células experienciaram uma EMT e quando a concluíram começaram a produzir o
seu próprio TGF-β, que auxilia na manutenção do fenótipo mesenquimal através dum loop de
sinalização autócrina (mesmo quando o TGF-β exógeno era retirado do meio). Este papel do
TGF-β de promoção activa da agressividade das células malignas contrasta radicalmente com o
seu papel anti-proliferativo! Há várias razões que ilustram o contributo do TGF-β na etapa da
invasão: a maioria dos carcinomas humanos extra-intestinais conserva alguns receptores TGF-β
funcionais; a inactivação da via pRb (quase transversal a todos os cancros) cursa com a perda
concomitante da resposta aos efeitos citostáticos do TGF-β, conservando a resposta a outros
sinais a jusante libertados pelo receptor TGF-β activado – pode mesmo favorecer a proliferação
tumoral (estimula a produção de PDGF em osteossarcomas e glioblastomas) e a exposição de
células de cancro da mama a TGF-β acelera a formação de metástases osteolíticas. A acção pode
ser aditiva com outros factores: tanto TGF-β como o TNF-α activam a via NF-kβ, por exemplo.

Em suma, a iniciação dum programa de EMT depende da sinalização parácrina (células


estromais), que neutraliza os inibidores secretados que normalmente previnem a activação
desses programas pelas próprias células epiteliais, e a manutenção da residência no estado
mesenquimatoso depende também da sinalização autócrina (sobretudo de proteínas Wnt
canónicas e não-canónicas e de TGF-β).

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As células estromais contribuem para a indução do comportamento invasivo. Os
macrófagos (TAMs, tumor-associated macrophages) parecem ser peças muito importantes,
uma vez que, experimentalmente, a sua ausência associa-se a tumores benignos e não invasivos.

O EGF é um dos factores chave nesta


interacção: as células dos carcinomas, à
semelhança das células epiteliais,
expressam o receptor para este factor e
a sua activação resulta na aquisição de
motilidade e na secreção de CSF-1, que
estimula a proliferação de macrófagos.
Os macrófagos, por sua vez, libertam
EGF, que activa as células cancerosas,
evidenciando a colaboração recíproca
entre os dois intervenientes, por meio de
sinalização parácrina.

O crescimento do tumor está longe de ser um processo autónomo. O microambiente pode


modelar o fenótipo celular, particularmente pela indução das mudanças profundas de que a
EMT carece.

As EMTs são programadas por factores de transcrição (EMT-TFs, EMT-inducing TFs) que
orquestram passos decisivos da embriogénese (e, quando expressos transitoriamente, a
reconstrução de tecidos lesados). As mudanças despoletadas por esta transição envolvem
campos muito diversos: a organização do citoesqueleto, a motilidade, a sensibilidade à
apoptose, a associação com as células vizinhas, a libertação de proteases, a exibição de
integrinas e receptores de factores de crescimento à superfície celular, entre outros. Activando,
em resposta a sinais heterotípicos do estroma, os factores de transcrição que actuam desta
forma pleiotrópica (exemplos: Snail, Slug, Twist), as células cancerosas ganham o acesso aos
programas de EMT complexos que eles controlam. Os factores de transcrição Snail e Slug (ou
SNAI1 e 2) parecem actuar como repressores da transcrição (por exemplo do gene da E-

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caderina). A sua expressão, à semelhança do factor de transcrição Twist, é estimulada por
exposição a TGF-β. A multiplicidade de TFs aliada às possibilidades de combinação implica que
a EMT se refira a um grupo de programas biológicos celulares, grosseiramente semelhantes
entre si, mas com diferentes particularidades e detalhes moleculares em diferentes tumores.
Para além disso, as células cancerosas epiteliais podem activar parcialmente um programa de
EMT, adquirindo expressão de marcadores mesenquimais sem perder totalmente os pré-
existentes, de origem epitelial.

Os EMT-TFs permitem a entrada das células no estado estaminal. Um traço crítico para o
sucesso do processo de progressão metastática é a capacidade de iniciar um tumor e de auto-
renovação que as CSCs (cancer stem cells) possuem. A estaminalidade permite que poucas ou
até uma única célula originem uma grande população descendente, os crescimentos
secundários designados de metástases. (No entanto, é improvável que a EMT consiga interferir
positivamente no desenvolvimento das adaptações necessárias à colonização propriamente
dita.) Os estudos neste campo limitam-se a experiências envolvendo células epiteliais mamárias
humanas e de ratinho. Comparando sobpopulações tumorais estaminais vs não estaminais, as
primeiras expressam mais marcadores mesenquimais bem como EMT-TFs. Os miofibroblastos
encontram-se entre as células intervenientes na criação de nichos de células estaminais,
enquanto componentes do estroma reactivo e fontes de PGE2, que facilita a entrada no
compartimento estaminal. Além disso, podem facilitar a sinalização Wnt (através da expressão
de periostina), que contribui para a activação da EMT e assim do programa celular estaminal.

NOTA: Curiosamente, o factor de transcrição Slug é expresso fisiologicamente no ducto mamário


normal de ratinho (um tecido adulto, portanto), na camada basal onde residem as células estaminais –
os cancros da mama não devem inventar novos programas de estaminalidade durante o desenvolvimento
tumoral, mas sim apropriar-se dos programas de células estaminais pré-existentes no tecido mamário
epitelial percursor. As células estaminais epiteliais mamárias expressam, por isso, marcadores
mesenquimais.

Os EMT-TFs impulsionam a progressão maligna. A expressão de combinações de factores de


transcrição induz múltiplas mudanças biológicas celulares associadas à invasão e metástase.
Nenhum consegue orquestrar as alterações que culminam numa EMT individualmente. Ainda
assim, alguns reguladores chave conseguem induzir a síntese do factor de transcrição seguinte,
por intermédio de ligação ao seu promotor (por exemplo, o Twist liga-se aos promotores do
Snail, do Slug, do Zeb1 e do próprio Twist e depende do Slug para activar o programa de EMT).
Além disso, alguns factores de transcrição actuam de forma redundante (por exemplo, o Snail,
o Slug, o Zeb1 e 2 conseguem reprimir a expressão de E-caderina por ligação ao seu promotor
no gene CDH1). Experimentalmente, o shutdown do Twist resultou numa diminuição de 85% do
número de metástases, não atribuível a efeitos citostáticos (o tumor primário cresceu até mais
rapidamente).

O aumento de EMT-TFs no núcleo é um processo relativamente lento (desde a transcrição


do gene à obtenção da proteína funcional que actua como factor de transcrição). O Snail não
obedece a esta regra: é rapidamente produzido e degradado (em estado de quiescência, a
cinase GSK-3β fosforila-o marcando-o para a via ubiquitina-proteossoma) em ciclos fúteis de 25
minutos. A activação de sinalização mitogénica pela via Ras-PI3K-Akt/PKB resulta na inactivação
da cinase GSK-3β, permitindo a acumulação de Snail.

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O Zeb1 e o Zeb2 parecem comandar
a decisão de retenção do fenótipo
epitelial ou de activação do programa
de EMT (as células em cultura residem
num dos estados de forma estável).

O conhecimento do papel dos EMT-TFs em cancros humanos advém sobretudo da correlação


entre a sua expressão e a progressão clínica agressiva, que sugere relações de causalidade.
Outras evidências provêm da observação de CTCs (circulating tumor cells) na circulação
sanguínea de pacientes com cancro da próstata (resultados semelhantes em cancro da mama).
Estas células em migração co-expressam marcadores epiteliais e mesenquimais, sugerindo uma
submissão parcial a um programa de EMT antes da entrada em circulação. A aquisição da
capacidade de invasão pode ser compreendida como uma extensão natural dos processos que
levaram inicialmente à formação dos carcinomas primários, dado que a transformação e a
invasão dependem de muitos circuitos regulatórios e proteínas efectoras em comum.

A descoberta dos EMT-TFs sugere três aspectos fundamentais acerca da progressão maligna:
muitos fenótipos celulares malignos podem ser induzidos por alterações não genéticas
(nomeadamente, sinais heterotípicos de origem estromal) e, consequentemente, as células do
tumor primário já podem possuir as alterações genéticas suficientes para a disseminação; as
células do carcinoma podem readquirir o fenótipo epitelial quando encontram um
microambiente estromal normal nos locais de metástases (que não liberta os sinais
heterotípicos que activam os programas de EMT) e as células cancerosas não precisam de
adquirir múltiplos genes mutantes para adquirir os vários traços altamente malignos, sendo
que estes podem ser adquiridos concomitantemente com a expressão dos EMT-TFs, que
actuam de forma pleiotrópica.

As proteases extracelulares são efectores indispensáveis à invasão. A remodelação da MEC


pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) secretadas pelas células estromais (os programas
de EMT também podem induzir a expressão de MMP-2 e 9 nas células do carcinoma) é essencial
para movimentação das células cancerosas. A MMP-9 é altamente expressa por macrófagos,
neutrófilos e fibroblastos nas frentes invasoras dos tumores, correlacionando-se positivamente
com a capacidade metastática do tumor primário. Cliva vários tipos de colagénio, laminina,
quimiocinas, fibrinogénio e TGF-β (os dois últimos são activados pela clivagem proteolítica). De
facto, a função das MMPs estende-se além da degradação dos componentes da MEC. As MMPs
mobilizam e activam factores de crescimento aprisionados na forma inactiva na própria matriz
ou nas superfícies celulares.

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Para além das MMPs secretadas, existe ainda a MT1-MMP
que está directamente ligada à membrana plasmática das
células cancerosas e cliva, de forma localizada e altamente
controlada, substratos na vizinhança imediata: moléculas de
adesão celular (caderinas, integrinas), receptores de factores
de crescimento, quimiocinas, componentes da MEC e pró-
enzimas (activa pró-MMPs a MMPs).

A dissolução da MB é o primeiro passo crítico para a


invasão: o núcleo das células é relativamente rígido e impede
a passagem das células pelos poros desta estrutura. A MT1-
MMP lidera a disrupção da MB: através da sua concentração
em protusões focais discretas à superfície celular – os
invadopodia – as células cancerosas conseguem clivar o
colagénio tipo IV que confere rigidez à MB.

À medida que invadem o estroma subjacente, uma densa


rede de fibras de colagénio tipo I entrecruzadas também
começa a ser degradada pela MT1-MMP (que aumenta a
eficácia deste processo ao recrutar e activar a pró-MMP2
secretada de origem estromal).

Em tecidos normais, as proteases membranares e secretadas têm um papel crucial na


sobrevivência e proliferação celular: cada vez que uma célula se divide é necessário criar espaço
para as células filhas que por sua vez reconstroem a MEC circundante. A remodelação da MEC
é, assim, um processo normal e contínuo em tecidos mitoticamente activos (os ensaios com
fármacos inibitórios das MMPs foram interrompidos pela interferência na remodelação normal
da MEC). Cada tipo de MMP costuma actuar num conjunto de substratos bem definidos, de
forma regulada e localizada. Embora esta especificidade de actuação deva estar conservada no
processo de invasão, este processo é marcadamente distinto pela continuidade da proteólise
ao longo do tempo, em vez duma actividade proteolítica caracterizada por picos, que
acompanha o normal crescimento e divisão celular. O largo espectro funcional de actuação das
MMPs implica o controlo apertado da sua actividade enzimática o que se traduz na síntese inicial
das formas solúveis sob a forma de pró-enzimas que só funcionam após activação por outras
proteases. A regulação negativa ainda é providenciada pelos TIMPS (tissue inhibitors of
metalloproteinases).

As acções das proteases extracelulares explicam a nível bioquímico como é criado espaço
para a movimentação das células cancerosas invasivas. O seu comportamento móvel pode ser
reproduzido em cultura através da exposição a factores de crescimento – factores motogénicos.
No caso das células epiteliais, o melhor indutor da locomoção celular é o HGF (hepatocyte
growth factor), também designado SF (scatter factor) devido à capacidade de induzir
movimento multidirecional nas células em cultura em monocamada. As células que expressam
Met, o receptor do HGF, exibem motilidade em resposta à estimulação com esse factor.

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A maquinaria celular envolvida na motilidade é
extremamente complexa a nível molecular – envolve
a restruturação contínua do esqueleto de actina e
ciclos de criação/destruição de ligações entre a
célula em migração e a MEC.

Primeiramente, a célula prolonga o seu


citoplasma na direcção do movimento pretendido,
emitindo lamellipodia, que por sua vez emitem
filopodia que vão estabelecendo novos pontos de
ancoragem na MEC por meio de integrinas (o que
também pode ser importante na formação de
micrometástases). Estes focos de contacto
providenciam sinais de sobrevivência e criam tracção
física. Simultaneamente, a MEC vai sendo degradada
pelas proteases de superfície presentes na frente
invasora e as junções de adesão opostas à direcção
do movimento vão sendo quebradas permitindo a
alocação de citoplasma na frente invasora.

GTPases Ras-like controlam processos celulares como a adesão, a forma e a motilidade. O


controlo da forma e motilidade celular é realizado por proteínas da família Rho. É a sua
activação localizada em pequenos domínios do citoplasma que permite que a célula como um
todo se desloque. Uma activação globalizada levaria a célula a tentar mover-se em todas as
direcções em simultâneo. Esta activação depende, por sua vez, Rho GEFs (guanine nucleotide
exchange factors), que convertam as proteínas do estado inactivo ligado a GDP ao estado
funcionalmente activo ligado a GTP.

A activação de receptores tirosina cinase (por exemplo, PDGFR, EGFR e erbB2) por factores
de crescimento leva à activação subsequente de muitos membros da família Rho. Estes
receptores activam a Ras e pelo menos três vias de sinalização efectoras a jusante – a Raf, a PI3K
e a Ral-GEF. Da perspectiva da motilidade celular, a via PI3K é claramente a mais importante: ao
gerar PIP3 cria uma molécula na face citoplasmática da membrana celular à qual uma grande
variedade de proteínas citosólicas se podem ligar, incluindo GEFs que assim ficam activados. A
própria Ras pode activar directamente o Tiam1, que funciona como um GEF para as proteínas
Rac (uma das subfamílias Rho), activando-as e regulando a formação de lamellipodia. Portanto,
enquanto as proteínas Ras são frequentemente activadas por alterações estruturais as proteínas
Rho são funcionalmente activadas pelos reguladores fisiológicos a montante.

Outras funções importantes para o movimento dirigido já mencionadas, como o


estabelecimento de novas junções de adesão à MEC (subfamília Rho), a secreção localizada de
proteases (subfamília Cdc42), a contracção do corpo celular (subfamília Rho) e extensão de
filopodia (subfamília Cdc42), também são governadas por membros da família Rho. As suas
acções são ainda mais complexas, diferindo consoante o tipo celular. Por exemplo, nas células
epiteliais normais as subfamílias Rho e Rac mantêm as junções de adesão dependentes de E-
caderina, vitais para a imobilização. Todavia, nas células epiteliais transformadas a Rac contribui
inequivocamente para a motilidade celular.

As células de carcinoma que passam a EMT exibem alterações nos padrões de splicing de
centenas de pré-mRNAs, incluindo o que codifica a proteína Mena, que regula a extensão das

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fibras de actina. Esta proteína passa a incluir um domínio associado à invasão, afectando a
resposta a motilidade induzida por EGF e a migração trans-endotelial e, em termos latos,
aumentando a disseminação metastática.

As células metastáticas podem disseminar por via linfática. Após o intravasamento, a


migração através da circulação sanguínea, isto é, via hematogénica, é muito dependente do
sucesso da angiogénese induzida pelo tumor – não só suporta a actividade metabólica requerida
para a proliferação e sobrevivência como providencia vias de acesso directo a vários locais do
organismo. Contudo, as células cancerosas podem atingir da via linfática no ponto de conexão
com a circulação sistémica. A linfoangiogénese pode ser impulsionada pela secreção de VEGF-
C pelas células tumorais e pelas células estromais recrutadas. No entanto, os vasos linfáticos
raramente estão localizados no centro do tumor sólido, restringindo-se à periferia. Isso
influencia a via escolhida pelas células cancerosas para abandonar o tumor primário que
corresponde habitualmente aos capilares numerosos e funcionais. Mesmo assim, células
metastizantes do carcinoma mamário conseguem entrar directamente nos vasos linfáticos que
drenam directamente a glândula mamária e atingir os gânglios linfáticos próximos (distinguem-
se facilmente das células linfoides e expressam citoqueratinas – o exame histológico é utilizado
rotineiramente para determinar se o cancro primário já tem células metastizantes associadas).

Os gânglios linfáticos que drenam o tumor primário também podem funcionar como áreas
de estadiamento. Embora se pensasse que as pequenas metástases ganglionares pudessem ser
fonte de células que viessem a metastizar posteriormente noutros locais distantes, o mais aceite
é que as células presentes nos gânglios não metastizem, o que é apoiado pelo facto de a cirurgia
de remoção de gânglios em diversos tipos de cancro não aumentar a sobrevivência. Isto sugere
que ocorre metastização por via hematogénica em paralelo e que os gânglios comprometidos
(e o seu número) são marcadores úteis de prognóstico, sem envolvimento directo na
disseminação geral e na doença metastática.

NOTA: O gânglio sentinela é o gânglio que drena directamente o tumor primário.

Uma grande variedade de factores determina os sítios onde as células cancerosas


metastizam. O crescimento das micrometástases (<2mm) até macrometástases (>2mm), ou
seja, a colonização, parece ser um evento chave na determinação do desenvolvimento da
doença metastática. É um processo extremamente ineficiente – a grande maioria das células
que conseguem formar pequenas metástases não se consegue adaptar convenientemente ao
novo tecido e originar macrometástases. Embora os passos iniciais da cascata de invasão-
metástase possam operar de forma comum em diferentes tipos de cancro, a colonização
tecidual do mesmo tecido parece ser significativamente distinta consoante o tipo de cancro.
Adicionalmente, a colonização de diferentes tipos de tecido pelo mesmo tipo de cancro parece
requerer condições diferentes.

Para as células cancerosas metastáticas colonizarem um dado órgão alvo devem ser
altamente especializadas para o fazer. Há evidências que suportam esta afirmação: 75% dos
cancros papilares da tiroide metastizam nos gânglios linfáticos, mas apenas 3% dos pacientes
desenvolvem metástases distantes; muitos tumores carcinoides duodenais metastizam para os
gânglios linfáticos, mas raramente para o fígado ao contrário do cancro do cólon; entre outras.
Além disso, diferentes tipos de células cancerosas adquirem a habilidade de colonizar certos

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tipos de tecido mais rapidamente do que outros, o que sugere que o programa de diferenciação
das células epiteliais influencia a capacidade das células cancerosas tumorais derivadas
formarem metástases num dado órgão. Ou seja, precisam de sofrer um menor número de
alterações adaptativas complexas para colonizar determinados órgãos em detrimento de
outros.

Tropismo metastático

A tendência de certos tipos de


cancro metastizarem em alguns
órgãos em concreto é o reflexo da
capacidade de adaptação ao
microambiente dos tecidos distantes
(ex: colonização da medula óssea em
cancros da mama e da próstata), bem
como da configuração da circulação
(ex: metástases hepáticas derivadas
de cancros do cólon).

Um exemplo quase bizarro deste tropismo vem dos melanomas uveais (células pigmentadas
do olho) que metastizam caracteristicamente para o fígado.

Esta predilecção dos cancros metastizarem num determinado órgão foi descrita pelo
patologista Stephen Paget através da hipótese “seed and soil”, em 1889. Nesta analogia, as
células cancerosas metastizantes - as “sementes” - encontram um “terreno” compatível
somente em certos tecidos especialmente hospitaleiros - “a plant goes to seed, its seeds are
carried in all directions; but they can only live and grow if they fall on congenial soil”.

Contudo, esta hipótese não explica os padrões metastáticos de cancros cuja metastização
é principalmente ditada pela configuração dos vasos que conectam o sítio do tumor primário
com o sítio da metástase (ex: o carcinoma do cólon costuma metastizar no fígado porque as
células cancerosas abandonam o intestino via portal; a mesma óptica explica a metastização
pulmonar no cancro da mama). Para além disso, segundo o modelo “seed and soil” a
metastização contralateral devia ser frequente e não uma raridade como verificado (em caso
de órgãos simétricos, o órgão contralateral devia possuir o ambiente mais favorável à
colonização).

Assim, há dois parâmetros que governam a frequência da metastização num órgão: a


frequência com que as células metastizantes ficam aprisionadas no órgão e a facilidade com
que se conseguem adaptar ao microambiente do órgão. Também há indícios que a
hospitalidade dum dado tecido possa ser influenciada por processos patológicos, como a
inflamação crónica (providencia sinais mitogénicos e tróficos). Esta suspeição é a base dum
processo denominado tumor self-seeding (2009): as CTCs podem considerar que o
microambiente tecidular mais propício à colonização é o estroma do próprio tumor primário,
por ser reactivo e fornecer suporte para a sobrevivência a proliferação das células cancerosas.
Por outro lado, o facto de se tratar dum território familiar requer menos esforço adaptativo por

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parte das células cancerosas. De particular interesse é o facto de as células cancerosas poderem
sofrer alterações genéticas nos locais de metástase distantes para os conseguirem colonizar e
essas alterações genéticas conseguirem ser implantadas no local de origem do tumor primário
através de ondas secundárias de metastização a partir dos locais distantes.

Outros mecanismos estão propostos para explicar os tropismos tecidulares: a libertação de


quimiocinas e a expressão de moléculas tecido-específicas pela superfície luminal dos leitos
capilares - “vascular ZIP code” (argumento contra: coats de plaquetas que envolvem as células
cancerosas em circulação).

Algumas células abandonam o tumor primário em alturas relativamente precoces do


desenvolvimento tumoral – progressão paralela: as células cancerosas completam as últimas
etapas da progessão tumoral nos locais de metástase distantes, independentemente da
progressão tumoral do tumor primário. No entanto, a dificuldade de se adaptar ao
microambiente e a falta de alterações genéticas e epigenéticas em relação às células cancerosas
mais tardias e agressivas, pode ditar que estas células cancerosas mais precoces não consigam
originar mais do que micrometástases dormentes.

A metastização óssea requer subversão dos osteoblastos e dos osteoclastos. Os


mecanismos biológicos e bioquímicos subjacentes à metastização osteotrópica estão
relativamente bem conhecidos. Três dos carcinomas mais prevalentes – carcinoma da mama,
do pulmão e da próstata – metastizam frequentemente no osso.

O osso é um tecido muito dinâmico, o que permite a resposta a stress mecânico, e numa
década é totalmente renovado. Os osteoclastos têm um papel activo na desmineralização óssea
(por dissolução dos cristais de fosfato de cálcio) e degradação da MEC que fica exposta –
reabsorção óssea. Os osteoblastos reconstroem de forma coordenada estas áreas. A maioria
das células cancerosas metastizantes não possui a capacidade de remodelar a estrutura óssea
e portanto manipula estes dois tipos celulares previamente descritos. As células do cancro da
mama activam preferencialmente os osteoclastos, resultando em metástases osteolíticas
enquanto as células do cancro da próstata tendem a activar os osteoblastos, culminando no
aparecimento de lesões osteoblásticas, em que o osteoide se acumula na vizinhança das
metástases. Estes dois comportamentos antagónicos representam os extremos de um contínuo.
Na realidade, ambos os tipos celulares são activados nos dois tipos de cancro, sendo visíveis os
dois tipos de lesão (com predominância dum dos tipos). Uma excepção à coexistência dos dois
tipos de lesão é o caso do mieloma que só está na origem de lesões osteolíticas.

A coordenação entre as duas


funções complementares é conseguida
pelo sistema RANK-RANKL. O RANKL
(receptor activator of NF-kB ligand) é
exibido à superfície dos osteoblastos.
Quando se liga ao receptor na superfície
dos percursores dos osteoclastos induz
a maturação destas células em
osteoclastos funcionais. Em simultâneo,
a osteoprotegerina (OPG), um receptor
solúvel, é secretada pelos osteoblastos e
pode ligar-se ao RANKL, bloqueando a
activação dos osteoclastos.

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As células cancerosas metastizantes atingem a medula óssea por via hematogénica e são
atraídas pela MEC orgânica rica em colagénio e não mineralizada, fonte de factores mitogénicos
e tróficos. Provocando a desmineralização desta matriz, as células cancerosas ganham acesso
aos factores nela sequestrados e utilizam-nos para promover a sua própria proliferação e
sobrevivência.
As células do cancro da mama
revertem o seu fenótipo à chegada para
o fenótipo característico das células
epiteliais mamárias suas percursoras.
Mais especificamente, começam a
secretar PTHrP (parathyroid hormone
related peptide), mimetizando as células
dos alvéolos mamários aquando do
período de lactação. O PTHrP desencadeia
a dissolução osso mineralizado pelos
osteoclastos (via activação por RANKL) e
a exposição dos factores de crescimento
aprisionados na MEC (os iões de Ca2+
mobilizados desta forma deveriam ser
incorporados no leite materno em
condições normais). Os factores de
crescimento libertados (PDGF, BMPs,
FGFs, IGF-1, TGF-β) favorecem a
expansão das células cancerosas que
secretam mais PTHrP, auto-perpetuando
o ciclo vicioso osteolítico.

Os bifosfonatos podem constituir um agente terapêutico, na medida em que são


incorporados pelos cristais minerais e ao serem libertados pela acção osteoclástica levam à
apoptose destas células (adicionalmente reduzem a hipercalcemia). De facto, um estudo que
comparou mulheres pré-menopáusicas com cancro da mama que tomaram ácido zoledrónico
em relação a mulheres que não realizaram este tratamento demonstrou um aumento de 37%
na sobrevivência durante um período de 7 anos no primeiro grupo. Isto reforça a noção de que
muitas recaídas no cancro da mama dependem dos depósitos metastáticos na medula e
dependem da capacidade das células disseminadas obterem factores mitogénicos por
dissolução óssea. O denosumab é um anticorpo monoclonal anti-RANKL que superou o efeito
dos bifosfonatos em termos de retardar o aparecimento de lesões esqueléticas (é equivalente a
retardar a progressão da doença).

Quanto às lesões osteoblásticas, a libertação do factor de crescimento ET-1 (endothelin-1)


pelas células metastáticas parece ser o evento chave na estimulação dos osteoblastos. As
próprias células cancerosas apresentam receptores para a ET-1, estabelecendo um loop de
estimulação autócrina. A activação dos osteoblastos pode beneficiar as células cancerosas na
medida em que a construção de osso mineralizado envolve a secreção de uma grande
quantidade e diversidade de factores de crescimento.

Em suma, as células cancerosas não são só “sementes” passivas, mas “cultivam”


activamente o “solo” em que “caíram”.

Os genes supressores de metástase regulam o fenótipo metastático. Versões desreguladas


de genes que codificam factores de crescimento e os seus receptores ou proteínas envolvidas
na transdução de sinal podem contribuir activamente para muitas das etapas do processo de
invasão e metastização. Os circuitos onde estas proteínas intervêm têm também reguladores

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negativos. Os genes que os codificam foram denominados genes supressores de metástase.
Quanto ao p53, alelos dominantes com ganho de função são mais potentes a promover a
malignidade que os alelos nulos, pois as proteínas p53 mutantes são capazes de formar
heterotetrâmeros com as proteínas p53 WT. A E-caderina também é considerada o produto de
um gene supressor de metástase, pelos vários aspectos inerentes à sua função que já foram
referidos.

As micrometástases ocultas ameaçam a sobrevivência a longo prazo dos pacientes. A


ineficiência metastática traduz-se na presença de inúmeras micrometástases quiescentes no
organismo de muitos pacientes com cancro. A maioria é incapaz de originar metástases
clinicamente detectáveis, mas a sua simples presença é o testemunho da capacidade de o
tumor primário disseminar. Representam uma ameaça latente na medida em que podem
deflagrar em metástases macroscópicas até anos após a sua implantação nos tecidos distantes.
Os cancros da mama podem recorrer até duas décadas após a remoção do tumor primário e a
declaração do paciente como livre de doença. A presença de micrometástases na medula óssea
é um marcador prognóstico útil nestas pacientes (aumenta o risco de recorrência ou morte pela
doença).

Os mecanismos que previnem o crescimento vigoroso das micrometástases são pouco


conhecidos. Observa-se que estas células crescem em redor dos pequenos vasos, o que sugere
falta de capacidade angiogénica própria. A maioria destas células encontra-se num estado não
proliferativo (G0) e assim permanece por períodos extensos, o que as torna particularmente
resistentes à quimioterapia adjuvante, aplicada para remover a doença residual após ressecção
cirúrgica do tumor primário. Os mecanismos imunes também podem contribuir para a
supressão do crescimento metastático. Esta quiescência pode ainda ser aparente: a colonização
requer alterações fenotípicas significativas cuja ocorrência só parece ser compatível
considerando populações em proliferação (o período em que são clinicamente inaparentes
corresponde à actividade apoptótica que contrabalança a actividade proliferativa).

RESUMO:

A tendência a metastizar está relacionada com a expressão de padrões particulares de


genes que são reproduzidos pela maioria do tumor primário – sugere que esta propensão foi
adquirida relativamente cedo no processo de progressão tumoral (e não tardiamente por uma
pequena subpopulação especializada não representativa);

A análise dos genomas das células metastáticas pode obrigar a conciliar a preponderância de
subclones geneticamente especializados na iniciação do processo metastático;

O programa de diferenciação da célula normal de origem do tumor pode influenciar o seu


comportamento metastático;

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A habilidade para metastizar pode não ter tradução imediata na geração de células
cancerosas disseminadas mas definir a capacidade de resposta aos sinais estromais indutores
duma EMT;

Alguns problemas dificultam as abordagens experimentais às questões por resolver: a


ineficiência do processo metastático; a colaboração de factores genéticos e epigenéticos; o
confinamento da expressão génica às frentes invasivas; a difícil distinção entre as células dos
carcinomas que passaram por uma EMT completa e as células não neoplásicas mesenquimais
do estroma; e a quiescência metastática.

Há um grau de semelhança substancial entre os perfis de expressão génica dos tumores


primários e da sua descendência metastática (ainda assim, as células cancerosas no segundo
grupo costumam apresentar mais mutações), o que deposita esperança na resposta das células
metastáticas a tratamentos utilizados para destruir o tumor primário.

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Gynecologic Malignancies – Ovarian Cancer
Incidência e Patologia: O cancro do ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais mortal
nos países onde a prática de rastreio do cancro do colo do útero está generalizada. O ovário é
um órgão complexo e dinâmico, responsável pela maturação de folículos e oócitos, pela
ovulação e pela produção cíclica de hormonas sexuais esteroides, durante a vida reprodutiva da
mulher. Estas funções são coordenadas por vários tipos celulares que possuem potencial
neoplásico. As neoplasias mais comuns originam-se a partir do epitélio ovariano ou do epitélio
vizinho das trompas de Falópio, do corpo uterino e do cérvix. Os tumores nas mulheres mais
jovens costumam ser benignos. Existem quatro tipos principais de tumores epiteliais do ovário;
os serosos (50%), os mucinosos (25%), os endometrioides (15%) e os de células claras (5%).

Epidemiologia e Patogénese: Cada uma das variantes histológicas de tumores epiteliais do


ovário é distinta, possuindo características moleculares únicas. Os tumores epiteliais têm o seu
pico de incidência na 6ª década. Factores de risco para o aparecimento de cancro seroso do
ovário incluem: a nuliparidade, a obesidade e a terapia de substituição hormonal. Os factores
protectores parecem actuar através da supressão da ovulação (e da inflamação do epitélio
associada à ovulação) e incluem a mutiparidade, o uso de contraceptivos orais e a
amamentação. Os tumores mucinosos são mais frequentes em mulheres com hábitos tabágicos.
Já os tumores endometrioides e de células claras associam-se a história de endometriose. É
provável que as células percursoras do carcinoma seroso do ovário tenham origiem nas
fímbrias das trompas de Falópio (por extensão directa ou por captura das células tubárias
exfoliadas (pré-)neoplásicas por um folículo ovariano em involução).

Factores de Risco Genéticos: Uma grande variedade de síndromes genéticas incrementa o


risco de desenvolvimento de cancro do ovário. Aproximadamente 10% das mulheres com
cancro do ovário possui uma mutação germline no gene BRCA1 (30-50% de risco) ou BRCA2
(20-40% de risco), que codificam proteínas envolvidas na reparação do DNA. A maioria destas
mulheres tem história familiar positiva, flagelada por múltiplas ocorrências de cancro da mama
e/ou do ovário. De forma similar, mulheres com mutações nos genes de mismatch repair
associados com a síndrome de Lynch também têm risco aumentado de aparecimento de cancro
do ovário. Os estudos de rastreio nestas populações selecionadas sugerem que as técnicas
actuais de rastreio, nomeadamente a medição do marcador tumoral CA-125 e a
ultrassonografia são insuficientes para detectar a doença num estadio precoce e curável.
Portanto, as mulheres com estas mutações germline são aconselhadas a remover
profilaticamente os ovários e as trompas de Falópio, tipicamente após a maternidade e
idealmente antes dos 35-40 anos. A ooforectomia profilática também confere protecção contra
o aparecimento de cancro da mama, uma redução de risco que pode atingir os 50%.

Apresentação Clínica: Os tumores são indolores e os sintomas são relacionados com a


compressão das estruturas locais adjacentes (desconforto pélvico, distensão intestinal) ou
derivados da doença metastática (náuseas, falta de apetite, indigestão, obstipação, dor
abdominal e ascite). Crê-se que os tumores de alto grau metastizam precocemente e tendem a
disseminar-se através da cavidade peritoneal. A avaliação laboratorial evidencia valores muito
elevados do marcador CA-125, uma mucina (Muc 16), associada, mas não específica para o
cancro do ovário. Os cancros do ovário são classificados segundo quatro estádios: I – tumores
confinados ao ovário; II – tumores confinados à cavidade pélvica; III – tumores confinados à

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cavidade peritoneal e IV – tumores com metástases parenquimatosas (fígado, pulmão, baço) ou
da parede abdominal ou pleurais. Cerca de 60% das mulheres enquadram-se no estádio III.

Rastreio: O cancro do ovário raramente é curável nos estádios mais avançados. No entanto,
as estratégias de rastreio actualmente existentes – a US transvaginal e a medição sérica dos
níveis de CA-125 – não são suficientemente boas para serem recomendadas à população com
risco normal.

Tratamento: As mulheres com doença aparentemente localizada realizam salpingo-


ooforectomia unilateral e, após confirmação da origem primária do tumor no ovário, são
submetidas a histerectomia, a salpingo-ooforectomia contralateral, a omentectomia e a
biópsias aleatórias dos gânglios linfáticos pélvicos e da cavidade peritoneal. Este procedimento
cirúrgico extenso é executado porque cerca de 30% dos tumores que parecem estar confinados
ao ovário já se disseminaram para a cavidade peritoneal e/ou para os gânglios adjacentes. Se
houver evidência de doença intra-abdominal massiva tenta-se alcançar a máxima citorredução
tumoral, mesmo que isso implique ressecção intestinal parcial, esplenectomia, entre outros. O
sucesso desta estratégia correlaciona-se com melhor prognóstico. Após a intervenção cirúrgica,
as mulheres recebem quimioterapia com um agente platinum (ainda se debate se a
administração deverá ser endovenosa ou intraperitoneal). Também se pode administrar terapia
neoadjuvante com um platinum e um taxano antes da abordagem cirúrgica. Considerando
óptima cirurgia e quimioterapia, 70% das mulheres com doença avançada responde e 40-50%
das mulheres experienciam remissão completa. Infelizmente, uma pequena fracção destas
mulheres permanecerá em remissão clínica (75% tem uma recaída ao fim de 1 a 4 anos). O
primeiro sinal de recidiva costuma ser o aumento dos níveis de CA-125 (no entanto, a
intervenção nesta fase precoce não parece influenciar a sobrevivência). A doença recorrente
não é curável e eventualmente todas as mulheres se tornarão refractárias à quimioterapia.

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NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN
Guidelines®) - Ovarian Cancer: Including Fallopian Tube
Cancer and Primary Peritoneal Cancer
Overview: O cancro do ovário compreendem várias entidades histopatológicas e o
tratamento depende no tipo de tumor. O cancro epitelial do ovário contabiliza cerca de 90%
das neoplasias malignas do ovário e é a principal causa de morte por cancro ginecológico. Mais
de 70% das mulheres apresentam-se com doença avançada aquando do diagnóstico e menos
de 40% dos cancros são curáveis. A incidência aumenta com a idade (6ª e 7ª década de vida).

Factores protectores: idade da primeira gravidez <25 anos; uso de contraceptivos orais e
amamentação.

Factores de risco: nuliparidade ou primeira gravidez >35 anos. História familiar positiva de
cancro da mama e do ovário hereditário (HBOC) ou síndrome de Lynch está associada com
surgimento precoce da doença. A salpingo-ooforectomia bilateral profilática pode ser uma
opção a considerar nestas circunstâncias.

Rastreio: O diagnóstico de cancro do ovário costuma ocorrer numa fase pouco curável. Os
sintomas sugestivos incluem distensão e dor abdómino-pélvica, urgência e frequência urinária
e dificuldades na alimentação (>12 dias/mês). O rastreio com ultrassonografia transvaginal e
doseamento de CA-125 parece detectar os cancros de baixo grau, mas não parece reduzir a
mortalidade. O rastreio não é dirigido à população em geral, mas às mulheres em risco.

Estadiamento: O cancro do ovário pode ser estadiado de I a IV pelo sistema FIGO


(International Federation of Gynecology and Obstetrics). A maioria dos pacientes apresenta-se
no estadio III. A graduação patológica (grau 1 a 3) tem valor prognóstico e auxilia na selecção
da terapia.

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Diagnóstico: As massas pélvicas não diagnosticadas devem ser vigiadas (US, RM, TC; HE4 e
CA-125 + Risk of Ovarian Malignancy Algorithm [ROMA]) e também devem ser alvo de vigilância
especial as mulheres que tiveram um EOC (epithelial ovarian cancer) prévio. As pacientes com
cancro do ovário devem ser referenciadas para avaliação do risco genético. Os marcadores para
despiste de histopatologias menos comuns e gravidez incluem a CA-125, a inibina, a alfa-
fetoproteína (tumores das células germinativas) e a β-HCG. A aspiração por agulha fina deve ser
evitada em pacientes com doença presumível de baixo grau, prevenindo a ruptura de quistos e
libertação de células malignas para a cavidade peritoneal. Pode ser necessária em pacientes que
não são candidatos a cirurgia. Os cancros primários das trompas de Falópio e peritoneais
costumam ser diagnosticados no pós-operatório (ou no pré-operatório se a paciente já tiver sido
submetida a ooforectomia bilateral).

Pacientes com Diagnóstico Prévio (por cirurgia ou biópsia tecidual – citopatologia):


Frequentemente as pacientes referenciadas já foram intervencionadas (cirurgia citoredutora,
procedimentos adequados ao estadiamento). O ECO tem 4 subtipos histológicos principais:
seroso (70%), endometrioide, mucinoso e de células claras. O tratamento não difere.

Tratamento Primário: Consiste em estadiamento cirúrgico e citoredução (histerectomia


total e salpingo-ooforectomia bilateral; a salpingo-ooforectomia unilateral pode ser
equacionada em pacientes jovens e férteis), seguidos, na maioria dos casos, por quimioterapia
sistémica. O cirurgião deve reportar a extensão da doença inicial, a quantidade de doença
residual e se a ressecção completa ou incompleta foi efectuada.

Cirurgia Redutora de Risco: Destinada a mulheres com síndrome de cancro hereditário da


mama e do ovário. As trompas de Falópio devem ser seccionadas e extensivamente examinadas
na região de implantação das fímbrias. Os ovários também devem ser seccionados e
examinados. A realização de histerectomia é controversa.

Cirurgia Citorredutora: É a recomendação inicial para as pacientes com doença de estádio II


a IV. O objectivo é alcançar a citorredução máxima, ou seja, menos de 1 cm de doença residual
ou ressecção de toda a doença visível. A ressecção extensiva das metástases no abdómen
superior é recomendada para pacientes que consigam tolerar esta cirurgia. A aspiração do
líquido ascítico ou do lavado peritoneal deve ser executada para realizar exames citológicos.
Devem remover-se o útero, as trompas de Falópio, os ovários, o grande epíploon (se
envolvido) e gânglios suspeitos. A quimioterapia neoadjuvante deve ser considerada se a
citoredução máxima não for praticável.

Quimioterapia Neoadjuvante: Pode ser ponderada para pacientes com doença no estádio
III ou IV que não são candidatas a cirurgia, após diagnóstico patológico (por aspiração com
agulha fina, biópsia ou paracentese). Nos EUA não é uma opção prioritária.

Cirurgia e/ou Estadiamento Incompleto: Pacientes com doença de estádio II a IV com


doença residual não ressecável devem ser reavaliados após 3 ciclos de quimioterapia.

Quimioterapia: A maioria das pacientes com EOC recebe quimioterapia sistémica pós-
operatória – terapia adjuvante. Nas pacientes com doença em estádio I, a simples observação
é recomendada. A terapia adjuvante primária inclui opções intravenosas (standart:
carboplatina/paclitaxel) e, em certos casos, intra-peritoneais (no estádio III a administração ip

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de cisplatina/paclitaxel provou prolongar a sobrevida). A combinação docetaxel/carboplatina
deve ser considerada em pacientes com risco de neuropatia elevado (ex: diabéticas). A
administração semanal (em vez de 3 em 3 semanas) pode ser apreciada em pacientes com maior
idade e com doença mais avançada.

Agentes Anti-angiogénicos: A adição de bevacizumab à quimioterapia convencional, de


forma mantida (mas não apenas a administração inicial), está associada a aumento do tempo
sem progressão de doença.

Número de Ciclos de Quimioterapia e Agentes: Inicialmente, devem realizar-se 6 a 8 ciclos


de quimioterapia. A manutenção após remissão clínica completa pode ser realizada com
administração de paclitaxel durante 12 meses (aumenta o intervalo sem progressão de doença).
Existem outras opções (pazopanib, bevacizumab). As recomendações são controversas.

Recomendações após o Tratamento Primário e Follow-up: As pacientes devem ser


submetidas a uma reavaliação clínica e a observação (alertar para os sinais e sintomas, realizar
exames imagiológicos se justificável) é recomendada para as que não apresentarem evidência
de progressão (remissão clínica completa: exame físico negativo, níveis de CA-125 negativos,
TC negativa com gânglios linfáticos < 1cm). Quanto às pacientes que apresentem sinais de
progressão (recorrência) devem ser seguidas abordagens de 2ª linha (referenciar para os
cuidados paliativos se necessário). Recomenda-se a avaliação do risco genético para todas as
mulheres com cancro do ovário.

Níveis aumentados de CA-125: Após a recaída bioquímica passam em média 2 a 6 meses até
à recaída clínica. No entanto, o tratamento imediato não parece acarretar benefícios, devendo
ser protelado até à fase sintomática.

Doença Recorrente: O prognóstico é mau para as pacientes que apresentam progressão


após 2 regimes consecutivos de quimioterapia sem benefício clínico (refractárias) e para aquelas
em que a doença reaparece em menos de 6 meses (resistentes ao platinum). Estas últimas
devem ser encaminhadas para ensaios clínicos ou para cumprir terapêutica de recorrência ou
ainda para os cuidados paliativos (por exemplo, radioterapia dirigida a locais sintomáticos
específicos). Às pacientes que têm uma recaída mais de 6 meses após a quimioterapia inicial
(sensíveis ao platinum) deve ser oferecida quimioterapia consistindo numa combinação baseada
em agentes platinum. Deve ter-se cuidado com o uso sequencial de múltiplos regimes de
quimioterapia pois as pacientes podem sofrer efeitos provenientes da toxicidade excessiva e
podem não tolerar as doses iniciais. A cirurgia citoredutora secundária pode ser equacionada
para pacientes que recaem após um longo período livre de doença (> 6 meses).

Terapia da Doença Recorrente: As combinações baseadas em compostos platinum são


recomendadas para doença recorrente sensível a estes agentes. Em caso de doença resistente
ao platinum, a terapêutica baseia-se em agentes não-platinum (docetaxel, etoposide oral,
gemcitabine, liposomal doxorubicin, paclitaxel, topotecan). Embora estes agentes costumem ser
usados em regime único, há regimes de combinação disponíveis que incluem o bevacizumab
como 2º agente (este agente também pode ser adicionado à quimioterapia de combinação em
pacientes sensíveis ao platinum que não o receberam previamente). O olaparib, inibidor da
PARP (poli ADP-ribose polimerase) é eficaz em pacientes selecionadas, nomeadamente as que
têm mutações BRCA1/2 e são sensíveis ao platinum.

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Minireview: Human Ovarian Cancer: Biology, Current
Management, and Paths to Personalizing Therapy
O cancro do ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais mortal nos países
desenvolvidos. O ovário contém três tipos de células: germinativas (derivadas da endoderme;
3-5% dos cancros, habitualmente na 2ª e 3ª décadas), endócrinas e intersticiais (produzem
estrogénio e progesterona; 7% dos cancros) e células epiteliais (derivadas do ducto mülleriano;
90% dos cancros, normalmente acima dos 40 anos). Crê-se que mais de 90% dos cancros do
ovário tenham origem nas células epiteliais que revestem a superfície ou que delimitam os
quistos subserosos. Cancros histologicamente semelhantes podem originar-se das fímbrias das
trompas de Falópio ou de depósitos de endometriose.

Há diferentes histotipos que têm em comum a expressão de genes HOX (A9, A10, A11) (a
transformação maligna activa o programa que regula diferenciação ginecológica normal) e
relembram células epiteliais de diferentes locais: seroso (trompas de Falópio), endometrioide,
mucinoso (endocérvix) e de células claras (vaginal).

Existem dois tipos de cancro epitelial do ovário: tipo I/baixo-grau – precoces (I/II), crescem
lentamente e resistem à quimioterapia convencional mas podem ser responsivos à
hormonoterapia – e tipo II/alto-grau – avançados (III/IV), com crescimento agressivo e
respondem à quimioterapia. Os cancros tipo I costumam ter alelos WT dos genes p53 e
BRCA1/2, mas possuem frequentemente mutações nos genes Ras e Raf, expressam IGFR e têm
a via PI3K activada. Em teoria, todos os cancros tipo II têm o gene p53 mutados e metade tem
alterações no BRCA1/2. A oncogénese parece ser impulsionada por amplificação de genes
reguladores do crescimento que activam as vias PI3K e Ras/MAPK. Estão também associados a
anomalias numéricas e a instabilidade genómica.

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Os factores de risco mais relevantes para o desenvolvimento de cancro do ovário incluem a
idade avançada, o número de ciclos ovulatórios e a história familiar positiva (ovário, mama,
útero e cólon) relacionada com mutações BRCA1/2 e p53 germline. Quanto a factores
protectores destaca-se o uso de contraceptivos orais durante um período igual ou superior a
5 anos antes da menopausa (ovulação reduzida, tratamento das células com agentes
progestogéneos). Cerca de 15% dos cancros do ovário são familiares e 85% esporádicos.

Uma característica particular do cancro do ovário é a capacidade de se disseminar através


da cavidade abdominal formando nódulos metastáticos na superfície peritoneal. A
disseminação por via vascular (linfática ou hematogénica) é mais rara e tem como alvos o
fígado, o pulmão e o cérebro. Quando a maioria das pacientes é diagnosticada já existem
múltiplos nódulos peritoneais.

A citorredução é óptima quando o tumor macroscópico é totalmente removido antes do


início da quimioterapia (quando tal não é praticável administra-se quimioterapia neoadjuvante
antes da cirurgia). Após a cirurgia, o tratamento adjuvante standart é constituído por seis ciclos
de carboplatina (agente alquilante) e paclitaxel (impede a despolimerização do fuso mitótico).
A adição de bevacizumab (anticorpo anti-VEGF, anti-angiogénico) parece aumentar o tempo
livre de doença. Durante a quimioterapia primária aproximadamente 70% dos cancros do
ovário respondem ao platinum (carboplatina, cisplatina) como agente único ou em combinação
com paclitaxel (o knockdown de cinases pode aumentar a sensibilidade das células cancerosas a
este agente).

Mais de 70% das pacientes com


cancro avançado vão sofrer
fenómenos de recorrência (doença
incurável). Quando recorre mais de
6 meses após a quimioterapia
primária considera-se que a doença
é sensível ao platinum. Se recorrer
em menos de 6 meses é considerada
resistente ao platinum.

A cirurgia citorredutora e a quimioterapia com compostos de platinum e taxanos


aumentaram a sobrevivência mas menos de 40% dos cancros conseguem ser curados.

Quanto a biomarcadores, a CA-125 (MUC16) é uma mucina glicosilada transmembranar


expressa em 80% dos cancros do ovário, contribuindo para fenómenos de adesão, motilidade
e invasão. Encontra-se em circulação no soro e é útil na monitorização da resposta à
quimioterapia. Não é claro se a detecção de recorrência por monitorização dos níveis de CA125
terá valor em termos de sobrevivência. No entanto, ajuda a identificar pacientes que podem
ser submetidos a cirurgia citoredutora secundária e aumenta o intervalo temporal (através da
detecção precoce) que pode ser alvo do tratamento com múltiplos agentes convencionais e
novos.

A terapia personalizada baseia-se em agentes que têm como alvo as proteínas anormais em
cada paciente. Inibidores da poli-ADPribose polimerase (PARP) induzem letalidade sintética
em pacientes com deficiência da função BRCA1/2 e melhoram o prognóstico, bem como a

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resposta a compostos platinum. As proteínas codificadas pelos genes BRCA1 e BRCA2 medeiam
a recombinação homóloga, um mecanismo de reparação do DNA. Os cancros deficientes nesta
função não conseguem reparar as DSBs no DNA induzidas pelos compostos platinum. Os
inibidores da PARP retiram às células um segundo mecanismo de reparação – a base excision
repair – incitando desta forma a morte celular.

Inibidores da via PI3K/AKT (que pode estar constitutivamente activada) ou agentes anti-
angiogénicos (as metástases não conseguem crescer mais do que 1mm sem formação de
neovasos; anticorpos anti-VEGF e VEGFR, anti-PDGF) têm sido explorados. O desenvolvimento
de modelos animais que mimetizem a biologia do cancro do ovário humano é crítico para
identificar novos alvos e combinações úteis de terapia personalizada.

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Ovarian Cancer Development and Metastasis
O carcinoma do ovário pode originar-se quer das superfícies do ovário, quer da trompa de
Falópio, quer ainda da cavidade peritoneal revestida de mesotélio. As células cancerosas
ovarianas metastizam preferencialmente na cavidade peritoneal e são superficialmente
invasivas. No entanto, a rápida proliferação e compressão visceral consequente, aliada a uma
quimiosensibilidade temporária, justificam que seja um cancro bastante mortal, com a cura a
rondar os 30%.

A progressão tumoral pode resultar num carcinoma bem diferenciado (tipo I) ou num
carcinoma seroso com tendência metastizante e geneticamente instável (tipo II). Durante os
passos iniciais da tumorigénese, as células sofrem uma transição epitélio-mesenquimal, que
envolve mudanças na expressão de moléculas de adesão (caderinas e integrinas) e sobre-
regulação das vias proteolíticas. A fase mais tardia é definida pelo crescimento rápido
impulsionado por oncogenes de nódulos tumorais nas superfícies mesoteliais, com reversão
para o fenótipo epitelial. Sintomaticamente, esta fase caracteriza-se por ascite, obstrução
intestinal e caquexia.

A maioria (75%) das pacientes apresenta-se num estádio avançado aquando do diagnóstico
inicial, com doença metastática franca (peritoneal). Esta metastização pode ser por extensão
directa para os órgãos vizinhos (bexiga, cólon) ou por exfoliação a partir do tumor primário e
disseminação no fluido peritoneal. Mais raramente, a metastização segue a via vascular. A
doença costuma estar localmente avançada na cavidade pélvica, com comprometimento do
aparelho reprodutor e do cólon sigmoideu. O grande epíploon está quase sempre afectado.

As estratégias terapêuticas envolvem a cirurgia citorredutora agressiva (pode envolver


ressecção em bloco dos órgãos reprodutivos e do cólon sigmoideu) que melhora a
sobrevivência. Este efeito demonstra o comportamento biológico diferente do cancro do ovário
em comparação com a maioria dos cancros, em que a remoção das metástases não aumenta a
sobrevivência. No pós-operatório, com excepção de pacientes com certos cancros mais
diferenciados (precoces), todas as pacientes recebem quimioterapia com platinum
(carboplatina, cisplatina) e um taxano (paclitaxel). A administração intra-peritoneal parece
prolongar o tempo livre de progressão e a sobrevida em geral (em comparação com a
administração iv). Os carcinomas do ovário estão geralmente confinados à cavidade abdominal
e portanto esta via de administração permite a obtenção de altas concentrações peritoneais.

A OMS categorizou sete tipos de carcinomas do ovário de acordo com o tipo predominante
de célula epitelial (representativos de 80% dos cancros). O carcinoma seroso, quando ainda
possui um grau razoável de diferenciação, exibe uma arquitectura glandular ou papilar que se
assemelha à superfície da trompa de Falópio (carcinoma seroso-papilar). O carcinoma
endometrioide está frequentemente associado com endometriose. O carcinoma mucinoso
aparenta características das glândulas endocervicais ou do epitélio gastro-intestinal (distingue-
se de metástases de origem GI através de imuno-histoquímica para as citoqueratinas 7 –
normalmente positiva nos carcinomas do ovário - e 20 – normalmente positiva nos carcinomas
GI). O carcinoma de células claras é um subtipo raro associado com endometriose, que partilha
aspectos morfológicos dos carcinomas serosos e endometrioides. A análise da expressão génica

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destas categorias revelou que os genes expressos pelos diferentes tipos são expressos
normalmente pelos tecidos a que os carcinomas se assemelham histologicamente.

Como proposta explicativa da carcinogénese a partir da monocamada epitelial ovariana tem-


se a teoria da ovulação incessante, que invoca a reparação da superfície e a tendência para se
formarem quistos de inclusão como contributos para a transformação maligna.

As células epiteliais ovarianas expressam tanto marcadores epiteliais (queratinas) como


mesenquimais (vimentinas) à semelhança das células mesoteliais. A origem embrionária do
epitélio ovariano – epitélio celómico junto à crista gonadal – é distinta dos tecidos aos quais é
capaz de originar através da progressão tumoral – ductos müllerianos. Esta transição dum
epitélio simples e pouco diferenciado para epitélios do tipo mülleriano é explicada pela
expressão dos genes HOX, implicados na segmentação corporal e na morfogénese do tracto
reprodutor feminino (HOXA9 – c. seroso; HOXA10 – c. endometrioide; HOXA11 – c. mucinoso).

Algumas vezes as lesões percursoras não conseguem ser identificadas: o único tipo de
carcinoma com um componente pré-canceroso não estabelecido é o carcinoma seroso de alto
grau. A origem nas trompas de Falópio de alguns carcinomas do ovário é suportada por duas
teorias: a primeira tem por base a ideia que a transição entre o ovário e a trompa é materializada
por uma área de epitélio de transição, especialmente vulnerável a transformação maligna; a
segunda, postula que durante a ovulação as células epiteliais tubárias das fímbrias implantam-
se na superfície desnudada do ovário, gerando quistos de inclusão, alvos de transformação no
microambiente ovariano.

O modelo conceptual actual considera duas vias moleculares principais conducentes ao


aparecimento do carcinoma do ovário. Os cancros tipo I são de baixo grau, caracterizados por
diagnóstico em idade jovem, por uma sobrevida prolongada e por resistência relativa à
quimioterapia convencional. Os cancros tipo II são de alto grau e são mais prevalentes em
mulheres pós-menopáusicas. Embora a resposta inicial à quimioterapia seja melhor, as
pacientes têm uma sobrevida menor. Tipicamente, os tumores tipo I têm mutações nos genes
Raf, Ras e Erbb2, exibem instabilidade de microssatélites e seguem a progressão adenoma-
carcinoma. Em 80% dos tumores a proteína MAPK está activada. Os tumores de células claras e
endometrioides, apesar de se apresentarem como uma grande massa tumoral, não costumam
estar metastizados. Os tumores tipo II apresentam amplificação e perda de sequências de DNA
duma forma generalizada, o que reflecte a grande instabilidade genética deste tipo de tumor. A
expressão reduzida de Rb1 e p16 é frequente nesta categoria tumoral e a mutação do p53 ocorre
na maioria destas formas de cancro (evento precoce). Outras alterações genéticas importantes
incluem mutações BRCA1 e 2 e amplificação dos genes AKT2 e PI3K.

A metastização parece estar facilitada no caso do cancro do ovário: uma vez libertadas
células individuais ou clusters celulares (esferoides multicelulares) da massa tumoral primária,
estas parecem metastizar por um mecanismo passivo, à custa do movimento fisiológico do
fluido peritoneal. A colonização da cavidade peritoneal parece ser francamente eficiente, mas
a metastização por via hematogénica é muito rara (pacientes com shunts peritoneo-venosos
para drenar líquido ascítico raramente desenvolvem metástases por via hematogénea). É um
exemplo ilustrativo da teoria “seed and soil” de Paget: o solo por excelência para o carcinoma
ovariano é o mesotélio. O tumor raramente invade em profundidade.

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Antes da libertação das células, estas são submetidas a uma transição epitélio mesênquima
(EMT), que diminui a ancoragem das células à MB e enfraquece as ligações intercelulares
(perda de junções de adesão mediadas por E-caderina que se liga à β-catenina ligada aos
microfilamentos de actina – expressão inibida por libertação de repressores transcripcionais:
Sip1/ZEB2, Snail e Slug e domínios extra-celulares clivados pela MMP-9; outros tipos de
caderinas ficam sobre-reguladas – “cadherin switch”). A EMT permite que as células cancerosas
sobrevivam sob condições hipóxicas e favorece a sinalização mesenquimal através de
interacções com as células estromais circundantes. Uma vez instaladas no peritoneu
readquirem o fenótipo epitelial, permitindo a resposta a factores de crescimento parácrinos e
a proliferação rápida. A etiologia da ascite pode estar relacionada com a obstrução de vasos
linfáticos subperitoneais (impede a reabsorção de fluido produzido) e com a secreção de VEGF
pelas células cancerosas (aumenta a permeabilidade vascular).

A expressão de integrina-51 e do seu ligando, a fibronectina, à superfície das células


cancerosas está relacionada com a formação de esferoides. A integrina-61 (liga-se à laminina) e
a integrina-21 (liga-se ao colagénio tipo IV) também podem estar envolvidas. Os ligandos destas
integrinas também estão abundantemente presentes no repertório de proteínas extracelulares
do mesotélio. A actividade proteolítica é crucial para o destacamento inicial da superfície
ovariana (MMP-14) e para a desagregação dos esferoides aquando da adesão à camada
mesotelial (MMP-2; também cliva as proteínas da MEC facilitando a adesão aos fragmentos mais
pequenos). Os esferoides parecem constituir um nicho quimioresistente que renova
continuamente a população cancerosa na cavidade abdominal, tornando a cura do carcinoma
do ovário impossível.

No peritoneu, o diafragma direito e o mesentério são preferencialmente colonizados. As


integrinas à superfície das células cancerosas são mediadoras desta interacção (integrina-1, 41
– liga-se à VCAM-1) bem como o CD44 (receptor de superfície para o ácido hialurónico; também
é um marcador de células estaminais). Para a invasão da camada mesotelial pensa-se que seja
necessário atentar contra a integridade da superfície, usando estratégias como a secreção de
FasL pelas células cancerosas que se liga ao FasR (CD95) das células mesoteliais, induzindo a
apoptose. A transglutaminase também se encontra sobrexpressa, tendo como funções a
remodelação da MEC e o fortalecimento da adesão celular dependente de integrinas, entre
outras.

O processo de metastização precoce depende dum programa coordenado de adesão e


proteólise. Há menos conhecimento sobre os acontecimentos posteriores à colonização. A
angiogénse é fundamental para suportar o crescimento tumoral e é estimulada por secreção de
VEGFs, cujos receptores se encontram não só nas células endoteliais como nas próprias células
cancerosas (sinalização autócrina e parácrina). A expressão de VEGFRs nas células cancerosas
também pode proteger os esferoides flutuantes nas ascites da morte por anoikis, aumentando
a sua sobrevivência em suspensão. Os inibidores VEGF/VEGFR encontram-se em testes clínicos
com resultados promissores.

Os estudos comparativos utilizando microarrays, CGH, e análise de SNPs concluíram que o


tumor primário e as metástases são essencialmente idênticos. Uma das justificações é o facto
de o processo metastático respeitante ao carcinoma do ovário não ser tão complexo como e
outros tumores. Em alternativa, a maioria do potencial metastático das células cancerosas

90
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poderá já existir nas alterações genéticas presentes no tumor primário e portanto depender em
menor grau da pressão selectiva metastática. Isto sugere que o carcinoma seroso do ovário é
capaz de metastizar rapidamente uma vez concluída a transformação. Contudo, se as lesões
genéticas chave forem alvos terapêuticos poderá ser possível erradicar quer o tumor primário
quer o tumor metastático.

O comportamento biológico do carcinoma do ovário constitui uma oportunidade de


tratamento, uma vez que a maioria dos tumores está circunscrita à cavidade peritoneal, um
espaço terapêutico definido. Além disso, dada a semelhança genética entre os tumores
ovarianos e abdominais, se os alvos terapêuticos forem bem definidos há a hipótese de vencer
todos os tumores em simultâneo.

NOTA: Os carcinomas do ovário são heterogéneos e contêm um pequeno número de células stem-
like, que quando isoladas do líquido ascítico conseguem crescer em cultura sem necessidade de
ancoragem e são altamente tumorigénicas e resistentes à quimioterapia.

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Molecular Mechanisms of Platinum Resistance
in Ovarian Cancer
A maioria das mulheres com cancro epitelial do ovário (EOC) apresenta-se com doença
avançada (estádio III ou IV) no momento do diagnóstico, o que é devido sobretudo à falta de
sintomas específicos até a doença ter disseminado além dos ovários. A probabilidade de cura
está dramaticamente reduzida nesta fase, o que confere ao cancro do ovário a liderança na
mortalidade entre os cancros ginecológicos. O tratamento standart consiste em cirurgia
citorredutora completa seguida de quimioterapia (platinum+taxano). A resposta inicial é
elevada, a maioria das pacientes com doença avançada terá recidivas. O cancro do ovário
recorrente não é curável devido ao surgimento de quimioresistência.

A estratificação da sensibilidade à quimioterapia (ao platinum) segundo o Gynecologic


Oncology Group baseia-se no tempo decorrido desde a última sessão de tratamento de
primeira linha.

A cisplatina atinge o meio intracelular por intermédio do transportador CTR1. Após


activação, liga-se ao DNA (predilecção por locais nucleofílicos nas purinas), formando
monoaductos que podem formar ligações cruzadas intra e/ou intercadeias. Exerce assim a sua
actividade citotóxica – através das alterações de conformação da molécula de DNA impede a
separação das cadeias de DNA impedindo a replicação e síntese de DNA. Além disso, as
distorções no DNA podem sinalizar a célula para apoptose, em fase G2. Outros mecanismos
propostos incluem danos mitocondriais (dano no DNA mitocondrial, diminuição da actividade
ATPase) e interferência com o transporte celular.

A terapêutica com o regime cisplatina-paclitaxel associa-se a toxicidade significativa


(neurotoxicidade periférica e nefrotoxicidade) e é difícil de administrar em regime ambulatório,
tendo sido substituída pela combinação carboplatina-paclitaxel (escolha universal: perfil de
toxicidade mais favorável e administração mais fácil).

Os mecanismos de resistência celular aos agentes platinum podem ser classificados em dois
grupos: aqueles que limitam a formação de aductos citotóxicos platinum-DNA e aqueles que,
não interferindo na formação de aductos, previnem a morte celular.

92
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Redução da acumulação intracelular do agente: a diminuição do uptake celular pode ser
efectivada por inibição desse próprio uptake, por aumento do efluxo ou por ambos. O ATP7A,
sobrexpresso em algumas linhas celulares resistentes, sequestra os agentes platinum nos
compartimentos intracelulares, prevenindo as reacções nucleares. As proteínas de transporte
relacionadas com o MRP (especialmente, a MRP2) participam no efluxo dos agentes. O gene
MDR1 codifica a glicoproteína-P (Pgp) membranar que também actua como bomba de efluxo,
e a sua expressão pode ser estimulada pela terapêutica anti-tumoral prévia. Inibidores da Pgp,
como o valspodar, induziram interacções farmacocinéticas que diminuíram a clearance dos
agentes quimioterápicos concomitantemente administrados, elevando os seus níveis
plasmáticos acima do aceitável.

Inactivação intracelular: O glutatião (GSH) contribui para a destoxificação de muitas toxinas


celulares incluindo a cisplatina e os seus análogos. Uma fracção importante da cisplatina
intracelular pode sofrer conjugações pela GSH-S-transferase (GST), ficando inactivada. Reduzir
os níveis de glutatião parece ser uma estratégia racional. A canfosfamida é um pró-fármaco,
análogo do GSH, utilizada em cancros que sobrexpressam a GST, exercendo actividade
citotóxica.

Aumento da reparação do DNA: A citotoxicidade dos compostos platinum é atribuída à


indução do dano no DNA. É o equilíbrio entre o dano e a reparação que dita a morte ou a
sobrevivência após a terapêutica.

O mecanismo principal na reparação de aductos de DNA-platinum é o NER (nucleotide


excision repair). Uma das proteínas envolvidas no reconhecimento do dano é a ERCC1 (excision
repair cross-complementation group 1). Esta proteína actua no passo limitante da reparação, a
incisão que cliva o DNA antes da acção das polimerases e das ligases para reconstituir a
integridade do DNA. A sua sobrexpressão está correlacionada com a maior capacidade de
reparação dos danos induzidos pela cisplatina.

O sistema mismatch repair (MMR) actua numa fase pós-replicativa e a perda deste sistema
pode conduzir ao desenvolvimento de tolerância aos danos no DNA e, consequentemente, à
acção dos agentes citotóxicos. De facto, nalguns cancros do ovário verificam-se fenómenos de
metilação do promotor do MLH1 (especialmente nos do tipo endometrioide e mucoso).

A recombinação homóloga é a via preferencial de reparação das DSBs subsequentes à


formação de ligações cruzadas inter-cadeias. A interacção entre certos domínios BRCA1 e
PALB2 é a chave na reparação de DSBs. Logo, mutações nesses domínios podem impedir a
ligação, comprometendo a recombinação homóloga. Estas mutações já foram descritas em
alguns tumores e são prováveis fontes de instabilidade genómica e tumorigénese observada nos
portadores destas mutações. A proteína BRCA2 também tem uma função basilar na
recombinação homóloga, através da ligação à recombinase invasora da cadeia RAD51.

Apesar de apenas 5-10% dos EOCs terem um componente hereditário, mais de 90% desta
sobpopulação tem mutações BRCA1/2. Estes tumores costumam apresentar histologia serosa
e ser de alto grau. Surgem em idades mais precoces mas costumam ter melhor prognóstico
(maior sensibilidade aos compostos platinum; no entanto pode haver restauração da função
BRCA por intermédio de mutações secundárias, conduzindo a resistência). Ainda assim, mais de
metade dos EOCs esporádicos poderá ter disfunção BRCA. Os inibidores da PARP (olaparib,

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veliparib) constituem uma estratégia possível para cancros BRCA-mutados: inibindo a BER
previnem a reparação de ataques citotóxicos e também colaboram na letalidade sintética
(quando a mutação de dois genes individualmente, neste caso representando mecanismos de
reparação, é compatível com a viabilidade celular, mas a mutação de ambos em simultâneo é
conducente à morte).

As recaídas que ocorrem mais de 6 meses após a última dose de platinum são geralemente
tratadas com a combinação platinum. As respostas tendem a ser idênticas à resposta inicial e
quanto mais longo o intervalo platinum-free, melhores as respostas obtidas – pacientes
platinum sensíveis. As doenças que reaparecem em menos de 6 meses têm opções
terapêuticas limitadas, com base em agentes não-platinum.

O desenvolvimento de resistência a platinum é um processo molecular multifactorial e


complexo. Compreender as bases moleculares dos mecanismos envolvidos é essencial para
selecionar as pacientes platinum resistentes para terapêuticas alternativas mais dirigidas,
poupando a sujeição a efeitos tóxicos desnecessários e a tratamentos ineficazes.

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SIGNAL TRANSDUCTION AND GROWTH
FACTORS

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Growth Factors, Receptors and Cancer
As células normais processam os sinais extracelulares estimulatórios de crescimento e
integram-nos em circuitos complexos intracelulares a fim de regular o crescimento e a divisão.
Sem a comunicação intercelular o comportamento das células individuais não poderia ser
coordenado e a formação de tecidos arquitectonicamente complexos seria inconcebível. A
emissão de sinal requer a secreção de proteínas para o meio extracelular.

Mensageiros
proteicos

Respostas
biológicas

As versões normais das proteínas codificadas pelos oncogenes participam na maquinaria


celular de recepção e transdução de sinais bioquímicos. A arquitectura tecidual depende da
manutenção da proporção entre diferentes tipos celulares que coexistem e comunicam entre si
através de factores de crescimento. As decisões de crescimento ou não crescimento são
tomadas tendo em conta o benefício do organismo como um todo e não das células individuais.
Portanto, nenhuma célula em comunidade tem autonomia para decidir proliferar ou manter-se
num estado quiescente – todas as decisões celulares resultam de um consenso, uma decisão
partilhada entre as células vizinhas. Este comportamento de interdependência é ilustrado pelo
comportamento das células em cultura. Apesar de o meio líquido conter todos os nutrientes
necessários ao crescimento e divisão celular, a proliferação continua a depender da adição de
soro de sangue animal que contém os factores de crescimento decisivos, sem os quais as células
permaneceriam num estado metabolicamente activo e viável mas sem se dividirem. O soro
produz-se quando o sangue é deixado a coagular. Quando os coágulos plaquetários se formam
em resposta a lesões, as plaquetas activadas libertam por exocitose PDGF, um potente
estimulador da proliferação dos fibroblastos – um factor mitogénico.

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A proteína Src funciona como uma tirosina cinase. Esta oncoproteína foi a primeira a ser
estudada. As células transformadas pelo oncogene src que a codifica exibiam alterações de
formato, aumento do uptake de glicose a partir do meio envolvente e crescimento de modo
independente de ancoragem, perdendo a resposta de inbição por contacto. Foram utilizados
anticorpos de reconhecimento da Src. Descobriu-se que estes anticorpos ficavam fosforilados
na presença de ATP em cadeias laterais de resíduos de aminoácidos específicos, o que
desvendou a função de cinase da proteína Src. Independentemente desta função, a Src é uma
fosfoproteína, ou seja, possui grupos fosfatos ligados covalentemente a cadeias laterais de
aminoácidos. Isto indica que a própria Src é um substrato alvo de fosforilação por outra proteína
cinase ou por si própria (auto-fosforilação). A função de proteína cinase carrega grandes
implicações biológicas: a proteína Src consegue fosforilar múltiplos substratos distintos dentro
da célula que por sua vez ficam funcionalmente alterados condicionando a função dos seus alvos
a jusante. Este modo de acção explica como uma proteína deste tipo pode actuar de maneira
pleiotrópica, afectando múltiplos fenótipos celulares.

Exemplo de uma proteína cinase, a Akt,


e dos seus múltiplos efeitos biológicos.

Os resíduos de tirosina são preferencialmente fosforilados por esta proteína – é uma tirosina
cinase (TK). Efectivamente, a sinalização através de fosforilação de resíduos de tirosina é muito
comum nas vias de sinalização mitogénicas, enquanto as cinases envolvidas noutros processos
de sinalização celulares dependem quase exclusivamente de fosforilação de resíduos de serina
ou treonina (os fosfoaminoácidos de fosfotirosina constituem apenas 0,05 a 0,1% do total; 99%
são aminoácidos de fosfotreonina ou fosfoserina). Após transformação celular com o oncogene
src o nível de fosfotirosina pode atingir o 1% do total de fosfoaminoácidos presentes na célula.

O receptor de EGF funciona como uma tirosina cinase. O EGF tem efeitos mitogénicos nas
células que expressam o seu receptor à superfície.

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Este receptor tem um ectodomínio (em direcção ao espaço extracelular) envolvido no reconhecimento e ligação
ao seu ligando (o EGF), um segundo domínio transmembranar, composto por aminoácidos hidrofóbicos que
atravessam a bicamada lipídica e, finalmente, um terceiro domínio C-terminal citoplasmático. Este endodomínio
apresenta semelhanças em termos de sequência com a proteína Src, tendo actividade enzimática tirosina-cinase.

Muitos outros receptores estruturalmente equivalentes já foram descritos desde então, bem
como o respectivo ligando ou conjunto de ligandos, capaz de desencadear respostas biológicas
adicionais (forma, sobrevivência, motilidade, entre outras) à mera estimulação do crescimento
e divisão.

Um receptor de factores de crescimento alterado pode funcionar como uma oncoproteína.


A sequência do receptor de EGF está intimamente relacionada com a sequência da oncoproteína
codificada pelo oncogene erB. Este oncogene foi descoberto inicialmente no genoma do vírus
da eritroblastose aviária (AEV) que induz leucemia dos percursores dos eritrócitos
(eritroleucemia). Esta proteína não possui a sequência N-terminal de reconhecimento. Ou seja,
a delecção do ectodomínio parece permitir o envio de sinais estimulatórios de crescimento, de
forma constitutiva e independente de EGF, pelo receptor de EGF truncado. A existência destes
receptores truncados foi comprovada em glioblastomas e em menor extensão noutros tipos de
tumor. Versões truncadas do receptor relacionado ErB2 (HER2 ou Neu) estão associadas com
cancro da mama com mau prognóstico.

O estímulo independente de ligando pode ser alcançado por mutações em qualquer um dos
três domínios e até mesmo pela sobrexpressão de receptores (por aumento da taxa de
transcrição génica ou por fenómenos de amplificação génica) com consequente favorecimento
da sua dimerização e activação por efeito de massa. A prevenção da endocitose dos receptores
e da sua degradação nos lisossomas é outra das vias conducentes à sua acumulação excessiva
na superfície celular, deixando as células hiper-responsivas aos seus ligandos, mesmo em baixos
níveis.

Geralmente, as células não sintetizam e libertam factores de crescimento para receptores


que as próprias exibem à superfície, prevenindo a activação de sinalização autócrina. No
entanto, nas células cancerosas este comportamento auto-estimulatório é frequente.

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As células cancerosas dependem em menor grau dos factores de crescimento para o seu
crescimento e sobrevivência. Esta característica é explicada pela emissão constante de sinais
idênticos aos gerados pela activação do receptor pelo ligando, persuadindo a célula a agir como
se grandes quantidades do ligando estivessem presentes na vizinhança.

Um gene que codifica um factor de crescimento também se pode tornar um oncogene. A


sequência do PDGF está muito relacionada com a sequência da oncoproteína v-sis codificada
pelo vírus do sarcoma símio. Ao contrário do EGF que dirige a sua actividade mitogénica
sobretudo para as células epiteliais, o PDGF estimula uma grande variedade de células
mesenquimais: fibroblastos, adipócitos, células musculares lisas, células da glia, entre outras. O
oncogene sis leva as células infectadas (células não epiteliais) a libertar a proteína Sis (PDGF-
like) no espaço extracelular, estimulando os receptores da própria célula que a sintetizou,
criando um fluxo permanente de sinais. Estes loops de sinalização autócrina são comuns em
tumores. Por exemplo, certos cancros do pulmão produzem três factores de crescimento
distintos (TGF-α, SCF, IGF-1) para os quais expressam receptores. O tumor autócrino líder neste
padrão comportamental será provavelmente o sarcoma de Kaposi, em que para além de
ligandos de origem celular são produzidos ligandos adicionais codificados pelo genoma do
agente causal, o HHV-8. Em todo o caso, o princípio subjacente é a desregulação da expressão
dos factores de crescimento mitogénicos, resultando na sua produção em células que
normalmente não os expressam em níveis significativos. Os loops de sinalização mitogénica
autócrina põem em causa a interdependência que assegura a estabilidade das populações
celulares (ainda assim, há situações em que estes loops operam normalmente de forma a
manter as propriedades únicas das células estaminais). No fim, funcionam de forma equivalente
à alteração estrutural dos receptores: a célula gera os próprios sinais mitogénicos e reduz
marcadamente a sua dependência de mitogéneos exógenos.

NOTA: Os cancros que apresentam sinalização autócrina costumam responder ao tratamento


farmacológico de maneira semelhante in vitro e in vivo. Tal observação pode ser consequência da criação
de um ambiente próprio repleto de factores de crescimento quer in vitro, quer in vivo. Os cancros que
não secretam os próprios factores dependem dos mitogéneos associados ao soro in vitro e dos factores
de crescimento providenciados pelas células circundantes in vivo. Estas duas condições podem ser muito
diferentes e justificar a diferença de resposta à terapêutica in vitro e in vivo neste tipo de tumores.

Além das proteínas citoplasmáticas fosforiladas pelos receptores tirosina cinase (RTKs), o
próprio receptor auto-fosforila-se. Os ligandos, ou seja, os factores de crescimento,
apresentam-se frequentemente sob a forma de homodímeros ou heterodímeros. Muitas
proteínas estruturalmente semelhantes aos RTKs têm mobilidade lateral na membrana

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plasmática. Com base nesta evidência, construiu-se o seguinte modelo: na ausência de ligando
o receptor existe na forma monomérica; quando o ligando dimérico está presente a molécula
receptora liga-se a uma das suas subunidades e movimenta-se na membrana plasmática até
encontrar uma segunda molécula receptora que se liga à segunda subunidade livre do ligando;
finalmente, as duas moléculas receptoras dimerizam. Cada domínio cinase fosforila os resíduos
de tirosina do domínio citoplasmático do outro receptor. Esta fosforilação bidirecional e
recíproca é denominada transfosforilação. A maior consequência deste processo é a exposição
do domínio catalítico.

Alguns receptores podem formar heterodímeros com outros (por exemplo, o receptor
HER2, sem ligando identificado, dimeriza com receptores HER1 e HER3). O modelo de
dimerização dos receptores explica como podem participar na tumorigénese quando
sobrexpressos. Como se podem mover livremente na bicamada lipídica, estando presentes em
grande número, a sua colisão e dimerização espontânea, com emissão de sinal, torna-se mais
frequente.

Contudo, estes mecanismos são variáveis: no caso do receptor de EGF, a dimerização precede o reconhecimento
do ligando aumentando a afinidade dessa ligação, mas o disparo da actividade tirosina cinase só ocorre após essa
ligação. Assim, a sua sobrexpressão em muitos tipos de carcinoma exerce o seu efeito pejorativo através do aumento
do número de receptores num estado de alta afinidade (células hiper-responsivas).

Outro mecanismo possível é ilustrado pelo par receptor-ligando Met-HGF: neste caso, a
dimerização e disparo dos receptores é independente do ligando e consequência da
sobrexpressão dos receptores. Diversas alterações estruturais (mutações pontuais, delecções,
eventos de fusão) podem ainda desencadear a dimerização ligando independente, na ausência
de sobrexpressão dos receptores.

Genes mutantes que codificam receptores podem ser transmitidos na germ line. Formas
mutantes do receptor Kit que sinalizam constitutivamente de maneira independente de ligando
são frequentes nos tumores familiares gastrointestinais estromais (GISTs). O domínio justa-
membranar costuma estar implicado como alvo de mutações missense e delecções. Este
domínio exerce uma regulação negativa da actividade do receptor. O gene ret codifica um RTK.
Alelos mutantes deste gene podem ser herdados, causando a síndrome de cancro hereditário
conhecida por neoplasia endócrina múltipla (MEN) tipo 2A (carcinomas papilares da tiroide,
feocromocitomas e adenomas da paratiroide) e 2B. O gene met que codifica o receptor para o

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HGF também está mutado no cancro papilar renal hereditário. No geral, estes exemplos
constituem excepções à regra, uma vez que os oncogenes são mal tolerados na germ line
porque funcionam como alelos dominantes e são altamente disruptivos para o
desenvolvimento embrionário normal. Estas excepções são possíveis pois estes oncogenes têm
uma expressão tecidual restrita, compatível com o desenvolvimento embrionário.

Dada a variedade de sinais bioquímicos provenientes do ambiente, vários tipos de receptor


devem estar envolvidos na patogénese do cancro que é, em última análise, a perda de
capacidade das células individuais comunicarem com o microambiente que as rodeia.

As Jak cinases são tirosina cinases


associadas a receptores que recebem
sinais que controlam o desenvolvimento
das células hematopoiéticas. Associam-
se aos domínios citoplasmáticos destes
receptores de modo não covalente.
Entre estes receptores destacam-se o
receptor da ertitropoietina, da
trombopoietina, das interleucinas e do
interferão.

Os receptores do TGF-β são


compostos por três domínios à
semelhança dos RTKs, mas formam
invariavelmente heterodímeros. Além
disso, a actividade cinase é dirigida a
resíduos de serina e a treonina. O TGF-
β apresenta um comportamento dual
na patogénese do cancro, que vai desde
a supressão da proliferação em células
epiteliais normais à promoção dum
fenótipo invasivo em células já
transformadas. Após reconhecimento
do ligando, o receptor TGF-β tipo II com
actividade cinase constitutiva aproxima-
se e fosforila a subunidade do tipo I,
activando a sua cinase que fosforila
proteínas citosólicas que se dirigem para
o núcleo influenciando a expressão de
genes alvo.

101
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O receptor Notch encontra os seus
ligandos imobilizados na superfície
celular das células que emitem os sinais.
Este tipo de sinalização que requer a
interacção física entre a célula emissora
de sinal e a célula receptora designa-se
sinalização justácrina. A célula que
expõe o ligando activa o receptor noutra
célula através da criação de tensão
mecânica gerada por endocitose do
ligando, que afasta o ectodomínio do
receptor da célula receptora. O
ectodomínio fica vulnerável a clivagem
por uma protease. Após esta clivagem
ocorrer, uma segunda clivagem
proteolítica ocorre no domínio
citoplasmático, libertando um
fragmento do receptor que se dirige até
ao núcleo onde integra um complexo de
factores de transcrição. Em metade das
leucemias de células T no adulto, formas
mutantes constitutivamente activas do
receptor Notch foram encontradas.

O receptor Patched (Ptc) é


constituído por vários domínios
transmembranares (receptor em
serpentina). Quando as proteínas
Hedgehog (Hh) se ligam a este receptor
induzem a desinibição duma segunda
proteína transmembranar, a
Smoothened (Smo). Normalmente, o
cílio primário é percorrido pela proteína
Smo e pelo factor de transcrição Gli. Em
resposta à activação do receptor Ptc as
proteínas Smo e Gli acumulam-se no
cílio primário, onde a Gli é convertida de
repressor transcripcional a indutor
transcripcional, sendo mobilizada para
o núcleo.

As proteínas Wnt estão ligadas à


MEC, bem como às membranas
celulares através duma cauda lipídica.
Os factores de crescimento da classe
Wnt activam receptores da família
Frizzled (Frz), que atravessam a
membrana múltiplas vezes (tipo
serpentina). Na ausência de sinalização
Wnt, enzima citoplasmática glicogénio
sintetase cinase-3β (GSK-3β) fosforila
proteínas promotoras da proliferação
(incluindo a β-catenina), marcando-as
para destruição. A actividade desta
enzima é reprimida pela ligação das
proteínas Wnt aos seus receptores. O
controlo dos níveis de β-catenina pelas
Wnts é designado sinalização Wnt
canónica.

102
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Não obstante, certas Wnts, em
combinação com certos receptores Frz
(do tipo GPCRs), sinalizam através de
vias bioquímicas completamente
diferentes (nomeadamente através da
activação de proteínas G; a subunidade
α vai activar a enzima PDE e o complexo
βγ activa a PLC) – sinalização Wnt não-
canónica. Este último tipo de sinalização
pode influenciar vários fenótipos das
células cancerosas como a motilidade, a
capacidade de invasão e a manutenção
de potencial de autorrenovação.

Os receptores nucleares são sensíveis à presença de ligandos lipofílicos de baixo peso


molecular. A membrana celular é impermeável aos compostos polares, o que inclui a maioria
dos polipéptidos. Consequentemente, os receptores deste tipo de moléculas exibem
ectodomínios virados para o ambiente extracelular. Contudo, os ligandos hidrofóbicos de baixo
peso molecular (hormonas sexuais, retinoides, vitamina D) conseguem atingir o núcleo,
activando factores de transcrição. Esta capacidade dispensa as extensas cascatas de sinalização
citoplasmáticas, uma vez que os receptores nucleares se conseguem ligar directamente aos
ligandos e regular a expressão de genes alvo. Alguns dos receptores nucleares estão
constitutivamente ligados à cromatina, enquanto outros estão no citoplasma até reconhecerem
o ligando e serem importados para o núcleo. Uma vez associados à cromatina, os receptores
ligam-se como homo ou heterodímeros a sequências de reconhecimento de DNA relacionadas
com os promotores dos genes cuja expressão controlam – hormone response elements (HREs).
Por exemplo a ligação do estrogénio ao seu receptor, o ER, despoleta mudanças
conformacionais que permitem que o receptor atraia co-activadores e se liberte de co-
repressores. Estas moléculas associadas estão implicadas a modificação de histonas e portanto
da cromatina. O tamoxifeno, um modulador selectivo dos receptores de estrogénio, provoca a
libertação de co-activadores e o recrutamento de co-repressores.

Os receptores de integrinas são sensíveis às interacções entre a célula e a MEC. As células


normais requerem ancoragem a um substrato sólido para proliferarem, caso contrário, activam
a anoikis, uma versão do programa de morte celular. A dependência de ancoragem à MEC
implica que as células sejam capazes de detectar essa mesma ancoragem, bem como as
identidades dos componentes moleculares específicos aos quais estão ancoradas. Esta função é
consumada pelas integrinas que se encontram na superfície celular na forma heterodimérica
αβ e que se ligam aos componentes da matriz, gerando estabilidade mecânica. As integrinas
formam adesões focais por ligação aos componentes da MEC através dos seus ectodomínios.
O clustering das integrinas sob tais condições afecta a organização do citoesqueleto, pois
algumas integrinas estão ligadas através do seu domínio citoplasmático a elementos do
citoesqueleto. Para além disso, nestas circunstâncias os domínios intracelulares também podem
activar vias de sinalização que evocam respostas como a migração, a proliferação e a
sobrevivência celular. As funções desempenhadas pelas integrinas são assim indispensáveis para
o desenvolvimento tumoral. Outra particularidade é o facto de as integrinas poderem veicular
informação do interior da célula. Sinais de origem citoplasmática modulam a afinidade de
ligação entre as integrinas e os ligandos da MEC. Enquanto os receptores previamente descritos
são sensíveis a factores solúveis, as integrinas são sensíveis aos componentes da matriz,

103
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insolúveis. No conjunto, os dois tipos de receptores permitem que a célula verifique se estão
reunidas as condições para a sua divisão: a presença de níveis adequados de factores de
crescimento mitogénicos e a existência de uma ancoragem apropriada. Estes requerimentos
são abolidos na presença de um oncogene ras activado, o que sugere que a oncoproteína Ras
seja capaz de mimetizar quer os sinais veiculados por receptores de factores de crescimento
dependentes de ligando quer pelas integrinas ligadas à MEC.

A proteína Ras funciona como uma proteína G. As 4 proteínas Ras codificadas por 3 genes
diferentes possuem uma cauda lipídica na extremidade C-terminal que permite a sua
ancoragem à face citoplasmática da membrana plasmática. A proteína Ras encontra-se ligada
a GDP na forma inactiva, mas após recepção dum estímulo a montante (os sinais mitogénicos
transduzidos pelos RTKs activam uma GEF (guanine exchange factor) para a Ras), transita para
a sua forma activa ligada a GTP. A cessação da emissão de sinal está dependente da actividade
GTPase intrínseca da Ras, que hidrolisa o GTP e retornando à sua configuração não emissora de
sinal. As GAPs (GTPase-activating proteins) intervêm activamente nesta última fase. Implícita
neste modelo está a assunção da proteína Ras como uma proteína transdutora de sinal (recebe
sinais a montante e envia sinais a justante na cascata de sinalização). As mutações na Ras podem
sabotar o feedback negativo assegurado pela actividade GTPase, nomeadamente se anularem
esta função catalítica enzimática. As mutações missense que activam a Ras ocorrem
invariavelmente nos codões 12, 13 ou 61 - mantêm a função sinalizadora e comprometem em
simultâneo a actividade GTPase.

NOTA: A Ras é o protótipo de uma família de proteínas semelhantes – “small G-proteins”. Exemplos:
Rac, Ral, Rho, Cdc42. Estas proteínas parecem possuir os seus próprios GEFs especializados (guanine
nucleotide exchange factors, activadores), bem como as suas GAPs (GTPase-activating proteins,
inactivadoras). Controlam processos fisiológicos diversos, cuja característica comum é a necessidade de
serem regulados por interruptores binários.

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RESUMO:

A transformação celular resulta da hiperactivação de vias de sinalização mitogénicas;

Apesar de diferentes oncoproteínas possuírem funções biológicas diversas, os efeitos


exercidos na célula são bastante semelhantes, sugerindo a sua participação em cascatas de
sinalização comuns;

As células de cancro da mama que sobreexpressam o receptor HER2 apresentam traços


fenotípicos pleiotrópicos: aumento da síntese de DNA, maior tumorogenicidade, maior
tendência a metastizar e menor dependência de ancoragem e de estrogénios. Isto é
incompatível conceptualmente com a existência duma cascata linear a jusante do receptor
activado. Mais provavelmente, várias vias de sinalização irradiam destes receptores;

Outro aspecto que aumenta a complexidade das vias de sinalização é o facto de ligandos
diferentes desencadearem efeitos diferentes no mesmo receptor (exemplo: a ligação de TGF-
α ao EGF-R desencadeia a sua internalização e reciclagem enquanto a ligação de EGF ao mesmo
receptor leva à degradação lisossomal).

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Cytoplasmic Signaling Circuitry Programs
Many of the Traits of Cancer
O comportamento aberrante das células cancerosas podia sugerir que novas maneiras de
programar o seu crescimento e divisão fossem inventadas por estas células. Na realidade os
circuitos utilizados pelas células cancerosas são idênticos aos utilizados pelas células normais.
Muitos dos outputs resultantes do processamento de sinais são transmitidos ao núcleo, onde
constituem inputs críticos para a maquinaria central que governa a proliferação celular. Como
tal, as proteínas regulatórias devem comunicar de forma bastante específica (as cinases têm
muitos parálogos, isto é, proteínas que partilham uma origem evolucionária comum e que retêm
uma estrutura idêntica). Ainda assim, as células cancerosas modificam a maquinaria de controlo,
os circuitos regulatórios que operam dentro das células. No fundo, o cancro é uma doença de
processamento de sinal aberrante.

Uma via de sinalização estende-se desde a superfície celular até ao núcleo. Os IEGs
(immediate early genes) são expressos precocemente após a estimulação com factores de
crescimento. Os produtos destes genes auxiliam na transição do estado G0 para a iniciação do
ciclo celular. A indução da expressão destes genes não requer síntese proteica de novo – as
proteínas responsáveis por veicular os sinais mitogénicos emitidos pelos receptores da
superfície celular activados até aos factores de transcrição que actuam no núcleo estão
disponíveis normalmente na célula. A activação funcional destas proteínas citoplasmáticas
transdutoras de sinal não parece, portanto, estar dependente do aumento da sua concentração,
mas antes de mudanças estruturais e conformacionais, bem como alterações na sua localização
celular.

Os IEGs (exemplos: myc, fos e jun) codificam proteínas de interesse, nomeadamente,


factores de transcrição que são capazes de induzir uma segunda onda de expressão génica.
Além disso, codificam também factores de crescimento secretáveis (citocinas) e proteínas
envolvidas na construção do citoesqueleto. Os níveis de mRNA do gene myc aumentam
rapidamente após a exposição a mitogéneos e decrescem também de forma súbita uma vez
cessada a estimulação. A actividade sinalizadora da proteína Myc, que tem uma semi-vida curta,
é assim altamente dependente das alterações da sua concentração nuclear. Isto contrasta com
o comportamento das proteínas citoplasmáticas transdutoras de sinais (Ras, Src) que
respondem aos sinais mitogénicos com alterações estruturais ao invés de aumentarem a sua
concentração. Esta diferença reflecte-se nas alterações que os genes que codificam estas
proteínas sofrem quando são convertidos a oncogenes: os níveis de Myc ficam desregulados
pela sua expressão constitutiva enquanto as alterações nas proteínas Src e Ras são de cariz
estrutural e não tanto quantitativo. A segunda onda de expressão de DEGs (delayed early genes)
depende da síntese proteica de novo (dos factores de transcrição sintetizados na onda inicial
de expressão génica).

Para além da indução da expressão génica, os factores de crescimento induzem um aumento


da síntese proteica, subsequente à activação funcional das proteínas que permitem aos
ribossomas iniciar a tradução dos mRNAs. Outros factores de crescimento influenciam ainda a
motilidade, a forma e a sobrevivência celular. Estas respostas diversas indiciam que uma grande

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variedade de sinais bioquímicos com alvos celulares distintos (nucleares ou citoplasmáticos)
irradia dos receptores de factores de crescimento activados por ligandos.

As respostas transcripcionais a curto prazo após estimulação mitogénica não traduzem o


estado transcripcional caso a sinalização mitogénica perdure (quer por exposição continuada
aos factores de crescimento, quer por activação de oncoproteínas). Os IEGs e o DEGs deviam
continuar a ser expressos nas células transformadas. Isto verifica-se para alguns genes mas não
para outros. A discordância é justificada pelos mecanismos de retrocontrolo negativo que
suprimem precocemente a expressão de alguns genes, tornando as respostas bioquímicas
iniciais transientes.

NOTA: A proteína Ras integra uma cascata de sinalização complexa. Esta cascata foi elucidada através
dos estudos na D. melanogaster. O gene Sevenless codifica um receptor tirosina cinase (homólogo do
FGFR em mamíferos). A sua ausência conduz a falhas na formação das unidades fotossensíveis no olho da
Drosophila. Outras mutações que mimetizam os efeitos desta mutação visam proteínas a jusante na via
de sinalização. O gene Sos codifica uma destas proteínas com função GEF, capaz de activar a proteína Ras.
Entre o receptor e a proteína Sos ainda se identificam uma série de proteínas adaptadoras.

A fosforilação dos resíduos de tirosina controla a localização e as acções de muitas


proteínas sinalizadoras citoplasmáticas. As tirosina cinases associadas aos receptores podem
actuar de duas maneiras. O primeiro modelo pauta-se pela fosforilação, ou seja, pela
modificação covalente de proteínas citoplasmáticas que altera a sua configuração
tridimensional (estereoquímica), induzindo um estado activo. Este modelo coloca a importância
da fosforilação da própria molécula receptora num plano secundário. O modelo alternativo
centra-se na fosforilação da cauda citoplasmática do receptor, que afecta a localização física
das proteínas a jusante na cascata, sem necessariamente interferir com a sua actividade
intrínseca. Este conceito de relocalização parece ser mais preponderante.

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A análise da estrutura da proteína Sec revela a existência de três domínios de homologia –
SH1, SH2 e SH3. O domínio SH1 representa o domínio catalítico e domínios com sequências
semelhantes estão presentes nos RTKs, bem como noutras tirosinas cinases, o que corrobora a
sua origem evolucionária comum. O domínio SH2 funciona como um receptor intracelular, cujo
ligando é uma pequena sequência oligopeptídica com uma tirosina fosforilada. Há muitos
domínios deste tipo com afinidades para diferentes sequências que flanqueiam a fosfotirosina.
De facto, este domínio permite que a proteína que o possui (que pode ter outro tipo de
actividade que não a de tirosina cinase ou até nem ter qualquer actividade enzimática) se
associe com outra proteína que exiba a sequência alvo. Assim, os domínios catalíticos das
proteínas e os domínios SH2 (de reconhecimento do substrato) funcionam como módulos
estruturais independentes. No caso dos RTKs, após transfosforilação induzida por ligando,
exibem um espectro de fosfotirosinas nas suas caudas citoplasmáticas. A identidade única de
cada um destes resíduos de fosfotirosinas é conferida pela sequência de aminoácidos que os
flanqueiam na sua porção C-terminal. Estas fosfotirosinas funcionam como locais de “homing”
para as proteínas citoplasmáticas que contêm domínios SH2.

Após associação ao receptor, estas proteínas podem ser substratos de fosforilação de


resíduos tirosina pela tirosina cinase associada ao receptor. Noutros casos, podem atrair
proteínas adicionais para estes complexos multiproteicos. Esta multiplicidade de proteínas
associadas explica em parte como um receptor de factores de crescimento consegue despoletar
uma grande diversidade de respostas bioquímicas e biológicas. Cada uma destas proteínas
controla uma cascata de sinalização a jusante e cada uma destas cascatas pode influenciar um
aspecto particular do comportamento celular. Algumas das proteínas com domínios SH2
activam loops de feedback negativo que interrompem a sinalização pelo receptor (por exemplo,
a SHP1 é uma fosfotirosina fosfatase).

Acresce ainda o facto de os domínios citoplasmáticos dos RTKs se encontrarem perto da


superfície interior da membrana plasmática e ao atraírem as proteínas que possuem domínios
SH2 colocam-nas inevitavelmente em grande proximidade com as moléculas ligadas à própria
membrana plasmática, permitindo a interacção com as mesmas. Por exemplo, a Ras-GAP
(GTPase-activating protein) após ancoragem ao receptor fosforilado, fica em grande
proximidade com as proteínas Ras ancoradas à membrana celular, facilitando a sua actividade
hidrolisante e convertendo-as ao estado inactivo. De modo semelhante, quando a PI3K é
mobilizada para junto da membrana plasmática, ganha concomitantemente o acesso aos lípidos
incrustados na membrana que fosforila. Outro exemplo é o da PLC que da mesma forma
consegue clivar o fosfolípido membranar PIP2. Muitas reacções tornam-se possíveis quando as
enzimas e substratos envolvidos são colocados em grande proximidade, através da ligação
destas enzimas aos receptores fosforilados.

Os diversos RTKs expressos pelas células possuem domínios tirosina cinase


fundamentalmente idênticos. No entanto, quando estes receptores diferentes são activados por
ligandos induzem respostas claramente diferentes. Esta propriedade é compreensível se
considerarmos que cada RTK adquire um conjunto distinto de péptidos contendo fosfotirosina,
permitindo a atracção de uma combinação própria de parceiros sinalizadores a jusante.

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Finalmente, o domínio SH3 liga-se especificamente a sequências ricas em prolina noutras
proteínas ou na própria proteína que o contém (ligações intramoleculares).

Estes vários domínios ilustram como a capacidade de associação física intermolecular é


altamente específica, assegurando que os sinais são passados apenas para os alvos desejados.
O espectro de ligandos moleculares que podem ligar-se por complementaridade a domínios
receptores, formando complexos, inclui, para além de aminoácidos modificados, sequências
peptídicas, ácidos nucleicos e fosfolípidos.

NOTA: A cinase Src costuma estar num estado funcionalmente inactivo através da acção dum domínio
regulatório negativo que obstrui o sítio catalíco desta cinase. Este loop de activação é mantido no lugar
através das acções do domínio SH2 que reconhece uma fosfotirosina na própria proteína Src, formando
uma ponte intramolecular. Esta ligação intramolecular pode ser desfeita caso o reconhecimento pelo
domínio SH2 seja solicitado por outra molécula distinta (um receptor, por exemplo), formando-se uma
ligação intermolecular.

Os grupos SH2 e SH3 explicam a activação da Ras pelos receptores de factores de crescimento. A proteína
adaptadora Grb2 contém dois domínios SH3 com afinidade por duas sequências ricas em prolina presentes na
proteína Sos e um domínio SH3 com afinidade por receptores de factores de crescimento activados. Estas proteínas
adaptadoras contêm apenas domínios de reconhecimento – são “pontes” desenhadas para ligar proteínas entre si.
Quando a Sos fica ancorada ao receptor por intermédio da Grb2 fica em proximidade estreita com as proteínas Ras.
Esse posicionamento facilita a interacção Sos-Ras com activação da sinalização Ras.

Formas exageradas das vias de sinalização podem operar em células cancerosas que
experienciam o fluxo de estimulação constante resultante de loops de sinalização autócrina ou
de receptores mutantes constitutivamente activos.

A ramificação das vias a jusante dos receptores de factores de crescimento não explica que
a oncoproteína Ras consiga evocar várias mudanças celulares distintas. Na verdade, três vias de
sinalização major irradiam a partir da proteína Ras. Quando a Ras está ligada a GTP expõe o
seu loop efector que interage com parceiros distintos a jusante – os efectores Ras.

A Raf cinase foi a primeira proteína efectora a ser descoberta. Fosforila os seus substratos
em resíduos de serina e treonina. A activação da Raf pela Ras depende da relocalização da Raf
no citoplasma. A migração da proteína Raf é incitada pelo aumento exponencial de afinidade
pela Ras no estado ligado a GTP. Uma vez associada à Ras, a Raf fica ligada por intermédio da
primeira à membrana plasmática. A Raf fosforila e activa uma segunda cinase, a MEK, que tem
especificidade dual (fosforila tanto resíduos de serina e treonina como resíduos de tirosina). Por
sua vez, a MEK fosforila e activa outras duas cinases, a Erk1 e a Erk2 que fosforilam substratos
que regulam vários processos celulares, incluindo a transcrição (actuam no núcleo). Esta cascata

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de cinases constitui uma das vias de sinalização mais importantes a jusante da proteína Ras e
designa-se por via MAPK (mitogen-activated protein kinase) (a Raf é uma MAPKKK; a MEK é uma
MAPKK e as Erks são MAPK). Há proteínas que podem ajudar a manter as cinases que formam
esta cascata fisicamente próximas. As fosforilações envolvidas na via resultam em activação
funcional da cinase seguinte pela cinase que a precede. Especialmente importantes entre os
genes cuja expressão é induzida por esta via são os genes que codificam os factores de
transcrição Fos e Jun, que se associam num factor de transcrição heterodimérico, o AP-1
(frequentemente hiperactivado em células cancerosas). Quando a cinase Raf é introduzida em
células na sua versão oncogénica mutante consegue evocar a maioria dos fenótipos de
transformação induzidos pela oncoproteína Ras (independência de ancoragem, perda de
inibição por contacto, alterações na forma celular). Em cerca de metade dos melanomas uma
forma mutante da B-Raf exibe um aumento da actividade cinase. Os oncogenes ras raramente
coexistem com alelos mutantes B-Raf, o que suporta a ideia que as funções destes oncogenes
se sobrepõem, sendo parcialmente redundantes.

Uma segunda via de sinalização regulada pela Ras controla os lípidos inositol e a cinase
Akt/PKB. No contexto do cancro, a resposta celular mais importante evocada por esta via é o
evitamento da apoptose.

Alguns fosfolípidos contêm grupos inositol nas suas cabeças hidrofílicas, que podem ser modificados por
fosforilação. O fosfoinositol resultante (IP3) pode ser clivado do restante fosfolípido e pode difundir-se livremente
no meio intracelular, funcionando como uma hormona intracelular, mais propriamente um 2º mensageiro, que
conduz sinais da membrana a locais distantes da célula. O produto remanescente desta clivagem, o DAG, pode servir
para activar a PKC, uma serina-treonina cinase. Alternativamente, o inositol fosforilado pode permanecer ligado ao
fosfolípido e servir de ponto de ancoragem para proteínas citosólicas sinalizadoras. A fosforilação do PIP2 pode ser
executada pela PI3K, convertendo-o a PIP3.

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Como já foi mencionado, a PI3K é atraída através do seu domínio SH2 por receptores
activados por ligando, colocando-a em proximidade com o seu substrato, os fosfolípidos
contendo inositol. Adicionalmente, a relocalização da PI3K para a zona justa-membranar
permite aumentar a sua actividade funcional, ao situá-la junto da Ras ligada a GTP. Logo, a
PI3K é um efector a jusante da Ras. Tem um papel central em várias vias de sinalização, iniciadas
por vários ligandos (PDGF, NGF, IGF-1, MEC).
O PIP3 salienta-se da membrana e atrai
proteínas citosólicas com domínios PH
(pleckstrin homology). A proteína mais
importante que possui este domínio é a Akt,
também conhecida como PKB (proteína cinase
B), que é uma serina-treonina cinase. Esta
associação da Akt/PKB à membrana plasmática
resulta na sua activação funcional e na
fosforilação ulterior de uma série de substratos
com efeitos biológicos distintos: aumentar a
sobrevivência celular, pela redução da
activação do programa apoptótico; estimular a
proliferação celular; estimular o crescimento
celular através da síntese proteica e influenciar
a motilidade e a angiogénese. Num estado de
quiescência, os níveis baixos de PIP3 são
mantidos pela função de fosfatases, como a
PTEN que remove o fosfato 3’ adicionado pela
PI3K (o PTEN pode ser inactivado nas células
cancerosas).

No que concerne ao aumento da síntese proteica é conveniente explorar alguns dos


intervenientes. Esta acção resulta sobretudo da activação da cinase mTOR que fosforila e
inactiva inibidores da tradução (4E-BP) e fosforila e activa activadores da tradução (cinase
p70S6).

Outras proteínas com domínios PH que se associam ao PIP3 são GEFs que activam as
GTPases de proteínas da família Rho. As funções destas proteínas centram-se na reconfiguração

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do citoesqueleto e na remodelação das junções da célula com o meio envolvente. Para isso,
controlam a forma celular, a motilidade e no caso das células cancerosas, a invasão. A
subfamília Cdc42 controla a emissão de filopodia, extensões da membrana plasmática que a
célula utiliza para explorar o ambiente e formar junções com a MEC. A subfamília Rac controla
a formação de lamellipodia nas frentes que lideram a motilidade celular.

A via descrita está desregulada em muitos tipos de cancro. No cancro do ovário, níveis
elevados de PI3K estão associados a alto índice proliferativo, diminuição da apoptose e aumento
da capacidade invasiva. A PI3K também está hiperactivada num terço dos carcinomas do cólon,
tornando o seu gene o segundo oncogene mais mutado em cancros humanos. O PTEN também
tem a sua expressão reduzida em 30 a 40% dos cancros. No final, o outcome da activação da
PI3K ou da perda do PTEN é o mesmo: o aumento do PIP3.

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Uma terceira via a jusante da Ras tem como proteína efectora uma proteína Ras-like, a Ral.
A activação das proteínas Ral está dependente da substituição GDP-GTP. A comunicação entre
a Ras e a Ral é mediada por Ral-GEFs. A associação com a Ras relocaliza a Ral-GEF junto da
membrana e provoca alterações conformacionais que activam a actividade intrínseca GEF. No
fim, a activação das proteínas RalA e RalB contribui para a posterior activação das proteínas Sec5
e Exo84, que contribuem para o crescimento independente de ancoragem, tal como para a
activação da proteína RalBP1 que inactiva as proteínas Cdc42 e Rac.

A visão da proteína Ras como uma oncoproteína que actua de forma pleiotrópica consegue
ser explicada pelas acções destas três vias que irradiam da Ras. É importante reter que, no
entanto, a maioria dos fenótipos induzidos pela Ras resulta da colaboração das três vias. Além
disso as proteínas Ras são na verdade quatro: H-Ras, N-Ras e K-Ras (2). Agem de maneira
diferente, em localizações citoplasmáticas distintas (incluindo o aparelho de Golgi, o RE). Os
efectores Ras também excedem os três descritos. É preciso compreender que há uma
organização hierárquica em que as moléculas mais a montante influenciam mais vias (e
consequentemente, mais mudanças fenotípicas necessárias à transformação neoplásica) do
que as moléculas a jusante (cuja desregulação não representa uma vantagem selectiva tão
grande para uma célula pré-neoplásica).

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A via Jak-STAT permite a transmissão de sinais
desde a membrana até ao núcleo. Os receptores
envolvidos nesta via (citocinas, IFN, EPO, TPO) estão
ligados de forma não covalente a tirosinas cinase da
classe Jak. Após a dimerização do receptor mediada
por ligando, a enzima Jak associada com cada molécula
receptora fosforila tirosinas na cauda citoplasmática
da outra molécula receptora. Estas fosfotirosinas
atraem factores de transcrição que contêm domínios
SH2, denominados STATs (signal transducers and
activators of transcription). Os STATs são fosforilados
pelas Jaks e os seus próprios domínios SH2 têm
especial afinidade para se ligar a estas fosfotirosinas
recém-criadas, o que culmina na formação de dímeros
STAT-STAT. Os STATs dimerizados migram para o
núcleo onde actuam como factores de transcrição.
Activam a expressão génica de genes importantes
Nota: Para além de fosforilarem os STATs, as para proliferação e sobrevivência celular: o gene myc,
Jaks conseguem fosforilar substratos que activem os genes que codificam as ciclinas D2 e D3 e o gene
outras vias mitogénicas, como a via Ras-MAPK. que codifica a proteína anti-apoptótica Bcl-XL.

Os receptores de adesão celular emitem sinais que convergem com os emitidos por
receptores de factores de crescimento. A ancoragem das células à MEC via integrinas envia
sinais de sobrevivência para o citoplasma, diminuindo a probabilidade de entrada em apoptose.
Ao mesmo tempo a activação das integrinas por sinais oriundos do espaço intracelular pode
promover a motilidade celular. Assim, as integrinas têm três funções: a ancoragem física das
células à MEC (funcionam como sensores da tensão física entre a MEC e o esqueleto de actina);
a informação das células acerca do sucesso dessa ancoragem e a facilitação da motilidade
através da ruptura e regeneração de contactos com a MEC.

O clustering das integrinas nas áreas de adesões


focais conduz à activação por transfosforilação da
FAK (focal adhesion kinase), uma tirosina cinase não
receptora associada às caudas citoplasmáticas das
subunidades β de algumas integrinas. Os resíduos de
fosfotirosinas nas FAKs constituem locais de
ancoragem para as proteínas Src, que fosforilam mais
FAKs, criando locais de docking para outras proteínas
que contêm domínios SH2 (exemplos: Grb2, Shc, PI3K,
PLC). Parece haver paralelismos entre a sinalização via
integrinas e via RTKs. Esta convergência de sinalização
explica um dos efeitos da oncoproteína Ras, a
capacidade das células crescerem de forma
independente de ancoragem. As células parecem
depender normalmente da sinalização via integrinas
para medir a actividade da proteína Ras normal e a
ausência destes sinais é interpretada como uma falha
em se associarem à MEC, o que leva à paragem do ciclo
celular ou até à entrada em anoikis. A oncoproteína
Ras parece então mimetizar sinais a jusante que
normalmente resultam da ancoragem das integrinas
à MEC.

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A via Wnt-β-catenina está envolvida na
transdução de sinais mitogénicos, contribuindo para a
proliferação celular. Para além disso, esta via permite
que as células permaneçam num estado
relativamente indiferenciado. Os factores Wnt
actuam através de receptores Frizzled para suprimir a
actividade da GSK-3β. Na ausência de Wnts, a GSK-3β
fosforila substratos, marcando-os para destruição. O
substrato mais importante é a β-catenina, uma
proteína citoplasmática que existe em três estados:
ligada ao domínio citoplasmático de receptores de
adesão intercelular, como a E-caderina; sob a forma
solúvel no citosol (turnover muito elevado) e
finalmente no núcleo onde compõe factores de
transcrição. Depois de sintetizada, a β-catenina forma
complexos multiproteicos com outras proteínas (Apc,
Wtx, axina) que a dirigem para a GSK-3β, que a
fosforila. A β-catenina é marcada por ubiquitilação,
sendo destruída, o que explica a sua baixa
concentração. Quando a sinalização Wnt é activada
esta degradação rápida é prevenida e as moléculas de
β-catenina acumuladas dirigem-se para o núcleo
Nota: Nos cancros estão documentadas onde se associam às proteínas Tcf/Lef, formando
mutações no gene da β-catenina que a factores de transcrição que induzem a expressão de
tornam resistente à degradação pela GSK-3β. genes envolvidos no crescimento e proliferação celular
(ciclina D1, myc). Outros substratos alvo da actividade
da GSK-3β são a ciclina D1 (a via Wnt modula a
expressão desta ciclina quer a nível transcripcional
quer a nível pós-traducional.

Os GPCRs também podem impulsionar a


proliferação normal e neoplásica. Os GPCRs são
proteínas transmembranares que cruzam a membrana
sete vezes. Após activação pelos ligandos
extracelulares, activam proteínas G citoplasmáticas
heterotriméricas. Uma vez activadas, a subunidade Gα
dissocia-se e activa enzimas citoplasmáticas (adenil
ciclase, PLC). Os complexos Gβγ estimulam outras
proteínas sinalizadoras mitogénicas, como a PI3K. A
desregulação da sinalização desencadeada por estes
receptores e as proteínas G associadas pode contribuir
para a transformação celular e a tumorigénese.

Há mais quatro vias, além da Jak-STAT e da Wnt-β-catenina, que são regidas pelo princípio
de enviar para o núcleo proteínas que normalmente residem no citoplasma.

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A proteína transmembranar Notch actua como
O NF-kB é um factor de transcrição que costuma um receptor de superfície para proteínas Jagged ou
estar sob a forma homo ou heterodimérica no Delta-like. Sofre duas clivagens proteolíticas, uma no
citoplasma, sequestrado pelo inibidor IkB. Quando seu ectodomínio e outra no domínio transmembranar.
este inibidor é fosforilado pela IKK (IkB cinase) em Esta última liberta fragmentos citoplasmáticos que
resposta a sinais (TNF-α, IL-1β, LPS, EROs, fármacos migram para o núcleo onde funcionam como factores
anti-cancerígenos), é marcado para destruição e o NF- de transcrição em conjunto com outras proteínas.
kB é libertado, migrando para o núcleo e activando a Deduz-se então que o disparo dos receptores é
transcrição de genes alvo, com funções anti- proporcional ao número de ligandos extracelulares e
apoptóticas (Bcl-2) e proliferativas (myc, ciclina D1). ocorre um único disparo por receptor, o que contrasta
Apesar dos componentes desta via raramente estarem com os RTKs, que emitem sinais repetitivamente,
mutados em cancros, a via está frequentemente amplificando muito o sinal iniciado pelo seu ligando. A
activada de forma constitutiva (exemplos: no cancro contribuição desta sinalização para o desenvolvimento
da mama a IKK está sobrexpressa em 30% dos tumoral parece altamente dependente do contexto
tumores; nos cancros das linhas linfocítárias há celular, dado que as formas variantes do Notch
fenómenos de amplificação do NF-kB). costumam agir como oncogenes nos cancros
hematopoiéticos e a funcionar como TSGs em
carcinomas.

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O Hedgehog é um ligando do receptor Patched, O TGF-β e a via de sinalização controlada por este
que interage com a proteína Smoothened. A ligando aparentam ter um papel crucial na patogénese
interacção decorrente da ligação do ligando ao dos carcinomas, tanto na fase precoce, em que o TGF-
receptor faz com que a proteína Smoothened interaja β exerce efeitos anti-proliferativos, como na fase
com a proteína Gli no cílio primário, protegendo-a de tardia em que contribui paradoxalmente para a
clivagem (a versão clivada actua como um repressor invasão tumoral. A activação desta via resulta na
transcripcional). A proteína Gli migra para o núcleo e migração do factor de transcrição Smad para o núcleo,
actua como activador da transcrição. Quando onde induz a expressão de alguns genes e reprime a de
sobreexpressa a proteína Gli funciona como uma outros.
oncoproteína.

Os circuitos de sinalização requerem tanto controlos de feedback positivo quanto


negativos. Frequentemente, os componentes inibitórios intracelulares estão funcionalmente
inactivos até se dar a activação do circuito que regulam negativamente. Esta inibição induzível
designa-se feedback negativo. Por exemplo: quando um RTKs fica activado por ligando e se
auto-fosforila, o domínio SH2 da Ras-GAP permite a ligação a uma das fosfotirosinas do receptor,
posicionando a enzima favoravelmente para induzir a actividade GTPase da Ras, inactivando-a
e interrompendo rapidamente o sinal mitogénico. Antagonicamente, existem loops de feedback
positivo que amplificam os sinais. A NF1 é uma Ras-GAP que exerce a sua função quando a
célula não está exposta a sinais mitogénicos, mas que é degradada aquando essa exposição, o
que permite acelerar a actividade da proteína Ras. Estes mecanismos de feedback positivo
também podem ser utilizados para estabilizar decisões como a manutenção dum estado de
diferenciação ou a progressão do ciclo celular. Todavia estes loops representam um perigo, pelo
menos no caso das vias de sinalização mitogénicas, na medida em que permitem que a
sinalização seja auto-perpetuada, perdendo-se o controlo da proliferação, indispensável ao
fenótipo celular normal.

RESUMO:

Uma das características distintivas das células cancerosas é a sua capacidade de gerarem
endogenamente os seus próprios sinais mitogénicos, livrando-se da dependência de sinais
mitogénicos externos;

Os ramos das vias mitogénicas com mais importância para a patogénese do cancro são:

Há três maneiras de modular a transdução de sinal: modulando a actividade intrínseca das


moléculas sinalizadoras, de forma covalente ou não covalente; alterando a concentração das
moléculas sinalizadoras (é o mecanismo que actua de forma mais lenta) e regulando a
localização intracelular das proteínas sinalizadoras;

Alguns ERs estão ancorados à membrana citoplasmática e, após reconhecerem o ligando,


associam-se à proteína Sch, o que pode explicar como é que o estrogénio activa cascatas
mitogénicas citoplasmáticas.

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The Rational Treatment of Cancer
Nas últimas décadas, apesar de ter sido adquirido muito conhecimento acerca da etiologia
(mecanismos causativos) do cancro, comparativamente, pouco se traduziu em progresso
terapêutico. O aumento do sucesso terapêutico não tem sido tão marcado quanto se poderia
esperar, e até este pequeno aumento pode estar sobrestimando pelas técnicas modernas de
diagnóstico, que permitem a detecção mais precoce de tumores, aumentando o intervalo entre
o momento de diagnóstico inicial e a doença terminal. Com o aumento do número de cancros
detectados graças aos avanços nas técnicas de diagnóstico torna-se imperativo equacionar o
benefício clínico da terapêutica dirigida a tumores relativamente benignos que podem nunca
chegar a ameaçar a vida do paciente em relação à morbilidade que esses tratamentos podem
gerar. O potencial curativo das terapêuticas tradicionais em relação aos cancros de alto grau
parece estar explorado ao máximo e o progresso futuro está assim dependente do
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Os novos agentes racionais atacam alvos
moleculares específicos e identificáveis, sendo potencialmente mais efectivos a erradicar o
tumor e, simultaneamente, menos tóxicos.

O desenvolvimento e a utilização clínica de terapêuticas efectivas dependem do diagnóstico


adequado da doença. Os cancros são categorizados tendo em conta o seu tecido de origem e o
seu estado de progressão clínica. Estas classificações podem ainda ser refinadas pela descrição
de marcadores moleculares (por exemplo, a expressão de HER2 no cancro da mama), com valor
prognóstico. Este estadiamento tradicional com base histopatológica é pouco informativo na
medida em que pouco informa sobre a resposta aos vários tratamentos disponíveis.

A decisão de tratar é na maioria das vezes simplificada: tratam-se quase todos os tumores.
Devia confrontar tumores que se encaixam em três classes: indolentes com baixo potencial
invasivo e metastático; altamente agressivos com alta probabilidade de já terem metastizado
no momento do diagnóstico inicial e tumores de grau intermédio, que podem ser excisados ou
tratados com citotóxicos antes de disseminarem. Os da primeira classe, que hipoteticamente
permanecerão nessa classe durante toda a vida do paciente, não devem ser tratados. Um tumor
deste tipo é o tumor pancreático neuroendócrino (NET), em que 86% dos pacientes apresenta
sobrevivência livre de progressão a 5 anos. Uma vez que tratamentos verdadeiramente efectivos
para a maioria das metástases não estão disponíveis presentemente, a decisão de tratar os
pacientes que encaixem na segunda classe é controversa. Esta classe de tumores irá
provavelmente revelar-se letal e os tratamentos que lhes são dirigidos muitas vezes visam
apenas melhorar os sintomas. Raras vezes, os tratamentos conseguem obter respostas
subóptimas e prolongar a vida dos pacientes. Nos tumores de grau intermédio reside a maior
oportunidade terapêutica. São os tumores em que o tratamento pode efectivamente prevenir
a progressão metastática e ter resultados a longo prazo. Na realidade, os tumores de todas as
classes costumam ser tratados e muitas vezes de forma agressiva. Note-se que alguns agentes
utilizados têm acções mutagénicas e podem aumentar o risco de desenvolvimento dum
segundo cancro num segundo local.

Arrays de expressão génica podem ajudar na estratificação dos cancros de acordo com as
suas propriedades biológicas e o seu prognóstico.

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NOTA: No caso do cancro da mama, os parâmetros de prognóstico utilizados para prever o curso da
doença são a idade da paciente, o tamanho do tumor, o número de gânglios axilares acometidos, o tipo
histológico, o grau e os receptores expressos. Como estes parâmetros, quer avaliados individualmente ou
em conjuntom não são suficientemente precisos, a maioria das pacientes com cancro da mama primário
invasivo é tratada agressivamente, embora só 19% desenvolvam doença que ameace a vida. Com o uso
de arrays de expressão a progressão do cancro da mama pode ser prevista com até 90% de precisão. A
sua utilização deve permitir a estratificação em subtipos de cancro que permitam o desenvolvimento de
terapias ajustadas. Outro exemplo: os linfomas de células B têm outcomes muito variáveis (desde morte
em poucas semanas após o diagnóstico até cura ou remissão durante anos), apesar de terem uma
aparência histológica muito semelhante. Contudo, a utilização de arrays de expressão permitiu segregar
estes tumores em três doenças distintas com outcomes clínicos e resposta a tratamentos específicos
bastante diferentes.

Para além da análise do transcriptoma (conjunto de mRNAs expressos), a análise do


proteoma (conjunto de proteínas expressas) pode auxiliar na criação de estratégias
terapêuticas cada vez mais personalizadas.

Note-se que os efeitos disruptivos das mutações somáticas e das alterações epigenéticas
que conferem fenótipos malignos raramente erradicam a influência do programa normal de
diferenciação das células de origem do tumor. Estas interacções complexas entre
determinantes genéticos e não genéticos não são discerníveis pela sequenciação dos genomas
das células tumorais, obrigando à monitorização sistemática dos determinantes não genéticos
do comportamento das células cancerosas (avaliação dos seus padrões de expressão, utilizando
a análise genómica funcional).

A terapêutica corrente tem como pilares a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia.

A cirurgia oncológica baseia-se em dois fundamentos: os tumores pequenos vão


inevitavelmente originar tumores maiores e a ressecção cirúrgica dos tumores primários
representa um meio efectivo de reduzir o risco duma recaída metastática. Por exemplo, a
ressecção dum carcinoma colo-rectal precoce conduz a 95% de sobrevivência a 5 anos, mesmo
sem quimioterapia adjuvante.

A radioterapia adjuvante tornou-se uma ferramenta clínica essencial na redução da recidiva


pós-cirúrgica no campo cirúrgico. A administração de isótopos radioactivos por via endovenosa
como componentes dum fármaco ou acoplados a anticorpos monoclonais é a base da
radioterapia sistémica que é escolhida quando o tumor não é ressecável ou é necessário eliminar
células cancerosas disseminadas.

A quimioterapia é o pilar mais recente. Os agentes alquilantes são dos primeiros exemplos
(convém notar que para além do efeito citotóxico que possuem, têm efeitos mutagénicos –
para além de reduzirem/eliminarem os tumores também são carcinogéneos, sendo que o
benefício da remissão clínica poderá ser contrabalançado pelo aparecimento dum tumor
independente noutro local, anos mais tarde). A classe que se seguiu foram os agentes anti-
metabolitos, que interferem em reacções biossintéticas críticas à síntese de DNA e RNA (alguns
são análogos pirimidínicos ou purínicos). Outros agentes desta classe afectam a organização dos
microtúbulos, quer favorecendo quer bloqueando a sua despolimerização (muitos têm origem

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em produtos naturais, como o paclitaxel, a vincristina e a vinblastina). A classe das platinas
(cisplatina, carboplatina) induz modificações covalentes no DNA, criando aductos e gerando
ligações cruzadas intra-cadeia. Entre as explicações que elucidam a selectividade destes
fármacos pelas células cancerosas em detrimento das células normais a mais simples parece ser
o facto de os seus efeitos estarem dependentes do índice proliferativo das células. No entanto,
a maioria das células cancerosas tem um baixo índice proliferativo.

A resistência farmacológica é entendida em termos do crescimento selectivo de variantes


mutantes pré-existentes na população tumoral heterogénea antes do desafio farmacológico.
A resposta à resistência centra-se no desenvolvimento de protocolos que combinam múltiplos
agentes sinérgicos, com acções distintas e complementares. A probabilidade de subpopulações
tumorais serem resistentes a vários agentes em simultâneo é muito reduzida. Contudo, a
resposta dos tumores sólidos a esta estratégica costuma estar limitada pela emergência de
subpopulações refractárias resistentes. Estas populações multi-resistentes surgem a uma taxa
muito superior ao que seria expectável de acordo com as frequências das resistências
individuais. De facto, a multi-resistência pode ser adquirida por um único gene e pela proteína
por ele codificada que funciona como uma bomba de efluxo na membrana citoplasmática,
expulsando moléculas farmacologicamente activas da célula. Mutações que enfraqueçam a
maquinaria pró-apoptótica também podem originar resistência concomitante a múltiplos
agentes. Outro problema inerente às terapias com múltiplos fármacos advém do risco de se
atingirem níveis de toxicidade sistémica inaceitáveis. Os tratamentos racionais baseados em
mecanismos específicos devem dar resposta a três questões que não estão tão elucidadas no
que respeita aos agentes tradicionais: como é que o fármaco mata as células cancerosas; porque
é que a sua acção é selectiva para as células neoplásicas e como é que o tumor desenvolve
resistência passado um período de resposta inicial

A diferenciação, a apoptose e os checkpoints do ciclo celular podem ser explorados para


matar as células cancerosas. A maioria das estratégias não cirúrgicas para eliminar as células
cancerosas levam à activação das vias apoptóticas. A princípio estas estratégias podem parecer
vãs, uma vez que as células cancerosas desmantelam a maquinaria apoptótica. Ainda assim, há
redundâncias funcionais no circuito apoptótico e há componentes que permanecem intactos.

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Muitas abordagens visam interromper a sinalização anti-apoptótica (exemplo: via Akt/PKB).
Outros tratamentos exploram as vulnerabilidades adquiridas pelas células cancerosas quando
descartam certos controlos checkpoint que operam no ciclo celular normal. Baseiam-se na
geração de dano genómico, que não é reparado antes do avanço para a fase M, culminando em
catástrofes mitóticas, que ameaçam a viabilidade celular enquanto as células tentam segregar
os cromossomas danificados. Os danos podem ser tão esmagadores que a célula activa a
resposta residual apoptótica. Existem ainda estratégias terapêuticas que se baseiam na indução
da diferenciação, dado que a aquisição dum fenótipo maligno cursa com o evitamento da
diferenciação e da entrada num estado pós-mitótico. Na APL (leucemia aguda promielocítica) as
células leucémicas indiferenciadas blásticas podem ser induzidas a diferenciar-se em neutrófilos
através do tratamento com ATRA (all-trans-retinoic acid).

Apenas algumas proteínas defeituosas nas células cancerosas são alvos moleculares
atraentes para o desenvolvimento de terapêuticas dirigidas. Se o estado biológico aberrante
das células cancerosas deriva e depende do malfuncionamento de proteínas sinalizadoras, a
inibição/eliminação dessas proteínas deve resultar em respostas citotóxicas ou citostáticas que
parem a progressão do tumor ou induzam a sua regressão. Ainda mais, estes alvos moleculares
funcionam de forma diferente nas células normais e nas células cancerosas – há esperança de
obter altos índices terapêuticos com a utilização de agentes dirigidos. Existem características
funcionais incontornáveis que influenciam o desenvolvimento destes novos agentes. A maioria
dos fármacos inibe funções bioquímicas e não as potencia. Esta consideração dificulta a
concepção de fármacos que substituam as funções ausentes dos genes supressores de tumor
e dos genes de manutenção do genoma (excepção: compostos que conseguem afectar as
configurações estereoquímicas da p53, restaurando parcialmente a sua função). As
oncoproteínas tornam-se assim os alvos mais atraentes para o desenvolvimento de terapias
anti-cancro. Estas moléculas podem ser inibidas farmacologicamente, o que poderá ser
conducente ao colapso do programa de crescimento neoplásico. As proteínas transdutoras de
sinal que estão imediatamente a jusante das oncoproteínas hiperactivadas também são alvos
atraentes, porque são efectoras positivas da sinalização. Também há que considerar que as
alterações iniciais que levaram à progressão inicial do tumor podem já não desempenhar um
papel tão crítico quando o tumor já exibe um fenótipo altamente maligno, o que colocaria os
oncogenes precocemente activados na fracção dos maus alvos terapêuticos. Na realidade, o
contrário tem vindo a ser provado (embora não de forma universal). A dependência do
oncogene iniciador está até descrita como “oncogene addiction”.

As características bioquímicas das moléculas alvo também influenciam o seu potencial


terapêutico. As moléculas terapêuticas costumam ser compostos orgânicos de baixo peso
molecular (são mais fáceis de sintetizar e penetram melhor o tumor). As moléculas alvo devem,
portanto, possuir domínios estruturais capazes de estabelecer interacções fortes e específicas
com as pequenas moléculas terapêuticas. Uma proteína é considerada “druggable” se tiver
uma cavidade, normalmente catalítica (exemplos: proteínas cinases; o Imatinib inibe a
actividade TK da proteína de fusão Bcr-Abl na leucemia mieloide crónica). As proteínas
“undruggable” incluem os factores de transcrição que não possuem estas fendas catalíticas
(exemplos: Myc, Jun; excepção: receptores de hormonas nucleares). A presença dum domínio
funcional não garante, contudo, a identificação dum alvo atraente. Atente-se no caso da Ras,

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que possui actividade GTPase. Esta actividade enzimática não é alvo terapêutico porque
representa um regulador negativo da sinalização Ras. Outros exemplos incluem as tirosinas
fosfatases e a fosfatase PTEN. Como as cavidades moleculares parecem ser alvos promissores,
as interacções proteína-proteína que criem estas cavidades também podem ser visadas. Nesta
óptica, candidatos óbvios a essa inibição seriam os pares ciclina-Cdk. As tentativas nesse sentido
têm sido mal sucedidas, provavelmente porque estas interacções são muito extensas,
excedendo a dimensão das moléculas terapêuticas. Ainda assim há interacções entre outras
proteínas que já foram perturbadas com sucesso (exemplos: Mdm2-p53, Bcl-XL-BH3).

A descoberta de actividade off-target dum fármaco em desenvolvimento pode ser útil na


medida em que pode elucidar acerca da sua toxicidade farmacológica e pode revelar novas
aplicações clínicas para o fármaco.

Os candidatos a agentes terapêuticos têm de ser testados em modelos celulares. Estes testes
podem elucidar acerca da selectividade biológica do agente (por exemplo, se o agente bloqueia
uma dada cinase, pode bloquear outras cinases essenciais ao metabolismo celular).

O passo seguinte será o teste do agente em modelos animais. Alguns agentes afectam as
células de suporte estromais do tumor mais do que as próprias células cancerosas (por exemplo,
as células endoteliais expostas a danos no DNA causados por fármacos citotóxicos libertam IL-6
que confere resistência às células do linfoma). Independentemente das possíveis respostas
induzidas pela quimioterapia, as células estromais podem providenciar continuamente sinais de
sobrevivência anti-apoptóticos (ex: IGF-1), que não são considerados nas células em cultura. Ou
seja, a complexidade biológica do tumor criada pelas interacções heterotípicas com o estroma
associado ao tumor dita, muitas vezes, que as respostas aos agentes terapêuticos in vitro não
consigam prever as respostas in vivo. Além disso, é utilizada a xenotransplantação - células
cancerosas humanas em hospedeiros murinos imunocomprometidos – para que os tumores
sejam o mais similar possível aos encontrados na realidade. No entanto, estas células humanas
cancerosas são o resultado da propagação em cultura de linhas celulares tumorais, muitas das
quais não são representativas das neoplasias encontradas na clínica oncológica, por derivarem

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de tumores particularmente agressivos adaptáveis à propagação em cultura. Também existem
pressões selectivas inerentes à propagação em cultura in vitro. Os modelos de xenotransplantes
tumorais revelam-se, portanto, insuficientes. Há ainda experiências que salientam a diferença
comportamental entre transplantes tumorais experimentalmente implantados e os tumores
autóctones, mesmo se as duas populações tumorais forem geneticamente indistinguíveis.
Outras limitações na capacidade preditiva dos modelos animais estendem-se à farmacocinética
e farmacodinâmica dos agentes, bem como à sua toxicidade.

Os agentes candidatos promissores são sujeitos a ensaios clínicos rigorosos de fase 1. As


limitações descritas explicam que o verdadeiro teste de tolerabilidade dum agente terapêutico
advenha dos primeiros pacientes expostos. Estes ensaios começam por utilizar doses muito
baixas que vão escalando até se atingir a dose máxima tolerada, que marca o limite acima do
qual a toxicidade é inaceitável. Em conjunto com medidas farmacocinéticas e farmacodinâmicas,
consegue-se definir a janela terapêutica.

A eficácia clínica é avaliada através de ensaios clínicos de fase 2 e 3. Os pacientes envolvidos


em ensaios deste tipo são escolhidos consoante possuem indicações para um determinado
ensaio. Os ensaios de fase 3 são executados contra um controlo que utiliza um agente
farmacológico aprovado. Os pacientes já foram submetidos a múltiplas rondas de quimioterapia
que terminaram em recidivas com aparecimento de tumores refractários. Uma vez que se lida
com os cancros mais difíceis e agressivos, a aprovação dos agentes testados não usa critérios
demasiado elevados (o aumento da qualidade de vida ou a regressão temporária do tumor
podem ser suficientes). Por exemplo, os cancros pancreáticos têm uma sobrevida a 5 anos
inferior a 5%. A gemcitabina foi aprovada com base na melhoria sintomática, apesar dos efeitos
modestos na sobrevivência.

Frequentemente, os tumores desenvolvem resistência a terapêutica inicialmente eficaz. Os


sucessos clínicos iniciais na redução da população tumoral são usualmente seguidos da
reemergência de populações tumorais que desenvolveram resistência. Esta resistência
adquirida é devida à plasticidade genética e fenotípica das populações cancerosas. De facto,
alguma desta resistência pode derivar de variantes populacionais que já existiam no tumor. Os
mecanismos podem relacionar-se com alterações na importação e exportação do agente
terapêutico, na sua metabolização ou ainda na neutralização da maquinaria apoptótica ou
aumento da capacidade de reparação das lesões induzidas pela quimioterapia ou pela radiação.
Já existem explicações a nível molecular para a MDR (multi-drug resistance). O gene MDR1
codifica uma bomba de efluxo (P-gp) e é sobrexpresso em células cancerosas. A já referida
inactivação da maquinaria apoptótica é outro meio de conferir resistência a múltiplos
citotóxicos. Ainda assim é aceite de forma consensual que a monoterapia não consegue curar a
maioria dos cancros e que os regimes terapêuticos com vários agentes têm de ser utilizados para
que as respostas clínicas definitivas e duráveis sejam atingidas.

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Em 95% dos casos de CML (leucemia mieloide
crónica) o cromossoma Filadélfia (Ph), resultante
duma translocação recíproca 9:22, está presente. Esta
aberração cromossómica é consequência duma
mutação somática e resulta numa proteína de fusão
Bcr-Abl que funciona como uma tirosina cinase
constitutivamente activa. Os domínios desta proteína
de fusão permitem a activação da via Ras, da via PI3K-
Akt/PKB, da via Jak-STAT e de factores de transcrição
como o Jun, o Myc e o NF-kB. Estas associações
variadas permitem uma acção sobre quase todos os
circuitos regulatórios da proliferação e sobrevivência
celular. O domínio TK revelou-se assim o elemento
chave da transformação leucémica.

O imatinib (Gleevec) foi um agente desenvolvido para bloquear a cavidade catalítica da TK


da proteína Bcr-Abl (o local de ligação ao ATP), estabilizando a enzima na sua formação
cataliticamente inactiva. Outras quatro TKs são inibidas pelo Imatinib (potenciais alvos
terapêuticos: PDGF-R – doenças mieloproliferativas; receptor Kit - GIST). As células dependentes
da função cinase Abl são forçadas a entrar em apoptose pela inibição do Imatinib. O tratamento
das CMLs precoces leva a resposta hematológica em 90% dos casos (em 50% dos casos o
cromossoma Ph já nem é detectável por análise cariotípica). Até 60% dos pacientes que já
progrediram para um estado de crise blástica respondem ao Imatinib, embora tenham recidivas.

As resistências reportadas devem-se a mutações no domínio cinase, que interferem com a


ligação do Imatinib ou causam mudanças de conformação estereoquímica da oncoproteína.
Numa minoria de pacientes, a resistência é conseguida ela amplificação do gene BCR-ABL. Já se
desenvolveram outros inibidores capazes de inibir as proteínas mutantes Imatinib-resistentes
(exemplos: nilotinib, dasatinib). A utilidade do Imatinib está limitada pela existência de células
estaminais tumorais (CSCs, a minoria que tem capacidade tumorigénica em testes biológicos,
detectável por FACS). De facto, o Imatinib consegue matar as células leucémicas que estão em
fase activa do ciclo celular, isto é, as células progenitoras ou transit-amplifying. No entanto, as
CSCs estão num estado quiescente, desfavorável à acção de fármacos citotóxicos, e expressam
níveis elevados de bombas de efluxo. As CSCs estão presentes em número muito diminuto em
pacientes a ser tratados com Imatinib. Porém, se cessado o tratamento, as CSCs entram em
ciclos de crescimento e divisão, regenerando a população de células progenitoras e levando à
recaída clínica. Isto explica a cronicidade do tratamento com Imatinib e a necessidade futura de
desenvolver agentes que ataquem o núcleo do tumor, destruindo as CSCs.

Tratar com este nível de sucesso outros cancros com tirosinas cinases desreguladas pode não
ser um universo tão atingível. A CML é uma entidade única entre os tumores adultos porque
quase todas estas leucemias partilham um “driver” genético comum – a translocação Brc-Abl
– no qual são “viciadas”, tendo poucas mutações oncogénicas ou aberrações cromossómicas
adicionais.

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(C) – A eliminação das CSCs (presumíveis fontes de autorrenovação tumoral) pode não significar a cura, uma
vez que a evidência científica recente leva a crer que non-CSCs podem gerar novas CSCs (por desdiferenciação de
células progenitoras). Portanto, ambas as populações devem constituir um alvo dos tratamentos anti-neoplásicos
a fim de prevenir a recorrência.

Os antagonistas dos EGF-Rs podem ser úteis em vários tipos de tumor. Acredita-se que este
receptor esteja envolvido no desenvolvimento de até um terço dos carcinomas, que são cancros
muito comuns. Existem pelo menos seis ligandos, incluindo o próprio EGF, para este receptor.
Mesmo nos carcinomas em que o receptor não é sobrexpresso, podem existir loops autócrinos
ou parácrinos de sinais oncogénicos derivados da presença destes ligandos (por exemplo, a
libertação de EGF pelos macrófagos despoleta o comportamento invasivo das células do cancro
da mama). Adicionalmente, nos cancros da mama que sobreexpressam HER2, a acção
oncogénica deste receptor pode depender da formação de heterodímeros com o EGF-R. Os dois
inibidores melhor caracterizados são o Iressa (gefitinib) e o Tarceva (erlotinib). Actuam através
do bloqueio do local de ligação ao ATP. As células cancerosas privadas da sinalização
transmitida pelo EGF-R perdem o benefício trazido pelos sinais mitogénicos e anti-apoptóticos.
Estes agentes de baixo peso molecular conseguem penetrar bem na massa tumoral e
reconhecer receptores truncados (sem ectodomínio), ao contrário dos anticorpos monoclonais
(que, no entanto, têm semividas muito superiores). O Iressa foi estudado em pacientes com

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NSCLCs, obtendo resposta numa minoria de pacientes que possuía receptores mutantes com
alterações estruturais na porção citoplasmática (“oncogene addiction” – a aquisição dum gene
EGF-R mutante pode permitir a aquisição de outros oncogenes ou a perda de genes supressores
de tumor que seria, isoladamente, deletéria para a célula). Há um achado estranho que ainda
não está racionalizado em termos do conhecimento corrente: o melhor marcador positivo de
resposta tumoral às terapias anti-EGF-R é o desenvolvimento de rash cutâneo. Esta observação
é o indício de que poderão existir variações subtis inter-individuais nas maquinarias de
processamento de sinais que operam nas células epiteliais.

Na previsão da resposta aos TKIs (inibidores das TKs) tem de se considerar a possível
activação de efectores citoplasmáticos a jusante do receptor da superfície celular, que torna a
inactivação isolada do receptor uma estratégia fútil, uma vez que existem vias de sinalização
funcionalmente redundantes activadas.

Os níveis das proteínas regulatórias são determinados pelo balanço entre a sua síntese e
degradação (devida em grande parte ao sistema ubiquitina-proteassoma). O aparecimento de
caquexia em doentes oncológicos em fase avançada despoletou o interesse nos inibidores do
proteassoma. O Velcade (bortezomib) inibe competitivamente a actividade peptidase do
núcleo 20S do proteassoma. Foi utilizado em ensaios em pacientes com mieloma múltiplo
(caracteriza-se pelo surgimento de lesões osteolíticas que destoem a medula óssea, resultando
em depressão imune severa), obtendo respostas objectivas.

A via do NF-kB apresenta grande actividade


nas células do mieloma. Os inibidores do NF-kB são
marcados para destruição por poliubiquitilação,
após fosforilação por IKKs. Inibindo o proteassoma,
previne-se a degradação dos IkBs que continuam a
sequestrar o NF-kB no citoplasma, impedindo a sua
translocação para o núcleo onde activa a
transcrição de genes anti-apoptóticos (Bcl-2) e
proliferativos (IL-4, IL-6), bem como de moléculas
de adesão que auxiliam o estabelecimento de
interacções heterotípicas entre as células do
mieloma e as células estaminais da medula óssea.

Para além da inactivação da via NF-kB existe


outra teoria para o mecanismo de acção do
Velcade. As células do mieloma secretam
anticorpos a uma taxa muito elevada e muitas
destas moléculas são degradadas no proteassoma
devido a erros na sua maturação pós-traducional. A
acumulação destas proteínas no RE induz um
estado de stress que activa a UPR (unfolded protein
response), que incita o recrutamento de
chaperonas para o lúmen do RE (episódios agudos)
ou até mesmo a apoptose (episódios crónicos).
Portanto, a inactivação do proteossoma pode
culminar na activação da UPR e subsequentemente
da apoptose.

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A ciclopamina é um agente natural teratogénico que perturba a via de sinalização activada
pelo Hedgehog, por inibição da proteína Smoothened.

NOTA: Nesta via, o percursor do factor de transcrição Gli é clivado no citoplasma, permitindo que o
produto da clivagem se desloque para o núcleo onde actua como um repressor transcripcional. A proteína
Smoothened, que reside na membrana citoplasmática, consegue evitar esta clivagem mas essa acção é
normalmente inibida pelo receptor membranar Patched. Esta inibição é evitada quando o ligando
Hedgehog se liga ao receptor Patched. Nestas circunstâncias, a proteína Smoothened dirige-se ao cílio
primário prevenindo a clivagem da proteína Gli, que se dirige intacta para o núcleo onde actua como um
factor de transcrição.

Mais de metade dos carcinomas de células basais possuem mutações inactivadoras do gene
PTCH ou activadoras do gene SMO. Vários tipos de carcinomas, especialmente em órgãos
derivados da endoderme, sobreexpressam o ligando Hedgehog, activando loops de sinalização
autócrina. A ciclopamina veio inspirar o desenvolvimento de antagonistas da via Hedgehog. Os
pacientes com cancro do pâncreas poderão vir a beneficiar deste tipo de terapêutica – 70%
sobrexpressa o ligando Hedgehog. Neste caso é a sinalização parácrina que tem um papel
determinante (e não a autócrina): as células de carcinoma secretam Hh que estimula a
proliferação de fibroblastos e miofibroblastos no estroma associado ao tumor. Estas células
constroem um estroma desmoplásico denso, característico desta doença e cria uma barreira
física, impedindo o atingimento do parênquima pelos agentes quimioterapêuticos. Isto sugere
a utilização duma combinação de um inibidor Hh, para prevenir a formação do estroma denso,
com agentes citotóxicos.

O circuito regulatório mTOR representa um alvo atraente para a terapêutica anti-


neoplásica. A Rapamicina (sirolimus), um produto bacteriano, foi utilizada inicialmente como
um agente anti-fúngico mas depressa veio a provar conseguir deter o crescimento dum grande
espectro de células eucarióticas. Exerce ainda efeitos imunossupressores, diminuindo o risco de
doenças linfoproliferativas pós-transplantação. A rapamicina liga-se a uma proteína de baixo
peso molecular, a FKBP12, e o complexo assim formado associa-se à proteína mTOR
(mammalian target of rapamycin), inactivando a sua actividade serina-treonina cinase.

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A mTOR integra aferências acerca da disponibilidade de nutrientes e presença de mitogéneos
e controla processos biológicos como o uptake de glucose e a síntese proteica. Estas acções
fazem da mTOR a proteína governadora do crescimento celular (mais do que da proliferação).
Além disso, a proteína mTOR é um activador a montante da proteína Akt/PKB, ou seja, regula
também a apoptose e a proliferação celular.

A associação da mTOR com a proteína Rictor e com a proteína GβL resulta na formação do complexo TORC2,
que é regulado por factores de crescimento e activa a proteína Akt/PKB. Já a associação da mTOR com a proteína
Raptor e com a proteína GβL forma o complexo TORC1 que activa a síntese proteica (fosforila a cinase S6K1 que
fosforila a proteína 40S da subunidade menor do ribossoma, permitindo a sua associação com a subunidade maior e
fosforila a proteína 4E-BP1 que liberta assim o factor iniciador da tradução eIF4E).

Este último complexo é o alvo mais precoce do complexo rapamicina-FKBP12. Porém, se o


tratamento for prolongado, o complexo TORC2 também é inibido, o que explica o efeito da
rapamicina em cancros que exibem hiperactivação da via PI3K ou perda da expressão do PTEN.
Dada a posição estratégica da mTOR no circuito regulatório das células as respostas clínicas ao
tratamento com a rapamicina ou análogos são surpreendentemente modestas. De facto, o
complexo TORC1 também participa na regulação por feedback negativo do próprio circuito
que o activa, o que pode anular os benefícios iniciais da sua inibição com o passar do tempo.

A sequenciação dos genomas das células tumorais levou à identificação de alelos B-Raf
mutantes em mais de metade dos melanomas humanos. Em 90% destes casos, detectou-se a
mutação pontual V600G (valina > ácido glutâmico na posição 600). Nos melanomas, bem como
noutros tipos de tumor, há um padrão mutuamente exclusivo entre a presença de alelos B-Raf
mutantes e de oncogenes Ras – são alelos funcionalmente redundantes. O vemurafenib tem

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como alvo a proteína B-Raf V600E e está aprovado para o melanoma metastático, prolongando
a esperança de vida (mas não curando e podendo até estimular o crescimento de outros
tumores subclínicos latentes - as proteínas Raf dimerizam como homo ou heterodímeros e o
vemurafenib estimula a actividade do componente WT do dímero).

RESUMO:

O cancro não é uma doença única - a utilização das técnicas de diagnóstico molecular tem
levado a uma expansão de subcategorias entre as doenças neoplásicas: centenas de entidades
distintas têm sido reconhecidas;

A incidência de muitos tipos de cancro é fortemente influenciada pelas práticas de


diagnóstico – “the more one looks, the more one finds”;

As proteínas que são bons alvos para anticorpos localizam-se invariavelmente na superfície
celular ou no espaço extracelular;

As proteínas que são bons alvos para agentes de baixo peso molecular são enzimas com
domínios catalíticos “druggable”.

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Chronic Myeloid Leukemia
A CML é uma doença clonal das células estaminais hematopoiéticas, causada pelo produto
quimérico do gene BCR-ABL1, resultante duma translocação equilibrada recíproca entre os
braços longos do cromossoma 9 e 22 t(9;22) (q34;q11.2), citogeneticamente detectado como o
cromossoma Filadélfia (Ph). A proteína de fusão resultante actua como uma TK
constitutivamente activa. O curso da doença não tratada é bifásico ou trifásico, com uma fase
inicial indolente ou crónica seguida duma fase de aceleração/agudização e duma fase terminal
blástica. Os inibidores da tirosina cinase (TKIs) BCR-ABL1 selectivos, como o imatinib,
revolucionaram a história natural e o prognóstico da CML (a sobrevivência a 10 anos passou de
30% para 85%). O transplante alogénico de células estaminais passou a ser oferecido como
terapia de 2ª ou 3ª linha.

Incidência, Epidemiologia e Etiologia: A CML contabiliza 15% dos casos de leucemia. Tem
preponderância ligeira no sexo masculino e na 5ª e 6ª décadas de vida. A prevalência da doença
tem aumentado graças ao sucesso das novas terapêuticas. Não há associações familiares
estabelecidas. A exposição a radiação ionizante aumenta o risco de desenvolver CML.

Fisiopatologia: A translocação 9:22 está presente nas células hematopoiéticas (mieloides,


eritroides, megacariócitos, monócitos e, mais raramente, em linfócitos) em mais de 90% dos
casos de CML clássica. O oncogene híbrido resultante, o BCR-ABL1, resulta da translocação do
oncogene ABL1 para junto do gene BCR (major breakpoint cluster region). (Nota: Há mais dois
breakpoints raros na região BCR, minor e micro, correlacionados com pior e melhor prognóstico,
respectivamente.) Este gene de fusão codifica a oncoproteína p210BCR-ABL1, com actividade
cinase constitutiva o que confere vantagem proliferativa às células da CML. Com o tempo, a
hematopoiese normal é suprimida. A actividade constitutiva da proteína BCR-ABL1 resulta na
sua auto-fosforilação e activação de múltiplas vias a jusante (ex: Ras, MAP cinases, STATs, PI3K,
Myc), que modificam a transcrição génica, a apoptose, a organização do citoesqueleto e a
degradação de proteínas inibitórias. Estas interacções requerem a ligação da proteína BCR-ABL1
a proteínas adaptadoras.

Os TKIs ligam-se ao domínio cinase da oncoproteína de fusão, prevenindo a activação das


vias transformantes. A proliferação das células da CML é inibida, a apoptose induzida e a
hematopoiese é restituída. O gene de fusão BCR-ABL1 demonstrou ter potencial
leucemogénico como uma alteração oncogénica única. A causa do rearranjo molecular é
desconhecida. Técnicas de detecção molecular identificam esta anomalia em 25% dos adultos
normais e em 5% das crianças, sugerindo que a alteração não é suficiente para causar a CML
na maioria dos indivíduos onde ocorre, sendo necessários eventos moleculares adicionais e
falhas no reconhecimento imune das células afectadas. A CML é definida pela presença do BCR-
ABL1 nos pacientes com neoplasias mieloproliferativas. Nalguns pacientes com o quadro
morfológico típico de CML o cromossoma Ph não é detectável por análises citogenéticas
standart, sendo requerida a utilização de técnicas de FISH e estudos moleculares por PCR.
Indivíduos com CML atípica não respondem à terapia com TKIs. Os mecanismos de transição
entre a fase crónica para a fase acelerada-blástica estão mal estudados, podendo implicar
anomalias cromossómicas, perda de p53, entre outros – evolução clonal. De qualquer forma, é
consensual que a proteína BCR-ABL1 induz instabilidade genética que leva à aquisição de

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mutações adicionais e, eventualmente, à transformação blástica. Um efeito crítico dos TKIs será,
portanto, a estabilização do genoma das células da CML, diminuindo a transformação,
especialmente a que ocorre de forma insidiosa. A resistência a estes agentes prende-se com a
mutação do domínio cinase da ABL1, evitando a ligação dos TKIs ao sítio catalítico (o local de
ligação ao ATP). Isto despoletou o desenvolvimento de TKIs de 2ª geração (dasatinib, nilotinib,
bosutinib) e de 3ª geração (ponatinib). Estes últimos agentes têm eficácia selectiva contra a
mutação T315I.

Apresentação Clínica: A maioria dos pacientes (90%) apresenta-se na fase indolente ou


crónica, podendo mesmo ser assintomáticos no momento do diagnóstico. Sintomas comuns,
quando presentes, são manifestações de anemia e esplenomegália (dor abdominal, fadiga,
perda ponderal). Eventos trombóticos ou vaso-oclusivos poderão ocorrer em casos de
leucocitose ou trombocitose severa (ex: priapismo, complicações CV, EAM, trombose venosa,
alterações visuais, insuficiência pulmonar, sonolência, confusão, AVC). Os pacientes em fase
blástica ou acelerada têm febre e agravamento dos sintomas mencionados, além de eventos
hemorrágicos e dores articulares. Achados menos comuns incluem hepatomegalia,
linfadenopatia e alterações cutâneas.

A medula óssea dos pacientes é hipercelular com hiperplasia mieloide marcada. Os blastos
medulares não excedem os 5%; quando elevados acima deste valor correlacionam-se com pior
prognóstico ou representam aceleração (>15%). O diagnóstico citogenético de biópsias
medulares tem sido complementado pelas técnicas de FISH e PCR em amostras de sangue
periférico. Estas práticas também se aplicam à monitorização da terapia com TKIs. Uma
resposta citogenética parcial define-se pela presença de menos de 35% de metáfases Ph-
positivas, na análise citogenética de rotina e uma resposta completa refere-se à ausência de
metáfases Ph-positivas (dentro da qual se inclui a resposta molecular major, com menos de
0,1% de transcritos BCR-ABL1 e completa, em que estes transcritos são indetectáveis).

A progressão da CML cursa com leucocitose resistente à terapia, anemia grave, febre e
sintomas constitucionais. O aumento de blastos e basófilos também é característico. Os critérios
de fase acelerada incluem: >15% de blastos periféricos, >30% de blastos + pró-mielócitos
periféricos, >20% de basófilos periféricos, evolução clonal citogenética e trombocitopenia.
Muitos destes critérios perderam o valor prognóstico com o aparecimento dos TKIs. A fase
blástica é definida pela presença de mais de 30% de blastos periféricos ou medulares ou pela
presença de camadas de blastos na doença extramedular (pele, tecidos moles, lesões ósseas
líticas). A fase blástica é comummente mieloide.

Tratamento: Antes da terapêutica com imatinib, a mortalidade anual da CML era de 10% nos
2 primeiros anos e de 15-20% a partir desse ponto. A sobrevivência média rondava os 3 a 7 anos.
A estabilidade da doença era imprevisível com pacientes a sofrerem transformação repentina
para a fase blástica. Com o imatinib a mortalidade anual decresceu para 2% e o curso da doença
passou a ser mais previsível, com diminuição das transformações, que começam por assumir a
forma de recaída citogenética seguida de recaída hematológica (não são súbitas). Os factores de
prognóstico pré-tratamento têm vindo a ser substituídos por factores de prognóstico
relacionados com o tratamento. A obtenção de uma resposta citogenética completa tornou-se
o maior endpoint terapêutico, o único associado com aumento da sobrevida.

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Signal Transduction in Cancer
A progressão tumoral é impulsionada por alterações genéticas e epigenéticas que permitem
às células cancerosas proliferar excessivamente e escapar aos mecanismos homeostáticos que
normalmente controlam a sua sobrevivência e migração. Muitas destas alterações remetem
para as vias de sinalização que controlam o crescimento, a divisão, a morte, o destino e a
motilidade celular que actuam no contexto de redes ainda mais abrangentes que influenciam o
microambiente tumoral, a angiogénese e a inflamação. Mutações que convertem os proto-
oncogenes em oncogenes podem conduzir à hiperactivação dessas vias de sinalização,
enquanto a inactivação de genes supressores de tumor elimina reguladores negativos dessas
mesmas vias.

Introdução: A causa do cancro é de ordem genética e epigenética. No caso dos tumores


sólidos, a acumulação de alterações promove a progressão de massas hiperplásicas benignas a
massas celulares com morfologia, aparência citológica e organização anormais. Com a
expansão tumoral, o cerne tumoral perde acesso a oxigénio e nutrientes, podendo estimular a
angiogénese. Posteriormente, as células tumorais podem invadir os tecidos adjacentes, entrar
em circulação e metastizar. A progressão tumoral está associada com a interacção complexa
entre as células tumorais, as células vizinhas não neoplásicas e a MEC. As características que
normalmente acompanham esta progressão são o aumento da proliferação celular, a resistência
à apoptose, alterações metabólicas, instabilidade genética, a indução da angiogénese e o
aumento da capacidade migratória. A desregulação das vias celulares de transdução de sinal
está subjacente ao aparecimento da maioria destas características.

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Mutações como a causa do cancro

As alterações genéticas podem ser herdadas ou esporádicas (dano DNA induzido por
carcinogéneos ambientais ou erros replicativos). Estas alterações conferem vantagens
selectivas às células o que se traduz no seu crescimento e proliferação. Tipicamente, duas a oito
mutações são mutações “driver” - causam a progressão tumoral. As outras dezenas a centenas
de mutações identificáveis são mutações “passenger”. As mutações podem ser pontuais (ex:
G12V Ras), delecções (ex: PTEN), inversões ou amplificações (ex: myc). Também podem ocorrer
rearranjos (ex: fusão BCR-ABL em leucemias). A perda de heterozigotia, por conversão génica
ou recombinação mitótica, é outra fonte de alterações genéticas propulsoras (ex: pRB, p53). A
metilação de promotores também possui um papel determinante na oncogénese. O
silenciamento epigenético até é mais comum do que o silenciamento mutacional para alguns
genes (ex: p16, um inibidor CDK; MLH1, uma enzima MMR). Na mesma óptica, há mutações que
afectam reguladores epigenéticos que controlam a metilação do DNA ou as modificações das
histonas. Finalmente, uma minoria de cancros está associada a vírus que codificam genes que
promovem a tumorigénese (ex: o HPV codifica a proteína E6 que promove a degradação da p53
e a proteína E7 que inactiva a pRb e CKIs; o HBV pode codificar proteínas oncogénicas ou
promover a expressão de oncogenes celulares subsequente à integração viral ou contribuir para
a carcinogénese através da lesão e inflamação persistente no fígado; o EBV produz a proteína
LMP1 que actua como um receptor de TNF constitutivamente activo).

Mutações causativas de cancro afectam as vias de sinalização: O resultado destas alterações


é a sinalização desregulada não sujeita aos normais mecanismos de controlo. As mutações
oncogénicas resultam na sobrexpressão das proteínas codificadas pelos oncogenes ou na
produção de proteínas mutadas com actividade anormal (ex: RTKs, como o EGFR; GTPases,
como a Ras; serina-treonina cinases, como a Raf e a Akt; TKs citoplasmáticas, como a Src e a Abl;
cinases lipídicas, como as PI3Ks; receptores nucleares, como o ER; componentes das vias de
sinalização do desenvolvimento, como o Wnt, o Hh e o Notch; factores de transcrição, como o
Myc e o NF-kB; remodeladores da cromatina; efectores do ciclo celular, como as ciclinas).
Alternativamente, delecções e outras mutações podem inactivar reguladores negativos que
funcionam como supressores tumorais (ex: proteínas envolvidas no controlo do ciclo celular,
como a p53, a pRb e os CKIs; proteínas que regulam negativamente as vias de sinalização
citoplasmáticas, como a APC – via Wnt e o PTEN – via PI3K-Akt).

De notar que as vias hiperactivadas por oncogenes podem induzir um estado de paragem
irreversível do ciclo celular, denominado senescência. Isto representa um mecanismo de
segurança para inibir a proliferação derivada da activação aberrante de oncoproteínas nas
células normais. A transformação oncogénica requer, portanto, alterações que evitem a
senescência como a perda de TSGs.

Vias de sinalização oncogénicas: Muitos dos genes comumente mutados codificam


componentes ou alvos das vias PI3K-Akt e Ras-ERK. Normalmente, estas vias são activadas
transitoriamente em resposta a factores de crescimento ou citocinas ou ocupação por ligando
dos receptores de adesão das integrinas. As alterações genéticas podem ser conducentes à
sinalização constitutiva.

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A via PI3K-Akt pode ser activada através da amplificação ou da activação mutacional de
proteínas sinalizadoras (ex: PI3K, Akt) ou da inactivação mutacional de fosfatases (ex: PTEN,
INPP4B). Mutações nos TSGs TSC1 e TSC2 hiperactivam a sinalização pelo complexo mTORC1,
alvo da sinalização PI3K-Akt.

A via Ras-ERK também pode ser activada através da activação mutacional de proteínas
sinalizadoras (ex: Ras, Raf) ou da inactivação mutacional de GAPs (ex: NF1). O factor de
transcrição Myc, um alvo a jusante desta via, está frequentemente amplificado ou sobrexpresso
(o Myc liga-se a regiões promotoras mas também aumenta a actividade transcripcional da
polimerase II, funcionando como um amplificador universal da expressão génica).

Mutações oncogénicas, amplificações ou fusões génicas que envolvam os RTKs (ou GPCRs)
a montante (ex: EGFR, ErbB2, FGFR, PDGFR) levam a sinalização constitutiva através de ambas
as vias. A síntese desregulada dos factores de crescimento que actuam como ligandos também
pode ter um papel importante, gerando loops de sinalização autócrina ou parácrina.

Desregulação dos processos celulares por sinalização oncogénica

Proliferação celular: A disponibilidade limitada de factores de crescimento e nutrientes, a


inibição por contacto e outros mecanismos de feedback asseguram que as vias que regulam a
proliferação são muito controladas. No entanto, estas vias podem ser hiperactivadas de várias
formas, culminando na activação da maquinaria do ciclo celular e proliferação excessiva
(acresce-se ainda que os próprios componentes de controlo do ciclo celular também podem
estar alterados).

Um alvo importante da via Ras-ERK é o Myc, que é fosforilado pela ERK, escapando à
ubiquitilação. O Myc induz a expressão de muitos genes que promovem a proliferação celular
– os que codificam as ciclinas que operam na transição G1/S, as CDKs e os factores de transcrição
da família E2F. Adicionalmente, reprime a expressão de inibidores do ciclo celular (ex: CKIs),
bloqueia a actividade de factores de transcrição que promovem a diferenciação, induz genes
que aumentam a tradução e promove o metabolismo anabólico. Outros factores de transcrição
fosforilados pela ERK são o Elk1, que em combinação com o factor de transcrição SRD, induz a
expressão do IEG (immediate early gene) FOS. O FOS é um oncogene que codifica um
componente do factor de transcrição AP1 que regula muitos genes envolvidos na proliferação
celular. Muitas cinases também são fosforiladas pela ERK e fosforilam factores de transcrição
que regulam a progressão do ciclo celular.

A via PI3K-Akt controla a proliferação celular a vários níveis. A Akt inibe a actividade GAP do
complexo TSC1-TSC2, permitindo que a proteína Rheb ligada a GTP active o complexo mTORC1.
O mTORC1 tem efeitos que culminam na promoção do crescimento celular por aumento da
síntese proteica. A Akt também fosforila e inactiva a cinase GSK3, inibindo a sua actividade
catalítica, a fosforilação da ciclina D, do Myc e da β-catenina, marcando-os para degradação.
Assim, estes reguladores do ciclo celular ficam estabilizados. Para além disso, a Akt inibe
inibidores do ciclo celular (ex: CIKs como o p27 e o p21).

Outras vias de sinalização podem impulsionar a proliferação celular no cancro. A sinalização


através de citocinas e RTKs pode activar o STAT3, que estimula a síntese da Myc e da ciclina D.

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As vias Notch, Wnt/β-catenina, Hedgehog e a activação do ER do subtipo a também podem
induzir a síntese das mesmas proteínas. O NF-kB, que pode ser activado por sinais como o TNF,
também pode aumentar a expressão de ciclina D. A sinalização através dos ERs e dos ARs
(androgen-Rs) está acoplada e é fomentada pela sinalização Ras-ERK e PI3K-Akt. Além disso,
estes receptores esteroides formam complexos citoplasmáticos com as proteínas Src e PI3K,
activando os seus efectores a jusante e a ERK pode fosforilar o ERa.

A proliferação também é regulada negativamente. A pRB inibe directmente a actividade


transcripcional das proteínas da família E2F até ser desactivada por fosforilação pelas CDKs. Já a
p53 bloqueia a proliferação em resposta a sinais de stress, como o dano genómico, induzindo os
CKIs que inibem a actividade das CDKs. Acima na hierarquia estão TSGs específicos de vias, como
o NF1 (Ras-GAP) e o APC que bloqueiam a sinalização Wnt/β-catenina.

NOTA: A via supressora de tumor Hippo regula a inibição da proliferação por contacto, pela supressão
do coactivador transcripcional YAP.

Sobrevivência Celular: A morte celular representa um mecanismo homeostático que


controla o número celular e que confere protecção contra o cancro. A disrupção deste
mecanismo no cancro inclui: sobrexpressão de proteínas anti-apoptóticas (ex: Bcl2, Bcl-xL) e
perda de reguladores pró-apoptóticos (ex: p53 – o controlo do ciclo celular também fica
comprometido, Bax, Bim, Bad).

A hiperactivação da sinalização Ras-ERK e PI3K-Akt por mutações oncogénicas desequilibra


o balanço normal, favorecendo os sinais anti-apoptóticos (geralmente, na ausência de factores
de crescimento e sinais do microambiente, as células entram em apoptose). A Akt fosforila
factores de transcrição como o FoxO3A, levando à sua sequestração citoplasmática, evitando
a indução de ligandos de morte (ex: FasL, TRAIL) e da proteína pró-apoptótica Bim. Também
activa o inibidor da apoptose XIAP e o NF-kB que regula proteínas anti-apoptóticas. A
ubiquitilação dependente de Akt da p53 conduz à sua degradação.

Metabolismo Celular: O crescimento celular envolve a coordenação de processos


metabólicos biossintéticos. Assim, as vias de sinalização iniciadas por factores de crescimento
programam as células para satisfazerem a necessidade de síntese de macromoléculas para
produzirem células filhas. A alteração metabólica mais comum no cancro é o aumento do
uptake de glicose e da glicólise. Embora possa parecer desvantajosa por gerar menos ATP,
permite o desvio dos esqueletos de carbono da glicólise para reacções anabólicas, como a
síntese de nucleótidos e aminoácidos. As células cancerosas também aumentam o uptake de
glutamina e a glutaminólise para suportar a fosforilação oxidativa e a biossíntese de proteínas,
lípidos e ácidos nucleicos. Também sobre-regulam a síntese lipídica, redirecionando o citrato do
ciclo de Krebs para a síntese dos ácidos gordos.

A Akt regula o transporte de glicose (ex: GLUT4, GLUT1) e a hexocinase. A fosforilação da


TSC2 pela Akt afecta o metabolismo através da regulação da glicólise mediada pelo complexo
mTORC1, aumentando a quantidade e induzindo (por aumento do HIF1) as enzimas glicolíticas
e a LDH. A piruvato desidrogenase cinase também é induzida (por aumento do HIF1) e inibe a
piruvato desidrogenase na mitocôndria, reduzindo a preponderância do ciclo de Krebs. A

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Akt/mTORC1 promove a síntese lipídica pela activação do factor de transcrição SREBP (sterol-
response-element-binding protein 1). O complexo mTORC regula ainda o uptake de aminoácidos
pela estiumulação da translocação de transportadores de aa para a membrana plasmática. A Akt
regula negativamente por fosforilação os factores de transcrição FoxO, que controlam
programas que aumentam o metabolismo oxidativo.

A sinalização Ras-ERK exerce muitos dos seus efeitos metabólicos por intermédio do Myc,
que regula o uptake de glicose, a glicólise, a via pentose-fosfato, o uptake de glutamina e a
glutaminólise. A maioria das células cancerosas produz uma forma alternativa da enzima
piruvato cinase, a PKM2 que é menos activa em condições fisiológicas que a forma PKM1,
encontrada nas células diferenciadas. A PKM2 pode ser inibida pela sinalização via TKs, o que
inclui os RTKs das vias Ras-ERK e PI3K-Akt, e por EROs. Desta maneira, as células cancerosas
redirecionam o fluxo de intermediários glicolíticos para vias anabólicas (ex: produção de
ribose, serina e glicina; produção de NADPH e glutatião). Ainda a assim, a perda da PKM2 acelera
a formação de tumores da mama.

Uma vez mais, quer a activação de oncogenes quer a perda de TSGs podem impulsionar
estas mudanças metabólicas. A p53, por exemplo, infra-regula a glicólise pela indução da
enzima TIGAR que diminui os níveis da frutose 2,6-bifosfato, activadora glicolítica. Entre outras
funções além do estímulo da fosforilação oxidativa, a p53 aumenta a produção de glutatião,
um antioxidante celular fulcral. As mutações associadas com o cancro podem culminar na
produção de metabolitos únicos (ou unicamente elevados) nas células cancerosas –
oncometabolitos – com funções na tumorigénse.

Polaridade e Migração Celular: A capacidade de invasão que algumas células adquirem


aquando da progressão maligna implica mudanças na adesão, polaridade e morfologia celular e
na dinâmica do citoesqueleto. A migração é regulada por factores de crescimento, quimiocinas,
receptores de adesão e outros estímulos.

Muitos efectores a jusante das vias PI3K-Akt e Ras-ERK regulam a migração e invasão celular:
as GTPases da família Rho (RhoA, Rac1, Cdc42, ARF6), que controlam reguladores do
citoesqueleto; as integrinas e proteínas de adesão à matriz associadas; as proteases
extracelulares, que criam espaço para a locomoção das células, reduzem os seus contactos
adesivos e libertam moléculas bioactivas sequestradas na MEC; os complexos de adesão
intercelular e factores de transcrição que regulam a expressão de muitas das proteínas
enumeradas.

A manutenção da polaridade é crítica para a conservação da arquitectura tecidual.


Complexos proteicos (ex: Scribble, Par, Crumbs) regulam a polaridade cellular. A perda de
polaridade está frequentemente acoplada ao aumento da proliferação celular, porque a perda
de moléculas de adesão alivia os efeitos da inibição por contacto.

Algumas subpopulações tumorais marginais passam por uma EMT, pelo menos parcial, um
processo morfogenético característico do desenvolvimento. Este processo é orquestrado por
múltiplas vias altamente coordenadas e pela combinação de diferentes factores (ex: TGF-β,
TNF, Wnt, Notch). A EMT é definida pela perda de polaridade ápico-basal, infra-regulação das

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moléculas de adesão de E-caderina, adopção duma aparência fibroblasto-like e, em certos
contextos, aquisição de fenótipos estaminais com independência de ancoragem.

Diversos factores de transcrição (ex: Snail, Slug, Twist, ZEB) com papéis críticos na EMT são
regulados pelas cinases ERK e Akt. Por exemplo, o factor de transcrição AP1, regulado pela via
Ras-ERK, consegue induzir factores de transcrição que promovem a EMT e outros programas de
expressão génica que responsáveis pelas mudanças fenotípicas associadas com a EMT (ex:
sobre-regulação de heterodímeros de integrinas específicos, como α5β1 e αVβ6, de vimentina
e fibronectina e infra-regulação de citoqueratinas, proteínas polarizadoras e E-caderina).

Finalmente, é importante salientar que a EMT não é essencial para a invasão e disseminação
das células tumorais. As células tumorais podem migrar como uma camada epitelial, à
semelhança do que ocorre fisiologicamente nos processos de cicatrização, ou invadir como um
todo, “empurrando” a membrana basal.

Destino Celular e Diferenciação: A corrupção das vias de sinalização que operam em


processos do desenvolvimento é um atributo de muitos cancros. A progressão tumoral requer
uma população com capacidade de autorrenovação. A estaminalidade pode ser induzida por
oncogenes ou a célula de origem pode já ser uma célula estaminal. Os cancros hematopoiéticos
interrompem os programas de diferenciação antes de as células atingirem um estado
diferenciado não proliferativo. Por exemplo, a leucemia mielocítica aguda os mieloblastos
falham a diferenciação em leucócitos maduros porque uma translocação origina uma proteína
de fusão PML-RAR, que reprime a activação dos alvos normais da proteína RAR que controlam
a diferenciação. Mutações subsequentes impulsionam a proliferação excessiva de mieloblastos
indiferenciados. Outro exemplo paradigmático está relacionado com a sinalização Wnt
inapropriada no cancro do cólon. A sinalização Wnt via β-catenina mantém os enterócitos num
estado indiferenciado nas criptas colónicas, sendo progressivamente suprimida pela degradação
mediada por APC da β-catenina, à medida que as células migram para a superfície luminal
intestinal. Mutações no gene supressor de tumor APC evitam esta destruição e mantêm as
células num estado indiferenciado.

Os sinais do desenvolvimento também podem estimular a proliferação. Mutações que


activam a sinalização Notch podem contribuir para a leucemia linfocítica aguda, pelo estímulo
do ciclo celular e inibição da apoptose. Na realidade, a sinalização Notch é ambígua: pode
funcionar como supressora tumoral ou estimular a proliferação, dependendo da concentração.

A activação da sinalização Hedgehog, por mutações no receptor Patched, ocorre em


carcinomas das células basais e meduloblastomas, resultando em proliferação celular
aumentada. Noutros tumores que afectam tecidos derivados do intestino embrionário está
hiperactivada por loops autócrinos de sinalização.

Como as vias Ras-ERK e PI3K-Akt são activadas por factores de crescimento como o EGF, o
IGF e o FGF que controlam o destino celular, também podem ser consideradas vias de sinalização
associadas ao desenvolvimento.

Instabilidade Genómica: Aneuploidias e rearranjos de DNA são achados comuns em muitos


cancros. Há enzimas que, normalmente, asseguram a reparação do dano genómico e os

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checkpoints celulares garantem que a replicação do DNA e a citocinese são interrompidas nas
células em divisão até que se corrijam erros, podendo mesmo induzir a entrada em senescência
ou apoptose. A instabilidade genómica (que pode ser uma causa ou uma consequência do
cancro, ou ambos) reflecte a falência destes mecanismos.

Os sinais de dano genómico são transmitidos por cinases à p53, que pára o ciclo celular e
activa a maquinaria de reparação. A jusante, o CKI p21 é induzida e cessa actividade da DNA
polimerase se a replicação já tiver sido iniciada. Se os danos persistirem a célula entra em
senescência ou apoptose. O silenciamento destes TSGs ou das cinases a montante pode
inactivar a sinalização dos checkpoints celulares. As próprias proteínas que encabeçam a
reparação do DNA encontram-se frequentemente mutadas (ex: enzimas MMR, BRCA1/2).

O checkpoint mitótico (formação do fuso mitótico) salvaguarda a aquisição dum conjunto


completo de cromossomas pelas células filhas. Várias proteínas (ex: Bub1/3, Mad1-3)
monitorizam a ancoragem dos cromossomas ao fuso mitótico, podendo bloquear a segregação
cromossómica se os cromatídeos irmãos não estiverem ligados a microtúbulos provenientes de
polos opostos. A inactivação deste checkpoint tem potencial de gerar aneuploidias.

A Akt pode inibir a reparação por recombinação homóloga, directa e indirectamente. Tanto
a via PI3K-Akt como a via Ras-ERK inibem a apoptose, promovendo a sobrevivência de células
danificadas. Assim, a Akt modifica quer a resposta, quer a reparação do dano genotóxico. O
TSG PTEN também regula a estabilidade cromossómica, independentemente da sua actividade
fosfatase, nomeadamente através do aumento da expressão da proteína de reparação RAD51.
A perda de PTEN leva a quebra de centrómeros e a translocações cromossómicas. A
sobrexpressão de Myc também pode influenciar a instabilidade genómica, promovendo
rearranjos cromossómicos.

Microambiente Tumoral: A progressão tumoral também depende grandemente da MEC, dos


vasos, das células imunes e de células não cancerosas, como os fibroblastos. Muitas mudanças
no microambiente tumoral mimetizam as que acontecem durante a cicatrização de lesões ou
processos do desenvolvimento. À medida que os tumores evoluem, a complexidade do seu
ecossistema aumenta: interacções parácrinas e justácrinas recíprocas entre as populações de
células neoplásicas e entre estas e as células não neoplásicas regulam as vias de sinalização.

- Matriz Extracelular: A MEC oferece o suporte físico tecidual e providencia o substrato para
a adesão e migração celular, sendo ainda fonte de moléculas bioactivas (ex: FGF, TGFβ, VEGF,
PDGF). É uma estrutura muito dinâmica e influencia o comportamento celular. Componentes
da MEC, como a fibronectina, a laminina e o colagénio servem como ligandos da sinalização via
integrinas, que consegue activar vias canónicas como a Ras-ERK ou a PI3K-Akt e outras
proteínas como a tirosina cinase FAK, que transmite sinais dos complexos de adesão à matriz
até ao citoesqueleto. A FAK também regula a p53 e membros da família de microRNAs miR-200
que controlam a apoptose e o fenótipo epitelial. A MEC fica mais densa com o avançar da
progressão tumoral, pela deposição de matriz pelos fibroblastos associados ao cancro e pelo
aumento das ligações cruzadas entre as fibras de colagénio. O aumento de densidade da MEC
incita a migração celular e a sinalização por integrinas. Outras mudanças na MEC incluem níveis

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aumentados do proteoglicano tenascina C, comum em circunstâncias inflamatórias e que
promove a angiogénse e a sobre-regulação das MMPs e infra-regulação dos seus inibidores.

Angiogénese: Os tumores adquirem o seu suprimento sanguíneo pela indução da


angiogénese, corrompendo vias normalmente associadas à cicatrização tecidual. Sinais centrais
para a angiogénese incluem o VEGF, o PDGF, os FGFs, a IL-8 e a angiopoietina.

A via PI3K-Akt regula a angiogénese através do aumento do HIF1, que facilita a síntese e a
secreção de VEGF pelas células cancerosas. Após ser secretado, o VEGF necessita da actividade
de MMPs produzidas por monócitos e macrófagos associados ao tumor para ser libertado da
MEC onde fica sequestrado. A proteína VHL (von Hippel-Lindau) promove a degradação
ubiquitina dependente do HIF1 e restringe a sua tradução em normoxia. Funciona como
supressora tumoral e a inactivação do gene que a codifica é comum em cancros. Factores
inibitórios da angiogénese como a Tsp1 (trombospondina) são reprimidos pela Ras, pela Src e
pelo Myc.

Inflamação: As células inflamatórias são recrutadas por quimiocinas secretadas pelas células
tumorais e estromais e secretam moléculas que promovem a proliferação tumoral, a
sobrevivência e a migração, o que recapitula, em termos gerais, o processo cicatricial. A
sinalização via NF-kB promove a sobrevivência e proliferação e estimula a produção de citocinas
como o TNF. A actividade desta via está aumentada em muitos cancros, maioritariamente pelo
aumento da produção de citocinas pelas células inflamatórias.

Para além de citocinas, as células inflamatórias também secretam factores de crescimento


(ex: EGF, FGF), importantes na sinalização Ras-ERK e PI3K-Akt. Estas vias, reciprocamente,
aumentam a produção de CSF1 (colony-stimulating factor 1), estimulando os macrófagos a
produzirem mais EGF. As células imunes produzem ainda VEGF e MMPs.

Todos estes factores participam em loops parácrinos que sustêm a inflamação crónica e
promovem o crescimento e progressão tumoral. Adicionalmente, as bactérias que residem no
microambiente tumoral podem libertar produtos pró-inflamatórios que estimulem a infiltração
por células imunes.

Fibroblastos associados ao Cancro: A libertação de sinais como o TGFβ e o PDGF pelos


macrófagos e pelas células cancerosas activa os fibroblastos que libertam EGF, HGF, IGF e
quimiocinas que activam vias como a Ras-ERK e a PI3K-Akt nas células cancerosas, gerando
loops de feedback positivos que amplificam o processo. Os fibroblastos associados ao tumor
também influenciam a composição da MEC em carcinomas avançados.

Conclusões: As características distintivas das células cancerosas têm subjacente a


desregulação das vias de transdução de sinal celulares. Esta descompensação não afecta só as
próprias células cancerosas, mas uma rede mais extensa de sinalização que envolve células não
cancerosas, a MEC e os vasos. De facto, o cancro metastático pode ser considerado uma doença
sistémica.

Inibidores farmacológicos e anticorpos que tenham como alvo as proteínas sinalizadoras


mutadas no cancro ou proteínas a jusante destas têm sido desenvolvidos. Exemplos: inibidores

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
da TK não receptora Abl (leucemia mieloide crónica), do RTK ErbB2 (cancro da mama), do B-Raf
(melanoma), do EGFR e da cinase ALK (NSCLC). Efectivamente, os componentes de vias como a
Ras-ERK e a Akt-PI3K, que controlam muitas características das células cancerosas em
simultâneo, parecem ser bons alvos para as novas abordagens terapêuticas.

A complexidade da rede de sinalização das células cancerosas complica os esforços neste


sentido. A eficácia deste tipo de terapêutica dirigida pode estar limitada pelas respostas
adaptativas à inibição das mutações “driver” – perda de inibição por feedback ou indução de
vias de stress. Adicionalmente, o microambiente tumoral pode estimular vias alternativas que
sustenham a viabilidade celular apesar da inibição das vias alvo - há redundância de vias e
“crosstalk” entre as vias. Ainda podem existir células tumorais que expressem variantes de
proteínas resistentes ou que contenham mutações que ultrapassem a dependência da via alvo
ou que activem vias de resistência intrínseca. Face à heterogeneidade genética intratumoral,
a esperança centra-se nas terapias de combinação que podem aumentar a eficácia das terapias
dirigidas.

140
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
PRIMARY TUMOR, MICROMETASTASES
AND RELAPSE

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Benign and Malignant Diseases of the Prostate –
Prostate Cancer
As alterações benignas e malignas na próstata aumentam com a idade. Na 8ª década mais de
90% dos homens apresenta alterações hiperplásicas e mais de 70% possui alterações com algum
grau de malignidade. Como estes pacientes apresentam outras causas de morbilidade o
tratamento deve ser ponderado em função dos sintomas e do risco que as alterações
representam para o indivíduo. As condições benignas estão associadas com poliúria, infecções
e possível obstrução uretral. As condições malignas podem ser letais.

Anatomia: A próstata é composta de glândulas túbulo-alveolares ramificadas rodeadas de


estroma fibromuscular. O PSA (prostate-specific antigen) e a PAP (prostatic acid phosphatase)
são produzidos pelas células epiteliais. Quer as células epiteliais quer as células estromais
expressam ARs e dependem de androgénios para o seu crescimento. A testosterona é
convertida pela enzima 5α-redutase a DHT na glândula. A porção peri-uretral da glândula
aumenta de tamanho durante a puberdade e a partir dos 55 anos devido ao crescimento de
células não malignas na zona de transição que envolve a uretra. A maioria dos cancros
desenvolve-se na zona periférica e esta localização permite a sua palpação durante o exame do
toque rectal.

Cancro da próstata: O número absoluto de mortes devido a cancro da próstata tem vindo a
aumentar, o que é atribuível ao uso generalizado das estratégias de detecção baseadas no PSA.
O benefício do rastreio em termos de sobrevivência não é óbvio. Embora 1 em cada 6 homens
venha, em média, a ser diagnosticado e a doença seja a segunda causa de morte por cancro
entre os homens, apenas 1 em 30 homens com cancro da próstata morrerá dessa doença.

Epidemiologia: Os estudos epidemiológicos revelam duplicação do risco se um familiar de 1º


grau for afectado e quadruplicação se 2 ou mais familiares forem afectados. Cerca de 40% dos
cancros que se estabelecem precocemente e 5 a 10% de todos os cancros da próstata devem
ser hereditários. Os afro-americanos têm maior incidência de cancro da próstata e os seus
tumores são de pior prognóstico do que os caucasianos (variantes polimórficas do AR, do
CYPC17A1, da 5α-redutase). A incidência da doença clínica varia a nível mundial, sugerindo a
influência de factores ambientais e da dieta (ácido α-linoleico, hidrocarbonos aromáticos
policíclicos). Não existem, de momento, fármacos ou suplementos dietários disponíveis para a
prevenção do cancro da próstata.

O Modelo de Estadiamento Clínico: Para faciltar a monitorização definem-se estádios


clínicos com base no estabelecimento ou não de diagnóstico, na presença ou não de metástases
detectáveis e nos níveis circulantes de testosterona. Em cada avaliação, a decisão de oferecer
tratamento e qual o tipo de tratamento é baseada no risco representado pelo cancro
relativamente às causas de mortalidade em competição no indivíduo. O tempo de permanência
no mesmo estádio fornece uma ideia da eficácia duma determinada intervenção. Por exemplo,
um paciente com cancro da próstata localizado que é submetido a uma prostatectomia radical
permanece no estádio de doença localizada enquanto os níveis de PSA se manterem
indetectáveis. O modelo de estadiamento clínico permite distinguir entre a cura, o objectivo

142
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terapêutico primário e o controlo do cancro, nomeadamente o controlo dos sintomas até que o
paciente faleça por outra causa.

Rastreio e Diagnóstico: A necessidade de despistar o diagnóstico de cancro da próstata é


invocada pelo aparecimento de sintomas urogenitais, por um exame digital rectal anormal (os
carcinomas são duros, nodulares e irregulares) ou por uma elevação sérica dos níveis de PSA.

O PSA (kallikrein-related peptidase 3, KLK3) é uma serina protease que causa liquefacção do
coágulo seminal. É produzida por células epiteliais malignas e não malignas – é específica da
próstata e não do cancro da próstata. Os níveis séricos também podem aumentar como
consequência de prostatite ou de HBP. A realização de uma biópsia prostática pode aumentar
até dez vezes os níveis de PSA, durante 8 a 10 semanas. O PSA circulante é inactivo e está sob
a forma de um complexo com o inibidor de protaase α1-antiquimotripsina (t1/2= 1-2 sem) ou
sob a forma livre (rapidamente eliminada por filtração glomerular, t1/2= 12-18h). A coloração
imunohistoquímica para o PSA pode ser utilizada para estabelecer o diagnóstico de cancro da
próstata.

Mais de 70-80% dos novos casos detectados graças ao teste do PSA são confinados à
próstata. O nível de PSA no sangue está fortemente correlacionado com o risco e o prognóstico
de cancro da próstata. A maioria dos cancros mortais (90%) ocorre em homens com níveis de
PSA superiores a 2 ng/mL. É controversa a realização de rastreio, uma vez que o prejuízo do
sobre-diagnóstico e do sobre-tratamento pode exceder os benefícios em termos de redução da
mortalidade. O valor cut-off para a recomendação duma biópsia prostática com intuito
diagnóstico é o PSA igual ou superior a 4 ng/mL. A maioria dos homens que se enquadram neste
grupo não possui evidência histológica de cancro da próstata na biópsia. Para além disso,
homens com valores de PSA inferiores têm, de facto, células cancerosas. Não há nenhum nível
de PSA abaixo do qual o risco de cancro da próstata seja zero. Actualmente, o objectivo é
aumentar a sensibilidade do teste para pacientes mais jovens que têm maior probabilidade de
falecer devido a esta doença e reduzir a frequência de detecção de cancros de baixo potencial
maligno em homens mais idosos que têm maior probabilidade de morrer devido a outras causas.

Biópsia prostática - A agulha de biópsia é guiada por imagem (US transrectal ou RM), de
forma a assegurar que são colhidas amostras de todas as áreas da glândula. Homens com PSA
anormal e biópsia negativa são aconselhados a repetir a biópsia. Mais de 95% dos cancros
identificados são adenocarcinomas. Os restantes são cancros escamosos ou das células
transicionais ou, raramente, carcinosarcomas. Metástases prostáticas são raras, mas podem
ocorrer por extensão directa de cancros do cólon ou das células de transição da bexiga. Depois
de diagnosticado, o cancro da próstata é avaliado em termos de agressividade histológica
recorrendo ao sistema de graduação de Gleason no qual o padrão histológico glandular
dominante e secundário são pontuados de 1 (bem diferenciado) a 5 (indiferenciado). A área
pior diferenciada, à qual corresponde o grau histológico mais elevado, determina
frequentemente o comportamento biológico do tumor.

Estadiamento do Cancro da Próstata: O sistema TNM inclui cancros identificados apenas


com base no PSA anormal (T1c), cancros palpáveis mas clinicamente confinados à glândula
prostática (T2) e os que têm extensão extra-prostática (T3 e T4).

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Tratamento

Cancro da Próstata Localizado: Os pacientes com cancro da próstata não metastático são
submetidos a prostatectomia radical ou a radioterapia ou a vigilância activa. A escolha da
terapia tem de considerar a presença de sintomas, a probabilidade de o tumor não tratado
afectar a qualidade de vida ou a sobrevivência do paciente e a probabilidade de o tumor ser
curável com terapia local ou de requerer concomitantemente terapia sistémica.

A sobrevivência sem recaídas nos níveis de PSA é utilizada para medir o sucesso terapêutico.
Os níveis de PSA devem ser indetectáveis 6 semanas após a prostatectomia. Após a
radioterapia o PSA continua a ser detectável porque as células não malignas continuam a
produzi-lo mesmo que todas as células cancerosas tenham sido eliminadas. Os níveis de PSA em
pacientes monitorizados por vigilância clínica deverão continuar a aumentar na ausência de
tratamento.

Quanto mais avançada a doença, menor a probabilidade de se atingir o controlo local e


maior a probabilidade de haver uma recaída sistémica. Têm sido desenvolvidos nomogramas
para averiguar o risco e guiar a opção terapêutica. Estes modelos prognósticos englobam o
estadiamento clínico, o score de Gleason e o nível de PSA baseline.

Os efeitos adversos relacionados com o tratamento mais importantes são a incontinência, a


impotência sexual e disfunções intestinais. O objectivo da prostatectomia radical é a excisão
do cancro completo com margens limpas, com a manutenção do esfíncter uretral externo e dos
nervos autonómicos que controlam a potência sexual. O procedimento é recomendado para
pacientes com mais de 10 anos de esperança de vida e é efectuado via retropúbica, perineal ou
laparoscópica. A terapia hormonal neoadjuvante não está recomendada, uma vez que não há
benefícios em termos de sobrevivência livre de recaídas nos valores do PSA. A radioterapia pode
ser administrada por uma fonte externa ou por fontes radioactivas implantadas na glândula
(braquiterapia). A falência terapêutica é considerada quando há uma subida do PSA igual ou
superior a 2 ng/mL em relação ao nível mais baixo atingido. A dose de radiação é crítica para a
erradicação do cancro da próstata. A radioterapia com fonte externa está associada com maior
número de complicações intestinais (diarreia, proctite) do que a cirurgia. A vigilância activa
consiste na monitorização da doença em intervalos fixos através de exame digital rectal,
medições do PSA e biópsias prostáticas até que mudanças histopatológicas ou serológicas
correlacionadas com a progressão tumoral requeiram tratamento com intenção curativa. As
preocupações em relação a esta abordagem incluem a capacidade limitada de previsão com

144
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base nas biópsias por agulha e a possibilidade de se perderem oportunidades para curar a
doença. Os pacientes cuja única manifestação da doença após cirurgia ou radioterapia é a
elevação dos níveis de PSA têm de ser reavaliados de forma a discernir a fonte desse aumento
– doença persistente no local primário, doença sistémica ou ambas. Em teoria, a doença
confinada ao local primário pode ser curável por tratamento local adicional. A radioterapia
adjuvante após prostatectomia não é recomendada se o PSA estiver persistentemente elevado
após a cirurgia, o que indica que a doença está disseminada e não deve ser passível de ser
controlada com terapia local. A subida do PSA após cirurgia ou radioterapia pode indicar doença
micrometastática subclínica com ou sem recorrência local. O tratamento depende da
probabilidade estimada de o paciente desenvolver doença metastática clínica. Como tal, a
terapia imediata não é necessariamente requerida. Quando o tempo de duplicação dos valores
de PSA é inferior a 12 meses o tratamento costuma ser aconselhado, uma vez que esta
observação tem valor prognóstico em termos de sobrevivência.

Doença Metastática: Os pacientes com cancro da próstata metastático não castrado têm
níveis de testosterona superiores a 150 ng/dL. São pacientes recém-diagnosticados ou que
apresentam recorrência após tratamento da doença localizada. Os sintomas da doença
metastática incluem dores ósseas e outros relacionados com o compromisso da medula óssea,
com a compressão da medula espinal ou coagulopatias.

O tratamento standart envolve a deplecção/diminuição dos níveis de androgénios medica


ou cirurgicamente e/ou o bloqueio da ligação dos androgénios ao AR utilizando anti-
androgénios.

A orquiectomia cirúrgica é o gold standart mas raramente é realizada devido à


disponibilidade de agentes terapêuticos efectivos e ao uso generalizado de hormonas de forma
intermitente.

Os agentes que conduzem à diminuição dos níveis de testosterona incluem


agonistas/antagonistas da GnRH, inibidores do CYP17, inibidores da 17,20-liase, estrogénios e
progesterona. Os análogos GnRH (acetato leuprolide, acetato goserelin) produzem uma
elevação inicial na LH e na FSH (pode traduzir-se numa acentuação da doença, havendo
contraindicação em pacientes muito sintomáticos), seguida de infraregulação dos receptores
hipofisários de GnRH, o que culmina na castração clínica. Com os antagonistas da GnRH
(degarelix) consegue alcançar-se a castração em 48 horas sem a subida inicial dos níveis de
testosterona. Os estrogénios (DES) raramente são utilizados devido ao risco de complicações
cardiovasculares (retenção de fluidos, flebite, eventos embólicos). Em monoterapia, a
progesterona é menos eficaz. No conjunto, estes agentes estão relacionados com a síndrome
de deplecção de androgénios que se manifesta por afrontamentos, fraqueza, fadiga, perda de
libido, impotência, sarcopénia, anemia, mudanças de personalidade e depressão. Mudanças no
perfil lipídico, obesidade e resistência à insulina também podem ocorrer, aumentando o risco
de desenvolver diabetes e doenças cardiovasculares. A diminuição da densidade óssea é outro
efeito adverso possível.

Os anti-androgénios não esteroides de 1ª geração (flutamide, bicalutamide, nilutamide)


bloqueiam o reconhecimento de ligando pelo AR e foram inicialmente aprovados para evitar o
pico sintomático associado ao início da terapêutica com agonistas da GnRH. Quando

145
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administrados isoladamente, os níveis de testosterona são maiores do que os obtidos com a
administração dos agentes que diminuem a testosterona, mas os efeitos adversos são muito
menores. Apesar do impacto positivo na qualidade de vida, os outcomes específicos no cancro
são piores. O bloqueio androgénico combinado não demonstra ser superior a monoterapias de
deplecção de androgénios, não sendo recomendado. Na prática, os pacientes tratados com
agonistas da GnRH recebem um anti-androgénio nas primeiras 2 a 4 semanas para prevenir
crises sintomáticas.

A IADT (Intermittent Androgen Deprivation Therapy) utiliza hormonas numa abordagem “on
and off”, com o objectivo de previnir a selecção de céulas resistentes à deplecção de
androgénios e de reduzir os efeitos colaterais. Permitindo que os níveis de testosterona
endógenos subam, as células que sobreviveram à privação de androgénios seguirão vias de
diferenciação normais, proliferando na presença de androgénios e mantendo a sensibilidade a
uma privação de androgénios subsequente. Assim, diminui-se a probabilidade de se desenvolver
um estado resistente à castração. Clinicamente, a privação de androgénios é continuada por 2
a 6 meses até ao ponto de resposta máxima, interrompendo-se o tratamento e permitindo a
subida dos níveis de testosterona endógenos com simultânea redução de sintomas associados
ao tratamento. Os níveis de PSA também aumentam e reinicia-se o tratamento. Múltiplos ciclos
de regressão e proliferação ocorrem. Esta terapia parece ser melhor tolerada.

Os outcomes das várias estratégias de deplecção ou bloqueio de androgénios são previsíveis:


à resposta inicial segue-se um período de estabilidade (células dormentes, não proliferativas) e
finalmente, um aumento do PSA e crescimento do tumor como uma lesão resistente à
castração, que costuma ser letal. A deplecção de androgénios não é curativa porque as células
que sobrevivem à castração estão presentes no momento do diagnóstico. As guidelines da
American Society of Clinical Oncology não suportam o início imediato da terapia adjuvante após
a cirurgia ou radioterapia do tumor primário, devendo aguardar-se pela recaída bioquímica
(níveis de PSA), pela detecção da doença metastática ou pelo aparecimento de sintomas.

O CRPC (castration-resistant prostate cancer) é definido como a doença que progride apesar
da supressão de androgénios recorrendo a terapias médicas ou cirúrgicas (níveis de
testosterona iguais ou inferiores a 50 ng/dL). O aumento do PSA indica a actividade do eixo de
sinalização iniciado pelo AR, o produto de uma série de alterações oncogénicas que incluem a
sobrexpressão de enzimas envolvidas na biossíntese de androgénios, levando ao aumento dos
androgénios intra-tumorais e a sobrexpressão do próprio AR, permitindo a sinalização na
presença de níveis baixos de androgénios. A maioria dos casos de CRPC não é hormono-
refractário. No CRPC podem ou não existir alterações imagiológicas bem como sintomas da
doença. Até 2009, o docetaxel era o único agente sistémico que prolongava a sobrevida. Desde
então, seis agentes foram aprovados. O sipuleucel-T consiste em células apresentadoras de
antigénio activadas ex vivo, carregadas com antigénio e reinfundidas no paciente. O cabazitaxel
é um taxano. O acetado de abiraterona é um inibidor do CYP17 que diminui os níveis de
androgénios no tumor, nas glândulas supra-renais e nos testículos. O enzalutamide é um anti-
androgénio de 2ª geração que têm maior afinidade de ligação ao AR e que tem a particularidade
de inibir a translocação nuclear e a ligação ao DNA do complexo do receptor. O alfaradin é um
radioisótopo com utilidade e benefício em termos de sobrevivência em pacientes com sintomas

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de doença óssea. Os bifosfonatos e o inibidor do RANK-L denosumab minorizam o impacto da
osteoporose consequente à deplecção de androgénios.

Anexo – TMN:

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Origins of Metastatic Traits
Os tumores podem libertar um grande número de células para a circulação mas uma
pequena fracção sobrevive infiltrando órgãos distantes e uma fracção ainda menor consegue
formar metástases clinicamente detectáveis.

As bases moleculares e evolucionárias da biologicamente complexa cascata metastática


estão a ser estudadas em modelos experimentais animais e em investigações clínicas. A melhoria
das técnicas de sequenciação genómica tem facilitado a análise das relações clonais entre os
tumores primários e as lesões secundárias provenientes de amostras clínicas. Algumas
assinaturas génicas preditivas e alguns mediadores do processo de metastização têm sido
identificados. Porém, o modo de aquisição destes traços pelas células cancerosas ainda está
por elucidar.

Early Ideas: A visão clássica da progressão tumoral baseada na teoria da evolução clonal
(darwiniana) assume que a capacidade metastática é conferida por mutações aleatórias raras
nas células do tumor primário que permitem a sua selecção e expansão clonal em órgãos
secundários. De facto, a metastização é um processo raro, mas que segue padrões previsíveis,
sugestivos da existência de mutações específicas subjacentes. Identificar estas mutações driver
ainda não foi possível. A evidência de que o modelo da selecção clonal não era suficiente para
explicar a progressão metastática emergiu com o advento das técnicas de avaliação do
transcriptoma e sua aplicação a amostras tumorais. A probabilidade de metastização em muitos
tipos de cancro pode ser prevista pelo perfil de expressão génica dos tumores primários,
apontando para a existência duma fracção significativa de células cancerosas na população
tumoral com traços predisponentes para a metastização. As metástases podem ser o outcome
das mesmas forças oncogénicas que impulsionaram a emergência dos tumores primários. No
entanto, a visão evolucionária não pode ser verdadeiramente rejeitada. As metástases são o
resultado duma forte pressão selectiva imposta pelos diferentes microambientes – hipótese
“seed and soil” (Paget).

Metastasis Steps: A formação de metástases clinicamente detectáveis é o produto de uma


série de eventos estocásticos que permitiram que as células cancerosas dispersassem,
sobrevivessem e proliferassem em locais distantes. Este processo engloba etapas de migração
celular, invasão local, intravasamento, extravasamento e colonização. Este último passo é
altamente complexo e exigente – requer a sobrevivência após contacto com o tecido, a
formação de micrometástases, a adopção de estados de latência (até décadas), a reactivação do
crescimento, o apoderamento do tecido hospedeiro e até a reentrada em circulação e formação
de lesões terciárias no mesmo ou em diferentes órgãos. A visão destas etapas como fenómenos
biológicos ordenados é útil para a dissecção mecanística da progressão metastática.

Metastasis Bottlenecks: Biologicamente, a metastização é um processo altamente


ineficiente. Diariamente, os tumores agressivos colocam em circulação milhares de células -
circulating tumor cells (CTCs). Esta etapa, que compreende a aquisição de motilidade e
capacidade invasiva pelas células cancerosas bem como um conjunto de interacções estromais
complexas, é mais fácil do que as seguintes. A probabilidade de formação de uma colónia
metastática por uma célula proveniente dum cancro agressivo é ínfima – a maior parte das
células que abandona o tumor morre e isso costuma acontecer quando as células cancerosas

148
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infiltram órgãos alvo. A compatibilidade metastática dos tecidos proposta pela hipótese “seed
and soil” é relativa. Para as células cancerosas o melhor solo é um solo quase morto. O stress de
atravessar as barreiras endoteliais, a falta de sinais de sobrevivência e dum estroma de suporte
no tecido alvo e a exposição aos ataques da imunidade inata são desafios que as células
cancerosas têm de enfrentar. Estas barreiras à progressão metastática são clinicamente as mais
relevantes, porque etapas anteriores desta progressão já ocorreram muitas vezes no momento
do diagnóstico. A identificação dos mecanismos naturais que eliminam as células cancerosas
disseminadas pode facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que previnam ou
combatam as metástases.

A disseminação não é um
passo limitante. O atingimento
de capilares dum órgão distante
pode acontecer em segundos
após o intravasamento e o
extravasamento para o
parênquima desse órgão pode
ocorrer em horas. A latência, no
entanto, pode durar décadas.

A passagem por cada um


dos “bottlenecks” requer funções
autónomas especializadas da
própria célula e corrupção de
componentes do estroma do
tecido alvo.

Metastatic Latency: A latência metastática é definida clinicamente como o período


compreendido entre o momento do diagnóstico do tumor primário e a emergência de lesões
metastáticas detectáveis. A nível biológico a latência refere-se aos vários estados que as células
cancerosas disseminadas podem adoptar durante o período indolente. Incluem estados de
dormência (paragem de crescimento) de células solitárias ou micrometástasses ou estados de
stemness (crescimento micometastático não produtivo, com proliferação contrabalançada com
morte e perda celular). Estes estados podem coexistir.

A progressão metastática varia dramaticamente entre os vários tipos de tumor e entre


pacientes (exemplo: glioblastomas metastizam raramente e meduloblastomas metastizam com
frequência; nos cancros do pâncreas e do pulmão é frequente existir doença metastática no
momento do diagnóstico, ao contrário dos cancros da mama e da próstata). Existem mesmo
tumores que metastizam de forma tão insidiosa que o cancro diagnosticado é de fonte primária
desconhecida. Conhecer os padrões temporais da sequência tumor primário→ metástase
latente→ metástase clínica com base na observação clínica é difícil – pode-se pensar que um
tumor, como o adenocarcinoma pancreático, metastiza precocemente pois encontram-se
metástases no momento do diagnóstico, quando, de facto, o diagnóstico é que é atrasado. Ainda
assim, sabe-se que cancros da mama ER+ e cancros da próstata estão associados com longos
períodos de latência entre a ressecção do tumor primário e o desenvolvimento de metástases,
o que indica que as células cancerosas estão disseminadas muito antes de adquirirem
capacidade de colonização.

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Metastasis Organ Tropism: Os tumores sólidos apresentam grande variação nos padrões de
metastização. Alguns metastizam num órgão em particular (exemplos: cancros da próstata no
osso, melanomas oculares no fígado, sarcomas no pulmão) e outros em múltiplos órgãos
(exemplos: cancros da mama TN, melanomas da pele, cancros do pulmão, carcinomas renais).

A configuração da circulação sanguínea pode dirigir as células para um determinado órgão


(exemplo: a circulação mesentérica dirige as células do cancro colo-rectal para o fígado). Outro
aspecto referente à arquitectura vascular é o facto de o endotélio fenestrado da medula óssea
e os capilares hepáticos serem mais permissivos que os capilares contínuos de outros órgãos
como o cérebro.

A capacidade das CTCs passarem a barreira endotelial pode, portanto, influenciar o tropismo
metastático de certos tumores. A capacidade de as células cancerosas sobreviverem no
microambiente dos órgãos distantes também é crítica para o sucesso metastático. Há genes
que codificam mediadores da etapa de estravasamento e cuja expressão se associa a aumento
da acumulação de células cancerosas nos órgãos susceptíveis. Da mesma forma, existem
mediadores da sobrevivência das células cancerosas nos órgãos distantes e cuja expressão está
contemplada nas assinaturas metastáticas com valor preditivo.

Outras condições determinam a capacidade das micrometástases evoluírem para


macrometástases. As células cancerosas disseminadas dependem de componentes do estroma
(exemplo: acção dos osteoclastos nas metástases osteolíticas; acção dos astrócitos nas
metástases do parênquima cerebral). Estes traços podem ser evidenciados meses a décadas
após o atingimento do parênquima órgão, quando as células disseminadas emergem do estado
de latência e iniciam o crescimento agressivo. Por isso, tanto os determinantes do “seeding”
metastático como os da colonização evidente condicionam os padrões de tropismo
metastático de cada tipo de cancro.

Os avanços terapêuticos têm prolongado a vida dos pacientes com doença metastática e
isso tem impacto nos padrões metastáticos de alguns tipos de cancro (por exemplo, o aumento
de incidência de metástases cerebrais em cancros da mama HER2+ é atribuível ao facto de os
agentes disponíveis serem efectivos no controlo das metástases extra-cranianas). Assim,
diferenças de sensibilidade à terapêutica constituem mais um determinante dos padrões de
metastização.

Clonal Evolution and Tumor Heterogeneity Genetic Analysis of Human Cancer: Os cancros
surgem através de ciclos sucessivos de mutações e selecção clonal. Um modelo genético
clássico da progressão tumoral em humanos é o do cancro colo-rectal – progressão adenoma-

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carcinoma (inaugurada pela mutação no gene gatekeeper APC e seguida de mutações no K-Ras,
no TP53, no SMAD4, no PIK3CA, no TGFBR2, entre outras). Com base nestas observações,
pondera-se que outras alterações genéticas estejam relacionadas com a progressão
metastática.

A sequenciação do exoma de amostras tumorais e a comparação dos tumores primários com


as respectivas metástases não encontrou mutações nas células de cancro colo-rectal que fossem
específica e recorrentemente associadas com as metástases. Portanto, o tempo entre decorrido
entre a iniciação tumoral (aparecimento de percursores pré-malignos) e a emergência de um
carcinoma invasivo excede o tempo necessário para o desenvolvimento de uma metástase.
Adicionalmente, os modelos matemáticos da evolução tumoral baseados nos dados genéticos
sugerem que a vantagem selectiva conferida por uma mutação driver individualmente é de
0,4%. Em vez de existirem mutações específicas de metástases as alterações são comuns às que
ocorrem nos tumores primários. No entanto, embora não tenham sido descritas mutações
driver específicas das metástases, os clones celulares metastáticos não representam a
população tumoral primária como um todo, mas apenas subpopulações. Além disso,
diferentes clones metastáticos podem diferir na sua capacidade de colonizar órgãos específicos
(ou seja, metástases em dois órgãos diferentes não descendem imperativamente do mesmo
clone da população tumoral primária). Quanto mais longo o período entre a emergência dum
tumor primário e a emergência de metástases distantes, mais provável será que os clones
metastáticos possuam alterações genéticas próprias. A pressão adaptativa em combinação
com o genoma instável das células cancerosas justificam este achado.

Lessons from Mouse Models: Investigações recentes sugerem forte impacto de eventos não
genéticos na probabilidade de metastização hepática do cancro colo-rectal. As células de
cancro colo-rectal que se tornaram insensíveis ao TGF-β por inactivação genética da sua via de
sinalização podem sobrexpressar esta citocina, que favorece a metastização hepática pela
indução da secreção de IL-11, uma citocina pró-sobrevivência, pelos fibroblastos. Esta
sobrexpressão pode envolver reguladores epigenómicos da produção de TGF-β. A inactivação
da expressão do SMAD4, que normalmente activa a via supressora tumoral do TGF-β, parece ser
um evento crítico para o desenvolvimento de cancros da próstata avançados com capacidade
de metastizar. Estas e outras evidências salientam importantes vias como mediadoras da
progressão tumoral e metastática mas não corroboram a existência de alterações genéticas
restritas às metástases. Uma excepção é resultado da inserção de mutações via transposões no
meduloblastoma: algumas mutações promoveram a metastização das leptomeninges.

Em alguns modelos de ratinho a disseminação de células cancerosas é observada mesmo


antes de os tumores primários se tornarem declaradamente invasivos. Até células estaminais
não transformadas, quando colocadas em circulação podem infiltrar os pulmões e sobreviver
durante períodos consideráveis. Existe a possibilidade de que as células cancerosas que
disseminam precocemente evoluam independentemente de e em paralelo com as células
cancerosas no tumor primário, mas não se sabe se chegam a formar metástases detectáveis.

Amplifying Oncogenic Signaling: Os clones com propensão metastática emergem sob


pressão selectiva quer devido a alterações genéticas que detenham, quer amplificando as vias
de sinalização que já estão activas no tumor primário. Neste último modelo, a capacidade
metastática é função da amplitude de sinalização de certas vias oncogénicas. Nos cancros da

151
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mama TN já estão identificados genes pró-metastáticos (VCAM-1, Src, TNC, POSTN) que
amplificam vias de sinalização de sobrevivência (PI3K-Akt) e de estaminalidade (Notch, Wnt) já
selecionadas no tumor primário. As células metastáticas precisam de optimizar o output das
vias intracelulares críticas antes de se aventurarem no processo de metastização. O nível de
actividade destas vias providenciado pelos eventos oncogénicos precoces pode ter permitido a
progressão local do tumor, mas em locais metastáticos onde os sinais tróficos são limitados, a
amplificação de sinal é requerida para a sobrevivência celular.

Expanding the Output of Oncogenic Pathways: O envolvimento das vias de sinalização


oncogénicas na cascata metastática não está limitado aos ganhos quantitativos em termos de
transmissão de sinais de estaminalidade e sobrevivência. O espectro de genes alvo de um
programa transcripcional também pode ser submetido a modulação qualitativa através de
alterações na estrutura da cromatina e, consequentemente, da acessibilidade dos loci alvo. No
contexto da progressão metastática tal modulação representa a expansão do output duma via
oncogénica já activada, permitindo a expressão de fenótipos metastáticos para além de
funções tumorigénicas básicas. Só assim se explora plenamente o potencial maligno das vias,
que providencia vantagem metastática.

Sources of Influence: Germline, Plasticity, Stroma, and Therapy: Os traços metastáticos


ainda são influenciados por diversos aspectos.

Variantes germline condicionam a predisposição para o aparecimento de cancro, mas


podem também afectar a progressão tumoral, isto é, existe um componente hereditável que
influencia a progressão metastática e consequentemente o prognóstico.

Além disso, a capacidade de as células tumorais adoptarem mudanças fenotípicas,


nomeadamente um fenótipo stem-like, auxilia o sucesso da progressão metastática. Há
citocinas que induzem a reactivação de programas de desenvolvimento de EMT,
providenciando simultaneamente várias características pró-metastáticas, como a
estaminalidade, a motilidade e a resistência à terapêutica. Contudo, o papel dos reguladores
transcripcionais indutores de EMT é ambíguo: podem promover ou inibir a colonização
metastática. As lesões metastáticas apresentam características epiteliais, o que implica que o
benefício da EMT para a disseminação das células cancerosas seja transitório e que deva
ocorrer uma MET no sítio metastático.

Outro interveniente activo no processo de metastização é o estroma não neoplásico. Os


efeitos das interacções com as células cancerosas podem ser pró ou anti-tumorigéicos. A
modulação da progressão do tumor primário e da metastização pode ser atingida com recurso
a loops de sinalização desde justácrina a sistémica. Estes sinais não são produzidos
exclusivamente pelas células estromais, mas também por condições ambientais como a hipoxia.
Os sinais estromais também intervêm na atracção (“seeding”) das células metastáticas em
circulação, favorecendo a expansão clonal. Para além destas interacções reactivas e reversíveis,
o estroma altera as pressões selectivas locais, podendo conduzir à selecção de células com
potencial metastático significativo. Por exemplo, muitas das células estromais associadas aos
tumores têm origem na medula óssea e secretam factores solúveis como o CXCL12 e o IGF1. Os
clones tumorais que evoluem sob a influência de tais factores estão enriquecidos em traços

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que permitem a sobrevivência na medula óssea mesmo antes de a atingirem – “metastasis
seed preselection”.

Os cancros metastáticos e os estromas relacionados também evoluem sob pressões


terapêuticas. Há conexões entre a progressão metastática e a resistência terapêutica.

Deterministic versus Stochastic Emergence of Metastasis Clones: Mesmo os melhores


marcadores preditivos da progressão metastática só indicam uma probabilidade mais elevada
de metastização a nível do organismo. A nível celular, o grau de aleatoriedade é maior – os
tecidos de pacientes que desenvolvem lesões metastáticas letais podem ter milhares de células
micrometastáticas que nunca chegam a ser detectadas. Apesar da identificação de mediadores
moleculares que determinam o processo de metastização e conferem fenótipos metastáticos,
as metástases apresentam características estocásticas. Existem funções pró-metastáticas que
são especificamente requeridas para a colonização de órgãos particulares, o que sugere que
alterações moleculares transmissíveis, genéticas e epigenéticas, determinem a capacidade de
metastização das células cancerosas. Todavia, a natureza estocástica da progressão metastática
não deixa de ser evidente:

(A) Primeiramente, a evolução tumoral é impulsionada por alterações aleatórias que aumentam a
diversidade populacional sobre a qual as pressões selectivas podem actuar. Da combinação entre o efeito do
tecido de origem e das alterações adquiridas resultam clones com fenótipo metastático e outros que não são
compatíveis. Um fenótipo que é vantajoso durante a fase inicial da tumorigénese pode não ser compatível
com a metastização.

(B) Além disso, cada fenótipo pode ser conseguido por múltiplas vias evolucionárias (conjunto de
mutações) – não existem dois clones totalmente idênticos.

(C) Finalmente, mesmo dos clones com elevada propensão metastática poucas células conseguem formar
metástases – o destino de células fenotipicamente idênticas nunca será idêntico.

A par da tendência estocástica da progressão metastática existem factores determinantes


não aleatórios neste processo como a influência selectiva dos nichos microambientais e da
inflamação sistémica impulsionada pelos tumores primários, que modula o estroma dos órgãos
distantes aumentando a colonização metastática em tecidos outrora resistentes.

153
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Conclusions and Perspective: A progressão metastática é um processo evolucionário longo.
A metastização implica a acumulação de múltiplas alterações que providenciam uma pequena
vantagem selectiva em pelo menos uma das etapas do processo. Um clone metastático
competente é o produto final raro dessas alterações genómicas e epigenómicas. Esses clones
são geneticamente distintos do tumor primário e não são necessariamente representativos.

A heterogeneidade clonal no tumor primário é a base para a selecção de células cancerosas


metastáticas. A análise genética de tumores primários e das metástases derivadas identificou
mutações associadas às metástases mas não específicas das metástases. Muitas serão
provavelmente mutações passenger, sem papel causal na progressão metastática. Portanto,
duma perspectiva genética a formação de uma metastáse é uma extensão da progressão do
tumor primário e não uma etapa distinta com determinantes mutacionais característicos.

154
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Androgen deprivation therapy: progress in
understanding mechanisms of resistance and
optimizing androgen depletion
Resumo: A terapia de privação de androgénios é fulcral no tratamento de homens com
cancro da próstata avançado, com evidência que suporta a sua utilização em doença
metastática e em conjunto com cirurgia e radioterapia em casos pontuais. A supressão
intermitente de androgénios e a terapia com estrogénios são alternativas à terapia standart com
potencial de melhorar o perfil toxicológico, mantendo o benefício clinico. As estratégias
correntes de privação de androgénios suprimem de forma incompleta os níveis de androgénios
e o nível de actividade mediada por receptores de androgénios a nível tecidular. A
compreensão dos mecanismos que resultam no cancro da próstata resistente à castração está
a levar ao desenvolvimento de terapias racionais que têm como alvo o metabolismo dos
androgénios (por exemplo, inibidores da síntese de androgénios como o acetato de abiraterona)
e o receptor de androgénios.

Introdução: O cancro da próstata é o tumor sólido mais comum e a segunda causa de morte
por cancro mais comum entre os homens nos EUA. Aproximadamente 85% dos casos de cancro
são localizados no momento do diagnóstico. As opções terapêuticas da fase precoce da doença
incluem cirurgia, radioterapia e vigilância activa. Para a doença metastática ou localizada de
alto risco, a terapia de privação de androgénios, em monoterapia ou em combinação, é
recomendada.
A testosterona (maior parte em circulação
ligada à albumina ou à SHBG) e a di-
Abordagens históricas da terapia de privação de hidrotestosterona (DHT, principal androgénio
androgénios: nos tecidos prostáticos) são os dois principais
androgénios nos homens. A testosterona é
produzida pelas células de Leydig (90-95%) e
pelas glândulas supra-renais (5-10%). A DHT é o
resultado da conversão a nível tecidular (25%
nos testículos e 75% na próstata e na pele) de
testosterona a DHT pelas duas isoformas da
enzima 5α-redutase (S5A1 e S5A2). Actualmente
crê-se que a testosterona e outros percursores
androgénicos circulantes difundam pela próstata,
com uptake pelo epitélio prostático e
subsequente conversão a DHT. O AR (androgen
receptor), membro da família de receptores das
hormonas esteroides, é activado quer pela
testosterona quer pela DHT. Esta última aumenta
10 vezes a activação da transcrição em relação à
testosterona, sendo considerada o ligando e
efector primário da sinalização mediada pelo AR.
O AR existe no citoplasma ligado a heat shock
proteins (HSPs) que o estabilizam, permitindo a
ligação a androgénios. Após activação pelo
ligando, o AR dissocia-se das HSPs, dimeriza, é
fosforilado e translocado para o núcleo, onde se
liga a androgen response elements e induz a
transcrição de genes alvo envolvidos na
regulação do ciclo celular e da proliferação. Os
androgénios têm assim, um papel crítico na
promoção do crescimento do cancro da próstata.

155
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A terapia de privação de androgénios visa reduzir a síntese testicular e os níveis circulantes.
Métodos comuns incluem a orquiectomia ou a castração médica pela administração crónica de
agonistas da GnRH. Outras abordagens incluem a terapia com estrogénios. Para monitorizar a
eficácia terapêutica mede-se o nível de testosterona circulante, devendo ser inferior a
50|ng/dl (<1.74|nmol/l). A orquiectomia reduz a testosterona circulante em 12h e associa-se a
atrofia glandular e involução da próstata. Em modelos de xenotransplantes, inicialmente a taxa
de proliferação diminui e a de apoptose aumenta com a castração cirúrgica, mas ambos os
índices normalizam após 7 a 10 dias. A utilização de agonistas da GnRH induz efeitos
semelhantes embora de forma mais gradual. Adicionalmente, a castração induz a paragem do
ciclo celular das células epiteliais em fase G0/G1. Dado que estas células podem eventualmente
ultrapassar esta paragem com a aquisição de independência de androgénios, constituem uma
população alvo para o desenvolvimento de potenciais estratégias terapêuticas que previnam a
progressão para CRPC (castration-resistant prostate cancer).

Actualmente, o uso de agonistas da GnRH é preferível A estimulação cíclica da hipófise com


GnRH leva à libertação de LH que estimula a síntese testicular de androgénios. Os agonistas da
GnRH (leuprolide, goserelin, buserelin) induzem um aumento transitório da libertação de LH,
seguido de taquifilaxia resultante duma estimulação não fisiológica e não pulsátil dos
receptores de GnRH. A administração de hormonas sexuais esteroides, como a progesterona e
os estrogénios, também suprime a libertação de LH através de inibição por feedback do eixo
hipotálamo-hipófise. Os antagonistas do AR (bicalutamide, flutamide, nilutamide) inibem a
ligação dos androgénios ao receptor. A combinação com estratégias que limitem a produção
dos ligandos é controversa, mas aparentemente benéfica.

Indicações para a terapia de privação de androgénios: A terapia de privação de androgénios


prolonga a sobrevida e produz respostas objectivas na doença metastática no osso e nos tecidos
moles, suprimindo em 80 a 90% os níveis de PSA em pacientes com doença metastática. A
resposta inicial à terapia é dramática, mas na doença metastática a terapia é considerada
paliativa (a progressão da doença ocorre dentro de 2/3 anos, com esperança de vida de 16/18
meses a partir desse momento). Cerca de 5-10% dos pacientes está vivo 10 anos após o início
da terapia. Uma abordagem standart para os indivíduos com cancro da próstata metastático
pauta-se pelo uso de um agonista da GnRH ou realização de orquiectomia como monoterapia.
Para pacientes com doença metastática sintomática, um anti-androgénio não esteroide é
usado frequentemente antes da iniciação dos agonistas da GnRH para prevenir efeitos
adversos resultantes da elevação inicial dos níveis de LH e testosterona. Nos pacientes
assintomáticos este procedimento é controverso. Há benefício demonstrado em combinar a
terapia de privação de androgénios com a radioterapia em homens com doença localmente
avançada ou de alto grau – optimiza a apoptose induzida por radiação e suprime
micrometástases sistémicas. A terapia de privação de androgénios adjuvante aumenta
claramente a sobrevivência em homens com metástases ganglionares após prostatectomia.

Toxicidade da terapia de privação de androgénios: Os efeitos adversos incluem disfunção


sexual, atrofia muscular, osteoporose, afrontamentos, fadiga, ginecomastia, anemia, depressão
e disfunção cognitiva e síndrome metabólica.

Mecanismos de resistência à terapia de privação de androgénios: Quando a progressão da


doença ocorre apesar da manutenção de níveis adequados de androgénios circulantes,

156
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considera-se que a doença é independente de androgénios ou refractária à hormona. Os
mecanismos de desenvolvimento de CRPC centram-se na existência de vias de sinalização do
AR alternativas ou invocam mecanismos verdadeiramente independentes do AR, baseados na
protecção contra a apoptose induzida pela castração. A perpetuação da sinalização activada
pelo AR pode dever-se a amplificação do AR ou a mutações que aumentam a sensibilidade à
DHT e a moléculas esteroides não androgénicas e a anti-androgénicos. Outros mecanismos
dependentes do AR englobam a activação do receptor ou dos efectores a jusante via
modificações ligando-independentes (exemplos: fosforilação do AR, crosstalk com RTKs
activados, mudanças no balanço coactivadores/correpressores). É possível que existam CSCs
AR-negativas que resistem à castração hormonal e que renovam constantemente a população
cancerosa.

Persistência de androgénios teciduais apesar da castração: Apesar dos níveis séricos de


testosterona apontaram no sentido do sucesso terapêutico, alguns pacientes mantém níveis
prostáticos de androgénios suficientes para suportar a sinalização via AR e a sobrevivência das
células cancerosas. Estudos em pacientes com cancro da próstata localizado demonstraram que
os níveis de DHT intra-prostáticos só foram reduzidos em 75-80%. A síntese tumoral de
androgénios também deve ser considerada. Evidência clínica e experimental sugere que as
enzimas do metabolismo esteroide tumoral possam suportar o CRPC.

1 – Esteroidogénese tecidual e tumoral; 2 – Mutações no AR (ligandos alternativos ou aumento da afinidade por androgénios);
3 – Amplificação do AR; 4 – Activação ligando-independente do AR (modificações ou crosstalk com outras vias); 5 – Mudanças no
balanço co-activadores/co-repressores; 6 – Vias bypass com funcionamento independente da actividade do AR (aumento das
moléculas anti-apoptóticas como a Bcl-2); 7 – Produção de clones resistentes à castração pelas células estaminais tumorais.

157
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Abordagens contemporâneas à terapia de privação de androgénios: As estratégias
alternativas que têm sido exploradas visam reduzir a toxicidade e ultrapassar os mecanismos
de resistência conhecidos.

Dados pré-clínicos sugerem que permitir a recuperação dos níveis de testosterona após um
período de privação de androgénios pode prevenir o desenvolvimento de resistência, pela
diminuição da pressão selectiva exercida sobre o crescimento tumoral nas baixas condições de
disponibilidade de androgénios – supressão intermitente de androgénios. Além disso, em
comparação com a monoterapia, esta abordagem melhora a saúde cognitiva, sexual e óssea
mantendo o controlo da doença.

Os estrogénios actuam por intermédio dum eixo de feedback negativo hipotálamo-


hipofisário, reduzindo a produção de LH. O estrogénio também activa as isoformas α
(proliferativo) e β (suprime a carcinogénese) do ER. Outra maneira de suprimir o crescimento
tumoral funda-se na competição com os androgénios pela ligação ao AR e consequente
redução da produção testicular de testosterona. Em pacientes com CRPC o estrogénio não
esteroide DES reduz os níveis circulantes de androgénios adrenais. É utilizado em cancro da
próstata avançado. Os benefícios terapêuticos são contrabalançados pelo risco de toxicidade
cardiovascular. No entanto, a toxicidade óssea, metabólica e cognitiva associada à terapia de
privação de androgénios é melhorada.

Novos horizontes para a terapia de privação de androgénios: A MDV3100 é uma pequena


molécula antagonista total do AR que inibe a sua translocação nuclear e ligação ao DNA. É
utilizada em casos de sobrexpressão do AR em que os anti-androgénios convencionais se
comportam como agonistas. Os modelos de xenotransplante demonstram diminuição do
volume da massa tumoral e estudos de fase I-II mostraram redução significativa do PSA em 13
de 14 pacientes com CRPC. O acetato de abiraterona é um inibidor específico da enzima
CYP17A1, cuja actividade é limitante para a biossíntese de androgénios. É esperado que a
inibição desta enzima, que actua em dois passos sequenciais da síntese de androgénios, suprima
a produção de androgénios em todos os órgãos endócrinos – testículos, glândulas suprarrenais
e nas massas tumorais produtoras de androgénios. Os ensaios clínicos revelam redução do nível
de PSA e melhorias sintomáticas e radiográficas. As taxas de resposta relativamente elevadas a
estes dois agentes suportam a hipótese que a síntese tumoral de androgénios e a perpetuação
da sinalização pelo AR tenham um papel crucial na patogénese do CRPC. Um agente em fase
pré clínica, o VN-124-1, combina os efeitos da inibição do CYP17A1, do antagonismo do AR e da
redução da síntese do AR. Esta combinação de efeitos pode suprimir a actividade de ligando do
AR dos percursores esteroides a montante que se acumulam quando se inibe o CYP17A1.

Conclusões: A compreensão dos mecanismos subjacentes ao CRPC tem conduzido ao


desenvolvimento de terapias racionais que têm como alvo o metabolismo dos androgénios e o
AR. A utilização de novos agentes pode prevenir o desenvolvimento e a progressão do CRPC,
melhorar a qualidade de vida e aumentar a sobrevivência.

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A Preoperative Nomogram for Disease Recurrence
Following Radical Prostatectomy for Prostate Cancer
Background: Os autores desenvolveram um nomograma que permite a previsão do risco de
recorrência da doença, com base em factores prognósticos clínicos pré-operatórios para
pacientes com cancro da próstata localizado candidatos a prostatectomia radical. Os dados
clínicos recolhidos incluem o nível de PSA pré-tratamento, o score de Gleason da biópsia e o
estadiamento clínico. A falência terapêutica foi registada quando houve evidência clínica de
recorrência da doença, quando se verificou aumento do nível sérico de PSA (duas medidas >0,4
ng/mL e aumentando) ou quando se iniciou terapêutica adjuvante. As previsões de recidiva a 5
anos com base no nomograma são precisas e discriminadoras. A relação entre a probabilidade
prevista e o outcome real é de 0,79.

Introdução: O cancro da próstata localizado é frequentemente tratado com estratégias


conservadoras, isto é, com vigilância clínica, hormonoterapia, radioterapia ou com
prostatectomia radical. Não há ensaios aleatorizados publicados que permitam uma
comparação definitiva entre o controlo da doença atingido com os vários tratamentos
alternativos. Mesmo que estes estudos existissem, nem todos os pacientes com cancro
localizado têm a mesma probabilidade de sucesso terapêutico. Há factores de prognóstico
estabelecidos para predizer o risco de recorrência após a cirurgia ou a radioterapia ou o risco de
metastização ou morte devido a cancro após a abordagem conservadora. Este estudo
desenvolveu um nomograma que prediz, antes do tratamento (prostatectomia radical), a
probabilidade de falência terapêutica.

Materiais e métodos:

 983 pacientes com cancro da próstata localizado (T1-3 NX M0);


 a dissecção dos gânglios linfáticos pélvicos foi realizada em todos os homens;
 o estadiamento patológico e as margens cirúrgicas não foram utilizados como
preditores do outcome, por não serem factores pré-operatórios;
 as variáveis clínicas selecionadas para prever a recorrência foram o nível de PSA
sérico pré-tratamento, o grau de Gleason da biópsia e o estadiamento clínico
(sistema TNM);
 a falência terapêutica foi definida como o aumento do PSA sérico pós-operatório
para níveis iguais ou superiores a 0,4 ng/mL (confirmado por uma segunda medição
superior à primeira) ou como o aparecimento de evidência de recorrência em
pacientes com níveis de PSA indetectáveis;
 os pacientes que foram tratados com hormonoterapia ou radioterapia pós-cirúrgica
foram considerados como pertencentes ao grupo da falência terapêutica;
 uma amostra de validação de 168 pacientes foi utilizada.

Resultados:

 196 pacientes enquadram-se no grupo de falência terapêutica;


 a probabilidade de sobrevivência livre de recorrência para os pacientes T1-3a NX M0
a 5 anos é de 73% e após este marco a recorrência é rara;

159
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 a probabilidade de que entre dois pacientes aleatoriamente selecionados o paciente
com o pior prognóstico com base no nomograma tenha uma recaída clínica primeiro
é de 0,74-6.

Discussão: As características clínicas do cancro da próstata foram combinadas num


nomograma para prever o estádio patológico final.

Nem todos os pacientes com doença não confinada ao órgão (por exemplo, com extensão
extracapsular ou envolvimento das vesículas seminais) vão ter recorrência da doença após
prostatectomia radical. Logo, a utilização do estádio patológico como um end point limitaria a
utilidade do nomograma para prever a probabilidade de recorrência da doença. A recorrência
do PSA, cujos níveis devem ser indetectáveis após a cirurgia, é mais apropriada para medir o
outcome final da doença. Níveis mensuráveis de PSA após a cirurgia evidenciam recorrência da
doença e podem preceder a detecção clínica da recorrência local ou distante por meses a anos.
Portanto, os níveis séricos deste marcador foram utilizados como um end point terapêutico. Há
outros modelos que combinam o PSA sérico, com o grau histológico segundo Gleason e o
estadiamento patológico. Podem ser úteis na selecção de pacientes que venham a beneficiar de
terapêutica adjuvante mas não conseguem prever o risco de recorrência no período pré-
operatório, uma vez que requerem a amostra da prostatectomia radical. Os níveis de PSA
parecem exercer muita influência, uma vez que pacientes com PSA muito elevado raramente
são considerados bons candidatos para a cirurgia. O nomograma também atribui muitos pontos
para os estádios clínicos mais avançados e para os cancros de alto grau.

Quanto às limitações deste modelo, a primeira advém de o seu desenvolvimento ter por
base uma população de pacientes que foi considerada apta para ser submetida a cirurgia, só
devendo ser aplicado a pacientes que reúnam esta condição. Este nomograma só deve ser
aplicado após tomada a decisão clínica, de modo a não a influenciar. Em segundo lugar, o
nomograma não é perfeitamente preciso e essa precisão deve situar-se perto do intervalo 0,74
(amostra do estudo) e 0,79 (amostra de validação). Os intervalos de confiança para as
probabilidades previstas também podem ser tão amplos quanto + ou – 10%. Por último, os
dados provêm de um único cirurgião (assume-se que a probabilidade de controlar o cancro após
prostatectomia radical é idêntica quando outros cirurgiões realizam a cirurgia) e da mesma
instituição, sendo que a maioria dos pacientes era caucasiano. De maneira semelhante, apenas
um patologista realizou a graduação dos tumores segundo Gleason.

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Anexo - Nomograma:

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TUMOR-HOST COMPETITION

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Crowd Control: Tumor Immunology and
Imunotherapy
Muitas defesas do organismo contra o aparecimento dum cancro são inerentes às células,
como a maquinaria apoptótica, o circuito pRb e os mecanismos de reparação do DNA. A
organização tecidual também constringe a proliferação das células cancerosas incipientes (por
exemplo, a perda de ancoragem à membrana basal activa a anoikis). Isto limita a possibilidade
de as células epiteliais saírem da sua localização normal e crescerem em locais ectópicos. Há
outra linha de defesa, o sistema imunitário, que é efectiva em eliminar agentes infeciosos
estranhos, mantendo os tecidos normais imperturbados. As células cancerosas são nativas em
relação ao hospedeiro e, em muitos aspectos, indistinguíveis das células normais, o que
dificulta a acção do sistema imunitário contra estes alvos.

O sistema imunitário destrói invasores extrínsecos (agentes infeciosos) e células anormais


(infectadas). Identifica os alvos através do reconhecimento de identidades moleculares
específicas, os antigénios, neutralizando as partículas infeciosas bem como as células
infectadas. As estratégias imunológicas envolvem dois braços de resposta.

A resposta imune humoral é o braço que gera anticorpos solúveis antigénio-específicos. As


células infectadas ou os agentes infeciosos são “coated” pelas moléculas de anticorpo –
opsonização - e são reconhecidos, internalizados e destruídos pelas células fagocíticas (ex:
macrófagos) ou mortos por células citotóxicas (ex: células NK). A capacidade de os anticorpos
reconhecerem antigénios específicos deriva de rearranjos combinatórios entre os genes que
codificam os anticorpos, permitindo gerar moléculas que possuem um número ilimitado de
sequências de reconhecimento de antigénio.

A molécula de anticorpo mais comum é


no plasma é a imunoglobulina γ (IgG). Possui
dois pockets de ligação ao antigénio,
possibilitando o reconhecimento de dois
antigénios em simultâneo. As porções de
ligação ao antigénio denominam-se domínios
variáveis e os restantes domínios são
domínios constantes, idênticos entre as
moléculas duma dada subclasse. A molécula
de anticorpo em si é um heterotetrâmero
composto de duas cadeias leves e duas
cadeias pesadas.

O outro braço envolve a resposta imune celular, em que se desenvolvem células citotóxicas
específicas que conseguem reconhecer e atacar directamente outras células que exibam certos
antigénios na sua superfície – os CTLs (cytotoxic T lymphocytes) -, não requerendo moléculas
intermediárias como os anticorpos.

O sistema imunitário é “educado” no confronto inicial com um determinado antigénio para


montar um contra-ataque vigoroso caso ocorra um segundo encontro – resposta imune
adaptativa. Concomitantemente, outras células do sistema imunitário reconhecem agentes

163
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infeciosos e células anormais de maneira espontânea e não dependente de exposição prévia
– resposta imune inata.

A resposta imune adaptativa conduz à produção de anticorpos. Quando as células


fagocíticas, como os macrófagos ou as células dendríticas, internalizam as células anormais ou
as partículas infeciosas apresentam os conteúdos ingeridos a outros componentes celulares do
sistema imunitário, como as células T, o que ocorre frequentemente nos gânglios linfáticos para
onde estas células migram após o uptake de antigénios.

Estas células apresentadoras de antigénio (APCs) digerem as partículas fagocitadas ou


endocitadas (via receptores de superfície), em vesículas citoplasmáticas especializadas, os
endossomas, fragmentando as proteínas internalizadas em pequenos oligopéptidos que são
carregados em domínios especializados de apresentação de antigénio nas moléculas de MHC II
com destino à superfície das APCs. Como os macrófagos e as células dendríticas são
especializados em utilizar as moléculas de MHC II para apresentar antigénios do ambiente são
consideradas APCs profissionais. A estrutura molecular apresentada às células T Helper é
formada pelos ectodomínios classe II e os oligopéptidos antigénicos ligados aos primeiros.
As moléculas de MHC
II migram do RE via
aparelho de Golgi para os
endossomas onde ocorre
a proteólise de partículas
potencialmente
antigénicas.

As células B só
internalizam partículas
que são reconhecidas
pelos seus anticorpos de
superfície antigénio-
específicos, enquanto as
APCs profissionais
fagocitam todo o tipo de
partículas, de forma
promíscua.

A apresentação de antigénios às células T Helper faz com que activem células B. A maturação
subsequente destas células B conduz à formação duma população de plasmócitos que secretam
activamente anticorpos para a circulação que reconhecem o antigénio particular que
impulsionou esta série de respostas.

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NOTA: Há evolução dos genes que codificam a região variável das imunoglobulinas. Isto ocorre nos
centros germinativos dos gânglios linfáticos e permite que os descendentes da célula B inicialmente
activada produzam anticorpos solúveis que tenham uma afinidade de ligação ao antigénio cada vez mais
elevada.

Este sistema opera na neutralização de


agentes infeciosos pelas moléculas de
anticorpo no espaço extracelular. Pela
mesma óptica, as células cancerosas que
exibam proteínas antigénicas distintas na
sua superfície celular também podem ser
cobertas com moléculas de anticorpo.

O ataque imune também pode ser efectuado via proteínas plasmáticas do sistema de
complemento que reconhecem a região constante das moléculas de anticorpo ligadas à
superfície da célula e incitam a formação de poros membranares que conduzem à morte celular.

Os complexos antigénio-anticorpo
podem atrair proteínas do complemento,
culminando na formação de canais
membranares adjacentes aos complexos
antigénio- anticorpo. Assim, a integridade
osmótica da membrana celular é destruída
o que conduz rapidamente a morte celular.

Finalmete, “coating” dos alvos celulares pelas moléculas de anticorpo pode levar à sua
eliminação pelas células efectoras do sistema imunitário.

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ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)

Outro tipo de resposta imune adaptativa conduz à formação de células T citotóxicas. A


resposta humoral é ineficaz contra agentes infeciosos que entraram nas células, ficando
protegidos pela membrana celular. O sistema imunitário precisa, então, de monitorizar o
interior das células, além dos conteúdos do espaço extracelular e da superfície das células. A
solução para esta necessidade é encontrada num mecanismo de apresentação de antigénio
que ocorre na grande maioria das células do organismo. Em vez de serem utilizadas para a sua
função normal, uma fracção das proteínas sintetizadas pelas células (até um terço) é
dispensada para proteassomas especializados, sendo clivadas em oligopéptidos que se ligam
às moléculas de MHC I que são transportadas para a superfície celular sob a forma de complexos
MHC-péptido. Incluem-se entre os péptidos expostos pelo MHC I os sintetizados normalmente
pelas células (apresentação contínua e rotineira) e aqueles sintetizados pelos agentes infeciosos
estranhos intracelulares, como os vírus e as bactérias.

Quase todas as células, incluindo as células cancerosas, salvaguardam uma parte das suas proteínas recém-
sintetizadas para a maquinaria de apresentação de antigénios. Os oligopéptidos gerados pelo proteassoma são
introduzidos no lúmen do RE por canais TAP onde formam complexos com moléculas de MHC I, que são
encaminhados para a superfície, onde expõem fragmentos das proteínas que estão a ser sintetizadas na célula.

Como as células possuem várias formas


variantes de proteínas MHC I com domínios de
ligação ao antigénio ligeiramente diferentes,
uma célula individual pode expor um conjunto
diverso de oligopéptidos à superfície.

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Algumas células dendríticas podem
utilizar o próprio complexo antigénio-
MHC I para apresentar os oligopéptidos
ingeridos aos percursores das CTLs e
auxiliar a sua maturação e activação –
apresentação cruzada.

A exibição de certos oligopéptidos à superfície atrai CTLs que matam as células alteradas. Isto
é o reflexo duma segunda função independente das células T Helper – a activação de células T
citotóxicas. A capacidade de as células T Helper facilitarem o desenvolvimento de respostas
imunes celulares e humorais reflecte a capacidade de subpopulações distintas secretarem
diferentes perfis de citocinas, factores imunes solúveis.

Os CTLs conseguem matar células alvo por duas vias: pela exposição das células a proteínas tóxicas contidas
em grânulos líticos citoplasmáticos, como as granzimas (clivam e activam caspases pró-apoptóticas), que são
endocitadas pelas células alvo em complexos multiproteicos que incluem perforinas (criam poros nas membranas
vesiculares, permitindo a libertação de granzimas no citosol) e pela acção do receptor de morte Fas, encontrado
à superfície de muitas células, cujo ligando, FasL, é exibido pelas CTLs e activa a via extrínseca de apoptose
(activação sequencial das caspases 8 e 3).

Os CTLs conseguem limitar a infecção viral. De facto ambas as frentes da resposta imune
adaptativa são utilizadas para esse fim: a imunidade mediada por células provoca a morte de
células infectadas e a imunidade humoral neutraliza as partículas no espaço extracelular através

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do “coating” com anticorpos. As respostas anti-virais são um meio de o sistema imunitário
bloquear o aparecimento de tumores humanos induzidos por vírus.

NOTA: Os genes que codificam as proteínas do MHC são altamente polimórficos. A racionalidade
subjacente a esta grande variabilidade inter-individual tem por base a capacidade de pelo menos alguns
indivíduos duma dada espécie serem capazes de reconhecer antigénios de novos patogéneos altamente
infeciosos, garantindo a sobrevivência da espécie como um todo e ainda a minimização de transmissão
em larga escala dum dado patogéneo levando a epidemias.

A resposta imune inata não requer sensibilização prévia. Os componentes celulares, os


imunócitos, conseguem exercer a sua função efectora sem terem sido “educados”
anteriormente. Em vez de reconhecerem antigénios específicos, as células de medeiam a
imunidade inata reconhecem padrões moleculares característicos apresentados à superfície
dos agentes infeciosos ou das células transformadas. São exemplos de componentes celulares
que auxiliam este tipo de resposta os macrófagos e os neutrófilos. As células NK têm também
um papel proeminente nesta resposta e são provavelmente protagonistas no encontro inicial
do sistema imunitário com as células cancerosas. Estão pré-programadas para reconhecerem
as células cancerosas, através de determinadas configurações de proteínas exibidas à sua
superfície, e para as eliminar. Após uma célula NK ter iniciado o ataque a uma célula alvo, envia
sinais de citocinas, salientando-se o IFN-γ, para recrutar outras células imunes. As acções da
segunda onda de imunócitos centram-se na montagem duma resposta imune mais específica
e efectiva (humoral ou celular).

A necessidade de distinguir o self do non-self resulta na tolerância imune. O sistema


imunitário é altamente regulado. Se os oligopéptidos exibidos por uma célula forem idênticos
aos encontrados rotineiramente pelas células imunes, a célula que os exibe permanece
imperturbada. Esta tolerância imune é devida à eliminação dos linfócitos auto-reactivos
(reconhecem antigénios do próprio) durante o desenvolvimento do sistema imunitário (até
50% das proteínas codificadas pelo genoma humano são expressas na medula tímica) –
tolerância central – ou à supressão dos linfócitos auto-reactivos que escapam à eliminação e
se alojam nos gânglios linfáticos – tolerância periférica. A falência destes dois mecanismos
traduz-se em actividade auto-imune.

As células T reguladoras conseguem suprimir componentes major da resposta imune


adaptativa. O ataque auto-imune de tecidos normais pela proporção de CTLs que reconhecem
antigénios do próprio é prevenido pela acção das células Tregs. Estas células CD4+CD25+
expressam o factor de transcrição FOXP3 que regula o seu desenvolvimento. Como expressam
TCRs conseguem bloquear especificamente as acções dos CTLs cujos TCRs reconhecem o
mesmo antigénio. Adicionalmente, nos gânglios linfáticos, as Tregs conseguem prevenir a
activação de células T Helper pelas células dendríticas. A secreção de TGF-β e IL-10 pelas Tregs
intervém na supressão da proliferação destes dois tipos de linfócitos T. O comportamento destas
células está fortemente implicado no desenvolvimento das doenças auto-imunes (pela falta de
função) e talvez na proliferação das células tumorais na presença de um número elevado de
CTLs (pela função inadvertida).

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O princípio da imunovigilância baseia-se na monitorização contínua dos tecidos. A presença
de células cancerosas deveria levar ao reconhecimento destas células como estranhas/
invasoras e à sua eliminação antes da proliferação descontrolada.

Várias abordagens experimentais tentaram decifrar o papel da imunovigilância tumoral.

Transplantes alogénicos de células


tumorais são rejeitados pelo hospedeiro
devido à histoincompatibilidade (moléculas
de MHC diferentes determinam a
imunogenicidade destas células). No entanto,
transplantes singénicos não são rejeitados. A
conclusão retirada destas experiências foi a
de que o sistema imunitário aniquila células
estranhas, além de microorganismos e vírus,
e que, portanto, as células cancerosas não
são transmissíveis.

Outra estratégia foi utilizada para aferir o papel da imunovigilância no aparecimento de


tumores. Assumindo que o sistema imunitário suprime a progressão tumoral, indivíduos
imunocomprometidos deveriam ter maior taxa de cancro. Esses tumores seriam autóctones e,
consequentemente, histocompatíveis com o organismo. Todavia, a investigação em ratinhos
Nude concluiu que a susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores nestes animais não está
aumentada em relação aos ratinhos normais. No entanto, estes ratinhos retêm componentes
funcionalmente importantes do sistema imunitário intactos, com destaque para as células NK e
os macrófagos e até para algumas células T que conseguem desenvolver-se fora do timo.

169
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A utilização de organismos geneticamente modificados propulsionou mais estudos acerca
da imunovigilância. O IFN-γ é uma citocina, um factor proteico difundível, libertado somente
por células do sistema imunitário. Ratinhos que não expressam o receptor do IFN-γ são mais
susceptíveis ao desenvolvimento de tumores quimicamente induzidos. Noutras experiências,
células tumorais que não expressam este mesmo receptor foram injectadas em ratinhos WT,
demonstrando ser mais tumorigénicas que as células tumorais com o receptor WT. Assim, a
expressão deste receptor pelas células tumorais permite a resposta ao IFN-γ libertado pelos
imunócitos, especialmente pelas células NK, prevenindo ou retardando o crescimento de
tumores. O IFN-γ secretado pelas células NK na vizinhança das células tumorais permite o
recrutamento de outras células imunes, amplificando a resposta. Entre as células recrutadas
salientam-se os macrófagos que matam as células tumorais directamente e indirectamente,
através da sua função de APCs profissionais. O IFN-γ também estimula as células tumorais a
expressarem níveis aumentados de MHC I, que podem estar carregados com oligopéptidos
capazes de desencadear respostas imunes adaptativas altamente específicas.

Suporte adicional à teoria da imunovigilância advém de experiências com ratinhos que não
produzem perforinas, as proteínas utilizadas pelos CTLs e pelas células NK para mediar a morte
das células alvo, que demonstraram aumento da susceptibilidade ao aparecimento de tumores.
Este aumento também foi verificado em ratinhos sem Rag-1 ou Rag-2, as proteínas responsáveis
pelo rearranjo dos genes que codificam os anticorpos solúveis e os TCRs.

Ratinhos Rag-2 -/- desenvolvem mais sarcomas quimicamente induzidos por 3-MC do que os ratinhos WT.
Curiosamente, quando se injectam células tumorais provenientes de sarcomas originados em ratinhos WT ou em
ratinhos Rag-2 -/- em ratinhos singénicos WT, as primeiras conseguem sempre gerar tumores no novo
hospedeiro, enquanto as segundas falham algumas vezes. Desta forma, das células transformadas num
hospedeiro imunocompetente, as que são fortemente imunogénicas são eliminadas rapidamente, com
sobrevivência de células fracamente imunogénicas (que também obviam a resposta imune num segundo
hospedeiro imunocompetente). Quando as células transformadas se originam num hospedeiro
imunocomprometido, quer as células fortemente imunogénicas quer as fracamente imunogénicas sobrevivem.
Quando os ratinhos WT são transplantados com tumores originados em ratinhos imunocomprometidos
conseguem eliminar os tumores fortemente imunogénicos.

170
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O sistema imunitário funcionante condiciona activamente a identidade dos tumores que se
desenvolvem e os antigénios que expressam. Esta intervenção no fenótipo tumoral é designada
imunoedição e pode ser conceptualizada como um tipo de selecção darwiniana em que a força
selectiva corresponde ao ataque imune de certos tumores incipientes. A imunoedição é
mediada pelas céulas T que respondem a proteínas mutantes altamente antigénicas e após
esta edição as células tumorais que eventualmente consigam sobreviver não expressam estas
proteínas mutantes.

Os tumores podem ainda permanecer monitorizados pelo sistema imunitário adaptativo,


não sendo eliminados (ou a taxa de eliminação é igual à taxa de proliferação), mas estando
confinados a pequenos crescimentos indolentes subclínicos. Este equilíbrio delicado pode ser
violado pela supressão dos antigénios mais imunogénicos pelas células tumorais, evadindo o
reconhecimento e a eliminação pelo sistema imunitário ou pelo dano dos próprios componentes
do sistema imunitário. Esta dinâmica explica que as micrometástases possam permanecer
indolentes por longos períodos de tempo. Além da evolução genética que contribua para a
adaptação ao microambiente, as interacções com os sistema imunitário também podem
desempenhar um papel crítico na determinação da erupção de tumores clinicamente
detectáveis.

Os humanos imunocomprometidos são mais susceptíveis do que a restante população ao


aparecimento de determinados tipos de cancro. Estes indivíduos são essencialmente os
indivíduos transplantados que fazem terapêutica imunossupressora continuada
(imunodeficiência clinicamente induzida) e os doentes HIV, que têm atingido uma sobrevida
considerável graças ao desenvolvimento de fármacos antibióticos, anti-fúngicos e anti-virais.
Este período de sobrevivência extenso representa um intervalo suficiente para ocorrer a
transição entre crescimentos pré-malignos e tumores clinicamente detectáveis. Cancros não
virais têm uma incidência muito semelhante entre indivíduos imunocompetentes e
imunodeprimidos, mas os tumores induzidos por infecções virais são mais frequentes em
indivíduos imunocomprometidos (exemplo: sarcoma de Kaposi causado pelo HHV-8; mesmo
assim, a introdução de esquemas terapêuticos com vários fármacos para suprimir a replicação
do HIV tem regenerado a função imune de muitos pacientes, diminuído a incidência desta
neoplasia na população com SIDA).

A eficácia extraordinária do sistema imunitário na defesa contra os tumores induzidos por


vírus é ilustrada pelo facto de 90% dos adultos no Ocidente estarem infectados com o vírus
potencialmente oncogénico EBV e os cancros associados serem incomuns (até 5% dos CTLs
totais reagem com antigénios do EBV!). A protecção contra qualquer tipo de infecção viral é uma
função normal do sistema imunitário e além disso, as células transformadas por vírus
oncogénicos também constituem alvos do sistema imunitário. De facto, os antigénios virais são
estranhos ao organismo e não são alvo de tolerância imune, sendo altamente imunogénicos, o
que até permitiu o desenvolvimento de vacinas contra tumores virais.

Já os tumores autóctones de origem não viral são muito idênticos aos tecidos normais.
Contudo, o reconhecimento imune desta classe de tumores é real: estudos histopatológicos
revelam infiltração de linfócitos com função anti-tumoral nas massas tumorais (correlaciona-se
com a sobrevivência a longo prazo) - TILs (tumor-infiltrating lymphocytes). Existem ainda
anticorpos anti-tumorais em circulação em muitos tipos de tumor. Adicionalmente, as células

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cancerosas demonstram realizar esforços que convergem na atenuação dos seus perfis
imunológicos – imunoevasão. A complexidade deste processo é inerente aos próprios
antigénios apresentados pelas células cancerosas, cujas identidades são frequentemente
elusivas. Os próprios imunócitos são variadíssimos e possuem funções diversas e por vezes
antagónicas. Cada tipo de tumor parece requerer um conjunto próprio de explicações sobre a
sua interacção com o sistema imunitário.

Macrófagos do subtipo M1
promovem o ataque imune anti-
tumoral. Macrófagos do subtipo
M2, normalmente associados a
processos de cicatrização e
reparação de tecidos, promovem a
progressão tumoral. É presumível
que ocorra interconversão entre
estes dois subtipos, mediada por
citocinas e outros sinais.

Diferenças subtis entre os tecidos normais e neoplásicos podem permitir a distinção pelo
sistema imunitário. As células cancerosas são nativas do organismo e, como tal, a maioria das
proteínas expressas pelas células tumorais pertence ao repertório normal de proteínas nativas.
No entanto, uma pequena fracção destas proteínas é estruturalmente inédita e não está
presente nos tecidos normais. Estes novos antigénios estranhos são capazes de desencadear
respostas imunes. Um exemplo paradigmático é dado pela oncoproteína Ras, que possui uma
sequência de aminoácidos alterada (substituição de aa nos resíduos 12, 13 ou 61), podendo
originar um oligopéptido antigénico que evoque uma resposta imune. Outros exemplos incluem
proteínas de fusão resultantes de translocações cromossómicas (frequentes em cancros
hematopoiéticos) – a região de junção constitui uma nova sequência de aminoácidos
potencialmente imunogénica.

Devido à elevada instabilidade genética dos genomas das células tumorais e ao grande
número de divisões sucessivas que ocorrem durante a progressão tumoral, alelos mutantes
que codificam proteínas estruturalmente alteradas são relativamente frequentes. A maioria
destes alelos não condiciona a aceleração da proliferação tumoral: são alelos passenger,
produtos acidentais da instabilidade genómica. Muitas proteínas com novas estruturas podem

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ser ignoradas pelo sistema imunitário dada a sua semelhança geral às proteínas celulares
normais. Outras podem ser toleradas por estarem presentes em baixas concentrações. Ainda
assim, as proteínas codificadas por estes alelos podem ser muito imunogénicas (exemplo:
triosefosfato isomerase mutante em melanomas, com afinidade aumentada para o MHC II).

NOTA: Outro mecanismo que leva ao aparecimento de versões estruturalmente distintas das
proteínas normais envolve o splicing alternativo de pré-mRNAs. Durante a EMT, centenas de pré-mRNAs
são sujeitos a splicing alternativo (exemplo: Mena).

A tolerância imune é adquirida, maioritariamente, durante o desenvolvimento embrionário


e no período pós-natal, no timo e na medula óssea. Há a possibilidade de algumas populações
linfocitárias nunca serem expostas a certas proteínas normais que sejam expressas
transientemente durante fases precoces do desenvolvimento embrionário, que estejam
presentes em baixas concentrações ou que se localizem em locais imunopriveligiados.
Portanto, a tolerância imune a essas proteínas nunca se desenvolve. Se alguma destas
proteínas for expressa em níveis anormalmente altos pelas células cancerosas isso pode permitir
o reconhecimento imune (exemplos: hTERT; Her2). A expressão de proteínas embrionárias é
comum em muitos tipos de tumor e estas proteínas podem representar antigénios potentes
quando presentes em tecidos adultos. Estes exemplos indicam que ataques imunes vigorosos
podem ser montados contra células tumorais que expressem proteínas em locais anatómicos
ectópicos, em estádios do desenvolvimento em que não são naturalmente encontradas ou em
níveis anormalmente elevados. Às vezes, as respostas imunes anti-tumorais são contra-
produtivas, na medida em que podem desencadear fenómenos de auto-imunidade.

As proteínas antigénicas tumorais dividem-se em duas classes: TSTAs (tumor-specific


transplantation antigens) e TATAs (tumor-associated transplantation antigens). As primeiras
são específicas do tumor, não integrando o repertório de proteínas e oligopéptidos expressos
nas células normais. São codificadas por genomas virais ou por alelos com mutações somáticas
(exemplos: ras, p53, bcr-abl) e sendo estruturalmente inéditas não devem ter induzido
tolerância durante o desenvolvimento do sistema imunitário. As segundas estão associadas com
as células tumorais, não sendo exclusivas dos tecidos malignos. Representam as proteínas
normais que, por razões várias, falharam em induzir tolerância imunitária.

A detecção e identificação de TSTAs é desafiante: se um tumor expressar um TSTA potente,


a resposta imune será vigorosa e eliminará as células que expressem níveis mais elevados
desse TSTA, poupando células que o expressem em baixos níveis – imunoedição – que serão a
única fonte para isolar o TSTA experimentalmente. Já se isolaram genes que codificam TSTAs
por clonagem génica em células expostas ao carcinogéneo mutagénico 3-MC. Os alelos
mutantes foram alvos aleatórios de mutações pontuais e não possuíam um papel causal na
tumorigénese. Os TSTAs resultantes de infecções virais estabelecem imunidade cruzada: todos
os tumores induzidos por um determinado vírus parecem partilhar um ou vários TSTAs, ao
contrário dos tumores induzidos por carcinogéneos, em que cada tumor expressa um TSTA ou
conjunto de TSTAs únicos.

Os TATAs também podem invocar uma resposta imune anti-tumoral. Os TATAs exibidos
pelos melanomas estão melhor estudados. As células deste tipo de tumor podem sobrexpressar
proteínas presentes em baixos níveis nos percursores normais dos melanócitos. Essas
proteínas específicas de linhagem podem ser designadas de antigénios de diferenciação, o que

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implica que a sua exposição seja um vestígio do programa de diferenciação que governa o
comportamento dos percursores celulares normais das células tumorais. A exposição destes
antigénios pelas células do melanoma pode despoletar uma resposta auto-imune, provocando
a despigmentação de extensas áreas de pele – vitiligo (nesta forma considera-se uma síndrome
paraneoplásica). Ou seja, a resposta imune desencadeada pelos TATAs do melanoma leva, como
efeito colateral, à destruição dos melanócitos normais que também expressam estes antigénios.
Os pacientes com melanoma que apresentam vitiligo têm maior probabilidade de sobreviver
mais tempo do que aqueles que não apresentam, traduzindo o controlo do melanoma exercido
pela resposta imunitária mais marcada. Outra subclasse de TATAs exibida pelos melanomas são
os antigénios oncofetais (expressos durante a embriogénese), nos quais se incluem os
antigénios CT (cancer-testis / cancer germ-line), expressos nas células germinativas do testículo
e do ovário fetal. A ausência de resposta imune contra os antigénios CT nos homens deve-se
provavelmente ao facto de várias células do testículo não expressarem MHC I, prevenindo a
apresentação do seu conteúdo interno, bem como à expressão significativa de FasL por estas
células – o testículo é um local imunopriveligiado. Como expectável, a expressão destas
proteínas em locais ectópicos provoca respostas imunes robustas.

Dado que os antigénios anteriormente descritos são tratados como se fossem produtos de
agentes estranhos, uma estratégia óbvia para a terapêutica anti-tumoral seria criar vacinas
contendo estas proteínas antigénicas.

NOTA: Defeitos na maquinaria de MMR criam instabilidade de microssatélites, levando à acumulação


de inúmeras mutações no genoma das células tumorais, com consequentes alterações do quadro de
leitura. Os cancros colo-rectais que apresentam instabilidade de microssatélites (15%) têm maior
número de TILs e menos eventos de metastização associados. Adicionalmente a apresentação de
antigénios pelo MHC I está comprometida com mais frequência do que nos tumores que exibem
instabilidade cromossómica (mecanismo de imunoevasão), sugerindo maior pressão selectiva exercida
pelo sistema imunitário. Estas observações indicam uma correlação entre a existência de instabilidade de
microssatélites e a maior imunogenicidade dos tumores.

Titulações relativamente altas de anticorpos contra antigénios tumorais são encontradas


frequentemente no sangue dos indivíduos com cancro e células T Helper e citotóxicas que
reconhecem os TATAs também são detectáveis. Assim, apesar da tolerância imunológica o
sistema imunitário consegue montar respostas contra a maioria dos cancros. Contudo, os
mecanismos de defesa imunológica, apesar de extraordinariamente eficientes (por exemplo, a
exposição de apenas 10 cópias de oligopéptidos derivados de TATAs ou TSTAs pelo MHC I à
superfície duma célula tumoral é suficiente para atrair células T citotóxicas), não conseguem
bloquear o desenvolvimento de muitos cancros. Os tumores que “escapam” a estes mecanismos
são fracamente antigénicos, porque expressam proteínas para as quais o sistema imunitário é
tolerante. É ainda possível que certos cancros inicialmente fortemente imunogénicos
desenvolvam manobras de imunoevasão quando sujeitos ao ataque imune. A manobra mais
intuitiva de as células cancerosas evitarem a detecção imune é pararem de exibir o TATA ou o
TSTA que atraiu a atenção do sistema imunitário, isto é, suprimir a exposição de antigénios
tumorais à superfície. A maioria destes antigénios representa moléculas que não têm relação
causal com a transformação neoplásica, mas que reflectem os antigénios de diferenciação
tecido-específicos. A expressão destes antigénios pode ser reprimida (por exemplo por
metilação de promotores) pelas células cancerosas, sem prejuízo próprio. Estas variantes

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antigénio-negativas conseguem escapar ao ataque imune e, porventura, emergir como a
população celular dominante na massa tumoral.

Todavia, noutros tumores esta estratégia não é indicada, porque a expressão continuada
do TSTA ou do TATA pode ser essencial para a proliferação neoplásica (exemplos: tumores que
sobreexpressam Her2). Nestes casos, estratégias imunoevasivas alternativas podem ser
adoptadas, como a repressão transcripcional da expressão das proteínas de MHC I. Esta perda
de expressão de MHC I está associada a tumores mais invasivos e metastáticos (ocorre em 50%
dos cancros da mama avançados). As células de carcinoma que formam micrometástases na
medula óssea utilizam este mecanismo para evitar a vigilância intensiva pelas células imunes
deste ambiente tecidual.

A redução de expressão de MHC I também pode


ser alcançada por mecanismos pós-traducionais.
Muitos tumores abolem a síntese de β-2
microglobulina, uma proteína que auxilia a migração do
complexo MHC I-oligopéptido desde o RE até à
superfície celular. Outros tumores têm defeitos nas
proteínas TAP1 e 2 (transporters associated with
antigen processing) que são necessárias ara o
transporte dos oligopéptidos para o RE.

Não obstante, a ausência total de MHC I incita o ataque pelas células NK que detectam
células que perderam estas proteínas chave da sua superfície. Isto explica que algumas células
tumorais suprimam selectivamente a expressão de uma das seis moléculas de MHC I que são
normal e concomitantemente expressas pelas células do organismo. Esta supressão pode
bloquear a apresentação dum antigénio tumoral particular, evadindo o ataque por CTLs e,
simultaneamente, evitar o ataque pelas células NK, uma vez que uma pequena proporção das
moléculas de MHC I foi perdida.

Em suma, o sistema imunitário cria uma grande pressão selectiva ao atacar as células
cancerosas que exibam moléculas de MHC I associadas a péptidos antigénicos, o que resulta no
crescimento de variantes que não exibam esses complexos na sua superfície. Como a
imunoevasão tende a ocorrer em cancros invasivos e metastáticos é provável que o sistema
imunitário só inicie uma resposta verdadeiramente pujante no momento em que as células
cancerosas invadem o estroma, onde as células imunes figuram em número substancial.
Contudo, a imunoevasão pode representar apenas um alívio temporário do ataque imune – o
sistema imunitário pode adaptar-se dinamicamente a uma dada manobra evasiva, co-evoluindo
com as células tumorais e redirecionando a sua “energia” para montar um ataque dirigido a
outro antigénio tumoral.

As células cancerosas protegem-se da destruição pelas células NK e pelos macrófagos.

A morte celular mediada por células NK envolve sinais negativos e positivos.

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O receptor KIR (killer inhibitory
receptor) é exibido normalmente à
superfície das células NK e reconhece
as moléculas de MHC I, emitindo
sinais que impedem o ataque das
células MHC I positivas. Estes sinais
inibitórios estão ausentes quando a
célula NK encontra um possível alvo
celular que não expresse MHC I à
superfície, o que conduz ao
silenciamento funcional do KIR
(reconhece um domínio estrutural
constante das moléculas de MHC I).
As células MHC I negativas são,
então, eliminadas, o que pode
explicar que certos tumores com
ausência de expressão de MHC I
tenham melhor prognóstico.

Outra interacção entre as células NK e as células cancerosas advém da expressão de certas proteínas (exemplos:
MICA, MICB, ULBP4) à superfície das células quando estas sofrem stress fisiológico (dano genético, infecções virais,
transformação neoplásica). As células NK possuem um receptor de superfície complementar a estas proteínas
associadas ao stress, o NKG2D. A ligação deste receptor a este tipo de proteína resulta na activação da resposta
citotóxica das células NK. As células cancerosas escapam a esta interacção quer infra-regulando a expressão destes
ligandos, quer dispensando estes ligandos para o meio sob a forma solúvel, apesar de os continuarem a sintetizar
em grande quantidade (ligam-se aos receptores NKG2D, provocando a sua endocitose e degradação).

Quando a ausência de expressão de MHC I e a presença de proteínas associadas ao stress


coexistem as acções citotóxicas dirigidas às células cancerosas são muito mais eficientes do que
quando apenas uma das condições é satisfeita. As células metastáticas em circulação evitam a
interacção com as células NK pela aquisição de um coat plaquetário, formando um microtrombo.

Paralelamente aos sinais que orquestram o ataque das células NK, existem sinais emitidos
pelas células cancerosas que mobilizam os macrófagos. A calreticulina (CRT) é expressa na
superfície das células neoplásicas em resposta à transformação e a outros tipos de stress
fisiológico, incluindo o provocado pelos agentes citotóxicos utilizados na quimioterapia. É um
sinal indutor de respostas fagocíticas pelos macrófagos - sinal “eat me”. No sentido oposto, a
expressão de CD47 evita a fagocitose - sinal “don’t eat me”. É um sinal utilizado pelas células
normais para evitar ataques espontâneos pelos macrófagos e aproveitado pelas células
neoplásicas, especialmente as CTCs (é um alvo de anticorpos monoclonais). A fagocitose pelos
macrófagos parece requerer baixos níveis de CD47 e sinais “eat me” activos.

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A função das células NK e dos macrófagos reflecte o papel precoce do sistema imunitário
inato de eliminar as populações incipientes de células cancerosas antes de terem atraído a
atenção do sistema imunitário adaptativo.

A grande maioria dos tumores pode desenvolver-se em ambientes imunodeficientes, isto


é, os tumores podem criar microambientes localizados nos quais a função imune está
comprometida.

A via FasL-FasR pode ser subvertida pelo desenvolvimento de resistência à morte mediada
por FasL, por exemplo, pela aquisição de resistência a múltiplas formas de apoptose pelas
células cancerosas. Seguidamente, as células cancerosas podem produzir formas solúveis de
FasL pervertendo o sistema – o FasL activa os FasRs na superfície dos linfócitos, causando a
sua morte, enquanto as células cancerosas, que já se tornaram resistentes a este efeito, são
poupadas. Em muitos indivíduos com cancro alguns tipos de linfócitos circulantes estão
diminuídos, o que indica defeitos sistémicos na função imune. Em pacientes com cancro oral,
vesículas membranares (exossomas) expondo FasL biologicamente activo ligado à membrana
podem ser encontradas em circulação.

Formas alternativas do contra-ataque imunossupressor liderado pelas células cancerosas


incluem a secreção de TGF-β e IL-10, proteínas com efeitos citostáticos em linfócitos T e que
previnem a maturação de células dendríticas e suprimem a sua expressão de MHC II. Em certos
contextos, o TGF-β até pode induzir a apoptose de células dendríticas e macrófagos, os dois
principais tipos de APCs. O TGF-β que é secretado pelas células cancerosas que passaram por
uma EMT para manter, de forma autócrina, a sua residência no estado mesenquimal pode,
colateralmente, estabelecer uma zona de segurança à volta destas células, actuando de forma
parácrina nos imunócitos que se aproximam. Criar células da medula óssea dos pacientes com
cancro resistentes à apoptose induzida por TGF-β poderia parecer uma estratégia viável, não
fosse o caso de células imunes não responsivas ao TGF-β iniciarem ataques autoimunes
devastadores, possivelmente mais debilitantes e letais do que a doença neoplásica de base.

Em suma, pelo menos três agentes – o TGF-β, a IL-10 e o FasL – constituem armas do contra-
ataque montado pelas células cancerosas. Este contra-ataque dirigido aos imunócitos também
protege as células cancerosas da eliminação mediada por anticorpos, uma vez que esta é
efectivada pelos imunócitos citotóxicos. Outras estratégias refinam a imunoevasão. Por
exemplo, a perda de expressão de E-selectina na superfície luminal das células endoteliais (a E-
selectina permite a ancoragem das células T circulantes antes do extravasamento para o
parênquima) é um achado frequente nos microvasos tumorais.

As células cancerosas tornam-se intrinsecamente resistentes a várias formas de eliminação


pelo sistema imunitário. Outro mecanismo para o qual são conhecidas manobras defensivas das
células cancerosas envolve a citotoxicidade mediada pelas granzimas (proteases) libertadas
pelas células NK e pelos CTLs. Em resposta, as células cancerosas aumentam os níveis de IAPs
(inhibitor of apoptosis proteins) que sequestram e inactivam as caspases pró-apoptóticas, alvos
de clivagem e activação pelas granzimas.

Muitas vezes os pacientes com cancro apresentam níveis significantes de anticorpos anti-
tumorais em circulação. Prevê-se que as células tumorais estejam revestidas por anticorpos
ligados à membrana, o que as deixa vulneráveis à citotoxicidade dependente do sistema de

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complemento. As células cancerosas protegem-se da lise e morte sobrexpressando proteínas
anti-complemento nas suas membranas celulares (exemplos: CD46, CD55, CD59), designadas
mCRPs (membrane-bound complement regulatory proteins). Este e outros mecanismos
relacionados podem contribuir para a resistência à terapêutica com anticorpos monoclonais
(MoAbs).

NOTA: Os MoAbs exercem acção anti-tumoral através da mobilização de mecanismos de


citotoxicidade dependente do complemento (CDC; proeminente nas neoplasias hematopoiéticas), de
citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC; proeminente nos carcinomas, pois sobrexpressam
inibidores da CDC) e de outros menos conhecidos que envolvem a indução directa da apoptose.

As células cancerosas atraem células T reguladoras para aniquilar o ataque mediado por
outros linfócitos. A célula Treg consegue inibir ou até mesmo matar os linfócitos T citotóxicos e
helper que reconheçam o mesmo antigénio que o TCR da própria célula Treg reconhece. Nos
indivíduos normais, estas células representam entre 5 a 10% da população de linfócitos T CD4+.
Contudo, nos indivíduos com cancro esta percentagem pode atingir os 25-30%. As Tregs são,
aliás, encontradas em grande número entre os TILs presentes no cancro do pulmão, do ovário,
da mama e do pâncreas, bem como nas ascites tumorais. A proporção considerável de células
Tregs encontradas entre os TILs de alguns tumores implica que seja efectuada a avaliação das
proporções relativas de células T citotóxicas e células Tregs de modo a compreender a
verdadeira dinâmica de interacção entre o tumor e a resposta imune celular. Estas observações
sugerem uma participação na regulação da imunidade anti-tumoral.

A quimiocina CCL22 é produzida e libertada


pelos tumores para recrutar células Tregs, que
expressam o receptor CCR4 à superfície. Uma
vez presentes na massa tumoral, as células
Tregs conseguem suprimir a habilidade das
células T helper, que mobilizam quer a vertente
humoral quer a vertente celular da imunidade
adaptativa. Adicionalmente, o TGF-β, além dos
efeitos tóxicos dirigidos a certos tipos de
imunócitos que possui, pode promover a
transdiferenciação de outros tipos de células T
em células Tregs (induzindo a expressão do
factor de transcrição FOXP3), quer no timo,
quer nos tecidos periféricos.

A tentativa de eliminação das células Tregs pode desencadear ataques auto-imunes


desastrosos. Portanto, se esta tentativa for conceptualizada com propósitos terapêuticos tem
de ser confinada à localização do tumor e tecidos adjacentes.

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O sistema imunitário dos pacientes com cancro pode ser manipulado de duas formas: Ou
se estimula a sua acção anti-tumoral - utilizando factores imunoestimulatórios que incitam o
desenvolvimento de imunócitos capazes de montar um ataque ou expondo os pacientes a TATAs
ou TSTAs (vacinação) – ou se aplicam estratégias de imunização passiva – suplementando um
pacente incapaz de montar uma resposta imune efectiva com produtos imunes, como
anticorpos ou com células antigénio-específicas com origem noutro organismo (transferência
adoptiva de células).

O tratamento de imunização passiva com MoAbs melhor estudado envolve o MoAb


Herceptin/trastuzumab, que reage contra o receptor HER2/erbB2/Neu. A proteína HER2 não
constitui um antigénio específico tumoral, mas é sobrexpressa (10 a 100 vezes) em cerca de 30%
dos cancros da mama, associando-se a pior prognóstico. Esta sobrexpressão resulta na
selectividade do trastuzumab, que mata preferencialmente as células cancerosas.
O trastuzumab tem origem murina. Os anticorpos
murinos não podem ser utilizados directamente na
terapia anti-tumoral em humanos porque a sua região
constante constitui um potente antigénio, levando à
produção de anticorpos neutralizantes – HAMAs
(human anti-mouse antibodies) - pelo sistema
imunitário do hospedeiro, podendo mesmo induzir uma
reacção de choque anafilático, em caso de reexposição
aos anticorpos murinos. Assim, o cDNA que codifica a
região constante do anticorpo murino foi alterado, por
engenharia genética, para que esta fosse codificada por
sequências mais parecidas com as do humano,
resultando num MoAb anti-HER2 humanizado,
normalmente não imunogénico. Estas moléculas
permanecem pelo menos um mês em circulação após a
sua inoculação, potenciando os efeitos a longo prazo.

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A utilização do trastuzumab resultou no aumento da esperança de vida das pacientes com
cancro da mama com sobrexpressão do receptor HER2. Raramente é utilizado em monoterapia,
sendo combinado com os agentes quimioterapêuticos. As mulheres com tumores operáveis
tratadas no período pós-operatório com trastuzumab e quimioterapia (a maioria possui
micrometástases nos gânglios linfáticos drenantes) têm menos recaídas do que as mulheres
tratadas só com quimioterapia (15% vs 33% em dois anos). Muito do benefício terapêutico pode
derivar do bloqueio da proliferação de células residuais que escaparam à remoção do tumor
primário e que podem ser responsivas aos mitogénios produzidos pelo processo de cicatrização
que se segue à cirurgia. O uso de trastuzumab também está aprovado para os 20% dos
carcinomas gástricos que sobrexpressam HER2.

No que concerne aos mecanismos de acção que culminam no bloqueio da proliferação ou na


morte das células cancerosas sabe-se que dependem da acção fagocítica e citotóxica de células
que expressam à superfície o receptor Fcγ (especialmente os macrófagos e as células NK) que
se liga à região constante das moléculas IgG que revestem a superfície das células alvo – ADCC.
De facto, o tratamento com trastuzumab é mais efectivo do que o tratamento com o agente de
baixo peso molecular lapatinib, que inibe o domínio TK do receptor HER2, sugerindo que o mero
“desligar” da sinalização do receptor não acarreta tanto benefício como a conjugação desse
efeito com a ADCC. A internalização e degradação dos receptores HER2 fomentada pela ligação
do anticorpo é outro mecanismo que contribui para o sucesso terapêutico. Não só se reduz a
sobrexpressão do receptor à superfície como também se diminui a formação de heterodímeros
com o HER3, parceiro na sinalização, privando as células cancerosas da sinalização via PI3K-
Akt/PKB que as protege da apoptose. Isto pode explicar a radiossensibilização e a maior
sensibilização à quimioterapia das células tratadas com trastuzumab. Noutros tumores, o
ectodomínio do receptor HER2 é clivado por proteases extracelulares. A proteína residual
contendo o domínio transmembranar e o domínio citoplasmático com funções TK exibe
activação constitutiva, sendo uma oncoproteína muito potente. Esta clivagem que conduz a
actividade desregulada é também bloqueada pela ligação do trastuzumab.

O pertuzumab bloqueia a heterodimerização do receptor HER2 com outros membros da


família de EGF-Rs, traduzindo benefícios adicionais à utilização do trastuzumab.

A sobrexpressão do receptor do EGF, HER1, ocorre em cerca de um terço dos carcinomas e


providencia sinais mitogénicos e anti-apoptóticos para as células tumorais. Como o receptor
HER1 forma heterodímeros com o receptor HER2, o primeiro pode potenciar os efeitos
deletérios da sobrexpressão de HER2 no cancro da mama. O anticorpo anti-HER1
Erbitux/cetuximab está clinicamente aprovado para o tratamento de cancro colo-rectal
avançado. Inibe competitivamente a ligação do ligando (EGF, TGF-α e outros) ao receptor.

Estes e outros anticorpos anti-receptores são mais específicos do que os agentes de baixo
peso molecular, na medida em que é improvável o comprometimento de outros RTKs não
relacionados. Contudo, a penetração tecidual é inferior à obtida com as pequenas moléculas
terapêuticas. Além disso, alguns tumores expressam versões truncadas do EGF-R que disparam
continuamente de forma ligando-independente. Estas proteínas perderam os determinantes
antigénicos que permitem o reconhecimento pelos MoAbs anti-receptor.

NOTA: A imunização passiva com anticorpos também é útil para tratar tumores de células B. O
rituximab é um MoAb anti-CD20. A molécula CD20 é expressa à superfície de células B em diferentes

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estados de diferenciação. É um anticorpo quimérico que carrega a porção Fc da IgG1 humana e a porção
restante dum MoAb murino. O CD20 é um antigénio muito útil uma vez que é expresso em níveis muito
elevados à superfície das células alvo e não é internalizado após a ligação ao anticorpo. Tem utilidade
comprovada em muitos linfomas não-Hodgkin (NHLs), incluindo casos de recaída e casos refractários. A
deplecção transiente das populações normais de células B, conducente a imunossupressão, é aceitável
face ao benefício terapêutico. Este anticorpo é capaz de estabilizar a doença, prolongando a
sobrevivência, mas não tem efeito curativo. O tumor recorrente pode ou não ser resistente ao rituximab.
A perda de acção terapêutica poderá envolver alterações na expressão de CD20, resistência elevada à
apoptose, perda da actividade do sistema de complemento e perda de imunócitos citotóxicos. O
background genético dos pacientes (por exemplo, polimorfismos no FcRγ) também influencia a resposta
terapêutica. O rituximab tem efeito terapêutico noutras neoplasias hematopoiéticas da linhagem
linfocítica B e em doenças auto-imunes em que a função das células B está implicada na etiopatogénese
(artrite reumatoide, LES). O ofatumumab (maior afinidade) e o obinutuzumab (incita a ADCC) são outros
anticorpos anti-CD20.

As terapias com anticorpos monoclonais são mais efectivas quando conjugam outros
agentes terapêuticos sinérgicos, garantindo remissões duradouras. A investigação em MoAbs
tem explorado a possibilidade de aumentar os efeitos citotóxicos destas moléculas. Uma
abordagem atraente é a ligação do anticorpo a agentes tóxicos, criando imunotoxinas
altamente dirigidas. Também podem ser conjugados com moléculas radioactivas ou com
moléculas quimioterapêuticas. A ligação de enzimas capazes de converter pró-fármacos não-
tóxicos em fármacos tóxicos activos aos MoAbs é outra estratégia que pode concentrar os
efeitos citotóxicos na massa tumoral. Uma única enzima pode gerar centenas a milhares de
moléculas activas tóxicas na proximidade das células cancerosas, amplificando o efeito de uma
única molécula de anticorpo monoclonal.

Outra forma distinta de imunização passiva requer o transplante de medula óssea. A


racionalidade desta forma terapêutica recai na ablação de todo o sistema hematopoiético,
sequente à mieloablação (química ou por radiação). O subsequente transplante de medula
óssea dum dador contém células estaminais hematopoiéticas capazes de reconstituir a medula
óssea do hospedeiro e de regenerar as linhas celulares envolvidas na hematopoiese normal e
na função imunitária.

A transferência de imunócitos pode curar neoplasias hematopoiéticas. Nas neoplasias


hematopoiéticas, nomeadamente linfomas e leucemias, estes transplantes eram realizados com
o intuito de eliminar as células estaminais neoplásicas medulares, prevenindo a regeneração
tumoral. Os dadores eram escolhidos de acordo com critérios de histocompatibilidade.
Percebeu-se, no entanto, que a histoincompatibilidade era, em certo grau, desejável, o que
generalizou o transplante alogénico de células estaminais (ASCT), utilizando dadores com
antigénios de histocompatibilidade minor diferentes. Grande parte do benefício do
transplante de medula óssea advém da resposta transplante-versus-tumor (GVT, graft-versus-
tumor), na qual os imunócitos do dador reconhecem e atacam as células tumorais residuais
que sobreviveram à quimio ou radioterapia utilizada para suprimir a medula óssea do paciente.
Este ataque requer a presença de linfócitos T do dador entre as células transplantadas e é
provocado pela expressão de antigénios não familiares pelas células tumorais do hospedeiro.
Presentemente, esta abordagem constitui a única forma efectiva de atingir remissões
duradouras e curas ocasionais em pacientes com leucemia mieloide crónica resistente ao
imatinib. Em tumores sólidos não é uma estratégia efectiva. Por razões não completamente

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elucidadas, a reacção GVT não é acompanhada por uma resposta com severidade comparável
dirigida aos tecidos normais, a GVHD (graft-versus-host-disease).

O sistema imunitário do paciente pode ser mobilizado para atacar o tumor. As abordagens
que dependem do melhoramento da defesa imune endógena pressupõem, naturalmente, que
o sistema imunitário do hospedeiro está intrinsecamente capaz de atacar e eliminar um tumor
e que as respostas anti-tumorais agressivas podem ser fomentadas, aumentando o número e a
actividade das células imunes efectoras citotóxicas. Esta forma de imunoterapia pode, em
última análise, ser considerada uma “vacina” anti-tumoral, ressalvando o seu intuito curativo e
não preventivo.

Uma das estratégias aprovada para o cancro da próstata metastático, com aumento da
sobrevivência comprovado, incide na activação das células dendríticas. Esta forma
imunoterapêutica, designada Provenge ou sipuleucel-T, depende da extração de células
mononucleares do paciente por leucoforese e da cultura dessas células ex vivo (36-44 horas),
na presença duma proteína derivada da PAP (prostate acid phosphatase), expressa nos
carcinomas da próstata.
O objectivo é carregar as proteínas de MHC II das células dendríticas extraídas do paciente
com os péptidos antigénicos derivados da PAP. Para facilitar esta etapa, utiliza-se uma forma
recombinante da PAP – proteína antigénica de interesse - fundida com o factor de crescimento
GM-CSF – ligando de um receptor de superfície expresso pelas células isoladas -, resultando numa
proteína de fusão denominada PA2024. O GM-CSF estimula a diferenciação de monócitos em
células dendríticas imaturas, competentes em processar e apresentar antigénios.
Adicionalmente, o reconhecimento do GM-CSF pelo respectivo receptor é seguido da
internalização do complexo receptor-ligando, proteólise da proteína de fusão PA2024 e
apresentação dos produtos péptideos à superfície das células dendríticas.

Os monócitos e as células dendríticas são reinfundidos no paciente/dador – transplante


autólogo. Idealmente, os fragmentos derivados da PAP serão apresentados às células T helper,
resultando na mobilização da função imune inata e adaptativa (quer celular, quer mediada por
anticorpos).

A resposta dos linfócitos T helper e citotóxicos à apresentação de antigénios pelas APCs


também pode ser melhorada. No encontro inicial entre os dois intervenientes, a resposta é
intensificada pela interacção entre o receptor CD28 expresso à superfície da célula T, em
associação com o TCR, e os ligandos expressos pela APC. Outro receptor de superfície da célula
T, o CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4), compete pela ligação aos mesmos ligandos,
inibindo a activação do linfócito T pela célula dendrítica apresentadora de antigénio. Assim, o
CTLA-4 medeia um feedback negativo crítico, assegurando que a activação do linfócito T é
transiente e que a resposta imune é limitada.

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MoAbs anti-CTLA-4, como o ipilimumab, neutralizam esta acção inibitória, potenciando a
reposta imune anti-tumoral desencadeada pelos linfócitos T, ao prolongar e intensificar a sua
activação. Todavia, podem surgir ou exacerbar-se reacções auto-imunes. Ensaios clínicos em
casos de melanoma metastático indiciam que outros tipos de imunoterapia, incluindo a
inoculação de antigénios associados ao melanoma purificados ou a injecção de células tumorais
autólogas que foram forçadas a expressar GM-CSF ex vivo, possam ser refinados pela injecção
de ipilimumab, aumentando a sobrevida dos pacientes.

A IL-2 é uma linfocina capaz de activar linfócitos, estimulando as células NK que são LAKs
(lymphokine-activated killers). Realizando esta activação in vitro, podem recolher-se células LAK
e reinjectar essas células no paciente (pode co-injectar-se IL-2 adicional). Este tratamento tem
efeitos colaterais que excluíram a sua utilização na clínica oncológica actual.

Uma estratégia relacionada envolve a preparação e amplificação ex vivo de TILs extraídos


de amostras tumorais cirurgicamente removidas e a subsequente reintrodução destas células
no paciente – transferência adoptiva de células (ACT). A maior parte destes TILs são células NK
que coexistem com uma subpopulação funcionalmente crítica de linfócitos T citotóxicos
reactivos contra os antigénios tumorais. Estas células T “educadas” são funcionalmente
activadas ex vivo recorrendo a IL-2. A injecção destas CTLs provocou regressão parcial de um
quarto dos melanomas e dos carcinomas renais tratados. Estas respostas são de curta duração,
porque os TILs reintroduzidos não se conseguem estabelecer de forma estável. Tentativas de
estabilizar e expandir estas populações linfocitárias anti-tumorais in vivo incluem a realização
de quimioterapia antes da injecção, com o propósito de reduzir as populações de linfócitos e
percursores de linfócitos pré-existentes, facilitando a instalação dos clones de TILs
reintroduzidos.

NOTA: A vacina BCG (estirpe atenuada de mycobacterium) é frequentemente injectada na bexiga de


pacientes com carcinoma da bexiga precoce, parando ou atrasando a progressão tumoral. Este
tratamento funciona através da atracção de imunócitos (exemplos: TCD4+, TCD8+, macrófagos, células
NK) para a bexiga, onde criam respostas inflamatórias localizadas.

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RESUMO:

A vigilância imune é claramente responsável pela prevenção do aparecimento de tumores de


origem viral, mas o seu contributo para a prevenção do desenvolvimento de tumores de origem
não viral é mais ambíguo.

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Cancer of the Skin – Melanoma
Epidemiologia: O melanoma é a neoplasia maligna que resulta da transformação dos
melanócitos, as células produtoras do pigmento melanina com origem na crista neural e que
migram para a pele, meninges, mucosas, esófago superior e olhos. O melanoma cutâneo afecta
predominantemente indivíduos de pele clara (98% dos casos) e a sua incidência correlaciona-se
com a latitude, providenciando evidência do papel da exposição solar. A idade média de
diagnóstico ronda o final da 5ª década. Nos indivíduos de pele escura os melanomas costumam
ser diagnosticados num estádio mais avançado e os pacientes tendem a ter pior prognóstico.
Além disso, nessas populações, a frequência de melanoma acral (subungueal, plantar, palmar)
e mucoso. Os dados epidemiológicos suportam um aumento incessante da incidência e
mortalidade por melanoma. Estas estatísticas sublinham a necessidade de promover a
prevenção e o diagnóstico precoce.

Factores de Risco: O risco de desenvolver melanoma relaciona-se com factores genéticos e


ambientais. Os factores de risco mais fortes são a presença de múltiplos nevos melanocíticos
benignos/comuns ou atípicos/displásicos e a história familiar ou pessoal de melanoma.

Os nevos são referenciados como lesões percursoras porque podem transformar-se em


melanomas. Cerca de um quarto dos melanomas estão histologicamente associados com nevos,
mas a maioria surge de novo. Os nevos atípicos têm bordos esbatidos e indistintos e o seu
padrão de pigmentação é mais heterogéneo do que os nevos benignos. Dos 90% de pacientes
em que a doença é esporádica, aproximadamente 40% tem nevos clinicamente atípicos. Os
nevos melanocíticos congénitos podem ser percursores de melanoma (especialmente os
gigantes). Como o risco pode ser tão elevado como 6%, a excisão profilática é uma atitude
prudente.

Até 10% dos melanomas podem ser familiares. Nestes casos, os pacientes costumam ser
mais jovens, as lesões são menos espessas, a sobrevivência é maior e múltiplos melanomas
primários são frequentes. Aproximadamente 20 a 40% dos casos de melanoma hereditário são
devidos a mutações germline no gene regulador do ciclo celular CDKN2A (CDK inibidor 2A). De
facto, 70% de todos os melanomas cutâneos têm mutações ou delecções que afectam o locus
CDKN2A. Este locus codifica duas proteínas supressoras tumorais, a partir de quadros de leitura
alternativos: o p16 e o ARF/p14. O p16 é um CKI que inibe a fosoforilação e inactivação da
proteína RB pelas CDK4 e 6, enquanto o ARF inibe a degradação da p53, mediada pela proteína
MDM2 via ubiquitina proteassoma. Assim, a perda do gene CDKN2A inactiva duas vias
supressoras tumorais críticas, que controlam a entrada das células em ciclo celular. Mutações
germline no gene MC1R, que codifica o receptor de melanocortina-1, são um factor de
susceptibilidade moderado. A exposição solar estimula a produção de α-MSH, o ligando para o
MC1R, que é um receptor acoplado à proteína G que sinaliza via cAMP e regula a produção de
melanina e o tipo de pigmento. O gene MC1R é altamente polimórfico e entre as suas 80
variantes estão aquelas que resultam em perda de sinalização e levam à produção de
feomelaninas vermelhas e amarelas que não são fotoprotectoras. Esta desvantagem em
relação à eumelanina é ainda agravada pela possibilidade de a produção destes pigmentos se
associar a dano oxidativo.

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Prevenção e Detecção Precoce: A prevenção é baseada na protecção solar. Deve educar-se
a população para reconhecerem as características clínicas do melanoma. Dependendo da
presença de factores de risco, as estratégias para a detecção precoce podem ser
individualizadas. Designadamente, os pacientes com nevos displásicos e que tenham história
familiar ou pessoal de melanoma devem ser vigiados por um dermatologista.

Diagnóstico: A detecção precoce pode ser facilitada pela aplicação do ABCDE para avaliar
uma lesão: assimetria, bordos irregulares, cor heterogénea, diâmetro >6mm e evolução (nas
dimensões, na cor, na espessura, nos sintomas). Os nevos benignos costumam aparecer na pele
exposta, raramente envolvendo o escalpe, o peito ou a região glútea. Estão presentes em cerca
de 85% dos adultos (10 a 40 sinais). Os nevos atípicos podem estar presentes na ordem das
centenas. A dermoscopia permite examinar lesões individuais, ampliando a epiderme e
possibilitando visualizar melhor os padrões de pigmentação. Quaisquer lesões suspeitas devem
ser biopsadas e avaliadas por um especialista ou registadas, para posterior seguimento. A
biópsia excisional com margens de 1 a 3 mm permite medir a espessura da lesão se for
melanoma e constitui o tratamento definitivo se a lesão for benigna. Em áreas grandes ou em
locais anatómicos onde a biópsia excisional não é fazível (rosto, mãos, pés) realiza-se uma
biópsia incisional através da área mais nodular e escura da lesão. As biópsias não parecem
facilitar a disseminação do melanoma. Devem tentar preservar as margens profundas e
periféricas e possibilitar a realização de imunohistoquímica. O relatório do patologista deve
incluir a espessura segundo Breslow (maior espessura atingida pelo melanoma primário), as
mitoses por milímetro quadrado para lesões ≤ a 1mm, a presença ou ausência de ulceração e
o estado das margens periféricas e profundas. Em casos de histologia duvidosa, a FISH e a CGH
podem ser úteis.

Classificação Clínica: Quatro tipos principais de melanoma cutâneo estão identificados. Em


três deles – o melanoma superficial (mais comum na população de pele clara), o lentigo maligno
(zonas danificadas cronicamente pela exposição solar, em indivíduos mais velhos) e o melanoma
acral lentiginoso (mais comum na população de pele escura) – a lesão tem um período de
crescimento superficial/radial, durante o qual aumenta de dimensões mas não penetra em
profundidade. Este é o período em que existe curabilidade mediante abordagem cirúrgica. O
quarto tipo – o melanoma nodular – não tem uma fase de crescimento radial identificável e
apresenta-se invasivo em profundidade. Quando os tumores começam a penetrar na pele diz-
se que estão em fase de crescimento vertical. Os melanomas em fase de crescimento radial têm
contornos nodulares e irregulares e variações na pigmentação. O sangramento, a ulceração e a
dor são sinais tardios. As costas são um sítio comum de aparecimento de melanoma. Embora os

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subtipos de melanoma sejam entidades histopatologicamente distintas, esta classificação não
tem valor prognóstico. As novas classificações enfatizam as características moleculares de cada
melanoma.

Patogénese e Classificação Molecular: A radiação solar UV é mutagénica, desregula a


função imune cutânea, aumenta a produção de factores de crescimento e induz a formação de
EROs. Há diferentes vias genéticas para o desenvolvimento de melanoma, conforme a sua
localização e grau de exposição solar. Classificam-se quatro grupos: os melanomas cutâneos
sem dano crónico induzido pela exposição solar, os melanomas cutâneos com dano crónico
resultante da exposição solar, os melanomas das mucosas e os melanomas acrais.

Foram encontrados diferentes padrões de alterações do DNA consoante o local de origem,


independentemente do tipo histológico. Apesar desta diversidade, as alterações genéticas
conduzem a efeitos convergentes. As vias proliferativas afectadas são a via de sinalização MAPK
e a via PI3K/AKT. Os genes RAS e BRAF, membros da via MAPK, que medeia a transcrição de
genes envolvidos na proliferação e sobrevivência celular, são alvo de mutações somáticas e as
proteínas por eles codificadas são potenciais alvos terapêuticos. O gene N-RAS encontra-se
mutado em cerca de 20% dos melanomas e o gene BRAF está mutado na maioria dos nevos
benignos e em 40-60% dos melanomas. A mutação BRAF mais comum é uma mutação pontual
(T>A) que resulta na substituição aminoacídica V600E. As mutações BRAF V600E não têm a
assinatura mutacional típica da radiação UV, ou seja, um dímero de primidinas. São mais
comuns em pacientes mais jovens e estão presentes na maioria dos melanomas que surgem em
locais com exposição solar intermitente e não tanto em melanomas derivados de pela
cronicamente danificada. Os melanomas também possuem mutações de amplificação do gene
AKT e delecção ou silenciamento epigenético do gene PTEN, que levam à activação constitutiva
da via PI3K-AKT, promovendo a sobrevivência celular através do evitamento da via intrínseca de
apoptose (inactivação de proteínas anti-apoptóticas, como a BAD, e expressão de genes pró-
sobrevivência através da activação do factores de transcrição FOXO1).

No melanoma, as duas vias de sinalização implicadas favorecem a tumorigénese, a


quimiorresistência, a migração e a desregulação do ciclo celular. Foram desenvolvidos agentes
moleculares dirigidos que inibem estas vias, mas o tratamento óptimo pode requerer
adicionalmente a promoção da erradicação imune da neoplasia.

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Factores de Prognóstico: O melhor preditor do risco metastático é a espessura da lesão
segundo Breslow. O local anatómico da lesão primária também tem valor prognóstico (melhor
no antebraço e na perna e pior no escalpe, nas mãos, nos pés e nas mucosas). Os indivíduos
mais velhos, especialmente os homens acima de 60 anos, costumam ter piores prognósticos o
que é explicado, parcialmente, pela tendência a um diagnóstico mais tardio (são tumores mais
espessos) e pela maior proporção de melanomas acrais nos homens. Contudo, há maior risco de
metástase nos gânglios linfáticos em pacientes jovens. Outros factores negativos reconhecidos
aquando do estadiamento são o elevado índice mitótico, a presença de ulceração, a presença
de lesões microssatélites e/ou metástases em trânsito, a evidência de envolvimento
ganglionar, níveis elevados de LDH sérica e a presença de metástases distantes.

Estadiamento: O estadiamento auxilia na determinação do prognóstico e na selecção da


terapêutica. O estádio é definido após avaliação patológica da lesão do melanoma e do exame
clínico/radiológico para avaliar a presença de doença metastática. O estadiamento patológico
também inclui a avaliação microscópica dos gânglios linfáticos regionais, obtidos mediante
biópsia do gânglio sentinela ou linfadenectomia total. A história clínica do paciente deve atentar
na presença de sintomas que possam representar doença metastática, como o mau estar, a
perda ponderal, cefaleias, alterações visuais e dor. Também se deve observar atentamente o
local do melanoma primário, procurando doença persistente ou gânglios linfáticos dermais ou
subcutâneos que possam representar metástases satélite ou em trânsito. Se os sinais ou
sintomas da doença metastática estiverem presentes, deve partir-se para exames
complementares imagiológicos. No momento de diagnóstico inicial, mais de 80% dos pacientes
terão doença confinada à pele, dispensando esse tipo de exames.

Tratamento:

Melanoma Localizado (estádio I e II): A excisão cirúrgica com margem é necessária para
remover todas as células malignas e minimizar a possibilidade de recorrência local. A inclusão
de gordura subcutânea facilita a medição adequada da espessura e a análise das margens
cirúrgicas pelo patologista. A biópsia do gânglio sentinela (é identificado pela injecção de
corante azul e/ou radioisótopo no local primário) é uma ferramenta de estadiamento com valor,

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que substituiu a dissecção dos gânglios regionais. Providencia informação prognóstica e ajuda a
identificar pacientes com alto risco de recaída que possam ser candidatos a terapia adjuvante.
Os gânglios identificados são sujeitos a análise histopatológica, incluindo colorações
imunohistoquímicas (ex: S100, HMB45, MelanA) que permitam identificar a presença de
melanócitos. Os pacientes cujos melanomas têm espessura ≤ 0,75mm não requerem biópsia de
gânglio sentinela (o risco é <5%). A partir de uma espessura superior a ≥ 1mm realiza-se biópsia
do gânglio sentinela. Quando a biópsia é negativa, apenas se têm de considerar as características
do melanoma primário durante o seguimento. Quando é positiva, o tratamento standart é a
linfadenectomia completa.

Melanoma Metastático Regional (estádio III): Os melanomas podem recidivar no limite da


cicatriz como metástases satélites, que estão separadas da cicatriz mas num raio inferior a 2cm.
Também podem recidivar como metástases em trânsito, recorrências a mais de 2cm da lesão
primária mas que não atingiram os gânglios linfáticos regionais, e ainda como metástases
ganglionares regionais. Cada uma destas três apresentações é abordada cirurgicamente,
levantando a possibilidade de sobrevivência livre de doença a longo prazo. A perfusão de
membro isolado com melfalano e a hipertermia são opções para os pacientes com recorrências
regionais extensas nas extremidades. Deve ser administrada terapia adjuvante. A radioterapia
reduz o risco de recorrência local após linfadenectomia mas não afecta a sobrevivência. A
terapia adjuvante sistémica está indicada para pacientes com doença estádio III de alto risco,
com gânglios linfáticos negativos e para pacientes com doença estádio IV completamente
ressecada. Quer o IFN-α2b quer a versão peguilada são aceitáveis, apesar dos efeitos adversos.

Doença Metastática (estádio IV): As metástases distantes podem envolver qualquer órgão
e comummente envolvem a pele, os gânglios linfáticos, as vísceras, o osso e o cérebro.
Historicamente, o melanoma metastático era considerado incurável. O prognóstico é melhor
para os pacientes com metástases cutâneas e subcutâneas (M1a), do que no pulmão (M1b) e
do que no fígado, no osso e no cérebro (M1c). A elevação sérica dos níveis de LDH é indiciadora
de mau prognóstico e coloca o paciente no estádio M1c, independentemente do local de
metastização. O tratamento para os pacientes com melanoma estádio IV mudou radicalmente
nos últimos anos, devido à introdução de novos agentes terapêuticos. A metastectomia pode
ser considerada para pacientes oligometastáticos.

IMUNOTERAPIA: A IL-2 está aprovada. A sua administração requer hospitalização. Está


associada a sobrevivência livre de doença a longo prazo. O mecanismo de indução da regressão
tumoral está dependente de células T melanoma-específicas.

O bloqueio dos checkpoints imunes com


anticorpos monoclonais dirigidos aos receptores
imunes inibitórios CTLA-4 e PD-1 tem obtido
resultados muito promissores. Muitos receptores
inibitórios estão sobreregulados durante a resposta
imune. No cancro, esta expressão continuada de
inibidores provoca a exaustão das células T, que
denotam potencial proliferativo limitado, produção
insuficiente de citocinas e citotoxicidade deficitária.

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O bloqueio dos checkpoints imunes restaura a função celular T.

O primeiro agente a conseguir melhorar a sobrevivência em pacientes com melanoma


metastático foi o ipilimumab, um anticorpo IgG que se liga ao CTLA-4, impedindo a emissão de
sinais inibitórios. Foi aprovado em 2011. Para além dos efeitos anti-tumorais, a interferência do
ipilimumab com os mecanismos regulatórios normais tem como consequência o surgimento de
efeitos colaterais auto-imunes, sendo os mais comuns o rash cutâneo e a diarreia, ou até
mesmo a colite. A toxicidade pode envolver uma multiplicidade de órgãos: hipofisite, hepatite,
nefrite, pneumonite, miocardite, neurite, entre outros. A vigilância e o tratamento com recurso
a esteroides (que não parecem interferir com o efeito anti-tumoral) são recomendados. A baixa
taxa de resposta objectiva (cerca de 10%, nos ensaios clínicos), a toxicidade significativa e o
custo elevado impedem a generalização deste agente terapêutico. Apesar disso, o benefício em
termos de sobrevivência para os pacientes que respondem é enorme e duradouro, devendo
considerar-se este tratamento para todos os pacientes elegíveis.

NOTA: A pequena percentagem de pacientes que possui mutações activadoras no gene que codifica o
RTK c-kit (sobretudo nos subtipos acral lentiginoso e mucoso) responde ao imatinib.

A activação crónica das células T também induz a expressão do receptor PD-1 à sua
superfície, cujo ligando, o PD-L1, é encontrado à superfície das células tumorais, como forma
de precaver a sua destruição. A administração de anticorpos anti-PD-1 e anti-PD-L1 parece ser
eficaz e menos tóxica do que a administração de ipilimumab. O bloqueio de ambas as vias
inibitórias mencionadas, utilizando ipilimumab e um anticorpo anti-PD-1, parece resultar em
actividade anti-tumoral superior do que o tratamento com qualquer um dos agentes de forma
isolada. O maior benefício da imunoterapia é a grande duração das respostas alcançadas
(supera os 10 anos, nalguns casos).

Terapia Alvo: Os inibidores da RAF e da MEK (via MAP cinase) constituem novas opções
terapêuticas para os pacientes com melanoma que possuem mutações BRAF. Dois inibidores
da BRAF, o vemurafenib e o dabrafenib, estão aprovados para o tratamento de pacientes
estádio IV com a mutação BRAF V600E. Causam regressão tumoral em cerca de metade dos
pacientes e aumentam a sobrevivência em comparação à quimioterapia. Os efeitos colaterais
também são mais toleráveis em relação à imunoterapia. Uma complicação específica da classe
dos inibidores da BRAF é o desenvolvimento de lesões cutâneas, algumas das quais são
carcinomas escamosos da pele bem-diferenciados (até 25% dos pacientes). Estes cancros da
pele têm de ser excisados, para que o tratamento prossiga em segurança. Não estão reportadas
metástases. A longo prazo, há a preocupação do desenvolvimento de resistência (não é
provável que incluam mutações no gene BRAF que afectem a ligação do inibidor). O inibidor da
MEK trametinib pode ser combinado a um inibidor BRAF, aumentando a sobrevivência livre de
progressão. Além disso, a combinação de agentes não está associada ao aparecimento de
lesões neoplásicas cutâneas.

Quimioterapia: Nenhum regime quimioterapêutico demonstrou aumentar a sobrevivência


no melanoma metastático. Com o desenvolvimento dos novos agentes terapêuticos, o papel da
quimioterapia ficou resumido à paliação de sintomas. Os fármacos, como por exemplo a
dacarbazina, têm taxas de resposta entre 12-20%.

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Abordagem Inicial ao Paciente com Doença Metastática: Após diagnóstico de doença
metastática, quer por biópsia, quer por técnicas imagiológicas, é necessário submeter uma
amostra do tumor do paciente a testes moleculares para determinar se uma mutação
“druggable”, nomeadamente a mutação BRAF, está presente. A análise da lesão metastática é
preferível, quando possível. Para os tumores BRAF wild-type recomenda-se a imunoterapia.
Para os tumores BRAF-mutados, adiciona-se a possibilidade inicial de começar a terapia com
um inibidor BRAF. Os testes moleculares poderão, eventualmente, incluir as mutações N-RAS e
c-kit. Apesar dos avanços terapêuticos, a maioria dos pacientes morrerá devido ao melanoma.

Follow-up: A vigilância anual e a auto-examinação da pele são recomendadas.

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Cutaneous melanoma: ESMO Clinical Practice
Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up
Incidência e Epidemiologia: A incidência anual do melanoma maligno, a nível europeu, varia
entre 3 a 5/100000 nos países mediterrânicos a 12 a 25/100000 nos países nórdicos. O aumento
da incidência que se tem registado dever-se-á ao aumento da exposição à radiação UV duma
população geneticamente predisposta. A mortalidade tem estabilizado nas últimas décadas,
excepto nos homens idosos. Há disparidade entre o rácio mortalidade/incidência entre a
Europa Ocidental e Oriental, implicando a necessidade de melhorar a prevenção, especialmente
na Europa Oriental. A radiação UV é um carcinogéneo major na patogénese do melanoma e a
prevenção da exposição a este agente, incluindo a utilização de protector solar, tem
demonstrado diminuir a incidência de melanoma cutâneo primário na população australiana.

Diagnóstico: As lesões suspeitas são caracterizadas por assimetria, bordos irregulares, cor
heterogénea e dinâmica (evolução na cor, alteração da dimensão) – a regra do ABCD.
Actualmente muitos melanomas primários têm <5mm de diâmetro. Os nevos (vulgo sinal), no
mesmo indivíduo, são idênticos entre si, enquanto os melanomas não se enquadram no padrão
individual (são o “patinho feio”). A dermoscopia realizada por um especialista aumenta a
precisão do diagnóstico. A dermoscopia automática pode ser mais precisa para o seguimento de
pacientes com múltiplos nevos atípicos.

O diagnóstico deve ser baseado numa biópsia excisional com profundidade completa e com
margem mínima, analisada por um patologista experiente. O relatório histológico deve seguir a
classificação do American Joint Committee on Cancer, incluindo: informação sobre a espessura
máxima em milímetros (Breslow), informação sobre o índice mitótico se a espessura for
inferior a 1mm, presença de ulceração, presença e extensão de regressão e limpeza das
margens cirúrgicas. Adicionalmente, deve reportar-se a localização anatómica, incluindo locais
extra-cutâneos como a mucosa e a conjuntiva, grau de dano solar, o tipo de melanoma
(superficial, lentigo maligno, nodular, acral lentiginoso, entre outros). Em situações raras, os
melanomas podem derivar de melanócitos dermais (dum nevo congénito gigante, dum nevo
azul maligno). Os melanomas superficiais e nodulares têm mutações BRAF e NRAS com maior
frequência. Os melanomas acrais lentiginosos e os melanomas da mucosa genital têm
probabilidade de ter mutações c-Kit. O reconhecimento de mutações tratáveis é mandatório
em pacientes com doença avançada (estádio III não ressecável ou estádio IV; muito
recomendável em doença ressecada de alto risco estádio IIc e estádio IIIb-IIIc). Se o tumor for
BRAF wild-type, o teste das mutações NRAS e c-Kit deve ser considerado. O teste mutacional de
tumores primários sem metastização não é recomendado.

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Estadiamento e Avaliação de Risco: Inclui o exame físico, pesquisando outras lesões
pigmentadas suspeitas, satélites tumorais, metástases em trânsito, gânglios linfáticos
regionais e metástases sistémicas. Nos melanomas de baixo risco (pT1a) é suficiente. Nos
tumores com estádio mais avançado (pT1b-pT3a) deve realizar-se ultrassonografia para avaliar
as metástases nos gânglios linfáticos loco regionais e em tumores com estádio superior ao pT3a
é recomendada a realização duma TC ou duma PET, antes de tratamento cirúrgico ou da biópsia
do gânglio sentinela.

Tratamento da Doença Localizada: Recomenda-se a excisão de tumores primários com


margens de segurança de 0,5cm para os melanomas in situ, de 1cm para tumores com espessura
até 2mm e de 2cm para tumores mais espessos. A redução das margens é aceitável para
preservação funcional nos melanomas faciais e acrais. A linfadenectomia ou a irradiação dos
gânglios linfáticos regionais não deve ser um procedimento de rotina. A biópsia do gânglio
sentinela é recomendada para um estadiamento preciso de tumores com mais de 1mm de
espessura ou mais de 0,75mm e factores de risco adicionais (ulceração, elevado índice
mitótico). No caso de o gânglio sentinela ser positivo, deve considerar-se a linfadenectomia
total dos gânglios linfáticos regionais, com benefício apenas ao nível da sobrevivência livre de
recaída.

A utilização de IFN-α como terapia adjuvante em pacientes com melanoma primário de alto
risco (estádio IIB/C) ou com melanoma estádio III com metástases dos gânglios loco regionais
completamente ressecadas tem benefício na sobrevivência livre de doença e na sobrevivência
em geral. Como o IFN-α peguilado é uma boa terapia a longo prazo, a European Organisation
for Research and Treatment of Cancer está a investigar o seu efeito como terapia adjuvante em

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melanoma estádio III ressecado. Houve benefícios em termos de sobrevivência livre de recaída.
A terapia adjuvante a longo prazo com ipilimumab, um anticorpo anti-CTLA4, também aumenta
a sobrevida livre de recaída para estádios N1b ou mais elevados. A quimioterapia adjuvante não
é benéfica de todo. A terapia adjuvante com outras citocinas, como a IL-2, com os inibidores da
BRAF, a vacinação tumoral e a imunoquimioterapia está em fase experimental. A radioterapia
deve ser considerada em casos de margens de ressecção inadequadas do melanoma lentigo
maligno, em ressecções R1 das metástases de melanoma ou após ressecção duma doença
volumosa.

Tratamento da Doença Loco-regional: Em caso de existirem metástases ganglionares loco-


regionais isoladas, a remoção cirúrgica é indicada (incluindo os gânglios linfáticos circundantes).
Se as metástases forem volumosas, a radioterapia pós-operatória pode melhorar o controlo
local do tumor. Antes de se ponderarem tratamentos cirúrgicos locais agressivos, deve fazer-se
o estadiamento detalhado, incluindo estudos recorrendo a técnicas de imagem de alta
resolução, como a PET, a TC e a RM, para excluir metástases distantes. A remoção cirúrgica ou
a radioterapia estereotáxica pode ser curativa em alguns casos de metástase parenquimatosa
única (incluindo no SNC), sendo recomendável.

Tratamento da Doença Metastática Sistémica (estádio IV): Novas estratégias terapêuticas


têm demonstrado uma eficácia impressionante, sobretudo a imunoterapia, nomeadamente a
que utiliza anticorpos contra os inibidores da activação das células T. Os anticorpos que
bloqueiam o CTLA-4, como o ipilimumab, e os que bloqueiam o PD-1, como o nivolumab e o
pembrolizumab, bem como os inibidores selectivos da BRAF, como o vemurafenib, o
encorafenib e o dabrafenib (podem ser combinados com inibidores da MEK), exibem grande
actividade anti-tumoral. Portanto, a imunoterapia e os inibidores de proteínas cinases são os
pilares da terapia sistémica. A quimioterapia constitui a segunda linha de tratamento. Os
tecidos tumorais, especialmente as lesões metastáticas, devem ser testados para mutações
BRAF V600E. Se os resultados forem negativos, os testes moleculares devem ser dirigidos para
mutações NRAS e c-Kit (tumores primários mucosos e acrolentiginosos) e GNA11 ou GNAQ
(tumores primários da úvea). Estes testes permitem o direcionamento dos pacientes para a
terapia alvo apropriada ou até para um ensaio clínico adequado.

Quanto à terapêutica de primeira linha para a doença metastática, parece razoável


administrar anticorpos anti-PD1. Para melanomas com mutações BRAF, combinações

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BRAFi/MEKi parecem ter taxas de resposta elevadas. Em pacientes com BRAF wild-type, o
ipilimumab é terapia standart e oferece benefícios em termos de sobrevivência. Contudo,
ensaios aleatorizados recentes, favorecem a utilização de anticorpo anti-PD1 em relação ao
ipilimumab. Ambas as terapias são eficazes em pacientes com outras mutações BRAF. A terapia
anti-PD1 também está recomendada como segunda linha, após falência do ipilimumab. Além
disso, os agentes anti-PD1 apresentam um perfil de segurança excelente. Num ensaio clínico
aleatorizado, o pembrolizumab supera o ipilimumab em termos de sobrevivência livre de
progressão, de sobrevivência a 1 ano e de taxa de resposta.

Se os novos agentes terapêuticos não estiverem disponíveis, fármacos citotóxicos como a


dacarbazina são a referência. A cirurgia de metástases viscerais está reservada a casos
selecionados, com manifestações da doença isoladas. A radioterapia paliativa deve ser
considerada para pacientes sintomáticos, especialmente os que evidenciarem metastização
óssea ou cerebral.

Medicina Personalizada: As mutações NRAS, c-Kit e BRAF constituem biomarcadores


moleculares preditivos indispensáveis para a abordagem do melanoma avançado. Com base na
evidência recente no que concerne à eficácia da terapia anti-PD1 no melanoma avançado PD-L1
positivo, este parâmetro, que é determinado por imunohistoquímica e reflecte a presença de
linfócitos T no microambiente tumoral, pode vir a ser relevante muito em breve. Os algoritmos
de tratamento devem focar-se na medicina de precisão, no contexto da imunoterapia e da
terapia dirigida.

Follow-up dos Pacientes: Os pacientes com melanoma devem ser advertidos para evitar a
exposição a radiação UV (solar ou artificial) e para realizarem auto-exames regulares da pele e
dos gânglios linfáticos periféricos. Os familiares têm risco aumentado de desenvolver
melanoma, mas tal não justifica a recomendação de testes genéticos. Durante o follow-up, os
pacientes são monitorizados clinicamente, de forma a detectar recidivas (as técnicas de imagem
podem ser úteis, em pacientes de risco elevado) e a reconhecer tumores cutâneos adicionais
(melanomas secundários, principalmente).

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Antibody therapies for melanoma: New and emerging
opportunities to activate immunity (Review)
Abstract: Os esforços para tratar o melanoma maligno, a forma mais letal de cancro da pele,
fomentando a activação da resposta imune com citocinas, vacinas e imunoterapias com
anticorpos são promissores em grupos limitados de pacientes. Este estudo discute as diferentes
abordagens imunoterapêuticas dirigidas que utilizam anticorpos, no contexto do melanoma.
As primeiras abordagens recorreram a anticorpos monoclonais que reconhecem antigénios
associados ao melanoma, como o CSPG4/MCSP, e elementos da vasculatura associada ao tumor,
como o VEGF. Recentemente, as estratégias focam-se na regulação imune e na interacção das
células imunes com as células tumorais. Identificaram-se moléculas checkpoint alvo nas células
imunes, como o CTLA4 e o PD-1 e nas células tumorais, como o PD-L1. O bloqueio com
anticorpos visando activar as respostas imunes (efectoras) e contrariar os mecanismos
imunomodulatórios associados ao melanoma (supressores, imunoevasivos), traduziu-se na
primeira grande revolução clínica com o desenvolvimento do anticorpo monoclonal anti-CTLA4.

Clinical Landscape: O melanoma maligno contabiliza cerca de 75% de todas as mortes


relacionadas com cancro da pele. A taxa de sobrevivência a 5 anos aproxima-se de 95% para
os pacientes diagnosticados com doença de estádio I e decresce abruptamente para <10% para
pacientes com doença metastática, de estádio IV.

Num passado não muito distante, os tratamentos disponíveis eram muito limitados e o
agente quimioterapêutico mais utilizado em casos de doença avançada era a dacarbazina, um
agente alquilante. A dacarbazina induz a paragem do ciclo celular e a apoptose das células
tumorais e a taxa de resposta está compreendida entre 15-20%, com uma duração aproximada
de 4 meses. As estratégias imunoterapêuticas sob a forma de citocinas recombinantes IL-2 e
IFN-α, embora não generalizadas na prática clínica devido aos efeitos adversos, suportam a
ideia de que a activação da imunidade no cancro pode ter um impacto positivo.

Duas classes de agentes aprovados vieram transformar a prática clínica: as pequenas


moléculas inibidoras de vias de sinalização – vemurafenib, dabrafenib e trametinib – e o
anticorpo monoclonal ipilimumab, que têm como alvo a molécula checkpoint nas células T
CTLA4.

O melanoma é considerado um tumor imunogénico e a presença de infiltrados de subtipos


específicos de células imunes, como os linfócitos T, parece estar correlacionada com outcomes
favoráveis. As observações de regressões totais ou completas, o aumento da prevalência de
melanoma em pacientes imunocomprometidos e os sucessos das imunoterapias corroboram
o papel fulcral da interface tumor/imunidade no melanoma. As células do melanoma
potenciam uma resposta de base inflamatória, constituída por uma grande variedade de tipos
celulares, como CTLs, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, mastócitos, linfócitos T e B, e
por um conjunto alargado de citocinas e anticorpos. No entanto, frequentemente, esta resposta
com extensão local e sistémica falha em impedir a progressão tumoral. De facto, a resposta
imune dirigida a proteínas do próprio alteradas expressas no tumor tem de ser orquestrada de
modo a evitar respostas indesejadas contra o organismo. Esta imunossupressão é governada
por componentes celulares como as células Tregs, as MDSCs (myeloid-derived suppressor cells)
e os macrófagos M2 activados e por mediadores, como a citocina IL-10, o TGF-β e o VEGF. A

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expressão de anticorpos é desviada para subclasses inactivas ou supressoras, como a IgG4 e as
funções anti-tumorais dos CTLs, das células dendríticas e dos macrófagos são aniquiladas. Nesta
fase avançada, os agentes quimioterapêuticos têm capacidade limitada, daí que se tenham
desenvolvido novos agentes terapêuticos.

Os primeiros esforços para fortalecer a resposta imune focaram-se nas citocinas


recombinantes IL-2 e IFNα2b. A racionalidade subjacente à utilização da citocina IL-2 é a
promoção da expansão de populações celulares de linfócitos T específicos contra o tumor. O
tratamento com doses de IL-2 obteve taxas de resposta objectiva entre os 5 e os 27%, mas tem
efeitos colaterais muito severos, como a hepato e a renotoxicidade, com altas taxas de
mortalidade. O IFNα é uma citocina antiviral e pró-inflamatória que costuma ser produzida por
células como os linfócitos T, as células NK e os macrófagos. Pensa-se que a sua acção anti-
tumoral se relacione com efeitos anti-angiogénicos e pró-apoptóticos derivados da fomentação
da apresentação de antigénios tumorais às células T CD4+. Doses altas de INFα prolongaram a
sobrevivência livre de doença e, no campo adjuvante, aumentam a sobrevida em geral em
doentes de risco elevado (está aprovado o seu uso no contexto adjuvante, a nível europeu). A
forma modificada IFNα2β peguilado tem uma semi-vida mais longa e aumentou a eficácia
terapêutica bem como a tolerância e está aprovada no contexto adjuvante.

As estratégias de vacinação têm sido alvo de investigação. Utilizam como imunogénios


péptidos, proteínas, células DNA e vírus ou formas modificadas de terapias celulares como a
transferência adoptiva de células dendríticas e de células T. Um estudo recente demonstrou
indução da imunidade contra o melanoma metastático através da vacinação com células
dendríticas carregadas com antigénios do melanoma (MART-1, MAGE-3, gp100 e tirosinase).
Todavia, nenhuma vacina é utilizada na prática clínica.

Anticorpos Monoclonais: Os anticorpos exercem a sua função


anti-tumoral directamente através do reconhecimento
específico das células alvo que espressam o antigénio à superfície,
parando a proliferação celular, induzindo a apoptose, bloqueando
receptores de citocinas (privando-as de sinais de crescimento) ou
prevenindo interacções com a matriz extracelular (restringindo a
migração/metastização).

Os anticorpos também podem


mobilizar células imunes efectoras com
receptores Fc, que neutralizam os alvos
celulares que expressam o antigénio
reconhecido pelo anticorpo (através da
citotoxicidade celular e fagocitose
dependentes de anticorpo ou da
activação do sistema de complemento).

Os anticorpos podem ser ainda utilizados como imunogénios para promover a apresentação
de antigénios e iniciar a resposta imune adaptativa ou ao evitarem a anergia das células
efectoras, ao terem como alvo elementos chave das vias imunomodulatórias.

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Outra função pode relacionar-se com o direcionamento para eventos críticos no
microambiente tumoral. Por exemplo, a inibição da angiogénese tendo como alvo os VEGFs,
restringindo o aporte de nutrientes e o escape de células metastáticas para a circulação. Quanto
ao melanoma, a linha de investigação corrente pauta-se pelo desenvolvimento de
imunoterapias que tenham como alvo vias de sinalização cruciais e que activem a imunidade.

Uma abordagem integra anticorpos que reconhecem antigénios sobrexpressados ou


mutados, exibidos à superfície das células cancerosas. Um exemplo paradigmático são os
anticorpos que reconhecem o antigénio associado ao tumor CSPG4 (chondroitin sulphate
proteoglycan 4)/MCSP. Esta proteína é sobrexpressa em 80 a 85% das lesões de melanoma e
tem funções relacionadas com a adesão, a disseminação e a migração das células de melanoma,
através da activação de cascatas de sinalização intracelulares, como as vias FAK (focal adhesion
kinase), PI3K/AKT, NFκB e MAPK/ERK. A proteína CSPG4 também é sobrexpressa na vasculatura
angiogénica tumoral. Assim, a terapia com anticorpos dirigidos pode retardar a progressão
tumoral evitando a activação das vias de sinalização, com o benefício potencial adicional de
restringir o suprimento sanguíneo tumoral. Entre as estratégias testadas contam-se anticorpos
conjugados a radioisótopos ou toxinas e anticorpos que actuam como imunogénios,
mimetizando os epítopos dos antigénios reconhecidos pelas respostas humorais dos pacientes.
Prolongaram a sobrevida dos pacientes que responderam à terapia. Um anticorpo humanizado
BiTE (bi-specific T-cell engaging) capaz de reconhecer o CSPG4 e o CD3 humano, para envolver
o complexo TCR, foi desenhado para redirecionar as células T CD3+ (especialmente os CTLs) para
as células de melanoma, despoletando a sua activação na ausência de clones específicos ou de
apresentação pelas APCs. Foi provada a citotoxicidade em cultura. Um fragmento de anticorpo
scFv anti-CSPG4 fundido com o TRAIL foi criado para fomentar a actividade sinalizadora pró-
apoptótica mediada pelo TRAIL nas células de melanoma CSPG4+. Uma abordagem mais recente
envolve células T modificadas com um receptor de antigénio quimérico CSPG4-específico
(CAR), que também codifica o endodomínio co-estimulatório CD28.

A progressão do melanoma maligno da fase de crescimento radial para a fase de


crescimento vertical está associada com o aumento da densidade de microvasos e mau
prognóstico para os pacientes. No melanoma há sobrexpressão de factores pró-angiogénicos,
como as moléculas da família VEGFs (A, B, C, D e E). A produção de VEGFs e dos seus receptores,
os VEGFRs (1, 2 e 3) incita mudanças na proliferação das células endoteliais, suporta a formação
de neovasos e fomenta a permeabilidade vascular,
permitindo a sobrevivência das células tumorais e a
metastização. A hipótese de que o bloqueio das interacções
VEGF-VEGFR pudesse ser benéfico conduziu ao
desenvolvimento do bevacizumab, um anticorpo
monoclonal humanizado que reconhece com alta afinidade
todas as isoformas de VEGF-A, bloqueando a sua ligação aos
RTKs VEGFR-1 e 2. Um ensaio clínico que utilizou o anticorpo
no melanoma metastático em combinação com um agente
alquilante revelou redução sistémica dos níveis de VEGF-A e
C (o primeiro estimula a angiogénese e o segundo a
linfangiogénese). Porém, em termos gerais, a sua actividade
anti-tumoral é limitada.

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O antigénio CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen-4) expresso à superfície dos linfócitos T,
actua como uma molécula inibitória da activação das células T, competindo com o CD28 pela
ligação aos membros co-estimulatórios da família B7 na superfície das APCs, o que leva a
inibição da actividade do TCR, à redução da transcrição do gene que codifica a IL-2 e à restrição
da proliferação das células T. Assim, o CTLA4 é um regulador negativo da activação das células
T, contribundo para a tolerância antigénica e limitando a auto-imunidade mediada por células
T, mantendo a homeostase. Uma vez que os antigénios tumorais são marioritariamente auto-
antigénios, colocou-se a hipótese de que bloqueando este checkpoint – a interacção CTLA4-B7
e, consequentemente, a cascata de sinalização a jusante – se aumentaria a activaçao das células
T, suplantando a tolerância antigénica e potenciando a reposta imune anti-tumoral.

O ipilimumab, um anticorpo IgG1 humano anti-CTLA4 cumpre esta função, permitindo a


formação de complexos CD28-B7. Adicionalmente, mobiliza células efectoras que expressam
o receptor Fc contra as células Tregs que expressam CTLA4, bloqueando a sua função
imunossupressora tumoral. Os ensaios clínicos demonstraram respostas mantidas por mais de
2 anos nalguns pacientes. A combinação com dacarbazina aumenta a taxa de resposta. Há
benefício significativo a nível de sobrevivência em pacientes com melanoma metastático. O
ipilimumab foi o primeiro anticorpo a ser aprovado para o tratamento de pacientes com
melanoma não ressecável ou metastático (estádios III e IV). Na prática clínica cerca de 40% dos
pacientes experienciam irAEs (immune-related adverse events) devido à activação universal
das células T, culminando em inflamação tecidual específica e efeitos autoimunes. Os efeitos
adversos mais graves incluem a colite, o rash e hepatotoxicidade e foram observados. Esta
toxicidade pode ser minimizada com tratamentos com esteroides sistémicos. Salienta-se, no
entanto, que os pacientes que experienciam mais efeitos adversos autoimunes são
simultaneamente os que têm maior probabilidade de beneficiar do tratamento com
ipilimumab.

O PD-1 (programmed death-1 ou CD279 ou B7-H1) é uma proteína inibitória expressa à


superfície de linfócitos T e B maduros e de células mieloides activadas. O seu ligando, o PD-L1
está sobre-regulado na superfície de APCs, bem como de células epiteliais e endoteliais após
estimulação antigénica com sinais inflamatórios como o IFNγ. Também é expresso nas células
de melanoma e noutras células imunes associadas ao tumor. O eixo PD1/PD-L1 consegue inibir
o crescimento das células T e a secreção de citocinas. De facto, o PD-1 pode desempenhar um

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
papel crítico na imunoevasão tumoral, ao
regular negativamente quer a resposta
imunitária celular, quer a resposta humoral. A
expressão de PD1 e PD-L1 correlaciona-se com
pior prognóstico e portanto o bloqueio desta
interacção constitui um alvo da imunoterapia. O
anticorpo IgG4 nivolumab reconhece o PD-1. No
contexto do melanoma a sobrevivência média
estimada aproxima-se dos 17 meses. A
toxicidade severa só atinge cerca de 5% dos
pacientes e a resposta clínica persiste mesmo
após a cessação da terapia. Os anticorpos anti-
PD-L1 despoletam uma infiltração linfocitária por
células T muito elevada no microambiente
tumoral. Os efeitos terapêuticos do bloqueio PD-
1/PD-L1 continuam a ser estudados em estudos
experimentais e em ensaios clínicos.

Finalmente, outra abordagem tem como finalidade a deplecção de células Tregs, um subtipo
celular que tem grande relevância na modulação das respostas anti-tumorais e que pode ser
parcialmente responsável pela eficácia limitada das imunoterapias e das vacinas adjuvantes. A
maior densidade de células Tregs associadas ao melanoma correlaciona-se com tumores mais
espessos e em fase de crescimento vertical. O daclizumab é um anticorpo humano anti-CD25
que é eficaz em eliminar as células Tregs circulantes em pacientes com melanoma. No entanto
isto não é suficiente para aumentar a eficácia da vacinação com células dendríticas. Uma
limitação considerável é o facto de o CD25 não ser exclusivamente expresso pelas células Tregs
e também ser expresso por outros subtipos de células T activadas, podendo enfraquecer as suas
funções.

Exemplos de Estratégias de Combinação com Anticorpos:

A combinação dos anticorpos anti-CTLA4 e anti-PD-1 resultou em redução da densidade de


células Tregs, bem como no aumento da infiltração por células T efectoras nas lesões dum
modelo de melanoma murino. Num ensaio clínico de fase I administrou-se nivolumab e
ipilimumab em pacientes com melanoma de estádio III ou IV. Os tratamentos concorrentes
(administração dos dois MoAbs em simultâneo) obtiveram uma taxa de resposta objectiva
superior aos tratamentos sequenciais – 53% vs 20%. Contudo, mais de metade dos pacientes
sob o regime concorrente evidenciou toxicidade severa.

Outras combinações que estão a ser estudadas coadunam os MoAbs e vacinas de péptidos
longos de antigénios associados ao melanoma, como o gp100 e o TRP-1 e 2.

Inibidores das Vias de Sinalização: Existem novos tratamentos de base não imunológica mas
com relevância imunológica. Cerca de 60% dos melanomas possuem mutações na cinase
serina-treonina BRAF, o que resulta na activação constitutiva da via de sinalização
RAS/RAF/MEK/ERK. Aproximadamente 90% destas mutações consistem na substituição dum
único aminoácido na posição 600 – mutação V600E (valina>ácido glutâmico). O vemurafenib é

200
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um agente aprovado para pacientes cujos tumores expressam a versão mutante do gene BRAF.
Este tratamento tem taxas de resposta, de sobrevivência livre de progressão e de sobrevivência
em geral muito superiores ao tratamento com dacarbazina, mas a maioria dos pacientes
desenvolve resistência e experiencia recaídas. Outro inibidor da BRAF semelhante é o
dabrafenib, que também está aprovado para doença avançada. Suspeita-se que os inibidores
da BRAF possam aumentar o processo de apresentação de antigénio o que prediz o aumento da
actividade anti-tumoral das células T.

Individualmente, o ipilimumab e os inibidores da BRAF aumentam a sobrevida e cada um tem


diferentes perfis de acção: a inibição da BRAF consegue obter respostas mais rápidas, mas mais
temporárias, enquanto o ipilimumab tem um início de resposta lento e uma taxa de resposta
objectiva relativamente baixa, mas os pacientes que respondem ao tratamento experienciam
respostas muito duradouras. Logo, a combinação duma terapia dirigida a uma oncoproteína
com a imunoterapia parece muito entusiasmante.

Conclusões: O melanoma é considerado uma doença maligna imunogénica, resistente aos


tratamentos standart. Os anticorpos que bloqueiam os checkpoints imunes vieram revolucionar
o tratamento deste cancro. Actualmente, continua-se a desenvolver agentes que potenciem a
eliminação imune dos melanomas com tradução em termos de benefício de sobrevivência.
Paralelamente aos anticorpos monoclonais, os agentes inibidores de via de sinalização também
estão a ter um impacto positivo na abordagem clínica da doença. A nova geração de anticorpos
poderá ser desenhada de forma a reeducar e direcionar células imunes especificamente contra
as células cancerosas.

201
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
The rapidly evolving therapies for advanced
melanoma – towards immunotherapy, molecular
targeted therapy, and beyond
Abstract: A incidência de melanoma têm continuado a aumentar nos últimos 40 anos,
apesar das tendências de estabilização ou declínio da incidência da maioria dos cancros. Devido
aos avanços estupendos na imunobiologia e na biologia molecular, grandes avanços na
imunoterapia e na terapia molecular alvo revolucionaram o tratamento de pacientes com
melanoma avançado. Todos os agentes desenvolvidos e aprovados recentemente
demonstraram um aumento na sobrevivência em geral e benefícios a longo prazo em vários
ensaios clínicos. Novos agentes aguardam ainda aprovação num futuro próximo.

Introdução: A principal causa de morte entre os pacientes com melanoma é a doença


metastática no sistema linfático e em vários órgãos, como o pulmão, o fígado, o osso e o
cérebro. Com as terapias tradicionais a sobrevivência média dos pacientes com melanoma
metastático rondava os 6 a 12 meses e a taxa de sobrevivência a 5 anos era inferior a 10%.
Devido à natureza agressiva deste tumor e à sua resistência ao tratamento, os esforços
enfatizavam sobretudo a prevenção da exposição à radiação UV.

Os progressos terapêuticos são muito recentes. A dacarbazina era o único agente aprovado
para primeira linha de tratamento de doença avançada, desde 1976. Mostrava taxas de resposta
entre 10-20%, sem benefício claro em termos de sobrevivência. A dose elevada de IL-2,
aprovada em 1998, com taxas de resposta não muito díspares, não é considerada um
tratamento primário devido ao perfil de toxicidade desfavorável. A aprovação do anticorpo
anti-CTLA-4 ipilimumab, em 2011, marcou o início da expansão da imunoterapia e da terapia
molecular alvo aplicadas ao melanoma avançado. Adicionalmente, outras modalidades como
a terapia adoptiva de células T (ACT), a terapia de células T CARs (chimeric antigen receptors), a
viroterapia oncolítica e as vacinas terapêuticas estão actualmente sob investigação, com
esperança de obterem resultados empolgantes num futuro próximo. Estes avanços terapêuticos
também erigiram a possibilidade de curar esta doença devastadora. Esta revisão discute as
forças, as limitações e os desafios de utilizar os novos agentes, bem como potenciais soluções e
áreas de investigação.

Imunoterapia: O melanoma é muito estudado no âmbito da imuno-oncologia, devido à taxa


significativa de regressão espontânea do tumor primário, bem como ao aparecimento de
vitiligo associado com a regressão imunomediada. O reconhecimento da importância da
imunoterapia para o tratamento do melanoma avançado fundou-se com a aprovação de doses
elevadas de IL-2 (apesar da grande toxicidade: hiper-permeabilidade capilar, arritmias e
renotoxicidade). Os linfócitos T possuem um papel central nesta interacção do sistema
imunológico com o melanoma. O modelo clássico de activação do TCR contempla dois sinais,
sendo o sinal 1 o antigénio e o sinal 2 a co-estimulação via CD28, expresso na superfície da
célula T (que interage com o ligando B7-1 na superfície das APCs). Subsequentemente,
identificaram-se receptores co-inibitórios expressos à superfície das células T – os checkpoints
imunes – destacando-se o CTLA-4 e o PD-1, que são capazes de infra-regular a activação do
sistema imune, promovendo a tolerância ao próprio e evitando a auto-imunidade. O CTLA-4 é

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expresso cerca de 48 horas depois da activação das células T e liga-se ao B7-1 com maior
afinidade do que o CD28, funcionando como um regulador negativo. Quando infiltram o
microambiente tumoral, as células T activadas são funcionalmente inactivadas pela interacção
do PD-1 com o seu ligando PD-L1, expresso pelas células tumorais. Assim, estes mecanismos
são grandes impasses à actividade anti-tumoral das células T. Os anticorpos dirigidos a estas
moléculas são inibidores dos checkpoints imunes e restituem/aumentam a resposta anti-
tumoral.

O ipilimumab é um anticorpo monoclonal IgG1 humanizado que se liga ao CTLA-4,


aumentando a activação das células T, bem como a sua expansão e função efectora. Prolonga a
sobrevivência em pacientes com melanoma avançado. Uma meta-análise recente revelou
benefício duradouro em termos de sobrevivência em aproximadamente 20% dos pacientes com
doença avançada, nalguns casos estendendo-se até 10 anos. Logo, os benefícios a longo prazo
sugerem que o ipilimumab possa induzir remissão num pequeno grupo de pacientes. Contudo,
alguns desafios têm emergido. Alguns pacientes só evidenciam respostas transitórias ou nem
sequer respondem ao tratamento com ipilimumab, enquanto outros (cerca de 10%) têm uma
resposta completa com desaparecimento das lesões cancerosas clinica e radiologicamente.
Infelizmente, não está ainda identificado nenhum biomarcador que ajude a identificar estes
pacientes que efectivamente beneficiam da terapia. Finalmente, reporta-se um aumento inicial
da carga tumoral após o início da terapia, que só mais tarde é substituído por uma redução
lenta e estável do tumor.

A partir do sucesso do ipilimumab, desenvolveram-se novos inibidores dos checkpoints


imunes. O pembrolizumab é um anticorpo monoclonal IgG4 humanizado anti-PD-L1 e produz
respostas objectivas duradouras nos pacientes com melanoma metastático. A taxa de resposta
em pacientes refractários ao ipilimumab atingiu os 26%. Também prolonga a sobrevivência livre
de progressão em comparação à quimioterapia, no mesmo contexto. Parece superar o
ipilimumab e estar associado a menores eventos de toxicidade severa. O nivolumab é um
anticorpo anti-PD-1 que confere benefícios semelhantes.

A combinação de inibidores dos checkpoints imunes – anti-CTLA-4 + anti-PD-1 – é uma


possibilidade, face aos seus mecanismos de acção complementares e não redundantes. O
CTLA-4 actua numa fase precoce da activação das células T, enquanto o PD-1 contribui para a
exaustão das células T já nos tecidos periféricos, na fase efectora. De facto, a combinação de
inibidores parece sinérgica e tem perfis de toxicidade aceitáveis (embora mais elevados). Estas
conclusões impulsionaram a investigação de novos alvos moleculares. A combinação de
inibidores dos checkpoints imunes com vacinas terapêuticas também parece uma estratégia
atraente. A combinação de uma vacina de GM-CSF (citocina que aumenta a activação de células
dendríticas) com o ipilimumab, num ensaio clínico de fase III, demonstrou aumento da
sobrevivência.

Os efeitos adversos associados a estes agentes – irAEs (immune-related adverse events) –


complicam a sua utilização. São sobretudo derivados da inflamação de sistemas orgânicos off-
target: dermatite, hepatite, colite e hipofisite. O efeito colateral mais comum e precoce é a
toxicidade dermatológica. Até 50% dos pacientes tratados com ipilimumab experienciam rash
ou prurido. Felizmente, a maioria dos irAEs são ligeiros e transitórios, mas ocasionalmente são
fatais. A análise retrospectiva dos ensaios com ipilimumab demonstrou a ocorrência de efeitos

203
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
adversos em 64,2% dos pacientes (23% experienciaram efeitos adversos graves). Os efeitos
adversos de maior grau relacionados com os inibidores PD-1 ocorrem com menor frequência. A
toxicidade relacionada com a terapia de combinação costuma envolver mais de um órgão. A
utilização temporária de agentes imunossupressivos, como os corticosteroides, melhora o perfil
de toxicidade sem eliminar a eficácia da resposta anti-tumoral. No entanto, é importante
salientar que aparentemente as respostas clínicas duradouras induzidas pelo ipilimumab estão
relacionadas com a indução de irAEs.

O grande entusiasmo com a terapia de inibidores PD-1 pauta-se pela actividade anti-tumoral
duradoura, bem como a boa tolerabilidade. Contudo, apenas cerca de um terço dos pacientes
responde ao tratamento. A procura de biomarcadores que permitam selecionar a população
de pacientes que irá beneficiar do tratamento e que prevejam o outcome clínico continua a ser
uma área de intensa investigação. O microambiente tumoral é o principal local de interacção
PD-1/PD-L1. Nesta óptica, a expressão de PD-L1 pelas células tumorais seria provavelmente um
dos melhores biomarcadores de resposta objectiva à terapia. Todavia, esta suposição é alvo de
grande controvérsia – alguns pacientes PD-L1 negativos respondem à terapia com inibidores
anti-PD-1. Portanto, a menor expressão de PD-L1 não é suficientemente preditiva.

A terapia adoptiva de células T (ACT) é um tratamento emergente que envolve infusão de


linfócitos T anti-tumorais. As células administradas proliferam in vivo e mantêm respostas
efectoras anti-tumorais a longo prazo. Os linfócitos T transferidos podem ser obtidos a partir
dos TILs (tumor infiltrating lymphocytes) endógenos ou a partir de linfócitos T do hospedeiro
que expressem um TCR anti-tumoral, geneticamente modificados. Múltiplos ensaios clínicos
demonstraram que a ACT, em combinação com a linfodeplecção, medeia uma regressão
tumoral completa e dramática em pacientes com melanoma avançado, com resposta objectiva
entre os 40 e os 72%. Além disso, até 40% dos pacientes que respondem experienciam respostas
completas que duram até 7 anos. O maior desafio à implementação desta estratégia terapêutica
reside na capacidade técnica, quer a nível de equipamento, quer a nível de profissionais
experientes capazes de executar esta terapia personalizada.

Os CARs são proteínas de fusão compostas por um domínio de reconhecimento de


antigénio, comummente derivado de um anticorpo e de um domínio de sinalização, que
consiste na cadeia CD3ζ que medeia a activação de células T. Os transgenes que codificam o CAR
são transfectados para as células T. A grande vantagem das células T-CAR é a capacidade de
reconhecimento dos antigénios associados ao tumor independente de MHC, superando um
dos maiores mecanismos de imunoevasão utilizado pelas células tumorais (desregulação do
MHC à superfície celular). A primeira geração de CARs apenas continha o domínio intracelular
da cadeia CD3ζ, enquanto os CARs de segunda e terceira geração também possuem domínios
de co-estimulação, aumentando a activação das células T. Grandes sucessos desta modalidade
de tratamento foram alcançados no contexto das neoplasias hematológicas. Porém, o impacto
desta terapia está muito menos desenvolvido no que concerne aos tumores sólidos.

Os vírus oncolíticos também apresentam resultados promissores. São desenhados para se


replicarem selectivamente nas células tumorais e posteriormente activarem o sistema
imunitário através da lise celular. O T-VEC é um vírus HHV-1 geneticamente modificado que é
injectado directamente nas lesões de melanoma, replica-se nas células tumorais e secreta GM-
CSF. Quando ocorre lise das células tumorais, a libertação de antigénios específicos do tumor

204
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e o GM-CSF despoletam uma resposta anti-tumoral sistémica. Há um ensaio de fase III que
evidencia que a taxa de resposta da injecção intra-lesional de T-VEC supera a taxa de resposta
de inoculação subcutânea de GM-CSF. A efectividade deste ensaio levou à aprovação do T-VEC
como a primeira viroterapia oncolítica, em Outubro de 2015. Actualmente, investiga-se a
possibilidade de combinação com inibidores dos checkpoints imunes.

As vacinas terapêuticas aumentam a capacidade de o próprio sistema imunitário do paciente


montar uma resposta anti-tumoral. Como se pensa que sejam menos tóxicas do que a terapia
sistémica, continuam a ser investigadas no contexto do melanoma. Nenhuma vacina conseguiu
ainda demonstrar benefícios de sobrevivência.

Inibidores da Transdução de Sinal – Terapia Molecular Alvo: Graças ao entendimento cada


vez mais profundo dos mecanismos moleculares que regulam o crescimento e a morte celular,
bem como do envolvimento das mutações genéticas na carcinogénese, concomitantemente ao
avanço da imunoterapia deu-se o avanço das terapias moleculares dirigidas. A via MAPK, que
promove o crescimento, a diferenciação e a sobrevivência celulares é uma das vias de sinalização
mais importantes para a progressão tumoral. A mutação do gene BRAF activa constitutivamente
a actividade da cinase ERK, a jusante da cinase BRAF na via de sinalização, incitando a
carcinogénese, através do aumento da entrada em ciclo celular, bem como pela supressão da
apoptose. A mutação BRAF mais comum consiste numa mutação pontual em que a valina (V) é
substituída por ácido glutâmico (E) no codão 600 – BRAF V600E. Aproximadamente 60% dos
melanomas cutâneos possuem esta mutação. Consequentemente, foram desenvolvidos e
aprovados inibidores da BRAF, o vemurafenib e o dabrafenib, bem como o inibidor da MEK
trametinib. Atacam uma mutação particular e são considerados os tratamentos standart em
pacientes com melanoma avançado em que seja identificada a mutação BRAF600.

O vemurafenib demonstrou uma superioridade impressionante relativamente à dacarbazina


em pacientes com melanoma metastático BRAF V600E (sobrevivência de 48% vs 5% dos
pacientes). O dabrafenib apresentou efeitos semelhantes. Os inibidores da MEK, incluem o
trametinib, o primeiro a ser aprovado após demonstrar benefícios em termos de sobrevivência,
e o cobimetinib, também já aprovado.

A resistência à monoterapia é quase inevitável. Entre os mecanismos de resistência


propostos contam-se a dimerização de isoformas RAF wild-type mediada pelos inibidores da
BRAF, que paradoxalmente reactivam a via de sinalização MAPK. A consequência mais terrível
desta reactivação é o desenvolvimento de tumores secundários, como carcinomas escamosos,
queratoacantomas, novos melanomas primários, leucemia, entre outros. A terapia de
combinação com inibidores BRAF e MEK pode retardar a aquisição de resistência, na medida
em que afecta duas moléculas diferentes na mesma via de sinalização. Os ensaios clínicos até à
data confirmam esta superioridade. Outro mecanismo de resistência pauta-se pela activação
aberrante da via PI3K-AKT-mTOR, por activação mutacional da PI3K ou perda do gene supressor
tumoral PTEN. Portanto, esta via semi-paralela pode ser um possível alvo de inibição, garantindo
a infra-regulação da activação desta via de sobrevivência nas células tumorais.

Situação Específica – Metástases Cerebrais no Melanoma: As metástases cerebrais são um


achado frequente em pacientes com melanoma (cerca de 7% dos pacientes no momento do
diagnóstico inicial). Se não forem tratados a sobrevivência não costuma exceder os 3 meses.

205
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Devido à má penetração dos agentes citotóxicos pela barreira hemato-encefálica, as opções
terapêuticas têm estado restritas à cirurgia e à radioterapia. Porém, com o aparecimento das
novas estratégias terapêuticas tem-se tentado alargar este paradigma. O tratamento com
ipilimumab (que não atravessa a BHE) produz resultados, presumivelmente através da migração
de células T activadas para o cérebro. O aumento de sobrevivência dos pacientes tratados com
inibidores PD-1 também inclui os pacientes com metastização cerebral. Vários ensaios clínicos
também já demonstraram benefício de sobrevivência com a terapia dirigida à BRAF/MEK (que
também não atravessam a BHE).

The ultimate solution: combining immunotherapy with molecular targeted therapy or other
therapies?

Testemunhou-se o emergir de duas estratégias terapêuticas efectivas mas


fundamentalmente diferentes para o melanoma avançado. A terapia molecular alvo conduz a
respostas rápidas e consideráveis na maioria dos pacientes com a mutação alvo, mas o
benefício clínico costuma ser transitório, devido ao aparecimento precoce de resistência
terapêutica. A monoterapia com inibidores da BRAF ou a terapia combinada com estes agentes
e os inibidores MEK levam a taxas de controlo da doença superiores a 90%, mas a maioria dos
pacientes têm recaída clínica em menos de um ano. Pelo contrário, a imunoterapia evidencia
benefícios de sobrevivência a longo prazo mas uma minoria de pacientes responde ao
tratamento.

Quanto à sequência de tratamentos para pacientes com melanomas BRAF-mutantes, o


consenso actual é o de que os pacientes com doença agressiva e sintomática e lesões
volumosas sejam tratados com inibidores da BRAF, para paliar os sintomas e retardar a morte,
enquanto os pacientes com doença indolente e assintomática e lesões pouco volumosas
devem ser tratados com imunoterapia, para terem a melhor hipótese de sobrevivência a longo
prazo. Em termos gerais, a monoterapia com anti-PD-1 ou a combinação com ipilimumab são
as primeiras escolhas para pacientes com melanoma avançado. O interesse em combinar a
imunoterapia com a terapia molecular dirigida justifica-se. Teoricamente, as APCs recolheriam
os antigénios tumorais libertados devido à apoptose das células tumorais induzida pelas terapias
dirigidas e apresentá-los-iam a células T específicas do tumor que podem estimular
adicionalmente a resposta imune. Depois, as células T activadas sobre-regulariam as moléculas
inibitórias, como o CTLA-4 e o PD1, devido a mecanismos de tolerância e, portanto, a
combinação dos inibidores dos checkpoints imunes aumentaria a resposta celular T anti-
tumoral. No entanto, já houve estudos interrompidos por toxicidade excessiva. Os esforços para
melhorar a duração das respostas irão provavelmente incorporar regimes triplos ou até
quádruplos.

Conclusões: O tratamento do melanoma avançado tem evoluido rapidamente,


acompanhando a acumulação de conhecimento acerca da biologia da doença e da regulação
imune.

206
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IDENTIFICATION OF NEW STRATEGIES IN
RISK STRATIFICATION AND TREATMENT

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Breast Cancer
O cancro da mama resulta da proliferação maligna das células epiteliais que delimitam os
ductos ou os lóbulos mamários. Contabiliza cerca de um terço dos cancros em mulheres.
Graças aos avanços no tratamento e na detecção precoce, a taxa de mortalidade tem começado
a decrescer.

Considerações Genéticas: O cancro da mama é uma doença clonal e pode existir durante um
longo período como uma doença não invasiva ou como uma doença invasiva mas não
metastática. Mais de 10% dos cancros da mama estão relacionados com mutações germline.
Vários genes estão implicados nos casos familiares, nomeadamente os genes supressores de
tumor p53 (Síndrome de Li-Fraumeni) e PTEN e os genes de manutenção BRCA1 (o seu produto
proteico correspondente funciona como um factor de transcrição envolvido na reparação do
genoma; confere 60-80% de risco de desenvolver cancro da mama e 33% de desenvolver cancro
do ovário ao longo da vida) e BRCA2. As mutações germline BRCA1 e 2 podem ser facilmente
detectadas e como tal, mulheres com forte história familiar de cancro da mama devem ser
referenciadas para realizar rastreio genético, de forma a posteriormente serem acompanhadas
e aconselhadas da maneira mais apropriada. Para além do seu papel nas formas herdadas de
cancro da mama, estes genes também estão envolvidos nas formas esporádicas: cerca de 40%
dos cancros esporádicos adquirem uma mutação p53 e 10% uma mutação no PTEN. Mutações
BRCA1 nos cancros da mama primários esporádicos não estão descritas. No entanto, já se
verificou diminuição da expressão do mRNA BRCA1, possivelmente devido a metilação génica,
e localização anormal da proteína BRCA1 nalguns cancros da mama. Finalmente, a expressão
aumentada dum oncogene dominante ocorre em cerca de um quarto dos cancros da mama. O
produto deste gene é um membro da superfamília de receptores EGF – o erbB2 (HER2/neu) – e
é sobrexpresso devido a amplificação génica. É alvo de terapia sistémica no âmbito adjuvante
e da doença metastática. A medicina personalizada ainda está longe de ser uma realidade uma
vez que várias mutações “driver” adquiridas já estão identificadas mas a maioria não está
presente em mais de 5% dos casos e não tem agentes efectivos dirigidos.

Epidemiologia: O rácio mulher/homem é cerca de 150:1. O cancro da mama é uma doença


hormono-dependente. As mulheres sem ovários funcionantes que nunca recebam terapia de
substituição de estrogénios não desenvolvem cancro da mama. O gráfico incidência vs idade
para o cancro da mama apresenta dois componentes: um aumento linear na incidência com a
idade com uma descida que começa no início da menopausa. Portanto, existem três datas na
vida duma mulher que têm um impacto fundamental na incidência de cancro da mama: a idade
da menarca (mulheres que têm a menarca aos 16 anos têm apenas 50-60% do risco de cancro
da mama de mulheres que tenham a menarca aos 12 anos), a idade da primeira gravidez de
termo (redução de risco de 30-40% em mulheres que tiveram a primeira gravidez completa aos
18 anos em relação a mulheres nulíparas) e a idade da menopausa (mulheres em que a
menopausa ocorra 10 anos antes da idade média da menopausa – 52 anos – têm o risco reduzido
em cerca de 35%). Assim, a duração da vida menstrual, particularmente a fracção antes da
primeira gravidez de termo, é uma componente substancial do risco total de cancro da mama.
Estes três factores podem contabilizar cerca de 70 a 80% da variação de incidência entre países
diferentes. A duração da amamentação também se correlaciona com redução de risco.

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
A variação internacional da incidência tem fornecido pistas acerca da carcinogénese
hormonal. As mulheres asiáticas têm um quinto a um décimo do risco de desenvolver cancro da
mama das mulheres da América do Norte e da Europa Ocidental. As mulheres asiáticas têm
concentrações de estrogénios e progesterona muito inferiores, que não podem ser explicadas
com base genética, uma vez que as mulheres asiáticas que vivem no ambiente Ocidental têm
concentrações de hormonas sexuais esteroides idênticas às mulheres ocidentais (diferem
também na sua altura e peso, reguladores da idade da menarca). Há associação entre o intake
calórico e o risco de cancro da mama: um aumento na ingestão de calorias está associado a
menarca precoce, idade tardia da menopausa e aumento das concentrações estrogénicas pós-
menopáusicas, reflectindo o aumento da actividade da aromatase nos tecidos gordos. O
consumo moderado de álcool também aumenta o risco por mecanismos desconhecidos. A
depressão está associada com ocorrência e recorrência do cancro da mama. A utilização de
contraceptivos orais relaciona-se com um pequeno aumento de risco de cancro da mama
(contrariamente ao efeito protector das hormonas exógenas contra os carcinomas do ovário e
cancros do endométrio). A terapia de substituição hormonal associa-se a aumento de risco para
cancro da mama (6 a 7 anos quase duplicam o risco). A exposição a radiação antes dos 30 anos
também aumenta o risco. A administração crónica de baixas doses de aspirina está associada
com diminuição do risco.

Avaliação de Massas Mamárias em Homens e Mulheres:

Virtualmente, todos os cancros da mama são diagnosticados por biópsia dum nódulo
detectado num mamograma ou por palpação.

A massa mamária palpável: As mulheres devem ser treinadas para a auto-examinação mensal das
mamas. Embora existam estudos que argumentem que esta prática não se traduz num aumento de
sobrevivência, é um procedimento seguro que aumenta a probabilidade de se detectar uma pequena
massa que pode ser tratada com cirurgia mais limitada. A examinação mamária pelo profissional de
saúde deve atentar na presença de retracções e alterações cutâneas. Deve examinar-se o mamilo,
procurando corrimento, os grupos ganglionares regionais e as lesões. O exame físico não consegue
excluir malignidade. As lesões mais prováveis de ser cancerosas costumam possuir uma série de
características – duras, irregulares, fixas e indolores. Um mamograma negativo na presença duma massa
mamária não exclui a malignidade. As lesões palpáveis requerem procedimentos diagnósticos
complementares, incluindo a biópsia.

Massas mamárias em mulheres grávidas ou lactantes: Durante a gravidez a mama cresce sob a
influência de estrogénios, progesterona, prolactina e lactogénio humano placentário. A lactação é
suprimida pela progesterona que antagoniza os efeitos da prolactina, efeito que se perde após o parto,
com a descida dos níveis de progesterona. O desenvolvimento duma massa dominante não deve nunca
ser atribuído às alterações hormonais. O cancro da mama em pacientes grávidas não difere do cancro da
mama em mulheres pré-menopáusicas não grávidas. No entanto, as mulheres grávidas costumam ter
doença mais avançada porque a significância clínica da massa mamária não foi devidamente avaliada e
pelos efeitos da estimulação hormonal endógena.

Massas mamárias benignas: A grande maioria de massas mamárias benignas deve-se a doença
fibroquística – pequenos quistos cheios de fluido e hiperplasia modesta do tecido epitelial e fibroso. No
entanto, a doença fibroquística é um diagnóstico histológico e não clínico e as mulheres que realizaram
uma biópsia com achados benignos têm maior risco de desenvolver cancro da mama do que as que não
realizaram biópsia.

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O mamograma anormal: A mamografia diagnóstica é realizada após uma anormalidade palpável ter
sido detectada e pretende avaliar o resto da mama antes de se executar uma biópsia ou integrar o teste
triplo (palpação + mamografia + aspiração) para evitar a biópsia imediata. A mamografia de rastreio
detecta alterações subtis como microcalcificações (sobretudo espiculadas) e distorções de arquitectura.

Rastreio: O rastreio sob a forma de mamografia anual aumenta a sobrevivência (redução


de 25-30% do risco de morte devido a cancro da mama com o rastreio anual após os 50 anos de
idade; como a incidência é menor nas mulheres mais jovens, há mais falsos positivos). Apesar
de alguma controvérsia existente, acredita-se no benefício substancial do rastreio. Note-se, que
a diminuição de mortalidade assistida na última década não deve ser apenas atribuível aos
avanços terapêuticos. Assim sendo, é prudente recomendar a realização duma mamografia
anual ou bianual a mulheres acima de 40 anos. Conquanto não tenham sido demonstrados
benefícios em termos de sobrevivência associados à auto-examinação mamária, o maior
benefício desta prática é a identificação de tumores em que se adequa a terapia local
conservadora. O melhoramento da tecnologia mamográfica, em conjunto com novas técnicas
de diagnóstico como a RM e a PET, tornam possível a identificação de cancros da mama de forma
mais fiável e precoce. A American Cancer Society sugere que o rastreio através de RM, mais
sensível e menos específico do que a mamografia habitual, pode ser benéfico para mulheres de
risco muito elevado.

Estadiamento: O estadiamento correcto tem importância extraordinária para estabelecer o


prognóstico e para a tomar a decisão terapêutica.

Tratamento:

Um dos aspectos particulares da biologia do cancro da mama é a sua subdivisão em cinco


subtipos, com base nos perfis de expressão génica.

Luminal A: Os tumores expressam as citoqueratinas 8 e 18, têm os níveis mais elevados de


expressão de ERs, tendem a ser de baixo grau, respondem bem à terapia endócrina e pior à
quimioterapia e têm prognóstico favorável.

Luminal B: As células tumorais também têm origem epitelial, mas o padrão de expressão
génica é distinto dos tumores do subtipo luminal A e o prognóstico é pior.

Mama normal-like: O perfil de expressão génica remete para o perfil do epitélio mamário
não maligno “normal”. O prognóstico é semelhante ao do subtipo luminal B. Este subtipo é
controverso e pode representar contaminação da amostra por epitélio mamário normal.

HER2 amplificado: Tumores que exibem amplificação do gene HER2, no cromossoma 17q, e
que frequentemente exibem co-amplificação de sobrexpressão de genes adjacentes.
Historicamente, o prognóstico clínico destes tumores era pior, mas com o advento do
trastuzumab e de outras terapias dirigidas o tem vindo a melhorar marcadamente.

Basal: São os tumores triplo-negativos, caracterizados por marcadores das células


basais/mioepiteliais. Tendem a ser de alto grau e expressam citoqueratinas 5/6 e 17, bem como
vimentina, p63, CD10, actina-α de músculo liso e EGFR. Também têm características de células
estaminais. Os pacientes com mutações BRCA também se enquadram neste subtipo molecular.

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Cancro da Mama Primário: Os tratamentos conservadores consistem na remoção do tumor
primário através de lumpectomia com ou sem irradiação da mama, resultando em taxas de
sobrevivência tão boas ou até ligeiramente superiores às subsequentes aos procedimentos
cirúrgicos extensos, como a mastectomia. A radioterapia da mama pós-lumpectomia reduz
grandemente o risco de recorrência. A radioterapia pós-operatória dos gânglios linfáticos
regionais após mastectomia também se associa a aumento da sobrevivência e redução da
recorrência (aconselha-se a mulheres com tumores primários de alto risco que realizaram
mastectomia – T2, margens positivas, gânglios positivos). Presentemente, cerca um terço das
mulheres nos EUA realizam lumpectomia. A cirurgia conservadora não se adequa a todas as
pacientes, nomeadamente às que possuem tumores de dimensões superiores a 5cm (ou até
dimensões menores se a mama for pequena), que apresentam envolvimento do mamilo-
aréola, que têm doença intraductal extensa envolvendo vários quadrantes mamários e às
mulheres que não preferem esta opção terapêutica ou que não têm acesso conveniente a
radioterapia. Mesmo assim, estes grupos não chegam a contabilizar um terço das mulheres
tratadas com mastectomia. Portanto, muitas das mulheres submetidas a mastectomia podiam
evitar este procedimento se apropriadamente aconselhadas.

A biópsia do gânglio sentinela é um procedimento standart para mulheres com cancro da


mama localizado e gânglios axilares negativos. Se a biópsia for negativa não é requerida cirurgia
axilar extensa, precavendo-se o risco de linfedema após dissecção axilar. O envolvimento de
gânglios linfáticos axilares e de estruturas vasculares ou linfáticas por tumor metastático
associa-se a risco aumentado de recaída mas não contraindica o tratamento conservador.
Quando se excluem estes factores de risco e a lumpectomia assegura margens cirúrgicas
negativas, a taxa de recorrência é inferior a 5%. A sobrevivência das pacientes que têm recidiva
é inferior à das que não têm. Todavia, a recorrência local na mama não é a causa de
metastização distante, caso contrário as mulheres tratadas com lumpectomia, que apresentam
taxas mais elevadas de recorrência na mama, deveriam ter piores outcomes em termos de
sobrevivência do que as mulheres tratadas com mastectomia, o que não se verifica.

Terapia Neoadjuvante: A quimioterapia neoadjuvante pode atingir taxas de resposta


objectiva que excedem os 75%, resultando na descida do estadiamento de muitas pacientes,
tornando-as candidatas a terapia conservadora. No entanto, a sobrevivência não tem sido
aumentada com esta abordagem em comparação à abordagem adjuvante. Pacientes que
atingem uma remissão patológica completa após a quimioterapia neoadjuvante têm a
sobrevivência muito aumentada. Adicionalmente, o pertuzumab, o segundo anticorpo anti-
HER2 a ser desenvolvido, demonstrou benefício adicional quando co-administrado com o
trastuzumab no campo neoadjuvante. A utilização adjuvante de taxanos tem sido investigada,
obtendo resultados promissores.

Terapia Adjuvante: A utilização de terapia sistémica adjuvante aumenta a sobrevivência,


após procedimentos dirigidos à doença local. Mais de metade das mulheres que iriam de outra
forma morrer de cancro da mama metastático permanecem livres de doença quando tratadas
com o regime sistémico apropriado.

Regimes Adjuvantes: São utilizados em pacientes cuja doença recebeu tratamento local
mas que mantêm risco de recidiva. A escolha do regime óptimo pode ser controversa.

211
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Em geral, as mulheres pré-menopáusicas recebem quimioterapia com múltiplos agentes.
As comparações dos vários regimes de quimioterapia adjuvante revelam poucas diferenças, mas
são reconhecidas vantagens dos regimes que contêm doxorubicina e dos regimes de dose densa.
A terapia anti-hormonal deve ser adicionada após completa a quimioterapia em pacientes ER+,
visando aumentar a sobrevivência. A castração profilática (cirúrgica ou medicamente induzida)
também pode associar-se com benefícios substanciais de sobrevivência.

Os dados em mulheres pós-menopáusicas são controversos. O impacto da quimioterapia


adjuvante é menos claro do que nas mulheres pré-menopáusicas, particularmente nos casos
ER+, embora tenha sido demonstrada vantagem em termos de sobrevivência. A terapia
endócrina adjuvante (inibidores da aromatase e tamoxifeno) melhora a sobrevivência
independentemente do envolvimento dos gânglios axilares, mas a melhoria é modesta para
pacientes com envolvimento ganglionar múltiplo. Por esta razão, é comum administrar
quimioterapia a pacientes pós-menopáusicas sem contraindicações médicas e que têm mais de
um gânglio linfático positivo. A terapia hormonal é frequentemente utilizada
subsequentemente. Para as mulheres pós-menopáusicas que tenham um prognóstico mais
favorável, a terapia hormonal pode ser utilizada isoladamente. Ensaios clínicos demonstram a
superioridade dos inibidores da aromatase em relação ao tamoxifeno isolado no campo
adjuvante, embora o tamoxifeno pareça equivalente em mulheres obesas. A continuação do
tamoxifeno durante 10 anos garante benefício adicional e é uma opção razoável para mulheres
com pior prognóstico. O uso concomitante de bifosfonatos é quase sempre desejável. No
entanto não está completamente estabelecido se o seu uso profilático aumenta a sobrevivência
para além de diminuir a recorrência óssea.

Variáveis de Prognóstico: As variáveis mais importantes são fornecidas pelo estadiamento


tumoral, principalmente pelo tamanho do tumor e pelo estatuto dos gânglios linfáticos
axilares. Para a maioria das mulheres, a necessidade de terapia adjuvante pode ser prontamente
definida com base nestas informações. Raramente existe justificação para a quimioterapia
adjuvante em mulheres cujos tumores não excedem 1cm e cujos gânglios axilares são negativos,
salvando-se a potencial excepção dos tumores HER2+.

A detecção de células tumorais em circulação ou na medula óssea associa-se com maior


taxa de recidiva. O desenvolvimento mais entusiasmante neste âmbito dos marcadores de
prognóstico é a utilização de arrays de expressão génica para analisar padrões tumorais. Há
conjuntos génicos definidos que predizem a sobrevivência livre de doença e em geral de maneira
mais fiel do que as outras variáveis de prognóstico, sendo úteis para circunstâncias ambíguas.

212
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O estatuto dos receptores de estrogénio e progesterona tem significância prognóstica. Os
tumores que não expressam um ou ambos os receptores têm mais probabilidade de recidivar.

A medida do crescimento tumoral também se correlaciona com a recaída precoce. A medida


mais precisa é a análise da fase S usando citometria de fluxo. Análises indirectas da fase S
utilizando antigénios relacionados com o ciclo celular como o Ki67 (PCNA) também são
relevantes. A quimioterapia é a melhor opção em termos de sobrevivência para tratar tumores
cuja proporção de células em fase S seja superior à média, representando um maior risco de
recaída.

A classificação histológica do tumor constitui mais um factor prognóstico – tumores com pior
grau nuclear têm maior risco de recorrência. As alterações moleculares tumorais também são
úteis. Tumores que sobrexpressam HER2 ou têm um gene p53 mutado têm pior prognóstico.
Adicionalmente, a sobrexpressão de HER2 associa-se a maior probabilidade de resposta a
regimes contendo doxorubicina e prediz a resposta terapêutica a anticorpos anti-HER2
(trastuzumab) e a inibidores do domínio cinase do HER2.

Terapia Sistémica da Doença Metastática: Cerca de um terço das pacientes tratadas para
cancro da mama aparentemente localizado, desenvolvem doença metastática. A sobrevivência
média para as pacientes nesta fase é inferior a 3 anos. As metástases nos tecidos moles, no osso
e nas vísceras (pulmão e fígado) contabilizam aproximadamente um terço dos locais iniciais de
recaída. Contudo, na altura da morte, a maioria das pacientes apresenta envolvimento ósseo.
Cerca de metade das recorrências ocorre passados mais de 5 anos desde a terapia do tumor
primário.

Na suspeição de doença metastática, deve ser sempre realizada biópsia confirmatória. Note-
se que podem existir alterações no estatuto dos receptores hormonais que afectem a decisão
terapêutica. Uma vez que a terapia da doença sistémica é paliativa as toxicidades potenciais
devem ser pesadas contra as taxas de resposta. A presença de receptores hormonais influencia
positivamente a resposta a terapia endócrina, enquanto esta resposta é improvável em caso de
rápidas recaídas e doença visceral progressiva. A radioterapia e eventualmente a cirurgia são
efectivas em aliviar os sintomas de doença metastática, particularmente com envolvimento
ósseo. As pacientes com doença exclusiva ou maioritariamente condicionada ao osso têm um
curso relativamente indolente, no qual a quimioterapia sistémica possui um efeito modesto,
enquanto a radioterapia pode ser eficaz por longos períodos. O tratamento concorrente com
bifosfonatos pode providenciar benefício paliativo. O objectivo terapêutico major é manter o
bem-estar da paciente pelo maior período de tempo possível, evitando as complicações mais
dramáticas da doença metastática. Por isso, a definição realista das expectativas dos
tratamentos deve ser estabelecida junto dos pacientes e familiares.

Terapia Endócrina: O tecido mamário normal é dependente de estrogénios, fenótipo que


pode ser retido pelo cancro primário e metastático. A resposta à terapia hormonal ronda os
30% para tumores ER+ e PR-negativos e atinge os 70% para tumores positivos para os dois
receptores. Se nenhum receptor estiver presente a taxa de resposta objectiva é inferior a 5%.
Devido à baixa toxicidade e pelo facto de mesmo alguns dos pacientes com receptores negativos
responderem à terapia, o tratamento endócrino deve ser tentado em todas as pacientes com
cancro da mama metastático. Na maioria das mulheres pós-menopáusicas prefere-se a

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iniciação da terapia com um inibidor da aromatase, em vez de tamoxifeno. Os inibidores da
aromatase não são utilizados em mulheres pré-menopáusicas porque o seu hipotálamo pode
responder à privação estrogénica produzindo gonadotropinas que promovem a síntese
estrogénica. A síntese endógena de estrogénios pode ser bloqueada por análogos da LHRH em
mulheres pré-menopáusicas. Os agentes anti-estrogénios puros, livres de efeitos agonistas,
também são efectivos. A combinação de várias terapias endócrinas não parece superar
monoterapia e as combinações de quimioterapia com terapia endócrina não são úteis. Os
pacientes com doença metastática hormono-dependente podem responder à terapia endócrina
durante 3 a 5 anos ou até possivelmente mais. A adição de everolimus, um inibidor da mTOR,
ao tratamento hormonal parece benéfica.

Quimioterapia: O cancro da mama responde a múltiplos agentes quimioterapêuticos,


incluindo as antraciclinas, os agentes alquilantes, os taxanos e os anti-metabolitos. As
combinações destes agentes melhoram as taxas de resposta, mas não surtem efeitos na
duração da resposta e na sobrevivência. A escolha da combinação depende frequentemente
do tipo de quimioterapia adjuvante que poderá ter sido utilizada previamente, preferindo-se
utilizar agentes a que os pacientes não tenham sido expostos. Quando há progressão da doença
sob tratamento com regime de combinação, é mais comum optar-se pela monoterapia
subsequente.

Cancro da Mama nos Homens: Costuma apresentar-se como um relevo unilateral e


frequentemente não é diagnosticado atempadamente por ser mais inesperado, o que faz com
que as formas localmente avançadas sejam comuns. O risco é muito mais elevado em homens
com ginecomastia. Aproximadamente 90% dos cancros são ER+.

Prevenção do Cancro da Mama: As mulheres que tiveram cancro da mama têm um risco de
desenvolver cancro da mama contralateral (primário) aumentado. Este risco é reduzido pela
administração adjuvante de tamoxifeno (que tem outros efeitos estrogénio-like benéficos,
como a preservação da densidade óssea, mas também tem efeitos deletérios como o aumento
do risco de cancro do útero) e inibidores da aromatase.

Follow-up dos Pacientes com Cancro da Mama: Apesar da disponibilidade de técnicas de


imagem sofisticadas e duma grande variedade de marcadores tumorais séricos, a sobrevivência
não é influenciada pelo diagnóstico precoce da recaída.

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Tailoring therapies—improving the management of early breast
cancer: St Gallen International Expert Consensus on the Primary
Therapy of Early Breast Cancer 2015
A 14ª Conferência Internacional de Cancro da Mama de St Gallen reviu novas evidências
acerca das terapias locoregionais e sistémicas para o cancro da mama precoce.

Há evidência crescente do valor prognóstico de marcadores moleculares multiparâmetros,


alguns dos quais comportam informação acerca da recaída tardia. Os resultados desses testes
são frequentemente utilizados para auxiliar decisões acerca da inclusão de quimioterapia
citotóxica no tratamento de pacientes com doença luminal, mas não tinham sido estabelecidos
valores limite que justificassem este propósito para nenhum dos testes. Estes testes são
dispendiosos e não estão disponíveis em muitos locais do mundo. A maioria dos novos casos de
cancro da mama e das mortes associadas ocorrem em zonas menos desenvolvidas do mundo,
onde testes de patologia menos caros poderão providenciar alguma informação útil. As
considerações económicas também se poderão aplicar ao tratamento.

Introdução: A 14ª Conferência Internacional de Cancro da Mama de St Gallen confirmou e


expandiu as recomendações anteriores. Este relatório pretende providenciar uma abordagem
prática para a alocação de terapias disponíveis para os pacientes individuais, à luz da mais
recente e confiável informação científica. O foco desta análise são os factores do tumor - como
a presença ou ausência de características que podem constituir um alvo terapêutico, sobretudo
os receptores hormonais e o HER2, bem como o potencial metastático, reflectido na medida
da proliferação e da extensão anatómica da doença – e os factores da paciente, nomeadamente
a relação com a menopausa, a idade, a presença de comorbilidades e a sua preferência pessoal.

St Gallen 2015 - Notícias e Progresso: A nível mundial, grande parte das regiões tem
registado um aumento de incidência de cancro da mama. Em muitas regiões, especialmente
nos países menos desenvolvidos, há recursos limitados para tratar esta doença, bem como para
realizar testes laboratoriais. Assim, o desenvolvimento de tratamentos efectivos menos
dispendiosos é prioritário.

Emergiu um paradoxo curioso no âmbito da terapia local: a abordagem cirúrgica permanece


com a tendência a realizar cirurgias cada vez menos extensas sem se comprometer o outcome,
mas ensaios com radioterapia em doença com gânglios positivos foram superiores em termos
de controlo da doença se os campos de radiação incluíssem as áreas dos gânglios linfáticos
regionais.

A administração de inibidores da aromatase (AIs) como terapia adjuvante a pacientes pós-


menopáusicas revelou que estas pacientes têm menos recorrências do que quando é utilizado
tamoxifeno.

Subtipos de Cancro da Mama: A análise genómica exaustiva descodifica quatro grupos,


semelhantes aos subtipos intrínsecos definidos pelos perfis de expressão génica. Os subtipos
podem ser definidos pelos testes moleculares multiparâmetros como o PAM-50 ou o
MammaPrint/BluePrint. O objectivo último será discriminar quais os pacientes que irão ou não
irão beneficiar de terapias particulares. Vários marcadores incluídos nestes testes foram
utilizados com este intuito. Como em muitas regiões estes testes poderão não estar disponíveis,

215
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tentaram desenvolver-se aproximações utilizando testes de imunohistoquímica para o ER, para
o PgR e para o HER2 (também podendo ser utilizada a FISH para detectar a
sobrexpressão/amplificação). O Ki-67 é utilizado como marcador alternativo da proliferação,
embora com menos valor analítico do que o teste molecular. Estas características patológicas
padronizadas parecem adequadas para definir grupos como os cancros triplo-negativo, os
cancros negativos para os receptores hormonais e HER2+ e os cancros HER2+ e positivos para
os receptores hormonais, para os quais o tratamento é mais ou menos consensual. É entre os
pacientes com doença luminal, definida pela presença de ER+ e/ou PgR+ e HER2-negativos que
a incerteza acerca do tratamento óptimo é mais comum, já que os clínicos temem o sobre ou o
infra-tratamento.

NOTA: Os testes moleculares multiparâmetros incluem como marcadores genes relacionados com a
actividade proliferativa, sendo que a maioria da informação prognóstica pode advir desta inclusão. A
utilização do ensaio Ki-67 é controversa, uma vez que apesar de ser um marcador imunohistoquímico
com valor prognóstico – valores elevados predizem o benefício da adição de quimioterapia citotóxica –
a definição de um cut point único é elusiva porque a distribuição do Ki-67 é contínua.

Cirurgia do Tumor Primário: A margem cirúrgica mínima aceitável é definida como “sem
tinta no carcinoma invasivo ou no carcinoma ductal in situ”. A conclusão aplica-se
independentemente das características do tumor como sejam a histologia lobular, um
componente intraductal extenso, idade jovem, multifocalidade ou multicentralidade e subtipos
biologicamente desfavoráveis. Os tumores multifocais e multicêntricos poderão ser tratados
com cirurgia conservadora se assegurada a limpeza das margens e planificada a radioterapia de
toda a mama. Não parece ser necessário ressectar toda a área do tumor primário original, se o
estádio tiver diminuído após quimioterapia neoadjuvante.

Cirurgia da Axila: Pacientes com macrometástases em um ou dois gânglios sentinela


requerem dissecção axilar depois da mastectomia se não se planear radioterapia (não é
consensual se a mastectomia deve ser seguida de radioterapia). Aceita-se a omissão de
ressecção axilar se a radioterapia for planeada após ressecção conservadora (especialmente
se incluir a região axilar inferior). Numa paciente com um gânglio linfático positivo que desça de
estádio após quimioterapia neoadjuvante considera-se que a biópsia do gânglio sentinela é
apropriada, requerendo-se a dissecção dos gânglios axilares se um gânglio sentinela for positivo.
As taxas de falsos negativos permanecem elevadas, a menos que três ou mais gânglios sentinela
sejam examinados.

Radioterapia: Após cirurgia mamária conservadora a radiação deve ser limitada à mama
apenas se os gânglios forem negativos. A seguir à mastectomia a radioterapia deverá ser
standart para pacientes com tumores superiores a 5cm, com biópsia de gânglio sentinela que
revele a presença de macrometástases e para pacientes com um a três gânglios envolvidos com
patologia adversa. Após reconstrução mamária imediata, a radioterapia deverá incluir os
gânglios linfáticos e a mama reconstruída na maioria dos casos. A descida de estadiamento após
terapia sistémica neoadjuvante não obvia a necessidade de a radioterapia se aplicar à extensão
inicial da doença antes da terapia.

Patologia: A distinção entre tumores HER2-negativos luminal-A – muito endócrino-


responsivos, pouco proliferativos e com bom prognóstico – e tumores HER2-negativos luminal-
B – com as características contrárias – pode ser derivada de testes de imunohistoquímica (ER,

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PgR, Ki-67). É maioritariamente aceite que um valor limite do Ki-67 entre 20 a 29% possa ser
utilizado para distinguir a doença luminal-B. Alguns especialistas acreditam que a determinação
de subtipo pudesse ser substituída pelo acesso a scores de risco derivados de marcadores
moleculares multiparâmetros. A maioria não aceita que a presença de TILs seja um marcador
prognóstico ou preditivo.

Clinicamente, testes que têm valor prognóstico mas que não são especificamente preditivos
da eficácia da terapia citotóxica são utilizados para auxiliar decisões acerca dessa terapia. Isto
tem por base a definição dum grupo de pacientes cujo prognóstico é tão bom que mesmo que
quimioterapia fosse proporcionalmente tão efectiva como em pacientes de alto risco o benefício
absoluto pode ser insuficiente para justificar o tratamento. De maneira semelhante, um teste
que indique um mau prognóstico pode justificar a utilização de terapia endócrina efectiva mais
tóxica ou de quimioterapia mais intensiva ou prolongada.

Terapia Endócrina Adjuvante para Pacientes Pré-menopáusicas: Os factores a favor da


inclusão da supressão da função ovariana (com tamoxifeno ou exemestano) incluem a idade
igual ou inferior a 35 anos, a persistência de níveis de estrogénio pré-menopáusicos após a
quimioterapia adjuvante ou o envolvimento de quatro ou mais gânglios axilares
(eventualmente, pode ser considerada a doença de grau 3 ou a existência de resultados adversos
de um teste de marcadores moleculares multiparâmetros). Os factores a favor da utilização de
um inibidor da aromatase conjuntamente com a supressão da função ovárica em vez de
tamoxifeno, garantida a mesma supressão são praticamente idênticos (salvo a controvérsia
acerca da persistência de níveis de estrogénio pré-menopáusicos após a quimioterapia
adjuvante). Na hipótese de se optar pela supressão da função ovárica, tal terapia deverá durar
5 anos e até mesmo 10 anos para mulheres pré-menopáusicas que inicialmente revelassem
gânglios positivos ou outra patologia adversa.

Terapia Endócrina Adjuvante para Pacientes Pós-menopáusicas: Algumas pacientes podem


ser tratadas unicamente com tamoxifeno. Todavia, o envolvimento de quatro ou mais gânglios
linfáticos, a patologia de grau 3 ou o Ki-67 elevado (e eventualmente a positividade para o HER2)
favorecem a inclusão dum inibidor da aromatase. A administração dum inibidor da aromatase
deverá ser de 1ª linha em pacientes de risco elevado. Caso se aplique, poderá trocar-se a
terapêutica para tamoxifeno ao fim de dois anos. Após 5 anos de tamoxifeno adjuvante as
pacientes com doença inicialmente gânglio-positiva devem continuar com a terapia endócrina
até 10 anos. O mesmo se poderá aplicar a pacientes com tumores de grau 3, alto Ki-67 e a
pacientes cuja menopausa tenha ocorrido durante os 5 anos de utilização de tamoxifeno. As
pacientes cujos 5 anos iniciais de terapia adjuvante envolveram uma mudança de tamoxifeno
para um inibidor da aromatase, deverão continuar a última terapia até a duração cumulativa da
utilização de inibidores da aromatase atingir os 5 anos.

Quimioterapia Citotóxica Adjuvante: As indicações de quimioterapia citotóxica adjuvante


para pacientes com doença luminal incluem a histologia grau 3, a positividade de quatro ou mais
gânglios linfáticos, a baixa marcação imunohistoquímica de receptores hormonais, Ki-67 elevado
e invasão linfovascular extensa. Crê-se que o fenótipo luminal A é menos responsivo à
quimioterapia, não justificando o tratamento com base no tamanho do tumor e na invasão
linfovascular. Porém, a positividade de quatro ou mais gânglios linfáticos permanece um critério.
Nem todos os pacientes com doença do tipo luminal-B carecem de quimioterapia. Pode ser

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omitida nos casos com baixo score nalguns testes de multiparâmetros moleculares. Quando a
quimioterapia citotóxica é indicada para a doença luminal, o regime específico depende da
posição no espectro de responsividade endócrina e risco de recaída. Para os tumores luminal-
B e triplo-negativo é recomendada a inclusão duma antraciclina e dum taxano, enquanto para
os tumores luminal-A há pouca vantagem em relação a regimes antigos, como o AC e o CMF. A
terapia baseada em agentes platinum não deve ser rotineiramente utilizada em pacientes sem
mutação BRCA.

Terapias anti-HER2 Adjuvantes: Não é suportado o bloqueio dual do HER2, adicionando


pertuzumab ou lapatinib ao trastuzumab para terapia adjuvante pós-operatória.

Quimioterapia Citotóxica Neoadjuvante para Doença Luminal: Não é recomendada para


pacientes com doença do tipo luminal-A, podendo ser contemplada se a cirurgia conservativa
não for realizável doutra forma. Em pacientes com doença do tipo luminal-B continua a não ter
grande aceitação.

Terapia Sistémica Neoadjuvante para Doença Estádio II HER2+: A terapia dual anti-HER2
com um taxano, trastuzumab e pertuzumab é aceitável para estes pacientes.

Terapia Sistémica Neoadjuvante para Pacientes com Tumores Triplo-negativos: É


favorecida a utilização dum tratamento baseado em taxanos e antraciclinas.

Terapias Endócrinas Neoadjuvantes: É uma boa opção para pacientes pós-menopáusicas


com doença endocrinamente responsiva.

Bifosfonatos: A utilização de bifosfonatos, como o ácido zoledrónico ou o clodronato,


visando o aumento da sobrevivência livre de doença não é unanimemente aceite. Nas pacientes
pós-menopáusicas parece ser aceite, ao contrário das mulheres pré-menopáusicas que recebem
LHRH e tamoxifeno. Não é suportada a administração de denosumab em substituição dos
bifosfonatos.

Pacientes Idosas: Não há um limite etário para a utilização de regimes quimioterapêuticos


standart. A administração de tais tratamentos é dependente das características da doença, das
comorbilidades, da esperança de vida e da preferência do paciente.

Pacientes Jovens: O teste para as mutações BRCA1 e 2 é indicado em pacientes com idade
inferior a 40 anos. É fortemente recomendada a supressão da função ovariana durante a
quimioterapia (utilizando agonistas LHRH) para doença ER-negativa, de modo a preservar a
função ovariana e a fertilidade.

Mutações de Alto Risco: A presença de mutações BRCA1 e 2 parece influenciar o tratamento


locoregional e neoadjuvante, mas não o tratamento adjuvante.

Cancro da mama diagnosticado durante a gravidez: O parto prematuro deve ser evitado, se
possível, e os regimes standart de quimioterapia devem ser oferecidos durante o terceiro ou o
segundo trimestre, mas não devem ser utilizadas terapias anti-HER2 ou endócrinas.

Tentativas de Engravidar após o Cancro da Mama: Reconhece-se a possibilidade de


interromper a terapia endócrina após 18 a 30 meses, na ausência de factores de risco elevados.

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Cancro da Mama no Homem: O tratamento adjuvante actualmente relevante é o
tamoxifeno.

Factores do Estilo de Vida para Reduzir o Risco de Recorrência: Deve-se sobretudo incitar a
prática de exercício físico e a perda/manutenção de peso.

SUMÁRIO:
Cirurgia:

 Não há benefício além de se atingirem margens “sem tinta em carcinoma invasivo ou carcinoma ductal
in situ”.
 A dissecção axilar pode ser evitada para pacientes com um ou dois gânglios linfáticos
macrometastáticos.

Radioterapia:

 O controlo da doença e a sobrevivência são melhorados quando os campos de radiação incluem as áreas
dos gânglios linfáticos regionais, em pacientes com doença com envolvimento ganglionar.

Terapias sistémicas neoadjuvantes:

 Embora não se admitam benefícios em termos de sobrevivência superiores aos da terapia adjuvante
pós-operatória, há suporte à terapia neoadjuvante citotóxica para doença estádio II triplo-negativa e
para combinação de quimioterapia e terapia anti-HER2 em pacientes com grandes tumores HER2+.

Terapias sistémicas adjuvantes pós-operatórias:

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Breast Cancer:
Ready for Prime Time?
A identificação de biomarcadores com valor prognóstico e preditivo é alvo da investigação
na área do cancro. É especialmente importante quando se trata cancro da mama precoce no
âmbito adjuvante, porque a capacidade de estimar com precisão o risco de recaída permite a
optimização das diferentes opções terapêuticas, incluindo a decisão de utilizar terapia
citotóxica.

Recentemente, a atenção tem-se focado no efeito do sistema imunitário na resposta à


terapêutica e no prognóstico. Neste contexto, a presença de TILs dentro ou ao redor do tumor
tem sido reportada como um importante biomarcador. A presença desta resposta do
hospedeiro parece correlacionar-se com bom prognóstico, particularmente nos pacientes com
tumores triplo-negativos.

Analisaram-se vários estudos que associaram a presença de TILs e a sobrevivência em geral.


A combinação de todos os dados de forma indiscriminada não provou a associação. No entanto,
diferenças significativas foram observadas quando a análise discernia a localização dos TILs. A
presença elevada de TILs no estroma peri-tumoral associa-se com aumento da sobrevivência
(resultados semelhantes verificam-se quando apenas se incluem estudos que contemplam
cancros da mama triplos-negativos). Ao se avaliar a presença de TILs intra-tumorais os
resultados são muito heterogéneos não fortalecendo a associação com o aumento da
sobrevivência. A existência de TILs estromais é vista como uma reacção imune do hospedeiro
contra o tumor e, no caso específico do cancro da mama triplo-negativo, pode representar o
fenótipo imune descrito por análises de expressão génica.

Uma fracção significativa da heterogeneidade observada pode ser explicada pela diversidade
de marcadores disponíveis para identificar TILs (ex: CD3, CD8 e FOXP3), pela variabilidade dos
valores cut-off utilizados para definir os altos níveis de TILs (ex: números absolutos ou proporção
ente os linfócitos e o restante infiltrado inflamatório) e ainda pela definição da localização dos
TILs. A sua utilidade clínica como biomarcador está, portanto, dependente da uniformização
destes critérios.

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
Clinical Utility of Circulating Tumor Cells in
Metastatic Breast Cancer
Há alguns meses foi reportada, numa grande análise combinada, a validade clínica da
utilização das CTCs como um biomarcador prognóstico dinâmico. Porém, o estudo
recentemente publicado acerca do ensaio aleatorizado SWOG S0500 que avaliou a
sobrevivência teve resultados contraditórios. Ainda assim, estes resultados eram previsíveis,
na medida em que a quimiorresitência à terapia de 1ª linha está frequentemente associada com
resistência generalizada às linhas subsequentes de terapia. Além disso, a transição precoce para
uma segunda linha quimioterapêutica nunca demonstrou utilidade clínica no cancro da mama
metastático.

Outros problemas têm de ser considerados para compreender totalmente os resultados


publicados. Primeiro, o teste de resposta CTC serve o propósito de detectar a resistência
precoce ao tratamento e exibe melhores performances em populações com elevada
prevalência de quimiorresistência.

Em segundo lugar, o teste de resposta CTC idealmente seria 100% sensível e específico para
detectar a progressão tumoral precoce: pacientes com quimiorresistência precoce teriam
abandonado o tratamento de 1ª linha não efectivo após um mês de tratamento, se avaliados
pelo teste de resposta CTC e após três meses de tratamento, se avaliados radiologicamente.
Não contemplando a performance real do teste, é improvável que esta diferença de dois meses
no início da doença metastática se traduza em aumento significativo da sobrevivência a longo
prazo para os pacientes no braço CTC, o principal end point do estudo.

Em terceiro lugar, o limite definido para se obter validade clínica pode diferir daquele que é
relevante para a utilidade clínica. O limite de ≥5 CTCs/7,5mL foi inicialmente proposto,
permitindo distinguir duas populações de pacientes com cancro da mama metastático com bom
e mau outcome em termos de sobrevivência. Contudo, não se sabe se este é o melhor limite
como para um teste de resistência precoce.

Em suma, embora negativos, os resultados do ensaio SWOG0500 suportam a validade clínica


do teste de resposta CTC. Existem ensaios a decorrer na Europa que pretendem demonstrar a
utilidade clínica da detecção de CTCs em pacientes com cancro da mama como um factor
prognóstico, como um teste dinâmico de prognóstico ou como uma ferramenta para reavaliar o
estatuto HER2 do tumor.

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
TUMOR MICROENVIRONMENT AND
SIGNALLING

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Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
Cellular Oncogenes
A origem viral da tumorigénese não é extrapolável para a maioria dos tumores. Clusters de
casos de cancro, mini-epidemias, são difíceis de encontrar. Das centenas de tumores
identificados na oncologia clínica, apenas dois tumores comuns – o carcinoma cervical e o
hepatoma – estão claramente associados a agentes causativos virais. Há outra fonte de genes
responsáveis pelo cancro e essa fonte é o próprio genoma humano.

Os investigadores que iniciaram o estudo da carcinogénese não viral previram que as células
transformadas por agentes mutagénicos físicos ou químicos continham genes mutados,
responsáveis pelo crescimento aberrante destas células. Para comprovar a existência de
oncogenes não virais nas células quimicamente transformadas, transfectou-se DNA de células
transformadas em células normais para determinar se as células ficariam transformadas devido
ao DNA tumoral introduzido. A identidade das células dadoras foi difícil de escolher: não era
claro se todos os tipos de células cancerosas possuíam genes transformantes – oncogenes
celulares - e também não era claro se um gene com capacidade de transformar uma célula
epitelial seria capaz de o fazer numa célula mesenquimatosa ou se um gene que conseguia
transformar uma célula humana conseguiria transformar uma célula murina.

Assim, escolheu-se células tumorais dadoras derivadas de fibroblastos de ratinhos


transformadas pelo agente 3-MC. Transfectou-se o DNA destas células para fibroblastos normais de
ratinho e múltiplos focos celulares de células independentes de ancoragem e tumorigénicas
apareceram. Provou-se que o DNA tumoral do dador possuía elementos genéticos transformantes.
O DNA extraído de células cancerosas de vários tipos de tumor humanos também conseguia
transformar os fibroblastos murinos.

NOTA: Como apenas 0,1% do genoma do dador se estabelece efectivamente no genoma duma célula
transfectada é muito improvável que dois genes independentes geneticamente não ligados fossem
introduzidos na mesma célula. Daí infere-se que apenas um gene seria responsável pela transformação
das células normais.

Os oncogenes detectados eram derivados de genes celulares normais pré-existentes sem


função oncogénica. Em termos latos, isto parece relembrar a activação de proto-oncogenes em
oncogenes por retrovírus. Havia a hipótese de os proto-oncogenes activados pelos retrovírus
serem os mesmos activados por mutagénicos não virais. Utilizando a técnica de Southern Blot,
verificou-se que as provas radio-marcadas derivadas de oncogenes retrovirais conseguiam
reconhecer e hibridar com oncogenes presentes no DNA proveniente de carcinomas humanos,
descobertos pelos métodos de transfecção. Assim, os oncogenes transfectados apresentam um
grau de homologia considerável com os oncogenes retrovirais.

223
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NOTA: Exemplo: O gene erbB, presente no vírus da eritroblastose aviária, está presente (o seu
oncogene relacionado) em número de cópias aumentado em tumores humanos da mama e do estômago,
entre outros. A amplificação génica do erbB2 está frequentemente mas não sempre correlacionada com
o aumento da expressão da proteína codificada. A unidade de de DNA amplificado – o amplicon – inclui
DNA cromossómico que rodeia o oncogene (região 17q), resultando na amplificação de genes vizinhos.
Alguns dos genes co-amplificados podem colaborar na produção do fenótipo maligno. Pacientes com
cancro da mama, cujos tumores expressam níveis normais desta proteína sobrevivem em média 6 a 7
anos, enquanto as pacientes cujos tumores sobrexpressam a proteína sobrevivem apenas 3 anos. Esta e
outras conexões provaram que muitos dos oncogenes encontrados nos retrovírus aviários ou de
mamíferos podiam ser encontrados num estado mutado e activado nos genomas das células tumorais
humanas.

Os proto-oncogenes podem ser activados por alterações genéticas que afectem quer a
expressão quer a estrutura da proteína que codificam. Numa célula normal, a transcrição dum
proto-oncogene é regulada pelo seu promotor, a sequência genómica que permite a resposta a
uma grande variedade de sinais fisiológicos. Por isso, a amplificação génica não pode ser
evocada como mecanismo explicativo da activação de proto-oncogenes em muitos dos tumores
humanos de origem não viral.

Os proto-oncogenes clonados revelaram ser muito semelhantes em estrutura e tamanho


aos oncogenes relacionados. No entanto, as duas versões tinham comportamentos biológicos
claramente distintos. O mapeamento de locais de clivagem utilizando várias enzimas de
restrição não revelou diferenças estruturais distinguíveis. Só através de técnicas de
sequenciação se conseguiu finalmente identificar estas diferenças extremamente subtis:
substituições de um único par de bases, ou seja mutações pontuais, podiam ser o único
requisito para converter um gene normal num oncogene potente.

NOTA: Esta descoberta veio elucidar a origem do carcinoma da bexiga do qual se clonou o oncogene
H-ras que foi analisado, mas o princípio podia ser extrapolar-se para muitos outros tumores. Este
carcinoma surgiu num homem de meia-idade, fumador há quatro décadas. Os carcinogénicos do tabaco
atingem a circulação e o sistema excretor. As espécies químicas presentes na urina conseguiram entrar
nalgumas células epiteliais que revestem o lúmen vesical e atacar o DNA. Eventualmente, conseguiram
introduzir uma mutação pontual no proto-oncogene H-ras, convertendo-o a oncogene e transformando
a célula.

Este evento – uma mutação somática - marca o início da progressão tumoral. A mutação
ocorreu no quadro de leitura, ou seja, na região que codifica a sequência de aminoácidos da
proteína. Existem portanto genes cujo potencial oncogénico está dependente da alteração da
estrutura da proteína que codificam, como o H-ras, e outros cujo potencial oncogénico
depende da desregulação da sua expressão e aumento da concentração da proteína codificada,
como o myc. Existem, então, mecanismos de activação de proto-oncogenes estruturais e
regulatórios, que podem colaborar entre si.

224
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Há três proto-oncogenes
ras (H, K, N) que podem ser
activados a oncogenes. A
frequência com que cada um
dos oncogenes é encontrado
varia extraordinariamente de
tumor para tumor. Estas
diferenças são atribuíveis
sobretudo às sequências
regulatórias que controlam a
expressão de cada um dos
oncogenes, e não à estrutura
da oncoproteína codificada.

NOTA: A clonagem de oncogenes transfectados não identificados foi possível utilizando provas de DNA
que reconhecessem as sequências Alu humanas. Existe cerca de um milhão deste tipo de sequências
dispersas no genoma humano, o que significa que, virtualmente, todos os genes humanos estão em
proximidade com pelo menos uma sequência deste tipo. Apenas 0,1% do DNA genómico do dador se
consegue estabelecer nas células murinas transfectadas. As células transformadas contêm o oncogene e
cerca de 103 sequências Alu humanas. Como este número ainda é elevado, o DNA humano reconhecido
foi extraído, fragmentado e utilizado num segundo ciclo de transfecção. Mais uma vez, apenas 0,1% desse
DNA foi integrado. Nas células transformadas as sequências Alu deviam estar em grande proximidade
com o oncogene humano, permitindo a sua identificação.

O oncogene myc pode ser activado através de pelo menos três mecanismos adicionais.
Nalguns tumores humanos, a expressão do gene myc continua a ser regulada pelo seu promotor
transcripcional mas o número de cópias deste gene está amplificado. Em 30% dos
neuroblastomas pediátricos, especialmente nos tumores mais agressivos, o gene N-myc está
amplificado. Isto resulta no aumento do seu produto génico – a proteína Myc, que possui efeitos
proliferativos. O processo de amplificação génica ocorre através da replicação preferencial de
uma região limitada de DNA cromossómico, deixando as regiões cromossómicas distantes
intactas.

NOTA: A região amplificada é detectável microscopicamente como HSRs (homogeneously staining


regions). A região que contém o gene myc pode ainda separar-se do cromossoma e ser detectada como
um pequeno elemento genético extracromossómico replicando-se independentemente – cromossomas
DM (double-minute).

O mecanismo de mutagénese derivada da inserção do vírus ALV (o proto-oncogene c-myc


humano fica sob o controlo transcripcional do pró-vírus ALV) veio sugerir a existência de outro
modo de activação do proto-oncogene c-myc: mesmo que continue a residir na localização
cromossómica normal pode ser activado se o seu controlo transcripcional for exercido por
promotores ectópicos. Este princípio foi validado pela observação de células de linfoma de
Burkitt.

225
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Os cromossomas metafásicos apresentam translocações,
normalmente recíprocas, envolvendo o cromossoma 8, onde
se localiza o gene myc, e o cromossoma 2, 14 ou 22. Num dos
lados do local de fusão/breakpoint encontra-se a sequência
promotora de um dos três genes que codificam as
imunoglobulinas. De facto, as enzimas responsáveis pelo
rearranjo de sequências dos genes que codificam os
anticorpos podem perder a especificidade e fundir parte de
um gene que codifica o anticorpo com o proto-oncogene myc.
Estas translocações separam o gene myc do seu promotor
normal e colocam-no sob o controlo transcripcional de
promotores muito activos pertencentes a um gene que
codifica uma imunoglobuina. Assim, o myc torna-se um
oncogene potente capaz de liderar a proliferação de células
linfoides, onde estes promotores transcripcionais são muito
activos. No entanto, permanece por explicar o papel do EBV
na patogénese do linfoma de Burkitt.

NOTA: A infecção crónica com malária, em conjunto com a malnutrição, pode comprometer as defesas
imunitárias das crianças (sobretudo africanas), deixando-as susceptíveis a infecções por EBV que terão
um efeito aditivo da debilitação do sistema imune. As infecções por EBV podem imortalizar populações
de linfócitos B estimulados a proliferar devido à infecção viral. Nalgumas células a translocação descrita
pode ocorrer, levando ao aparecimento de linfomas. É intrigante que nas populações ocidentais a infecção
por EBV seja comum e cause mononucleose em indivíduos imunocompetentes, não sendo frequente o
aparecimento de neoplasias.

Translocações com efeito oncogénico podem ser encontradas noutros tumores,


especialmente em neoplasias hematopoiéticas.

NOTA: As translocações podem não ser obrigatoriamente conducentes a um maior poder


transformante da proteína híbrida, graças à fusão com reguladores positivos da transcrição. Podem
simplesmente causar a delecção de locais de reconhecimento de microRNAs, diminuindo a influência de
reguladores negativos da tradução de mRNAs. Os genes que codificam os microRNAs podem até constituir
alvos de fusão com promotores ectópicos. Nas leucemias mieloides agudas o microRNA
subsequentemente sobrexpresso bloqueia a diferenciação celular. Assim, é possível que translocações
que envolvam genes não codificantes de proteínas afectem o comportamento celular.

Nas células cancerosas, existem outros mecanismos para além da amplificação génica e da
translocação cromossómica que permitem que genes com configuração e número de cópias
normais sejam sobrexpressos, através da acção de factores de transcrição desregulados. Além
disso a amplificação génica não implica obrigatoriamente a sobrexpressão dos mRNAs e das
proteínas correspondentes, sugerindo a existência de regulação por mecanismos de feedback
negativo que asseguram níveis de expressão fisiologicamente apropriados mesmo na presença
de cópias excessivas destes genes.

Diversas mudanças estruturais podem conduzir à activação de oncogenes.

A delecção do ectodomínio do EGFR, despoletando sinalização ligando-independente pelo


receptor de factores de crescimento truncado, está documentada em cerca de um terço dos
glioblastomas.

226
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As translocações cromossómicas, não só resultam na expressão inadequada de proteínas
oncogénicas ou de microRNAs (fusão de sequências regulatórias da transcrição com sequências
codificantes), como commumente levam à formação de novas proteínas híbridas. Em 95% dos
casos de leucemia mieloide crónica a t(9;22)(q34;q11) está presente e resulta na proteína de
fusão Bcr-abl. A proteína Abl começa a emitir sinais promotores de crescimento de forma
desregulada.

RESUMO:

As alterações nos proto-oncogenes que afectem o controlo da expressão ou a estrutura das


proteínas codificadas podem ser responsáveis pela sua activação em oncogenes que promovam
o crescimento;

Um repertório comum de proto-oncogenes pode ser activado por aquisição retroviral ou por
mutação somática;

227
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Cerca de 20% das mortes por cancro a nível mundial estão associadas a tumores induzidos
por agentes infeciosos (9% atribuíveis aos cancros do estômago, 6% aos hepatomas, 5% aos
carcinomas cervicais);

Há vírus que possuem oncogenes virais que alteram a fisiologia das células infectadas,
criando um ambiente intracelular mais propício à replicação viral – o cancro é um efeito
colateral das mudanças que favorecem a replicação viral, desregulando a proliferação celular
e evitando a apoptose.

228
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Dialogue Replaces Monologue: Heterotypic
Interactions and the Biology of Angiogenesis
O cancro é uma doença das células e o fenótipo das células pode ser entendido como o
produto do seu genótipo. Este conceito é muito reducionista, pois tenta compreender um
sistema complexo, a célula, a partir de um dos seus componentes, a molécula de DNA. Nesta
visão simplista, o cancro é um processo autónomo, ao nível celular, e todos os atributos das
células cancerosas são compreensíveis em termos dos genes que estas células possuem. Aliás,
todos os traços da massa tumoral podem ser reportados ao comportamento da célula individual.
Isto não é verdade. De facto, o cancro é uma doença do tecido. Os carcinomas, que contabilizam
mais de 80% dos cancros humanos, derivam de tecidos epiteliais de estrutura microscópica
altamente complexa. A caracterização histopatológica destes tumores epiteliais revela o grande
número de intervenientes celulares distintos, em particular, as células não-neoplásicas do
estroma que podem contabilizar até 90% das células na massa tumoral. Estas células são
intervenientes activas na progressão tumoral e são colaboradoras essenciais das células
neoplásicas, tendo sido recrutadas e exploradas pelas células cancerosas.

Quer os tecidos epiteliais normais quer os tecidos epiteliais neoplásicos são formados por
tipos celulares interdependentes. As células não neoplásicas estromais incluem os fibroblastos,
as células endoteliais, os péricitos, as células musculares lisas, os adipócitos, os macrófagos, os
linfócitos e os mastócitos. Uma dimensão adicional de complexidade provém da grande variação
na proporção entre os tipos celulares derivados da medula-óssea, alguns dos quais participam
em etapas da cascata de invasão-metástase. Outros são dispensados pelo sistema imunitário
para erradicar as células tumorais. A diversidade de tipos celulares que infiltra o estroma das
massas tumorais deriva das linhas celulares mesenquimais, sendo biologicamente distintos do
compartimento de células epiteliais cuja transformação impulsiona a carcinogénese.

NOTA: Vários anticorpos podem ser utilizados nas técnicas de imunohistoquímica, de forma a
identificar tipos celulares mesenquimatosos específicos, entre os que figuram no estroma associado ao
tumor. Exemplos: CD45 – marcador de leucócitos, excepto plasmócitos; CD31 – células endoteliais.

A presença destes vários tipos de células estromais pode dever-se a serem as células
remanescentes que residiam do estroma tecidual antes da transformação maligna ou ser
inerente à manutenção da arquitectura estrutural e da função dum tecido complexo, onde a
conservação das proporções entre os vários componentes celulares depende de sinalização
heterotípica. Esta última explicação parece mais verosímil. Nesta óptica, as interacções
heterotípicas (entre tipos celulares distintos) que ocorrem nos tecidos normais continuam a ter
um papel importante nos tumores com origem nesses tecidos. As células do carcinoma
controlam as populações celulares estromais vizinhas e recrutam-nas de tecidos normais
circundantes e da medula óssea. Reciprocamente, as células estromais influenciam a
proliferação e sobrevivência das células do carcinoma. Normalmente, a sinalização heterotípica
envolve factores de crescimento mitogénicos (exemplos: HGF, TGF-α, PDGF), sinais inibitórios
do crescimento (exemplo: TGF-β) e factores tróficos/de sobrevivência (exemplos: IGF-1 e 2).
Sendo factores secretados para o espaço extracelular, a sua localização determina a extensão
da sua acção.

229
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Apenas na segunda metade do século XX se começaram a considerar este tipo de interacções
como funcionalmente importantes para o desenvolvimento tumoral. Excisaram-se carcinomas
de células basais de pacientes e reimplantaram-se em áreas normais da pele dos mesmos
pacientes. Quando os auto-transplantes incluíam apenas células do carcinoma, o tumor não se
desenvolvia. Contudo, quando incluíam também o estroma associado ao tumor subjacente,
estabeleciam-se no local de implantação, evidenciando o papel de suporte do estroma.

Actualmente, sabe-se que as interacções heterotípicas participam em todos os passos da


progressão tumoral, desde a formação do tumor. Por exemplo, inicialmente, as células do
carcinoma libertam factores de crescimento, citocinas e quimiocinas que recrutam macrófagos,
neutrófilos e linfócitos para o estroma associado ao tumor. As células recrutadas orquestram
uma resposta inflamatória, que implica a libertação de TNF-α e prostaglandinas que estimulam
a proliferação das células epiteliais malignas e o processo de angiogénese. Muitas das
interacções perpetuam.

NOTA: As células do carcinoma secretam PDGF, ligando cujo receptor é exibido por diversas células
estromais, incluindo os fibroblastos, os miofibroblastos e os macrófagos. Estas células respondem
libertando IGF-1, que impulsiona o crescimento e sobrevivência das células cancerosas adjacentes (de
forma idêntica, as células estromais associadas ao melanoma secretam IGF-2 e as células estromais do
cancro da mama produzem a quimiocina CXCL12 e o factor de crescimento HGF).

Ao regularem mutuamente os seus números e posições, as células estromais e as células


epiteliais asseguram a óptima representação e localização de cada tipo de célula, quer nos
tecidos normais, quer nos tecidos neoplásicos. O componente celular estromal e o componente
celular epitelial colaboram ainda na construção da MEC especializada que os separa, a
membrana basal. Alguns proteoglicanos hidratam a membrana basal e constituem locais de
ancoragem e armazenamento de factores de crescimento.

As células endoteliais que recobrem os capilares sanguíneos e os ductos linfáticos são


elementos vitais. A proliferação das células endoteliais é encorajada pela libertação de factores
angiogénicos por células epiteliais e estromais, de forma a garantir o suprimento sanguíneo
adequado. A formação de capilares é acompanhada pela secreção de factores de crescimento
pelas células endoteliais, como o PDGF e o HB-EGF, que estimulam a proliferação de tipos
celulares não endoteliais. Estes factores atraem células peri-endoteliais, os péricitos, e células
musculares lisas que criam a camada mural vascular.

Assim, o crescimento do componente epitelial maligno é acompanhado pela proliferação


coordenada das células estromais. De facto, as células estromais estão até imiscuídas entre as
células cancerosas na maioria das metástases. Portanto, até as células independentes o
suficiente para abandonar o tumor primário e fundar novos clones tumorais em locais distantes
necessitam de recrutar células estromais que suportem a sua proliferação. Ocasionalmente, as
células metastáticas infiltram-se no estroma pré-existente dos locais anatomicamente distantes.
Ainda assim, nem todas as relações heterotípicas que são requeridas para manter um tecido
normal continuam a operar nos carcinomas, porque as células cancerosas adquirem traços,
como a menor dependência de mitogénios, a maior resistência à apoptose e a independência
de ancoragem, que reduzem a interdependência.

230
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NOTA: Alguns tumores são quase totalmente independentes. Há carcinomas muito avançados que
geram células que se flutuam nos fluidos corporais, originando tumores ascíticos.

As células que formam as linhas celulares cancerosas desenvolvem-se sem recurso a


interacções heterotípicas, desviando-se do comportamento das células cancerosas nos tumores
humanos. As linhas celulares cancerosas são populações de células cancerosas que conseguem
ser propagadas em cultura in vitro indefinidamente. As células das biópsias tumorais são
colocadas em cultura, na esperança de emergirem colónias vigorosas, que não costumam
aparecer com muita frequência.

As células carcinomatosas sujeitas às condições de cultura estão a ser forçadas a proliferar


em ambientes muito diferentes dos experienciados pelas suas antecessoras. Por exemplo, a alta
concentração de soro na maioria dos meios é inibitória para o crescimento das células, que
raramente experienciam tal abundância de factores, exceptuando na reparação aguda de
lesões. Logo, as células carcinomatosas estão a ser selecionadas in vitro em função da sua
habilidade de proliferar autonomamente, privadas de contacto íntimo com o estroma.

As colónias selecionadas evoluíram além da etapa de progressão tumoral que é alcançada in


vivo pela maioria das células neoplásicas. Assim, os modelos experimentais de cancro ignoram
as interacções heterotípicas, gerando tumores biologicamente muito diferentes dos
encontrados na clínica. Consequentemente, as linhas celulares cancerosas humanas que são
reagentes standart em muitos tipos de investigação (virtualmente todas as células têm
capacidade tumorigénica em ratinhos imunocomprometidos) são modelos imperfeitos para
desenvolver novas terapêuticas e prever as respostas clínicas dos pacientes oncológicos ao
novo agente que está a ser testado.

Os tumores assemelham-se a tecidos de cicatrização que não saram. Muitos dos sinais
moleculares distintos que medeiam a comunicação intercelular nas massas tumorais não são
rotineiramente trocados pelos tipos celulares que constituem o tecido normal não danificado.
Grande parte dos programas de sinalização e das respostas biológicas resultantes observados
no ambiente tumoral assemelha-se aos processos que ocorrem durante a cicatrização de
feridas. Assim, não são inventados, resultando da exploração de programas fisiológicos pré-
existentes utilizados com outro propósito – a cicatrização.

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Quando a pele sofre uma lesão, as plaquetas agregam- As células epiteliais nas margens da lesão também
se e secretam grânulos que contêm PDGF e TGF-β. A participam na reconstrução da camada epitelial. Para
cicatrização também implica a libertação de factores isso, reduzem a adesão à membrana basal, ganhando a
vasoactivos que aumentam a permeabilidade vascular, mobilidade necessária. Além disso, dispensam junções
permitindo a conversão de fibrinogénio plasmático a fibrina, de adesão intercelulares, mediadas por moléculas de E-
que forma a matriz do coágulo sanguíneo. O PDGF atrai caderina que mantém aposta a membrana celular de
fibroblastos, estimulando a sua proliferação. De seguida, o duas células epiteliais contíguas. De acordo com isso, a
TGF-β activa os fibroblastos, convertendo-os a expressão de E-caderina é suprimida nestas margens
miofibroblastos, que secretam MMPs, que também são epiteliais, sendo substituída pela expressão de N-
produzidas pelos macrófagos recrutados. Adicionalmente, os caderina. As mudanças fenotípicas que ocorrem nestas
fibroblastos recrutados secretam mitogénios, como os FGFs, células epiteliais conduzem à adopção duma aparência
que estimulam a proliferação de células epiteliais. As MMPs fibroblástica. Estas mudanças profundas constituem a
começam a degradar a MEC, permitindo a sua remodelação EMT (epithelial-mesenchymal transition). Os traços
estrutural que cria espaço para novas células e liberta adquiridos permitem que estas células se desloquem
factores de crescimento, anteriormente ancorados sob a para a lesão, preenchendo o hiato epitelial. As células
forma inactiva a proteoglicanos (exemplos: bFGF, TGF-β1, estromais auxiliam na EMT. Os factores solúveis e
PDGF, EGFs, IFN-γ). As MMPs também clivam e activam pró- activados, como o TGF-β1, libertados pela acção das
enzimas de outras proteases. Todo o conjunto de factores de MMPs secretadas pelas células estromais, reforçam a
crescimento libertados das plaquetas e mobilizados da MEC expressão do programa de EMT pelas células epiteliais
actua no recrutamento de monócitos, que se diferenciam em vizinhas. Note-se que esta profunda alteração
macrófagos, bem como neutrófilos e outras células imunes. fenotípica é temporária: uma vez coberto o local de
As células recrutadas removem o material estranho e os lesão, as células revertem para o estado epitelial através
restos celulares. Também libertam factores mitogénicos duma MET (mesenchymal-epithelial transition), não
como FGFs e o VEGF, que estimulam as células endoteliais na evidenciando sinais de alguma vez terem passado pelo
vizinhança a construir novos capilares – neoangiogénese. estado mesenquimatoso.

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Há paralelismos impressionantes entre o processo de cicatrização e a tumorigénese. Um
deles é a presença de redes de fibrina no estroma associado ao tumor, que não deriva do
trauma vascular. Em vez disso, os capilares associados ao tumor são intrinsecamente frágeis e
possuem permeabilidade suficiente para o fibrinogénio escapar. Outra semelhança relaciona-se
com a secreção contínua de PDGF pelas células cancerosas, verificada em muitos cancros,
incluindo os com maior incidência (cancro da mama, cancro da próstata, cancro do pulmão e
cancro do cólon). Os alvos são as células mesenquimais que exibem o PDGF-R, como as células
musculares lisas, os fibroblastos e os macrófagos. O PDGF funciona como um agente
quimiotáxico e mitogénico e parece ser a molécula sinalizadora mais importante utilizada pelas
células do carcinoma para recrutar e estimular a proliferação das células estromais. No cancro
da mama, por exemplo, maior o nível de expressão de PDGF correlaciona-se com o maior grau
de estromalização dos tumores mais avançados. Os fibroblastos recrutados ancoram-se, via
integrinas, na matriz de fibrina e migram. As células estromais invasoras remodelam esta matriz
provisória, degradando muitas das moléculas de fibrina inicialmente formadas e substituindo-
as por uma matriz com carácter mais permanente, composta pelo colagénio secretado pelos
fibroblastos.

No processo de cicatrização, uma das tarefas desempenhadas pelas células estromais


prende-se com a contracção física do local lesionado, de forma a aproximar as margens da
lesão. Esta contracção é mediada por fibroblastos especializados, os miofibroblastos, que
utilizam o sistema contráctil de actina-miosina para gerar a tensão mecânica necessária.
Paralelamente, também existem fibroblastos que expressam α-SMA (α-smooth muscle actin) no
estroma de carcinomas avançados. O termo CAFs (carcinoma-associated fibroblasts) utiliza-se
para descrever as populações mistas de fibroblastos e miofibroblastos presentes no estroma
de tumores epiteliais. A origem dos fibroblastos e miofibroblastos presentes no estroma não
está totalmente determinada. No caso da cicatrização, o recrutamento inicial de fibroblastos
do estroma dos tecidos vizinhos não afectados dever-se-á à secreção de PDGF pelas plaquetas
e os miofibroblastos produzem-se a partir de transdiferenciação induzida por TGF-β1, factor
que também é produzido pelas células carcinomatosas obtendo efeitos semelhantes. Outras
fontes possíveis de miofibroblastos documentadas são os fibrócitos e as MSCs (mesenchymal
stem cells) com origem na medula óssea. Ambos os tipos celulares são encontrados em
circulação e são mobilizados para tecidos danificados, onde se diferenciam em miofibroblastos
e, possivelmente, em fibroblastos. De forma semelhante, as MSCs também são recrutadas para
o estroma tumoral.

O estroma tumoral formado por miofibroblastos difere substancialmente do estroma


epitelial normal – é um estroma desmoplásico, termo que se refere à rigidez imposta pela
deposição de MEC (colagénio tipo I e III, fibronectina, proteoglicanos, GAGs) pelos
miofibroblastos. Estas células também secretam a protease uPa (urokinase plasminogen
activator) e MMPs que ajudam a mobilizar factores sequestrados na MEC. Conforme o estroma
desmoplásico amadurece, muitas células estromais inicialmente presentes desparecem, sendo
substituídas progressivamente pela MEC densa, acelular e colagenosa, característica deste tipo
de estroma. Os miofibroblastos são ainda potentes indutores da angiogénse. Por estas razões,
a maior proporção de miofibroblastos num tumor associa-se a menor sobrevida dos pacientes.

233
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Outro aspecto que indica a semelhança entre o processo de cicatrização e a tumorigénese é
o facto de agentes capazes de inibir a angiogénese associada ao tumor antagonizarem a
cicatrização tecidual.

NOTA: Existem estudos epidemiológicos realizados com pacientes com cancro da mama que revelam
um pico de recorrência da doença 3 anos após a realização de remoção cirúrgica do tumor primário. A
examinação dos fluidos que drenam do local de cicatrização revela a presença abundante de potentes
factores mitogénicos associados com o processo de cicatrização (especialmente mitogénicos para os
cancros da mama HER2+ - a terapêutica adjuvante com trastuzumab pode reduzir até cerca de metade a
taxa de recaída). Adicionalmente, há um pico de síntese de VEGF após a cirurgia. É portanto possível que
a cirurgia estimule a proliferação de micrometástases, anulando muito do benefício terapêutico trazido
pela remoção do tumor primário e dos gânglios linfáticos associados.

Muitas abordagens experimentais ilustram a profunda influência que as células estromais


exercem na tumorigénese.

 A secreção induzida de PDGF por queratinócitos imortalizados não tem efeito na proliferação destas
células epiteliais in vitro (não possuem PDGF-Rs), mas incute capacidade tumorigénica in vivo, derivada
do recrutamento e activação de células estromais pelo PDGF, que impulsionam a proliferação e
transformação maligna dos queratinócitos.
 A inactivação germ line do TGF-βR tipo II nos fibroblastos estromais de roedores evita a inibição de
crescimento mediada pelo TGF-β, havendo hiperplasia estromal subsequente. Os fibroblastos
hiperproliferativos induzem a proliferação das camadas epiteliais adjacentes, desenvolvendo-se,
eventualmente, carcinomas.
 E ainda: quando se introduzem células epiteliais mamárias fracamente tumorigénicas em ratinhos
imunocomprometidos, o desenvolvimento tumoral é encurtado pela presença de fibroblastos
estromais mamários na injecção (obvia o tempo requerido para recrutar estas células).
 Ademais, ao se compararem fibroblastos estromais extraídos dum tecido epitelial normal com CAFs
preparados de carcinomas, as células epiteliais imortalizadas da próstata que foram co-transplantadas
com CAFs formaram tumores 500 vezes maiores do que as que foram misturadas com fibroblastos
prostáticos normais.

234
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Desta forma, os CAFs são funcionalmente muito distintos dos fibroblastos normais,
sugerindo que durante a progressão tumoral as células estromais ficam cada vez mais
comprometidas a ajudar as células tumorais epiteliais. As populações de CAFs são enriquecidas
em miofibroblastos. Estes conferem múltiplos benefícios às células cancerosas epiteliais, o
maior dos quais poderá ser a promoção da angiogénese, através da secreção de SDF-1 (stroma-
derived-factor-1)/CXCL12, uma quimiocina que recruta células percursoras endoteliais e outras
células mieloides para o estroma tumoral. O VEGF, secretado também pelos miofibroblastos,
auxilia na diferenciação em células endoteliais que formam a neovasculatura tumoral. Como a
angiogénese costuma ser um passo limitante na progressão tumoral, a presença de CAFs acelera
o processo como um todo. As células endoteliais da neovascultura derivam da proliferação de
células endoteliais existentes (incluindo células endoteliais localizadas em tecidos normais
vizinhos), complementada pela diferenciação de células percursoras endoteliais que chegaram
via circulação.

NOTA: Um achado muito inesperado foi reportado em 2010: nos glioblastomas humanos, uma porção
significativa das células dos neovasos descende dos tumores geneticamente mutantes, mais
especificamente da transdiferenciação de células estaminais de glioblastoma. Estas células não expressam
o VEGF-R2. Isto pode ser a base para algumas resistências à terapêutica anti-angiogénica neste tipo de
tumor.

Nalguns tumores, as alterações funcionais do estroma podem advir da coexistência


prolongada com as células do carcinoma. Assim, as células estromais podem mesmo alterar o
seu genótipo, co-evoluindo com as células neoplásicas vizinhas. Por exemplo, alguns cancros
da mama apresentam mutações somáticas nos TSGs TP53 e PTEN nas células estromais.

235
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Os macrófagos e as células mieloides activam o estroma associado ao tumor. Os monócitos da linhagem
mieloide da medula óssea entram em circulação e são recrutados pelas células cancerosas, por intermédio de
quimiocinas quimiotáxicas. A MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) é expressa por vários tipos de células
cancerosas epiteliais e é um sinal crítico para o recrutamento de monócitos e indução da sua diferenciação em
macrófagos. O VEGF, o CSF-1 e o PDGF libertados por células tumorais também parecem auxiliar no
recrutamento. O CSF-1 auxilia ainda na própria diferenciação.

Uma vez estabelecidos no estroma tumoral, os macrófagos estimulam a angiogénese, tendo um papel
major na progressão tumoral, o que se correlaciona com pior prognóstico (documentado em gliomas e em
carcinomas da mama, do ovário, da próstata, do cérvix, da bexiga e do pulmão). A nível causal, a estimulação
da angiogénese deriva da secreção dos factores pró-angiogénicos VEGF e IL-8 pelos macrófagos. Áreas
hipóxicas intratumorais atraem os macrófagos, que toleram estas condições e secretam VEGF, que incita a
neoangiogénese, contornando-se a hipoxia tecidual. Nalguns tumores francamente proliferativos, as áreas de
hipoxia permanecem mal vascularizadas, o que indica que individualmente os macrófagos não conseguem
corrigir defeitos na angiogénese. Por isso, com a expansão tumoral podem surgir áreas necróticas.

Os macrófagos também produzem MMPs. A MMP-9 é produzida pelos TAMs (tumor-associated


macrophages). Para além das funções conhecidas das MMPs, a MMP-9 cliva as IGFBPs que sequestram as
moléculas de IGF no espaço extracelular. Os IGFs, nomeadamente o IGF-1, providenciam sinais de sobrevivência
para as células vizinhas. Nos cancros da mama avançados, os TAMs conseguem ajudar directamente as células
cancerosas que expressam o EGF-R, porque são a maior fonte de EGF.

Apesar da evidência a favor do papel pró-tumoral dos macrófagos, existe um grupo


morfologicamente distinto de macrófagos que colabora com o sistema imunitário e consegue
detectar as células cancerosas. Porém, falham em fazê-lo em muitos tipos de tumor porque
algumas células cancerosas adquirem a capacidade de bloquear ou inactivar as acções
tumoricidas desta segunda classe de macrófagos.

Um segundo tipo de linhagem mieloide, as iMCs (immature myeloid cells) contribui para a
invasibilidade tumoral, através da produção de MMP-9 e MMP-2.

O suporte estromal mais óbvio requerido pelos tumores é o acesso à circulação. O oxigénio
consegue difundir-se efectivamente pelos tecidos vivos numa distância de 0,2mm. As células
contidas neste raio podem fiar-se nesta difusão. As que se localizam além deste raio sofrem
hipoxia moderada a severa e experienciam um pH ácido. Estes tecidos ficam em risco de se
tornar necróticos. A apoptose dependente da p53 também ameaça as células hipóxicas e,
portanto, a inactivação da função p53 permite que as células cancerosas sobrevivam além do
pequeno perímetro peri-capilar. A proximidade do sistema circulatório garante ainda às células
a aquisição de nutrientes e a eliminação dos produtos metabólicos de excreção e de dióxido de
carbono. A vasculatura tem por estas razões um papel central para o crescimento e
sobrevivência de todos os tipos de tecido. A rede capilar é tão densa nos tecidos normais que
assegura estas funções.

A angiogénese observa-se durante o desenvolvimento embrionário. O tamanho e a


arquitectura dos órgãos ou tecidos estão geneticamente programados, mas a localização precisa
dos seus componentes celulares individuais não. Portanto, a vasculatura está configurada em
termos gerais, mas são as células individuais que desenham as redes capilares
(microvasculatura), através das interacções heterotípicas, isto é, formam-se capilares onde são
necessários pelas células não vasculares, ou seja, parenquimatosas, teciduais. Durante a
tumorigénese, este plano é adaptado ao desenvolvimento tumoral. A arquitectura geral do
tumor não é determinada e antecipada pelo genoma. Isto tem implicações na angiogénese: os
tumores não podem fiar-se num programa genético e precisam de desenhar o seu próprio

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esquema vascular à medida que se desenvolvem, dependendo das interacções heterotípicas
localizadas entre as células vasculares (células endoteliais, pericitos, células musculares lisas) e
as células não vasculares (célula neoplásicas e restantes tipos celulares do estroma de suporte).

A produção de VEGF é governada pela disponibilidade de oxigénio. A tensão de oxigénio


intracelular é monitorizada pelas acções da proteína VHL. Sob condições de hipoxia, os factores
de transcrição HIF-1α e HIF-1β acumulam-se, impulsionando a expressão de genes cujos
produtos são factores pró-angiogénicos. Entre estes produtos destaca-se o VEGF, que pode ser
sintetizado pelas células tumorais, pelos macrófagos e pelos miofibroblastos. O VEGF é o ligando
do VEGF-R1 e do VEGF-R2, que são receptores tirosina cinase. Ambos são expressos à superfície
das células endoteliais. De forma similar, o bFGF, outro factor angiogénico importante, liga-se
aos respectivos receptores das células endoteliais. Uma vez estimuladas por estes factores, as
células endoteliais proliferam e contorcem os seus citoplasmas para construir as paredes
capilares, que penetram pelas camadas teciduais em direcção aos locais de maior concentração
de factores angiogénicos. (Nota: Adicionalmente, o pH baixo e a sinalização via PI3K-Akt/PKB
activam sinais dependentes de HIF-1 de maneira insensível ao teor de oxigénio.)

Muitas das células que formam a rede capilar no estroma associado ao tumor derivam da
diferenciação de células progenitoras endoteliais circulantes com origem na medula óssea.
Porém, à medida que o tumor cresce uma proporção cada vez maior de neo-capilares são
formados a partir das células endoteliais já presentes no estroma tumoral. Mecanismos
idênticos funcionarão em prol da formação de vasos linfáticos.

A angiogénese é um processo morfogenético muito complexo, porque integra muitos


factores além do VEGF, como o TGF-β, os bFGFs, a IL-8, a angiopoietina, a angiogenina e o PDGF.
Além disso, vários tipos celulares contribuem para a construção de capilares. As células
endoteliais revestem o lúmen capilar mas estão rodeadas de pericitos murais e células
musculares lisas vasculares. A dispersão destas células é um tanto caótica, o que faz com que
os capilares tumorais possuam um diâmetro cerca de três vezes superior aos capilares normais.
As razões para esta desorganização podem envolver o balanço entre factores de crescimento
mutuamente antagonísticos, como a angiopoietina 1 e 2. O VEGF atrai e estimula a proliferação
das células endoteliais, iniciando o crescimento capilar. Uma mistura de angiopoietina 1 e 2
induz o recrutamento de pericitos e células musculares lisas que permitem manter a rigidez e a
pressão intracapilar. Um desequilíbrio nestas duas angiopoietinas em conjunto com a
sobrexpressão de VEGF é presumivelmente responsável por muitas das anomalias morfológicas
da vasculatura dos tumores.

A nível submicroscópico também existem alterações: as membranas plasmáticas das células


endoteliais adjacentes não contactam entre si, selando o lúmen capilar. Os hiatos intercelulares
permitem o acesso directo das células peri-capilares ao plasma sanguíneo (inclusive ao
fibrinogénio). As paredes capilares são dez vezes mais permeáveis do que as dos capilares
normais. Parte dessa permeabilidade pode dever-se à produção desregulada de VEGF. Outra
consequência da permeabilidade capilar anormal é a acumulação de grandes quantidades de
fluido no parênquima tumoral. Normalmente, o fluido seria drenado via linfática, retornando à
circulação venosa, mas nos tumores sólidos a expansão das populações de células cancerosas
provoca o colapso dos vasos linfáticos adjacentes (não têm a resistência dos capilares
sanguíneos porque lhes falta a pressão hidrostática interna deste tipo de vasos). Os defeitos na

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drenagem exacerbam, por isso, os efeitos do escape de fluido, gerando pressões de fluido
elevadas nas porções não vasculares do tumor. Esta pressão hidrostática elevada intra-tumoral
é ainda mantida pela secreção de PDGF pelas células carcinomatosas, o que induz a contracção
dos fibroblastos estromais, comprimindo o fluido intersticial. A pressão dificulta a
administração de agentes terapêuticos porque evita a formação dum gradiente de pressão
entre o lúmen capilar e o parênquima, o que é necessário para a transferência passiva de
fármacos em circulação para o espaço extravascular do tumor.

A libertação de factores angiogénicos é uma resposta automática à hipoxia. Porém, a


habilidade que as populações celulares tumorais têm de promover a angiogénese parece ser
um traço adquirido com o avançar da progressão tumoral. Esta ideia é consolidada pela
observação de que, em certos tumores, as células cancerosas que se localizam a mais de 0,2mm
dos capilares param de proliferar e podem entrar em apoptose ou em necrose. Portanto, mesmo
estando em circunstâncias de hipoxia não conseguem induzir a formação de novos capilares.

No início da progressão tumoral, os pequenos nichos tumorais expandem-se até atingirem


o diâmetro de 0,1-0,2mm. Há um estado dinâmico de não crescimento, que dura anos: a divisão
celular persiste mas é contrabalançada pela apoptose, mantendo constante a dimensão do
tumor. Aparentemente a barreira à expansão tumoral poderia ser física, a falta de espaço para
as células cancerosas incipientes se multiplicarem. No entanto, a realidade é diferente: as células
tumorais ainda não se tornaram angiogénicas e carecem de vasculatura. A hipoxia e outras
condições subóptimas (suprimento inadequado de nutrientes, altos níveis de dióxido de
carbono e de desperdícios metabólicos, pH baixo) que experienciam incitam a apoptose p53-
dependente. Contudo, a uma dada altura, os pequenos clusters de células pré-neoplásicas
ganham a capacidade de instigar a neoangiogénese. As células descendentes livram-se dos
constrangimentos que impediram a sua multiplicação e começam a proliferar vividamente. Esta
mudança dramática no comportamento de pequenas massas tumorais designa-se “angiogenic
switch”. Assim, a incapacidade de as células induzirem angiogénese é uma defesa anti-cancro.

Mesmo antes de ocorrer o


“switch” angiogénico, as células pré-
malignas já produzem grandes
quantidades de VEGFs que são
sequestrados pela MEC. Assim, o
“switch” angiogénico é acompanhado
pela expressão elevada da MMP-9,
que cliva e liberta o VEGF, pelos
mastócitos e macrófagos recrutados
e é dependente deste recrutamento
de células inflamatórias. O VEGF
activado desencadeia respostas
proliferativas das células endoteliais.

Esta sequência de acontecimentos descreve o comportamento do modelo de ratinho


transgénico Rip-Tag (expressa os oncogenes virais large T e small T sob o controlo do promotor
do gene da insulina, que assegura a expressão confinada às células β dos ilhéus de Langerhans

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pancreáticos). Ao contrário deste modelo que prediz um interruptor binário, noutros tumores a
angiogénese aumenta progressivamente.

Acresce-se ainda que diferentes tumores dependem de diferentes factores angiogénicos.


Por exemplo, a inactivação de ambas as cópias do gene que codifica o VEGF-A em fibroblastos
dermais adultos de ratinho transformados não os priva de uma elevada capacidade
tumorigénica. Formam sarcomas que continuam a crescer, mesmo que se utilizem anticorpos
anti VEGF-R2 (bloqueia a resposta das células endoteliais a VEGF-A e B). Este comportamento é
explicável pelo facto de os fibroblastos transformados produzirem uma mistura complexa de
factores angiogénicos que inclui o VEGF-B, os FGFs e o TGF-α.

O “switch” angiogénico inicia um processo muito complexo. A angiogénese começa no


estroma associado ao tumor muito antes da ruptura da membrana basal. Os sinais
angiogénicos são enviados pelas células tumorais benignas através dos poros da membrana
basal, de forma a aumentar a angiogénese do lado estromal, bem como recrutar miofibroblastos
que impulsionem ainda mais o processo. Esta angiogénese precoce é circunscrita e a
intensificação deste fenómeno só se inicia quando as células cancerosas se tornam invasivas e
adquirem contacto íntimo e directo com as células estromais. A densidade capilar aumenta a
par do aumento da malignidade e relaciona-se com pior prognóstico. Esta correlação é
susceptível de duas interpretações: a vascularização intensa permite que as células cancerosas
cresçam de forma mais agressiva ou a angiogénese marcada pode ser somente um marcador
dum fenótipo agressivo subjacente, não tendo papel causal na criação desse fenótipo.

À heterogeneidade tumoral subjaz a noção de que diferentes subpopulações de células


cancerosas possuirão diferentes poderes angiogénicos. Outra ideia associada a esta noção será
que na massa tumoral, após o “switch” angiogénico, as células cancerosas com um fenótipo
fracamente angiogénico fiam-se na ajuda das células fortemente angiogénicas para adquirirem
vasculatura. Então, existe cooperação entre subpopulações distintas de células tumorais.

O “switch” angiogénico está associado com eventos que se estendem além da vizinhança
imediata do tumor primário. Por exemplo, como já mencionado, nalgumas etapas da
progressão tumoral a neoangiogénese depende do recrutamento de células percursoras
endoteliais da medula óssea, processo controlado pelo VEGF (desde a produção de células
percursoras endoteliais à sua atracção até ao local da massa tumoral). O SDF-1/CXCL12,
libertado pelos miofibroblastos, também auxilia no recrutamento. Estes achados demonstram
que o tumor primário consegue ter um alcance sistémico antes de metastizar.

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A angiogénese é normalmente suprimida por inibidores fisiológicos. A regulação negativa
do processo fisiológico de angiogénese que ocorre, por exemplo, na cicatrização duma lesão, é
conseguida, em parte, pela supressão da formação do factor de transcrição HIF-1.

Também existem componentes da MEC que


bloqueiam activamente a angiogénese excessiva, como a
proteína trombospondina-1 (Tsp-1), que serve de ligando
para o receptor CD36, disposto à superfície das células
endoteliais, cuja activação pára a proliferação e leva à
libertação de FasL pelas próprias células endoteliais, que
actua de maneira autócrina nas células endoteliais, que
também exibem o FasR, causando a sua morte
dependente da activação da cascata de caspases pró-
apoptóticas. O FasR é expresso por células endoteliais em
proliferação ou que pararam recentemente de proliferar,
mas esta expressão é reprimida quando as células
terminaram a formação de capilares maduros e entraram
em quiescência. Assim, a Tsp-1 inibe selectivamente e
causa a regressão de capilares em crescimento ou recém-
formados mas tem pouco ou nenhum efeito sobre os
capilares já formados. A transcrição do gene TSP1 é
positivamente influenciada pela p53, daí que a perda da
função p53 conduza a uma diminuição substancial dos
níveis da proteína Tsp-1. Esta perda é, portanto, favorável
à indução da angiogénese. A oncoproteína Ras actua de
maneira oposta, diminuindo a expressão do gene TSP1,
através de cascatas de sinalização complexas.

A proteína Tsp-1 é apenas um exemplo entre um grande conjunto de inibidores naturais da


angiogénese. A existência de múltiplas moléculas anti-angiogénicas é sugerida pelas
observações do comportamento de certos tumores primários e das metástases deles derivadas.
Nalguns modelos murinos da tumorigénese, as metástases permaneciam pequenas em
tamanho enquanto o tumor primário continuasse a crescer. Contudo, quando se removia
cirurgicamente o tumor primário, as metástases começaram a crescer vigorosamente. Tais
observações sugeriram que os tumores primários libertam substâncias inibitórias que actuam
sistemicamente via circulatória para suprimir a proliferação dos nichos distantes de células
metastáticas, através do bloqueio da angiogénese. Uma vez excisado o tumor primário,
aliviava-se o constrangimento do crescimento das metástases disseminadas. Estes factores
circulantes são a angiostatina e a endostatina. São produtos de clivagem de proteínas da MEC
ou do plasma. Já se isolaram outras moléculas anti-angiogénicas. Estas descobertas sugerem
que a angiogénese é limitada pela acumulação de fragmentos proteicos anti-angiogénicos no
espaço extracelular. Outras proteínas anti-angiogénicas actuam como antagonistas das MMPs
– TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases).

Quando integradas, estas informações acerca dos reguladores fisiológicos da angiogénese


reforçam a ideia que a angiogénese é mais do que um estado binário on-off.

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Terapias anti-angiogénese podem ser empregues para tratar o cancro. A angiogénse é um
processo muito complexo, pela dependência de múltiplos tipos celulares e moléculas
sinalizadoras. Esta complexidade fornece vários alvos de intervenção. Como os tumores
dependem absolutamente da angiogénese para crescer acima de 0,2mm, quaisquer sucessos
em interferir com este processo representam uma mais-valia terapêutica. Os tumores
microscópicos devem ser impedidos de crescer e os tumores maiores devem colapsar quando o
seu suprimento sanguíneo se desintegrar.

Em princípio, existirá uma vantagem das terapias anti-angiogénicas em relação às terapias


que visam directamente as células neoplásicas. As últimas estão altamente condicionadas pelo
surgimento de variantes resistentes entre as populações tumorais. Pelo contrário, as terapias
anti-angiogénese são dirigidas a células geneticamente normais e fenotipicamente estáveis
que foram recrutadas para as massas tumorais. Portanto, em teoria, as terapias anti-
angiogénese não deverão exercer pressão selectiva e os tumores não se devem tornar
refractários a este tipo de terapia. No entanto, estas terapias devem inibir múltiplas vias
angiogénicas (por exemplo, após uma estratégia que bloqueie a sinalização pelo VEGF, as células
tumorais residuais que sobreviveram à terapia podem passar a expressar elevados níveis de
FGFs, que são potentes factores angiogénicos, regenerando a vasculatura e promovendo o
reaparecimento dum tumor proliferativo).

O interesse neste tipo de abordagem é sublinhado pela biologia peculiar das células
endoteliais associadas ao tumor. O seu turnover é muito elevado – vivem cerca de uma
semana. Contrariamente, as células endoteliais que revestem os vasos normais dividem-se
raramente e vivem centenas de dias, até sete anos. As células em ciclo celular activo são quase
sempre muito mais sensíveis aos efeitos citotóxicos da terapêutica do que as células
quiescentes, prevendo-se alguma selectividade na acção destas novas terapias.

O bevacizumab/Avastin é um anticorpo monoclonal que se liga ao VEGF-A, neutralizando-o.


Demonstrou eficácia significativa em vários ensaios clínicos de larga escala. A sua administração
combinada com a quimioterapia convencional evidenciou benefícios em termos de
sobrevivência em pacientes com carcinoma do cólon metastático e em pacientes com
carcinoma do pulmão de não pequenas células. Os efeitos sinergísticos poderão resultar da
normalização da vasculatura associada ao tumor, que facilita a entrega de fármacos
quimoterapêuticos no parênquima.

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Desenvolveram-se dois inibidores sintéticos dos domínios tirosina cinase dos receptores
VEGF-R2 (SU5416) e PDGF-R (SU6668). Estudos feitos no modelo de ratinho Rip-Tag revelaram
que o primeiro agente consegue bloquear o “switch” angiogénico em 90% dos tumores
incipientes, preservando-os num estado não invasivo, mas não tem efeito nos tumores mais
avançados. Logo, nos estádios precoces da angiogénese a sinalização via VEGF é crucial,
enquanto nos estádios mais avançados o processo torna-se cada vez mais independente do
VEGF. O segundo agente teve menor efeito no que concerne ao bloqueio do “switch”
angiogénico, mas é muito mais potente em tratar os tumores mais avançados, reduzindo as suas
dimensões a metade e restringindo a sua vascularização. As únicas células que expressam o
segundo alvo terapêutico, o PDGF-R, são os pericitos e as células musculares lisas, indicando que
estas células murais são o alvo do agente SU6668, que previne a associação destes tipos
celulares aos cilindros capilares formados pelas células endoteliais. Assim, as etapas iniciais da
angiogénese conseguem proceder sem a função do PDGF-R, mas, em fases mais avançadas, a
sinalização pelo PDGF torna-se cada vez mais importante. A terapia de combinação utilizando
ambos os agentes é uma estratégia potente para intervir nas várias etapas da progressão
tumoral. De facto, preveniu quase totalmente o “switch” angiogénico, deixando os tumores num
estádio pré-angiogénico, bloqueou significativamente a expansão de tumores angiogénicos de
pequena dimensão e causou a regressão de tumores já estabelecidos. Estas observações
indicam que a maneira mais efectiva de inibir a angiogénese será dirigir a terapêutica a vários
tipos celulares envolvidos na construção da vasculatura em simultâneo. Contudo, nenhum dos
agentes foi aprovado nos ensaios clínicos de fase II e fase III.

A radiossensibilidade dos tumores pode dever-se às células do hospedeiro recrutadas da


medula óssea, nomeadamente à sensibilidade das células endoteliais. As respostas clínicas a
certos tipos de quimioterapia convencional também podem ser fortemente influenciadas pela
sensibilidade da microvasculatura associada ao tumor. Assim, no futuro, os tratamentos com
vários agentes quimiterapêuticos poderão ser optimizados pelos seus efeitos nos microvasos
associados ao tumor, mais do que nas próprias células cancerosas.

RESUMO:

A origem de cerca de 95% dos tumores é identificável pela presença da maioria das relações
heterotípicas que governam a morfologia normal do tecido de origem. Os restantes 5% são

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anaplásicos e perderam a maioria dos traços histológicos que permitem o reconhecimento do
seu tecido de origem;

A maioria dos tumores anaplásicos não atingiu o estado de independência total porque
formam tumores sólidos. Este estado só é alcançado pelas células cancerosas que conseguem
proliferar como efusões pleurais ou ascites;

Há um aspecto paradoxal em torno da angiogénese: alguns pacientes com tumores


bastante hipóxicos enfrentam um mau prognóstico, o que é um contrassenso, uma vez que sob
hipoxia as células costumam entrar em apoptose ou sofrer necrose. Uma hipótese funda-se no
incremento da acção do factor de transcrição HIF-1, que activa a transcrição de genes que
codificam o PDGF, o TGF-α, o TGF-β e MMPs. Algumas destas proteínas secretadas são potentes
mitogénios. Outro gene cuja expressão é estimulada pelo HIF-1, é o gene que codifica o receptor
Met. Isto sensibiliza as células tumorais à acção do ligando HGF libertado pelas células estromais.
Entre as respostas incitadas pela interacção ligando-receptor, salienta-se a EMT;

A presença duma grande variedade de células estromais derivadas da medula óssea no


ambiente tumoral cria uma dimensão adicional de complexidade no que diz respeito às
interacções heterotípicas, que têm de incluir as interacções das células cancerosas com a
medula óssea. Tais interacções sistémicas contemplam informação veiculada por sinais
endócrinos, em vez dos sinais parácrinos que actuam na vizinhança tumoral;

Mesmo analisando apenas as trocas bidirecionais de sinais parácrinos entre o


compartimento epitelial neoplásico e o compartimento estromal associado, depara-se uma
grande complexidade.

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LIFE, DEATH AND ETERNAL LIFE

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pRb and Control of the Cell Cycle Clock
O destino celular das células individuais é ditado pelos sinais que recebem. As células
normais não proliferam sem serem impulsionadas por factores de crescimento mitogénicos. Há
ainda sinais, como o TGF-β, que podem antagonizar os sinais proliferativos. A célula pode
mesmo, na presença de certos sinais extracelulares, entrar num estado pós-mitótico e
diferenciado do qual nunca irá reemergir. Estes sinais díspares são veiculados por uma grande
variedade de receptores de superfície, integrando circuitos citoplasmáticos de processamento
de sinal muito complexos que culminam em decisões binárias: se a célula deve proliferar ou
entrar em quiescência (G0) (e se como célula quiescente se deve ou não diferenciar).

Este comportamento sugere a existência de um governador central que determina o destino


celular. Este governador é o relógio do ciclo celular que opera a nível nuclear. É composto por
uma rede de proteínas que interactuam, processam os sinais aferentes intra e extracelulares,
integram-nos e decidem o destino celular. O comportamento proliferativo das células
cancerosas indica que este governador major é influenciado por proteínas oncogénicas que
provocam a disrupção das vias de sinalização e dos circuitos de controlo. A delecção de proteínas
supressoras tumorais influencia, igualmente, a tomada de decisões pelo relógio do ciclo celular.

A saída do ciclo celular e entrada em quiescência (G0) podem ser encorajadas pela presença
de factores anti-mitogénicos ou pela ausência de factores de crescimento mitogénicos no
meio. Este estado é reversível, sendo a reentrada em crescimento activo e divisão possível pela
alteração do balanço dos factores que regulam a entrada em ciclo celular. No entanto, algumas
células, como os neurónios, abandonam o ciclo celular activo de forma irreversível, entrando
em estado pós-mitótico.

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Uma célula-filha formada recentemente que
permaneça em ciclo activo requer o início imediato da
preparação da próxima divisão. O crescimento celular que
precede a mitose e a citocinese, pauta-se pela duplicação
dos constituintes celulares macromoleculares, o que
inclui a replicação do DNA genómico.

A acumulação de RNA e proteínas tem início imediato


após a divisão celular e estende-se até à próxima divisão.
A replicação do DNA, no entanto, é adiada por algumas
horas (até 12 a 15h). Este período entre o nascimento de
uma célula filha e o início da síntese de DNA é a fase G1
(first gap) do ciclo celular, durante a qual as células
tomam decisões críticas (crescimento vs quiescência;
diferenciação ou não). A síntese de DNA corresponde à
fase S (sintética) e dura entre 6 a 8 horas (varia entre
diferentes tipos de células sendo curta em células
embrionárias e linfócitos). A entrada em mitose (fase M) é
precedida pela fase G2 (second gap), que dura 3 a 5 horas.
Ao conjunto das fases G1, S e G2 chama-se interfase.

A fase M dura cerca de 1 hora e inclui 4 subfases


distintas: prófase (os cromossomas condensam e tornam-
A doação de um genoma íntegro a cada uma se visíveis ao microscópico; os centrossomas organizam-
das células filhas depende essencialmente da se nos polos celulares), metáfase (alinhamento dos
cromossomas na placa mitótica e ancoragem às fibras dos
execução precisa de dois processos: a
microtúbulos do fuso mitótico; a membrana nuclear
replicação fidedigna do genoma celular da desaparece), anáfase (segregação dos cromatídeos
célula mãe durante a fase S e a alocação irmãos para cada um dos polos opostos) e telófase (os
cromatídeos descondensam e forma-se um membrana
apropriada de um genoma diploide para cada nuclear por cada conjunto completo de cromatídeos, que
célula filha durante a fase M. passam a designar-se cromossomas). Finalmente, ocorre a
citocinese, a divisão do citoplasma que permite a
formação de duas células filhas. A fase G0 denota o estado
não proliferativo das células que saíram do ciclo celular.

A célula possui uma série de mecanismos de


vigilância que monitorizam cada fase do ciclo celular e que
permitem que a célula progrida para a fase seguinte
apenas se a fase anterior tiver sido completada com
sucesso. Se algo tiver corrido mal, o ciclo celular é
interrompido até que se corrijam os defeitos. Além disso,
é assegurado que após uma fase ter sido completada com
sucesso não é repetida. Estes mecanismos designam-se
checkpoints.

O primeiro checkpoint garante que a transição G1/S


não ocorre se o genoma não estiver íntegro e necessitar
de ser reparado. O segundo checkpoint opera na fase S,
atrasando ou parando a replicação do DNA em resposta a
dano genómico. O terceiro não permite a transição G2/M
sem que os cromossomas estejam correctamente
replicados. O dano genómico também bloqueia a entrada
em fase M. Durante a fase M, um checkpoint bloqueia a
anáfase até que os cromossomas estejam correctamente
ancorados ao fuso mitótico.

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A progressão tumoral beneficia da maior mutabilidade do genoma que permite que as
células cancerosas experimentem diversas combinações de alelos mutados, retendo os que lhe
garantem maior vantagem proliferativa. Esta mutabilidade e a instabilidade genómica inerente
são incompatíveis com a progressão normal do ciclo celular, pela existência dos checkpoints de
controlo previamente descritos. Portanto, para acumularem rapidamente genes mutantes e
cariótipos alterados, as células cancerosas precisam de inactivar estes checkpoints para além
de possuírem genes que controlam o crescimento alterados (oncogenes activados e/ou genes
supressores tumorais inactivados).

NOTA: O processo de crescimento pode ser desacoplado do processo de divisão. A perda do gene
supressor tumoral TSC1 ou a hiperactivação da proteína Akt/PKB leva à fosforilação e activação da
proteína ribossomal S6, promovendo o crescimento celular.

A decisão de crescimento vs quiescência é tomada durante a fase G1. Todas as células


normais requerem sinais externos para iniciarem um ciclo de crescimento e divisão. A
racionalidade patente neste comportamento é simples: as células participam na formação de
tecidos estruturados e a sua proliferação precisa, necessariamente de ser coordenada com as
células vizinhas.

NOTA: O controlo de crescimento imposto pela via pRb não opera nas células estaminais
embrionárias, que não requerem os mesmos sinais mitogénicos necessários à proliferação de células mais
diferenciadas. Este comportamento altamente autónomo reflecte-se na capacidade de gerarem tumores
benignos, os teratomas, quando introduzidas em muitos locais anatómicos dos organismos adultos.
Representam o único tipo de célula geneticamente wild-type que é tumorigénica.

A responsividade ao ambiente extracelular e aos sinais reguladores de crescimento ocorre


durante uma janela temporal discreta do ciclo celular – desde o início da fase G1 até uma a
duas horas antes da transição G1/S. Se o soro com factores de crescimento for removido de
células em cultura antes de terem completado 80 a 90% da fase G1, as células vão falhar a
progressão no ciclo celular, podendo reverter para o estado G0. A mesma remoção do soro nos
10 a 20% finais da fase G1 não afecta a progressão do ciclo celular, que decorre normalmente.
Os factores anti-mitogénicos também não conseguem impor os seus efeitos inibidores de
crescimento durante esta fase.

A decisão crítica é feita no ponto de restrição (R point). Se a célula decidir avançar no ciclo,
compromete-se a completar um programa rígido de eventos sucessivos. Este programa fixo
ocorre de forma idêntica nas células normais e nas células cancerosas. O comprometimento não
é absoluto: desastres metabólicos, genéticos ou físicos podem forçar a paragem temporária do
ciclo celular. Ainda assim, na maioria dos casos, estes desastres são evitados, tornando o ponto
R determinante para decidir se as células vão crescer ou não. De facto, a desregulação da
maquinaria de tomada de decisão do ponto R é transversal entre as células cancerosas.

NOTA: Outro ponto de decisão na fase G1 tardia que pode ser corrompido pelas células cancerosas
consiste na monitorização da ancoragem à MEC antes da transição G1/S. Existem mais checkpoints que
garantem o acesso a nutrientes e a existência de níveis altos de EROs.

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As ciclinas e as cinases dependentes de ciclinas (CDKs) constituem os componentes chave
do relógio do ciclo celular. As proteínas cinase conseguem fosforilar múltiplos substratos alvo.
As modificações covalentes podem activar ou reprimir a actividade das proteínas alvo. O relógio
do ciclo celular serve-se de proteínas cinase para executar vários passos da progressão do ciclo
celular.

Exemplos: a fosforilação das proteínas associadas ao centrossoma na transição G1/S permite a sua
duplicação e preparação para a fase M; a fosforilação de algumas proteínas antes da fase S permite a
activação dos locais cromossómicos de replicação de DNA; a fosforilação de histonas adequa a estrutura
da cromatina ao início das fases S e M; a fosforilação de proteínas que formam a membrana nuclear, como
a laminina e as nucleoporinas, causa a dissolução da membrana nuclear no início da fase M.

Estas cinases são as CDKs. A sua actividade catalítica (serina-treonina cinase) está
dependente da associação de subunidades regulatórias, as proteínas ciclinas. Além disso, as
ciclinas guiam as CDKs até aos seus substratos proteicos. Os complexos bimoleculares ciclina-
CDK são o motor responsável por transmitir os sinais do relógio do ciclo celular a inúmeras
moléculas efectoras.

Durante a fase G1, até ao ponto R, a CDK4


e a CDK6 associam-se com as ciclinas do tipo D
(D1, D2 e D3). Após o ponto R, a CDK2 associa-
se as ciclinas do tipo E (E1 e E2). Com a entrada
na fase S, as ciclinas do tipo A (A1 e A2)
substituem as cilinas do tipo E como parceiras da
CDK2. No final da fase S, as ciclinas do tipo A
mudam de cinase parceira, associando-se à
CDK1 (=CDC2). Durante a fase G2, as ciclinas do
tipo A são substituídas pelas ciclinas do tipo B
(B1 e B2). Na fase M, os complexos CDK1-cilina
B activam muitos dos eventos que constituem o
programa de mitose.

Nota: O par ciclina C-CDK3 está implicado na


transição G0/G1.

A regulação da actividade dos complexos ciclina-CDK é alcançada pela modulação dos níveis
e da disponibilidade das ciclinas ao longo das várias fases do ciclo celular. Os níveis das CDKs
variam minimamente.

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Estudos em embriões de sapo e ouriço-do-mar (ciclos celulares síncronos) revelaram o aumento marcado
dos níveis de ciclinas do tipo B antes do início da mitose e a sua diminuição no final desta fase (o nome ciclinas
é inspirado na variação cíclica dos seus níveis). Os níveis de ciclina E são baixos durante a maior parte da fase
G1 até se atingir o ponto R, em que aumentam abruptamente, colapsando no início da fase S. Os níveis de
ciclina A aumentam com a entrada em fase S e diminuem no final desta fase.

O colapso dos níveis de ciclinas entre as várias fases do ciclo celular é atribuível à sua rápida
degradação, devido à acção de ubiquitina ligases que ligam cadeias poliubiquitinadas a estas
ciclinas, levando à sua destruição pelos proteassomas. Estes ciclos de acumulação gradual e
destruição rápida ditam a unidireccionalidade do ciclo celular.

A única excepção a estas flutuações programadas nos níveis de ciclinas é dada pelas ciclinas
do tipo D. Os níveis destas ciclinas não variam dramaticamente durante o ciclo celular. Em vez
disso, são controlados por sinais extracelulares, particularmente os veiculados pelos factores
de crescimento. A activação de RTKs pelos ligandos e estimulação das vias de sinalização a
jusante resulta na acumulação de ciclina D1 e a remoção dos factores de crescimento resulta,
inversamente, no colapso dos níveis de ciclina D1. Este comportamento distinto reflecte a sua
função de veicular sinais extracelulares até ao relógio do ciclo celular que opera no núcleo,
informando a célula acerca das condições ambientais momentâneas.

NOTA: Os complexos ciclina D-CDK4/6 têm actividade enzimática idêntica independentemente de


conterem a ciclina D1, D2 ou D3. A aparente redundância oferece à célula um input sensorial refinado e
uma maior flexibilidade de resposta. O promotor de cada um dos três genes codificantes está sob o
controlo de diferentes vias de sinalização e, portanto, de diferentes receptores de superfície. O promotor
do gene que codifica a ciclina D1 contém locais de ligação para os factores de transcrição AP-1, Tcf/Lef e
NF-kB. O promotor do gene que codifica a ciclina D2 é activado pelo factor de transcrição Myc e pelo
aumento do cAMP intracelular. O gene que codifica a ciclina D3 é responsivo aos factores de transcrição
STAT3, STAT5 e E2A. Assim, um conjunto de sinais extracelulares consegue controlar os níveis de ciclinas
do tipo D e influenciar a actividade das CDK4/6.

Os complexos ciclina D-CDK4/6 conseguem conduzir a célula até ao ponto R, a partir do qual
as restantes ciclinas, que se comportam de maneira pré-programada, executam um programa
autónomo até ao final da fase M. Adicionalmente, os complexos ciclina-CDK suprimem a
actividade dos complexos precedentes e activam a actividade dos complexos subsequentes.

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NOTA: As ciclinas podem ter outras funções para além do controlo do ciclo celular. A ciclina D1 pode
associar-se ao ER, mimetizando a acção do estrogénio. Mais de 70% dos cancros da mama expressa o ER
e a ciclina D1 também é frequentemente sobrexpressa nestes tumores, podendo possuir um papel
importante na proliferação das células cancerosas.

Os complexos ciclina-CDK são regulados por inibidores CDK (CKIs). A actividade das ciclinas
não é modulada apenas pelos seus níveis. O controlo adicional mais importante é imposto pelos
CKIs que antagonizam a actividade dos complexos ciclina-CDK.

As quatro proteínas INK4 – p16INK4A,


p15INK4B, p18INK4C e p19INK4D - inibem os
complexos que integram as CDK4 e 6. Os três
restantes CKIs – p21Cip1, p27Kip1 e p57Kip2 – têm
uma acção mais vasta, conseguindo inibir os
restantes complexos ciclina-CDK (também
regulam a transcrição, a apoptose, o destino
celular, a migração celular e a organização do
citoesqueleto; o p57 tem um papel minor no
desenvolvimento de cancro).

Quando o TGF-β está presente no meio, a


resposta anti-proliferativa desencadeada
envolve o aumento dos níveis de p15 que
bloqueia a formação de complexos ciclina D-
CDK4/6 e inibe os complexos já formados,
impedindo que a célula avance até ao ponto R.
Após este ponto, a acção dos complexos
ciclina D-CDK4/6 é desnecessária, explicando a
perda do poder inibitório do TGF-β.

Os níveis de p21 aumentam ligeiramente


na presença de TGF-β, mas aumentam de
forma muito significativa em resposta a
stresses fisiológicos, como o dano genómico.
Enquanto o DNA não for reparado, o p21 inibe
a actividade de todos os complexos ciclina-
CDK já formados, só aliviando este bloqueio
quando o dano for corrigido. Esta estratégia
faz todo o sentido na fase G1 tardia,
impedindo a progressão para a fase S e a cópia
inadvertida de sequências de DNA danificadas.
O p21 também pode inibir um componente
chave da maquinaria replicativa, o PCNA
(proliferating-cell nuclear antigen) parando a
síntese de DNA danificado.

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Antagonicamente, os mitogénios
silenciam esta função inibidora – a activação
da via PI3K conduz à fosforilação das
moléculas de p21 nucleares pela Akt,
exportando-as para o citoplasma onde não
conseguem exercer a sua função. A Akt
também fosforila o p27 prevenindo a sua
exportação do citoplasma, onde é sintetizado,
para o núcleo.

Há um aspecto no comportamento do p21 e do p27 que é paradoxal: estimulam a formação de complexos ciclina D-
CDK4/6, apesar de inibirem todos os demais complexos. Uma vez formado um complexo que incorpore um destes CKIs, o
complexo ciclina D-CDK4/6 consegue fosforilar os seus alvos. Quando as células estão em quiescência, o p27 está presente em
concentrações elevadas, suprimindo a actividade dos poucos complexos ciclina E-CDK2 que possam estar presentes na célula.
Se as células forem expostas a factores de crescimento, os complexos ciclina D-CDK4/6 acumulam-se e capturam moléculas de
p27, sequestrando-as e “arrancando-as” dos complexos ciclina E-CDK2, que ficam livres para impulsionar a passagem pelo
ponto R, através dum loop de feedback positivo que fomenta a degradação do p27 e a síntese de moléculas de ciclina E.

O estado pós-mitótico de muitas células diferenciadas é imposto pela presença de vários


CKIs. Modificações covalentes das CDKs – fosforilações activadoras nos loops de activação,
efectuadas pelas CAKs (CDK-activating kinases; são complexos ciclina-CDK) ou inibitórias
(removidas por fosfatases, como as CDC25A e B, sobrexpressas nalguns cancros) - também
controlam a sua actividade.

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Versões defeituosas do gene supressor de tumor Rb figuram em muitos retinoblastomas,
sarcomas, carcinomas de células pequenas do pulmão e noutros tumores.

A pRb codificada por este TSG é uma fosfoproteína


nuclear. O estado de fosforilação da proteína pRb varia
em conformidade com o ciclo celular.

A pRb está desfosforilada durante a fase G0 e fica


hipofosforilada (pelos complexos ciclina D-CDK4/6)
com a entrada em G1. A partir do ponto R, a pRb fica
extensamente fosforilada em muitos resíduos de serina
e treonina (pelos complexos ciclina E-CDK2), isto é,
hiperfosforilada, mantendo-se assim até ao término da
fase M. Finalizada a mitose, os grupos fosfato são
removidos pela enzima PP1 (protein phosphatase type
1), iniciando um novo ciclo de fosforilação da pRb.

O ponto R, definido pelo critério fisiológico de aquisição de independência de factores de


crescimento, é acompanhado pela alteração bioquímica da pRb, convertendo-a duma forma
inibidora de crescimento a uma forma funcionalmente inerte.

A simultaneidade do ponto R e da hiperfosforilação da pRb indicia que esta proteína é o


governador molecular da passagem pelo ponto R. Outras pistas que vieram suportar este
indício foram providenciadas pelas interacções das oncoproteínas codificadas por DNA viral
com a pRb. Estas oncoproteínas conseguem corromper o circuito regulatório de crescimento
celular: a oncoproteína E1A, codificada pelo adenovírus humano tipo 5, a oncoproteína large T,
codificada pelo vírus SV40 e a oncoproteína E7, codificada por certas estirpes de HPV,
conseguem formar complexos com a pRb nas células transformadas por vírus (a E7 também
marca a pRb para ubiquitilação e degradação proteolítica). Uma vez que a evolução seleciona
vírus capazes de se multiplicar eficazmente, esta evidência sugere que a sequestração ou a
inactivação funcional da pRb é requerida para uma replicação viral óptima – liberta-se a célula
infectada da supressão de crescimento imposta pela pRb, criando um ambiente intracelular que
suporta a replicação viral (a entrada em fase S é fundamental para que a maquinaria celular de
replicação do DNA possa ser explorada pelo vírus de DNA). Funcionalmente, a sequestração da
pRb equipara-se à perda mutacional das duas cópias do gene Rb. As oncoproteínas dos vírus de
DNA indutores de tumor ligam-se preferencialmente à forma hipofosforilada da pRb. De facto,
as formas hiperfosforiladas (funcionalmente inactivadas por fosforilação) são ignoradas pelas
oncoproteínas virais, salientando o foco dirigido para a inactivação das formas da pRb
inibidoras de crescimento, as presentes na fase G1 precoce e intermédia.

A fosforilação da pRb é reversível em casos de stress fisiológico (hipoxia, dano genómico,


disrupção do fuso mitótico), em que a pRb é reactivada transitoriamente até à resolução do
problema.

NOTA: Ao contrário das oncoproteínas codificadas pelos vírus de RNA indutores de tumor, as
oncoproteínas codificadas pelos vírus de DNA não se assemelham a proteínas naturalmente existentes
nas células não infectadas.

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A pRb é o guardião do ponto de restrição. Como a pRb decide, em última análise, se a célula
divide ou não, a sua fosforilação tem de ser estritamente regulada, daí que seja controlada por
componentes do relógio do ciclo celular. As ciclinas D em associação com as CDK4 e 6 iniciam
a fosforilação da pRb, que é necessária, mas não suficiente para a inactivação funcional
subsequente da pRb que ocorre no ponto R. A inactivação implica a hiperfosforilação pelos
complexos ciclina E-CDK2. As moléculas de pRb que escaparam à hipofosforilação não são bons
substratos para a hiperfosforilação seguinte. Se os mitogénios forem retirados do meio durante
a fase G1 precoce e intermédia, os níveis de ciclina D1 colapsam e a hipofosforilação da pRb
reverte por acção de uma fosfatase. A partir do ponto R, a hiperfosforilação e consequente
inactivação funcional da pRb é mantida pelos complexos contendo ciclina E, A e B, nenhum dos
quais responde a sinais extracelulares.

A hipofosforilação da pRb pelos complexos ciclina D-CDK4/6 é um pré-requisito para a transição do ponto R,
assegurando que esta transição é responsiva a sinais extracelulares.

A perda funcional da pRb alcançada por mutação dos seus alelos, por metilação do promotor
do gene Rb, pela acção de oncoproteínas virais e pela desregulação da sua fosforilação é um
achado frequente em muitos tipos de cancro, desregulando a transição entre o crescimento
mitogénio dependente e independente.

O controlo exercido pela pRb é


atribuível aos seus efeitos sobre um
grupo de factores de transcrição, os
E2Fs.

Quando a pRb (bem como as outras


pocket proteins relacionadas, a p107 e a
p130) está desfosforilada ou
hipofosforilada liga-se a E2Fs, incluindo
E2Fs ligados ao DNA. Inversamente, no
estado hiperfosforilado dissocia-se
destes factores de transcrição.

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A associação aos E2Fs previne a estimulação da transcrição. Por isso, muitos dos genes cuja
expressão depende dos E2Fs permanecem reprimidos durante a maior parte da fase G1. A partir
do ponto R, na fase G1 tardia, os E2Fs são libertados e estimulam a transcrição de genes cujos
produtos finais auxiliam na transição G1/S. A presença de oncoproteínas virais mimetiza a
hiperfosforilação da pRb, evitando o sequestro de E2Fs.

Em circunstâncias em que os E2Fs se ligam aos


promotores na ausência de proteínas pocket associadas, a
activação da transcrição génica é conseguida pela atracção de
outras proteínas, como as histonas acetilases, que
remodelam a cromatina vizinha e recrutam a RNA polimerase.

No entanto, quando os E2Fs estão ligados ao Existem oito membros na família de E2Fs: os E2F
DNA associados fisicamente à pRb, esta última 1 a 6 formam factores de transcrição heterodiméricos
consegue bloquear o domínio de transactivação dos com as proteínas DP1 e 2 e os E2F 7 e 8 possuem
E2Fs (utilizado para activar a transcrição) e recrutar domínios de ligação directa ao DNA. Os E2F 4 e 5
repressores transcripcionais (por exemplo, a histona estão envolvidos na repressão transcripcional,
desacetilase coloca a cromatina numa configuração dependendo das proteínas p107 e p130 para atrair os
incompatível com a transcrição activa). Portanto, repressores – expressão abundante em células
para além de bloquear fisicamente os domínios de quiscentes. Células que não expressam estes dois
transactivação dos E2Fs, a pRb funciona como um E2Fs são insensíveis aos efeitos inibidores de
repressor transcripcional. crescimento do p16. Os E2F 6, 7 e 8 actuam
exclusivamente como repressores transcripcionais e
não se associam a proteínas pocket.

Os E2F 1, 2 e 3 são muito expressos em células em proliferação (quando são injectados em


células quiescentes conseguem induzir a entrada em fase G1). Atraem proteínas activadoras da
transcrição e activam a transcrição de genes importantes para a fase S, como os genes que
codificam proteínas envolvidas na biossíntese de percursores de nucleótidos e outros genes
envolvidos directamente na replicação do DNA.

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Os E2Fs activam a transcrição de genes que O feedback positivo que marca a passagem
codificam a ciclina E - a inactivação da pRb leva, pelo ponto R é aumentado pela fosforilação do
portanto, ao aumento dos níveis de ciclina E, que p27 pelos complexos ciclina E-CDK2, que é
impulsiona a inactivação por hiperfosforilação da ubiquitilado e rapidamente degradado. Assim,
pRb, libertando mais E2Fs - e o E2F1 - expressão mais complexos de ciclina E-CDK2 ficam livres da
auto-sustentada. São loops de feedback positivo. inibição do p27 e disponíveis para fosforilar e
aniquilar mais moléculas de p27.

Os loops de feedback positivo garantem a execução rápida duma decisão tomada e


asseguram a sua irreversibilidade. O período de activação da transcrição pelos E2Fs 1, 2 e 3
corresponde à fase G1 tardia. A activação dos complexos ciclina A-CDK2 na fase S conduz à
fosforilação das subunidades E2F e DP destes factores de transcrição heterodiméricos,
resultando na sua dissociação. Também pode ocorrer ubiquitilação e subsequente destruição
destes E2Fs. Concomitantemente, os E2F 7 e 8 são expressos (expressão induzida pelos E2Fs 1,
2 e 3) e bloqueiam alguma expressão E2F-dependente residual que persista após a entrada em
fase S.

Diversas vias de sinalização mitogénicas controlam o estado de fosforilação da pRb. Um


número considerável de vias de sinalização distintas converge no relógio do ciclo celular e
modula o seu funcionamento.

Os sinais aferentes são processados e o ciclo celular é impulsionado pela acção dos
complexos ciclina-CDK. Proeminentes entre estes sinais, são os sinais veiculados pelas vias de
sinalização mitogénicas que estão hiperactivadas, virtualmente, em todos os cancros. A
conexão entre estas vias e o relógio do ciclo celular é crítica para o entendimento da
transformação celular e da progressão tumoral. Os sinais mitogénicos transduzidos via Ras
resultam na hipo e eventualmente hiperfosforilação da pRb. Esta fosforilação é o produto da
indução da expressão dos genes que codificam as ciclinas D. Se a sinalização via Ras for
bloqueada a proliferação é bloqueada em células wild-type expostas a soro. Se, adicionalmente,

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se inactivarem ambos os alelos do gene Rb, a célula entra em fase S, demonstrando que a função
principal da proteína Ras durante a fase G1 é assegurar que os sinais mitogénicos libertados por
receptores de factores de crescimento activados por ligando conseguem fomentar a fosforilação
e inactivação funcional da pRb.

A capacidade de os factores de crescimento


mitogénicos aumentarem os níveis de ciclinas D,
depende de várias vias de sinalização, entre as quais
se destaca a via Ras/Raf/MAPK. Os membros da
família Fos de factores de transcrição, que se
encontram a jusante desta cascata, formam
complexos AP-1, através da associação às proteínas
Jun. Estes complexos activam a transcrição do gene
que codifica a ciclina D1. Outra via de sinalização
importante é a via Ras/PI3K/Akt. A Akt fosforila e
inactiva a GSK-β, prevenindo os seguintes efeitos
desta enzima: fosforilação da β-catenina, que é
marcada para destruição via ubiquitina-
proteassoma – a β-catenina pode assim migrar para
o núcleo onde forma complexos com a Tcf/Lef, que
actuam como factores de transcrição e estimulam a
produção de mRNA da ciclina D1 - e fosforilação da
ciclina D1, marcando-a para destruição – aumentam
ainda mais os níveis desta ciclina.

A proteína Myc governa as decisões de proliferação vs diferenciação. Mais de 70% dos


cancros humanos sobrexpressam a Myc (ou a N-Myc ou a L-Myc). Contrastando com as
oncoproteínas Ras e Src que operam na vizinhança da membrana plasmática e iniciam cascatas
de sinalização que activam proteínas transdutoras de sinal citoplasmáticas e factores de
transcrição nucleares, a oncoproteína Myc encontra-se no núcleo onde funciona como um
factor de transcrição pró-crescimento.

As proteínas Myc integram a família bHLH de factores de transcrição. Os membros desta


família formam homo e heterodímeros, que se associam a sequências regulatórias, E-boxes,
encontradas nos promotores dos genes que regulam. A actividade do Myc é regulada pelos
seus níveis e pelas associações estabelecidas com proteínas bHLH que aumentam ou diminuem
a sua actividade. A proteína Max (expressa em níveis constantes) aumenta o poder activador
da transcrição da Myc (expressão influenciada por factores mitogénicos) ao se associar a esta.
Os produtos de muitos genes favorecem a proliferação celular.

NOTA: Em muitos genes, após a RNA polimerase II iniciar a transcrição, a enzima pára cerca de 50 bp
a jusante. O heterodímero Myc-Max interage com o complexo parado e liberta-o do local de pausa,
permitindo a elongação do trancripto de RNA. Sem esta intervenção, a RNA polimerase II pode ficar
parada indefinidamente.

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Há proteínas bHLH implicadas em programas de diferenciação tecidual, cuja acção pode ser
prevenida pela Myc. Consequentemente, a Myc pode estimular a proliferação e bloquear a
diferenciação celular em simultâneo. À medida que as células se vão diferenciando, a proteína
Mxd, da família bHLH desloca a Myc dos complexos Myc-Max, evitando a sua acção activadora
da transcrição, e permitindo a entrada da célula num estado pós-mitótico.

A Myc regula a expressão de componentes


críticos do relógio do ciclo celular. Quando a
expressão destes componentes é impulsionada por
níveis anormalmente altos de Myc presentes nas
células que têm oncogenes myc, o resultado é um
estado fisiológico semelhante ao encontrado nas
células que não têm função pRb. Ambas as
mudanças privam a célula de controlo durante a
progressão pela fase G1 e desregulam a passagem
pelo ponto R. A Myc controla a expressão do gene
que codifica a ciclina D2, cuja expressão é
conducente à hipofosforilação da pRb, bem como a
expressão da CDK4, mais uma vez, incitando a
hipofosforilação da pRb e o sequestro do p27. Estas
alterações na expressão génica contribuem para a
passagem pela fase G1. Através da associação com
a proteína Miz-1, a Myc pode funcionar como um
repressor transcripcional, coibindo a expressão do
p15 e do p21, dois CKIs manobrados pelo TGF-β para
bloquear a progressão da fase G1. Assim, a Myc
confere resistência a acções inibitórias do TGF-β.
Finalmente, a Myc induz a expressão dos genes que
codificam os factores de transcrição E2F1, 2 e 3,
favorecendo a proliferação celular.

A Myc possui, então, um grande alcance, afectando vários níveis regulatórios do relógio do
ciclo celular. A presença de Myc, mesmo na ausência de mitogénios, consegue induzir a
transição G0/G1 e a progressão durante a fase G1. A Myc também actua noutros genes alvo não
relacionados com o ciclo celular, genes envolvidos na biossíntese proteica e no metabolismo
energético (crescimento celular no sentido estrito).

257
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O TGF-β previne a fosforilação da pRb, bloqueando a progressão do ciclo celular. O TGF-β
representa o principal sinal inibitório de crescimento. Os efeitos citostáticos do TGF-β derivam
da sua acção sobre a pRb.

O receptor do TGF-β tem domínios


citoplasmáticos com actividade serina-treonina
cinase que fosforilam um par de proteínas
Smad2 ou Smad3. Este par forma um
heterotrímero com a proteína Smad4, que migra
para o núcleo onde funciona como factor de
transcrição. A colaboração do factor de
transcrição Miz-1 é requerida para activar a
transcrição dos genes que codificam o p15 e o
p21. O mesmo factor de transcrição pode
associar-se à Myc reprimindo a expressão destes
mesmos dois genes. Nas células normais, a
sinalização pelo TGF-β suplanta os sinais
conflituosos que a Myc possa libertar.
Complexos de Smad3-E2F4/5-p107 conseguem
ligar-se ao promotor do gene myc, suprimindo a
sua expressão.

As células normais precisam de aprender a evadir-se desta sinalização citostática para se


tornarem células cancerosas (preservando as respostas que favorecem a invasibilidade
tumoral). Algumas células cancerosas que dependem de níveis elevados de transcrição do myc
precisam de libertar essa transcrição das acções repressoras do TGF-β, através da aquisição de
promotores mutados que disparam constitutivamente ou da alteração dos factores de
transcrição que regulam a expressão do gene myc, como o Smad2 (mutado em carcinomas do
cólon) e o Smad4 (mutado em cerca de 50% dos carcinomas pancreáticos e em cerca de 25%
dos carcinomas do cólon). A evasão também pode ser alcançada pela inactivação da via pRb.
Alguns cancros utilizam uma manobra evasiva drástica: intactivam os genes que codificam o
receptor do TGF-β. Estas células cancerosas perdem benefícios potenciais conferidos pelo TGF-
β em fases mais avançadas da progressão tumoral.

De forma simplificada, as células podem existir em dois estados de crescimento alternativos:


um estado relativamente indiferenciado em que retêm a possibilidade de divisão –
comportamento das células estaminais – e um estado mais diferenciado, em que a capacidade
de proliferação é perdida – pós-mitótico. Na maioria dos cancros, a diferenciação é parcial ou
totalmente bloqueada. Tal bloqueio pode ser acompanhado pelo avanço da progressão
tumoral. Por exemplo, as neoplasias hematopoiéticas, como as leucemias podem apresentar-se
em duas formas: a crónica e a aguda. Nas leucemias crónicas, como a leucemia mieloide crónica
(CML), as células cancerosas são mais maduras e diferenciadas. Estas leucemias podem perdurar
anos sem ameaçarem a vida do paciente. No caso da CML, após 3 a 5 anos, costuma haver uma
erupção súbita de formas malignas e agressivas – crise blástica. Estas células têm a mesma
origem clonal mas são menos diferenciadas e multiplicam-se incessantemente, permanecendo

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num compartimento celular pouco diferenciado (mieloide ou eritroide), sem saírem para um
compartimento celular pós-mitótico (neutrófilos diferenciados).

Existe aceitação da ideia de os mecanismos associados com a diferenciação estarem


acoplados com os mecanismos que regulam a proliferação.

Exemplos experimentais:

 A inibição na função da pRb em percursores das células da retina in vitro impede a diferenciação em
células fotoreceptoras.
 In vitro, o bloqueio de mioblastos indiferenciados em fase G1, induzido pela expressão elevada de p16
e p21, instiga a diferenciação em miócitos, mesmo quando existem altos níveis de factores de
crescimento no meio. Essa diferenciação é evitada se, adicionalmente, se inibir a expressão de pRb.
 A expressão de ciclina D1 em mioblastos bloqueia a diferenciação quando há carência de factores de
crescimento no meio de cultura.

Estas experiências indicam que a hipofosforilação da pRb serve dois fins: a paragem da
proliferação e a facilitação da diferenciação. Todas estas observações corroboram que a
maquinaria que controla o estado de fosforilação da pRb tem um papel activo no processo de
diferenciação em muitos sistemas biológicos. Os sinais que favorecem a hiperfosforilação da
pRb, da p107 e da p130, inactivando-as, bloqueiam a diferenciação, enquanto os sinais que
previnem a hiperfosforilação, favorecem a diferenciação. Além disso, a saída duma célula do
ciclo celular activo para se diferenciar, ocorre presumivelmente durante a fase G1, quando a
pRb controla activamente o destino celular.

Muitos dos factores de transcrição que controlam a


diferenciação são membros da família bHLH, como a Myc.
Todavia, estas proteínas bHLH (ex: MyoD) orquestram
programas de diferenciação complexos, tecido-específicos,
enquanto a Myc bloqueia a diferenciação e promove a
proliferação. A Myc estimula a produção das proteínas bHLH
Id1 e Id2, que antagonizam membros bHLH pró-diferenciação.

O controlo da função da pRb está perturbado, virtualmente, em todos os cancros. A


desregulação da via Rb tem um outcome que é indubitavelmente característico do fenótipo
canceroso – a proliferação não constrangida. A regulação da passagem pelo ponto R está
corrompida, hipoteticamente, em todas as células cancerosas. O mecanismo mais directo de
atingir tal desregulação é a inactivação do gene Rb (mutacional ou por metilação do promotor)
ou da proteína pRb (pelas oncoproteinas virais, por exemplo). Esta inactivação funcional pode
resultar da presença de níveis anormalmente elevados de ciclina D1 (verificada em cerca de
metade dos cancros da mama), por amplificação génica ou corrupção das vias de sinalização a
montante que controlam a expressão desta proteína. A perda do gene supressor de tumor que
codifica o p16 (ocorre no melanoma familiar) retira um importante “travão” à fosforilação da
pRb. Mutações na CDK4, encontradas e formas esporádicas e familiares de melanoma, evitam a
inibição desta CDK pelas moléculas INK4 (p15, p16, p18 e p19), incitando, de forma similar, a
fosforilação da pRb.

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O CKI mais determinante para a patogénese do cancro será talvez o p27. Este CKI está
presente em níveis elevados na fase G0. Esses níveis diminuem progressivamente com a
reentrada no ciclo celular e caem precipitadamente com a entrada na fase G1 tardia, pelas
acções dos complexos ciclina E-CDK2.

NOTA: Os baixos níveis não são consequência de redução na transcrição génica do p27. São o produto
da acção da proteína Skp2 que encaminha o p27 para degradação via ubiquitina proteassoma. A Skp2,
cuja transcrição pode ser fomentada via Notch, pode ser activada a oncoproteína nalguns cancros. A
hiperactivação da via PI3K-Akt/PKB também tem efeitos cruciais no relógio do ciclo celular. A Akt
fosforila os CKIs p21 e p27, assegurando a localização citoplasmática destes intervenientes. Os níveis de
p27 podem ser adicionalmente reduzidos pela fosforilação e inactivação de um factor de transcrição da
família Forkhead que controla a sua expressão. Há ainda uma terceira maneira de visar o p27: a Akt
fosforila a proteína Skp2, activando-a.

As acções da oncoproteína Myc devem ser qualitativamente semelhantes às da proteína


Myc. A diferença é sobretudo quantitativa: nas células normais, os níveis da proteína Myc são
altamente dependentes dos factores de crescimento mitogénicos extracelulares, enquanto nas
células cancerosas a Myc pode ser expressa de forma constitutiva.

NOTA: Entre os produtos induzidos pela Myc, as proteínas Id têm especial relevância fisiológica: são
inibidores dominantes negativos dos factores de transcrição bHLH que programam a diferenciação
celular e conseguem ligar-se à pRb, inibindo-a, relembrando a acção das oncoproteínas virais. De facto,
a proteína Id2 é sobrexpressa em muitos tipos de cancro. A síntese e degradação das proteínas Id ocorre
rapidamente. Têm portanto semi-vidas curtas e estão presentes em baixas concentrações. É a sua
degradação que está comprometida em muitos tipos de cancro.

Vermelho – Elementos que favorecem a passagem pelo ponto R (hiperactivados no cancro);

Azul – Elementos que impedem a passagem pelo ponto R (inactivados no cancro).

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RESUMO:

Inactivando a função da pRb, o requerimento das acções promotoras do crescimento das


oncoproteínas é significativamente reduzido, e as células avançam pela fase G1 sem
preencherem muitos dos pré-requisitos que normalmente determinam a passagem pelo ponto
R;

Um aspecto do controlo proliferativo opera de forma independente do relógio do ciclo


celular: a capacidade replicativa é finita – cada célula só consegue dividir-se um número limitado
de vezes, e este número é determinado pelo DNA cromossómico. As células cancerosas têm
imortalidade replicativa;

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Os ciclos de crescimento e divisão das células cancerosas não são necessariamente mais
curtos que os das células normais: as alterações do relógio do ciclo celular que conferem
vantagem proliferativa às células cancerosas envolvem a fase G1, nomeadamente a passagem
pelo ponto R, um ponto de tomada de decisão crítico. As restantes fases do ciclo celular (S, G2
e M) procedem de forma automática e pré-programada, à semelhança do que ocorre nas células
normais;

No entanto, mudanças subtis podem ser sentidas em fases mais avançadas do ciclo celular.
Por exemplo, os complexos pRb-E2F1 regulam a expressão de genes envolvidos em várias etapas
da fase M: condensação dos cromossomas, função dos centrómeros e estabilidade
cromossómica, em geral. As células cancerosas que inactivaram a pRb sofrem de instabilidade
cromossómica, o que pode contribuir para acelerar a progressão tumoral;

Adicionalmente, a inactivação de proteínas envolvidas nos checkpoints controlo visa, não


directamente desregular a proliferação celular, mas principalmente destabilizar o genoma
celular e aumentar a mutabilidade.

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p53 and Apoptosis: Master Guardian and
Executioner
A proteína p53 zela pelo interesse do organismo, vigiando e garantindo o bom
funcionamento dos sistemas vitais internos da célula. Se a p53 detectar alterações metabólicas
ou genéticas caóticas, para o ciclo celular e orquestra respostas que facilitem a reparação do
dano. Se o dano for demasiado extenso para ser reversível, a p53 pode mediar a activação do
programa de suicídio celular latente, desencadeando a apoptose. Isto assegura a eliminação de
qualquer célula cuja prossecução do crescimento e divisão pudesse representar uma ameaça
para o organismo e para a sua viabilidade. A apoptose garante o desaparecimento da célula
onde foi activada em menos de uma hora. A presença duma maquinaria apoptótica latente mas
intacta representa uma ameaça permanente para a célula cancerosa incipiente, o que explica
que a inactivação da função p53 seja uma grande conquista na carcinogénese.

NOTA: A p53 foi identificada por estudos de imunoprecipitação em células transformadas pelo vírus
indutor de tumor SV40. A proteína large T codificada por este vírus tem capacidade antigénica e é utilizada
pelo vírus para perturbar circuitos celulares regulatórios. Células transformadas foram expostas a soro
reactivo contra as células SV40-transformadas. Os imunoprecipitados que se formaram continham a
proteína large T e a p53. Antisoro reactivo com a proteína p53 detectou a presença desta proteína em
muitas células tumorais não infectadas, ou seja, transformadas por mecanismos não virais. A p53 é,
consequentemente, uma proteína com origem celular e não viral, que está presente em células
transformadas. Mais tarde, confirmou-se que a oncoproteína large T se liga a esta proteína, perturbando
a sua função. Estas observações também sugerem que os níveis elevados de p53 nas células SV40-
transformadas provocam uma resposta imune contra a proteína large T e a própria p53 endógena.

Os primeiros estudos funcionais consistiram na transfecção do cDNA da p53 em fibroblastos


embrionários de roedor e revelaram a colaboração com o oncogene ras co-introduzido para a
transformação celular. Este comportamento é típico dum oncogene. No entanto, o cDNA
utilizado tinha sido sintetizado utilizando como molde mRNA extraído de células tumorais.
Quando se utilizou como molde um mRNA proveniente de células normais, a p53 demonstrou
suprimir a transformação celular. O gene TP53 foi considerado um gene supressor tumoral.
Uma mutação pontual distinguia o cDNA WT do cDNA mutante. Alelos mutados são comuns
numa série de cancros em humanos – o gene TP53 é o gene mutado com mais frequência nos
cancros humanos, sendo que as formas mutantes são detectadas em cerca de um terço de todos
os cancros.

263
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O TP53 não é um gene supressor tumoral típico. Ao contrário dos outros TSGs, reguladores
negativos da proliferação, cujo knockout experimental germ line dos dois alelos resulta na
disrupção do desenvolvimento embrionário e na desregulação da morfogénese tecidual, a
delecção germ line de ambas as cópias do gene p53, não surte efeito deletério no
desenvolvimento da maioria dos embriões murinos. Assim, o gene p53 não é um simples
regulador negativo da proliferação celular. Porém, é claramente um gene supressor tumoral,
uma vez que os ratinhos knockout morrem precocemente de linfomas e sarcomas. Logo, a
proteína p53 não deve participar na transdução de sinais proliferativos e anti-proliferativos. Em
vez disso, a p53 parece ser especializada em prevenir o aparecimento de células anormais.

As versões mutantes da p53 interferem com a função da p53 normal. A observação


frequente de alelos TP53 mutados nos genomas das células tumorais sugere que as células
cancerosas incipientes precisam de perturbar ou erradicar a função da p53. Outro aspecto
invulgar emergiu: o gene TP53 não obedece à hipótese de eliminação two-hits de Knudson, de
acordo com a qual uma célula pré-maligna só consegue retirar benefício substancial se tiver
perdido ambas as cópias funcionais do gene supressor tumoral que tem “travado” a sua
proliferação (através de duas mutações inactivadoras sucessivas ou de uma mutação
inactivadora seguida de um evento de perda de heterozigotia). No modelo de Knudson, os
eventos de inactivação génica são causados por mutações que criam alelos inactivos “null” que
são, portanto, alelos recessivos. Assim, o benefício que uma célula pré-maligna retira da
inactivação duma única cópia dum TSG é mínimo, devendo-se à diminuição quantitativa da
função da proteína codificada, ou até mesmo nulo, se a actividade residual garantida pela
expressão do alelo wild-type for suficiente para garantir a função normal.

Recordado a experiência descrita inicialmente: o cDNA mutante p53 alterou o fenótipo


celular dos fibroblastos embrionários, ainda que estes fibroblastos expressassem o seu próprio
par de cópias WT do gene p53. Isto significa que o cDNA mutante p53 não funciona como um
alelo inactivo e recessivo, exercendo uma função aparentemente dominante.

As análises das sequências dos alelos TP53 mutantes em vários genomas de células tumorais
humanas vieram suportar esta ideia. A grande maioria (74%) das mutações pontuais no quadro
de leitura gerava codões missense (substituições de aminoácidos) e não tanto codões nonsense
(codões STOP que implicam a terminação prematura da elongação da cadeia polipeptídica,
resultando numa proteína truncada). Além disso, as delecções são incomuns. Concluiu-se que
as células tumorais conseguem, efectivamente, beneficiar da presença duma proteína p53
ligeiramente alterada, mais do que da sua ausência, traduzida na criação de alelos null.

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As análises estruturais e bioquímicas da p53 revelaram que era uma proteína nuclear que
existia sob a forma de homotetrâmero. Assumindo que o alelo TP53 mutante codifica uma
proteína p53 mutante que perdeu a função normal, isso não invalida que retenha a capacidade
de integrar tetrâmeros. Se o alelo mutante coexistisse com um alelo wild-type, os tetrâmeros
de p53 resultariam da mistura de proteínas p53 mutantes e wild-type em várias proporções. A
presença de uma única proteína p53 mutante podia interferir com o funcionamento do
tetrâmero como um todo. Assim, probabilisticamente, apenas 1/16 dos tetrâmeros formados
numa célula heterozigótica seriam formados exclusivamente por subunidades p53 wild-type
e reteriam a função plena.

Na situação de transfecção experimental, a expressão do cDNA mutante p53 é controlada


por um promotor transcripcional muito activo e, por isso, a quantidade de proteína p53 mutante
excede a quantidade de proteína normal, produzida pelas cópias endógenas wild-type do gene
p53. Assim, menos de 1/16 dos tetrâmeros serão puramente wild-type, o que explica que o alelo
p53 mutante introduzido seja altamente efectivo em comprometer a função p53.

Em suma, uma mutação inicial que resulta num alelo mutante dominante negativo é muito
mais útil para uma célula cancerosa incipiente do que uma que resulte num alelo null. No
primeiro caso perdem-se 15/16 da função p53 enquanto o segundo, implica no máximo a perda
de metade dessa função (o alelo wild-type pode compensar minorando este efeito).

A eliminação do alelo wild-type continua, ainda assim, a ser necessária. O 1/16 de função
p53 normal residual pode representar mais do que as células cancerosas toleram para proliferar
da maneira mais eficaz possível. Assim, nas células tumorais humanas, à mutação inicial duma
cópia do gene TP53, segue-se, geralmente, a eliminação da cópia wild-type por um mecanismo
de perda de heterozigotia.

Geralmente, a proteína p53 tem uma semivida curta. A localização nuclear da proteína p53
indicia a sua actividade como factor de transcrição. Existem pelo menos três formas de regular
a actividade de um factor de transcrição: modulando a sua concentração nuclear ou mantendo
a concentração nuclear constante e alterando a actividade intrínseca através de modificações
covalentes ou modulando os níveis de factores de transcrição parceiros. No caso da p53, a

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primeira regulação é evidente. Os níveis de p53 podem variar drasticamente de célula para
célula e aumentar insidiosamente quando as células são expostas a stresses fisiológicos. A p53
é uma proteína instável com uma semivida que ronda os 20 minutos. O padrão repetitivo de
síntese seguida rapidamente de degradação proteolítica, semelhante ao que se verifica com a
proteína Myc, parece um desperdício de energia e capacidade sintética – um “ciclo fútil”. A
racionalidade subjacente a este turnover elevado caracteriza-se pela necessidade de a célula
aumentar ou diminuir os níveis da proteína em resposta a sinais fisiológicos. Mais rápida do
que a modulação da transcrição ou da tradução do mRNA à proteína de interesse é a
interferência na estabilização da própria proteína. Uma célula pode duplicar a concentração da
p53 em 20 minutos apenas bloqueando a sua degradação.

A indução rápida do aumento substancial da concentração da p53 ocorre na ausência de


alterações consideráveis nos níveis de mRNA p53. De facto, esta elevação é atribuível à
estabilização pós-traducional da proteína p53, que em condições regulares, é bastante lábil.

Uma grande variedade de sinais/agentes pode causar o aumento dos níveis de p53, entre
os quais a hipoxia, a activação oncogénica do myc, a sobrexpressão do factor de transcrição
E2F1, a desmetilação do DNA cromossómico, o défice de percursores nucleotídicos, a exposição
a NO ou a um meio ácido, a radiação X e UV e os agentes quimioterapêuticos que danificam o
DNA, que inibem a síntese de DNA e que interferem com a formação do fuso mitótico.
Claramente, existem muitos sensores responsáveis pela monitorização da integridade e do
funcionamento de sistemas de vigilância celulares distintos que, na presença de aberrações,
enviam sinais de alarme e activam a função da p53.

Quer os agentes genotóxicos quer os sinais fisiológicos capazes de induzir o aumento de p53
têm acções citostáticas, ou seja, param o ciclo celular – “growth arrest” (se reversível, as células
retomam o ciclo; se irreversível, entram em estado de senescência). Noutras situações, estes sinais
de stress activam o programa apoptótico. Estas duas respostas são mediadas pela p53.

O poder citostático e pró-apoptótico da p53 representa uma ameaça para a viabilidade das
células cancerosas incipientes, que experienciam muitos dos stresses – dano genómico, hipoxia,
desequilíbrios nas vias de sinalização – que conseguem invocar a função desta proteína. Como
tal, a função da p53 tem de ser desmantelada para que as células cancerosas prosperem.

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O dano genómico e a desregulação dos factores de crescimento provocam a estabilização
da p53. Três sistemas de monitorização alertam a p53 na presença de danos ou desequilíbrios
da sinalização. O primeiro responde a DSBs (double-strand breaks), especialmente as criadas por
radiação ionizante. Os sensores das DSBs transferem a informação para a cinase ATM que os
transmite à cinase Chk2 que fosforila a p53, protegendo-a da destruição pela proteína Mdm2.
O segundo responde a DNA de cadeia única, presente nas forquilhas de replicação
“encravadas”, quando as DNA polimerases encontram bases alteradas. Estes sensores activam
a cinase ATR que actua sobre a p53 via cinase Ch1k, de forma muito semelhante. O terceiro é
activado por sinais de crescimento aberrantes, nomeadamente os que resultam da
desregulação da via de controlo do ciclo celular pRb-E2F. Este sistema não depende de cinases
intermediárias. A convergência de sistemas de monitorização revela uma fragilidade intrínseca
da célula humana. Uma única proteína, a p53, está encarregue de receber sinais de alarme de
vigilantes que monitorizam uma grande variedade de sistemas intracelulares fisiológicos e
bioquímicos. Portanto, este design económico, acarreta um perigo colossal. A perda desta única
proteína regulatória representa a perda de a célula monitorizar o seu bem-estar e de responder
a um eventual mau funcionamento dos sistemas internos.

A proteína Mdm2 destrói a p53. A p53 é degradada, como muitas outras proteínas celulares,
pela via ubiquitina-proteassoma. O controlo deste processo foca-se no tagging inicial, através
da ligação convalente de cadeias laterais de poliubiquitina.

Normalmente, a degradação é regulada pela


proteína Mdm2 que reconhece a p53 como um
alvo que deve ser poliubiquitilado precocemente,
uma vez sintetizado. A proteína Mdm2 bloqueia,
consequentemente, a função de factor de
transcrição da p53 (a degradação da p53 previne
a ligação à proteína p300/CBP, que culmina na
activação da transcrição por acetilação de
histonas; sinergicamente, a proteína Mdm2
recruta activamente enzimas que metilam as
histonas). A ubiquitilação da p53 resulta na sua
exportação nuclear para o citoplasma onde é
poliubiquitilada e degradada nos proteassomas.

Nota: A p53 induz a transcrição do gene que


codifica a proteína Mdm2. Este mecanismo de
feedback negativo assegura que os níveis de p53
retornam ao normal e se mantêm normais, em
células não perturbadas.

267
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Nas circunstâncias de stress ou dano, a acção da proteína Mdm2 tem de ser evitada para que a p53 se
possa acumular. A fosforilação da p53 pelas cinases ATM, Chk1 e Chk2 serve esse propósito, prevenindo a
associação da proteína Mdm2 à p53. Adicionalmente, a cinase ATM fosforila a própria proteína Mdm2,
inactivando-a e destabilizando-a.

A Mdm2 pode ser activada a oncoproteína, cujo mecanismo de acção é invulgar, na medida em que não
está relacionado com as cascatas de sinalização mitogénicas que promovem a proliferação celular, mas sim
com a prevenção da entrada no estado de “growth arrest” ou da activação do programa apoptótico. Porém,
no final, todas as oncoproteínas favorecem o aumento do número de células.

A actividade e os níveis da proteína Mdm2 são afectados por outros sinais. A via PI3K-Akt/PKB culmina
na fosforilação da proteína Mdm2 pela cinase Akt, favorecendo a translocação da Mdm2 do citoplasma para
o núcleo. A via das MAPK cinases leva ao aumento da transcrição do gene mdm2, estimulado pelos factores
de transcrição Ets e AP-1. Em ambos os casos, o efeito final é a supressão dos níveis de p53.

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Em sentido contrário, a proteína p14ARF/ARF liga-se à proteína
Mdm2, inibindo a sua acção, por sequestro no nucléolo (estrutura
devota à produção das subunidades ribossómicas) ou por inibição no
nucleoplasma. Assim, a p53 acumula-se rapidamente. A proteína
ARF é uma aliada da p53 e, como tal, é considerada uma proteína
supressora de tumor (o locus p16INK4A/p14ARF está inactivado por
alterações genéticas ou epigenéticas em muitos tumores).

Note-se que a acção da proteína Mdm2 é extremamente importante para manter os níveis
de p53 baixos nas células normais. Ratinhos knockout para o gene mdm2 morrem durante a
embriogénese porque os níveis de p53 atingem valores intoleráveis, bloqueando a proliferação
normal ou activando a apoptose.

NOTA: A hiperactividade da p53 causa envelhecimento prematuro. Um alelo p53 truncado codifica
uma forma constitutivamente activa da proteína p53. Esse alelo foi introduzido na germ line de ratinhos.
Ratinhos heterozigóticos estão totalmente protegidos do desenvolvimento de linfomas, osteossarcomas
e sarcomas dos tecidos moles. Os fibroblastos destes ratinhos também são mais resistentes à
transformação in vitro por introdução dum oncogene ras. No entanto, estes ratinhos “resistentes ao
cancro” têm uma esperança de vida encurtada em 20%, porque envelhecem prematuramente. Em muitos
tecidos à deplecção celular generalizada, sugerindo perda de células estaminais.

Níveis de actividade dos factores de transcrição E2F 1, 2 e 3 anormalmente elevados indicam


o mau funcionamento do circuito da pRb. Esta situação impulsiona a expressão de genes que
codificam proteínas que participam num programa apoptótico p53-independente – as caspases
(3, 7, 8 e 9), as proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 (Bim, Noxa e PUMA), a proteína Apaf-
1 e a proteína p73. O programa apoptótico dependente da p53 também é activado. O gene

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p14ARF tem uma sequência no seu promotor que é reconhecida pelos E2F, que induzem a
expressão da proteína ARF, o que originará a acumulação de p53. O objectivo final é a
eliminação das células (pré-neoplásicas) que careçam de função pRb.

O oncogene myc também desregula a função pRb. Assim, possui fortes efeitos pró-
apoptóticos, que só permitem a sobrevivência da célula transformada se o programa apoptótico
tiver sido subvertido. Nessa condição, os efeitos mitogénicos da proteína Myc podem tornar-se
aparentes.

A hiperactivação da sinalização pela proteína Ras ou pela Raf incita o aumento da expressão
da proteína ARF e o aumento da expressão da própria p53 (via Erk), o que incute uma grande
pressão selectiva nas células cancerosas incipientes, forçando-as a neutralizar a função p53 sob
a pena de serem eliminadas por apoptose p53-dependente.

A p53 funciona como um factor de transcrição que pára o ciclo celular em resposta a dano
genómico e incentiva o processo de reparação. A sequência de reconhecimento está presente
nos promotores ou nos intrões iniciais dos genes alvo. A maioria (>90%) das mutações dos alelos
que codificam a proteína p53 afectam o seu domínio de ligação ao DNA. Um conjunto complexo
de modificações covalentes da extremidade C-terminal da p53 tem de ocorrer, de modo a
permitir a interacção com outros factores que regulam a transcrição (por exemplo, a ligação ao
co-activador p300 que acetila as histonas e a própria p53).

Um dos genes alvo codifica a proteína Mdm2, o agente da destruição da p53. É um loop de
feedback negativo que assegura a manutenção de níveis baixos de p53. Nas células cancerosas
que possuem um alelos mutantes TP53, a proteína p53 (inerte) está invariavelmente presente
em concentrações elevadas, o que é compreensível sob o ponto de vista da perda do poder
activador da transcrição (não activa a transcrição do gene mdm2). Nesta óptica, a detecção da
p53 por imunohistoquímica em células tumorais sinaliza a presença de alelos mutantes TP53.

Outro gene cuja expressão é estimulada pela p53 é o gene p21, que codifica um CKI. A sua
indução explica os efeitos citostáticos da p53 – o p21 inibe as CDKs activas durante a fase G1
tardia, a fase S, a fase G2 e a fase M.

Alguns componentes da maquinaria de reparação do DNA são mobilizados pela p53. Se o


DNA for reparado com sucesso, os sinais que protegeram a degradação da p53 desaparecem e
os níveis de p53 e de p21 colapsam, permitindo a entrada em fase S. Se a célula já estiver em
fase S, o p21 impede o avanço da maquinaria da DNA polimerase nas forquilhas de replicação.
Pela variedade de acções descritas que visam e redução da taxa de acumulação de mutações,
a p53 é considerada o guardião do genoma.

Em resposta a dano genómico massivo e irreparável, a anoxia ou a desequilíbrios de


sinalização severos, a p53 impele a entrada em apoptose. As mudanças celulares que
constituem o programa apoptótico procedem de forma coordenada e agendada. Em minutos, a
membrana plasmática emite protusões. O núcleo colapsa numa estrutura densa – picnose – e
fragmenta-se. No intervalo de uma hora, a célula apoptótica desintegra-se em pequenos corpos
apoptóticos. Segue-se a fagocitose pelos macrófagos, dependente de sinais “eat me”

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especializados, nomeadamente a exibição de fosfatidilserina na camada externa da membrana
celular (que normalmente se encontra no lado interno).

A apoptose é explorada durante a morfogénese normal e na é importante fisiologia tecidual,


para manter um número apropriado de células diferenciadas. A apoptose que ocorre
rotineiramente para a manutenção tecidual não depende da função p53. As acções da p53
estão, então, limitadas a situações de emergência não rotineiras. A capacidade de iniciação da
apoptose pela p53 depende da promoção da expressão de genes alvo que codificam proteínas
pró-apoptóticas e, concomitantemente, da repressão da expressão de genes que codificam
proteínas anti-apoptóticas.

A inactivação do gene TP53 é vantajosa para as células cancerosas incipientes em vários


passos da progressão tumoral. Uma etapa precoce da progressão tumoral pode envolver a
activação dum oncogene, colocando a célula em risco de apoptose p53-dependente. Mais tarde
no desenvolvimento tumoral, a população de células tumorais pode experienciar anoxia, por
falta de uma rede vascular adequada que providencie suprimento sanguíneo. De forma mais
generalizada, durante toda a progressão tumoral a mutabilidade é um requisito para que as
células pré-malignas evoluam para células malignas. Em qualquer uma destas etapas, a perda
da função p53 é profícua para as células tumorais. O proveito é mais extenso: um dos genes alvo
cuja expressão é aumentada pela p53 é o gene TSP-1 que codifica a trombospondina-1, uma
proteína extracelular anti-angiogénica. A redução nos seus níveis é benéfica para o tumor. As
consequências da inactivação do gene TP53 ilustram como o mau funcionamento de um único
componente do sistema de alarme permite que as células cancerosas adquiram múltiplas
alterações e sobrevivam sob condições que levariam à morte das células normais.

NOTA: Existem duas proteínas relacionadas com a p53: a p63 e a p73. Tetrâmeros mistos compostos
por subunidades de p53 e destas duas proteínas podem formar factores de transcrição e activar partes
do programa apoptótico p53-dependente.

Alelos mutantes herdados de componentes da via p53 predispõem para o aparecimento de


vários tipos de tumor. A síndrome de Li-Fraumeni caracteriza-se por susceptibilidade para uma
grande variedade de cancros. Em 70% dos casos, existe transmissão mendeliana dum alelo
mutante p53. A diversidade de tipos de cancro que surgem nestes indivíduos contrasta com a
predisposição para um único tipo de cancro, inerente à maioria das síndromes de cancro
familiar, o que é reflexo da função ubíqua da p53. Uma síndrome muito semelhante é atribuível
à presença dum alelo mutante germ line do Chk2.

A apoptose é um programa complexo que depende frequentemente da mitocôndria. Nem


todas as formas de apoptose estão relacionadas com a função p53, como por exemplo a anoikis.

NOTA: Nas neoplasias hematopoiéticas, a proteína bcl-2 adquire a função oncogénica graças a uma
translocação cromossómica recíproca que a coloca o seu gene sob o controlo dum promotor que
impulsiona a sua expressão constitutiva. Quando o oncogene bcl-2 foi inserido como um transgene na
germ line de ratinhos, assegurando a sua expressão em células percursoras de linfócitos, não houve
efeitos na sobrevivência a longo prazo. A expressão dum transgene oncogénico myc levou ao
aparecimento de linfomas e à morte precoce destes ratinhos. Porém, quando se expressaram ambos os
transgenes, os ratinhos faleciam ainda mais rapidamente. A incapacidade de o gene bcl-2 despoletar a
formação tumoral isoladamente, sugere que é um oncogene atípico. O estudo das populações linfocitárias
que possuíam apenas o transgene bcl-2 revelou que a presença deste gene prolonga a vida destes

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linfócitos. Contudo, os linfócitos B com esta única alteração não estão a proliferar activamente. O
oncogene myc, por sua vez, tem um potente efeito mitogénico, mas o seu poder estimulador de
crescimento é atenuado pela indução da morte celular. Todavia, quando os oncogenes myc e bcl-2
colaboram, criam uma neoplasia maligna da linhagem linfocitária B: o myc impulsiona a proliferação
celular e os seus efeitos indutores de morte são neutralizados pela acção do bcl-2 (acção equivalente à
inactivação do TP53).

A oncoproteína Bcl-2 tem função anti-apoptótica. A membrana externa da mitocôndria é o


local onde a proteína Bcl-2 actua. O citocromo c reside entre a membrana externa e interna da
mitocôndria e participa na transferência de electrões que ocorre na fosforilação oxidativa.
Todavia, quando a apoptose é iniciada, abrem-se canais na membrana mitocondrial externa e
o citocromo c é expelido para o citosol, onde se associa com outras proteínas. Assim, a
maquinaria de produção energética da célula possui uma função não relacionada com o
metabolismo: libertar um mensageiro bioquímico que inicia as mudanças que levam à morte
celular. A proteína Bcl-2 (e outras proteínas da família Bcl-2, como a Bcl-XL) controla o fluxo do
citocromo c através dos canais especializados, mantendo os canais encerrados. Outras
proteínas da família Bcl-2, como a Bax, a Bad, a Bak e a Bid têm a função oposta e tentam abrir
estes canais. A proporção entre as proteínas pró-apoptóticas e as proteínas anti-apoptóticas em
relação com cada canal determina a retenção ou não do citocromo c na mitocôndria. Muitas
destas proteínas pró e anti-apoptóticas também se associam com o RE onde modulam a
libertação de iões de Ca2+ deste organelo. Com o avanço do programa de apoptose, as
proteínas Bax e Bak congregam-se na superfície mitocondrial, induzindo a fragmentação deste
organelo e amplificando a libertação das proteínas pró-apoptóticas, o que corresponde ao
colapso total da maquinaria primária de geração de ATP.

Conhecem-se 24 proteínas da família Bcl-2,


6 anti-apoptóticas e 18 pró-apoptóticas. A
variedade de proteínas pró-apoptóticas
existentes permite a resposta a vários
estímulos fisiológicos celulares. As proteínas
pró-apoptóticas antagonizam as proteínas anti-
apoptóticas como a Bcl-2 e a Bcl-XL, prevenindo
a neutralização das proteínas Bax e Bak.

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Uma vez no citoplasma, as moléculas de citocromo c associam-se com a proteína Apaf-1, numa
estrutura chamada apoptossoma. O apoptossoma activa a pró-caspase 9, uma protease citoplasmática,
convertendo-a a caspase 9. A caspase 9 cliva e activa a pró-caspase 3, que passa a caspase 3 com função
de clivagem e activação de outras pró-caspases. Esta cascata de clivagens resulta na amplificação de sinal.
Uma outra proteína é libertada da mitocôndria a par do citocromo c: a Smac/DIABLO. Inactiva um grupo
de proteínas anti-apoptóticas designado IAPs (inhibitors of apoptosis). Os IAPs bloqueiam a acção das
caspases por ligação e bloqueio da actividade proteolítica, bem como por marcação para a via ubiquitina-
proteassoma.

A cascata de activação de caspases culmina na clivagem de “substratos de morte”, proteínas cuja


degradação gera as mudanças celulares associadas com a apoptose. Por esta razão, classificam-se as
caspases em dois grupos: as iniciadoras, que activam outras caspases e as executoras (3, 6 e 7), que
destroem os componentes críticos da célula.

A destruição é visível pelas transformações morfológicas sofridas pela célula apoptótica: a


clivagem das lamininas na camada interna da membrana nuclear é acompanhada pela
condensação da cromatina e pela picnose; a clivagem do inibidor da DNase activada por
caspases, liberta esta DNase, que fragmenta o material cromossómico; a clivagem das proteínas
do citoesqueleto leva ao seu colapso e à formação de protusões e corpos apoptóticos. As
caspases executoras dirigem a sua actividade também para a mitocôndria, corrompendo a
cadeia transportadora de electrões e libertando EROs. Os E2Fs activam a transcrição de genes
que codificam caspases e proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2, sensibilizando a célula a
estímulos apoptóticos.

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A morte celular pode ser o produto quer da via intrínseca quer da via extrínseca de
apoptose. O programa apoptótico descrito pode ser iniciado pela p53, que consegue induzir a
expressão do gene que codifica a Bax, que contribui para a abertura dos canais mitocondriais
antagonizando a proteína Bcl-2, entre outras proteínas pró-apoptóticas, como a PUMA (família
Bcl-2). Este é o programa de apoptose intrínseco, uma vez que os sinais que o despoletam se
originam do interior da célula - via de apoptose activada por stress.

Há sinais – Ca2+ excessivo, oxidantes, agentes danificadores do DNA e dos microtúbulos -


que conseguem induzir a libertação do citocromo c da mitocôndria através de mecanismos
que não implicam a p53. Algumas infecções virais também se servem desta via, assegurando
que a via intrínseca não é activada e que as células hospedeiras não morrem antes de os ciclos
infeciosos estarem completos.

De forma distinta, a apoptose pode ainda ser iniciada por sinais extracelulares que activam
receptores de superfície pró-apoptóticos – receptores de morte. Quando reconhecem o
ligando, estes receptores activam, através do seu domínio de morte citoplasmático, uma
cascata de caspases que rapidamente converge na via apoptótica intrínseca, culminando numa
resposta idêntica. O programa apoptótico iniciado por estes receptores designa-se programa de
apoptose extrínseco – via de apoptose activada por receptor.

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Os ligandos dos receptores de morte
são membros da família das proteínas TNF
– TNF-α, TRAIL e FasL. Os domínios de
morte citoplasmáticos ligam-se e activam a
proteína FADD. O complexo assim
formado, o DISC (death-inducing signaling
complex), activa as pró-caspases 8 e 10 a
caspases iniciadoras (auto-clivagem), que
activam as caspases executoras 3, 6 e 7.

NOTA: Alguns tipos celulares conseguem utilizar ambas as vias para impulsionar a sua própria morte,
enquanto outros utilizam exclusivamente um dos programas. Por exemplo, uma célula pode activar o
programa extrínseco secretando um ligando dum receptor de morte que exibe à superfície, que actua de
forma autócrina para iniciar a apoptose. Isto pode evadir as acções da proteína anti-apoptótica Bcl-2, uma
vez que a via extrínseca comunica directamente com a cascata de caspases (a via intrínseca gravita em
torno da mitocôndria). Ainda há que considerar um outro programa extrínseco capaz de activar a
apoptose, que é liderado pelos linfócitos T citotóxicos e pelas células NK. Estas células “assassinas”
activam os receptores de morte das células alvo, às quais se ancoram, injectando a protease granzima B,
que cliva e activa as pró-caspases 3 e 8. Neste ponto, há convergência imediata com as outras vias
apoptóticas já mencionadas.

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A p53 promove a expressão dos genes que codificam o FasR, deixando a célula mais responsiva
a ligandos de morte extracelulares. Outro gene cuja expressão é induzida pela p53 codifica a IGFBP-3
que é secretada e sequestra factores de crescimento IGF-1, reduzindo o aporte de sinais tróficos/de
sobrevivência e pondo em risco a viabilidade celular – as células sucumbem por negligência. As células
cancerosas obviam esta consequência quer secretando níveis muito elevados de IGFs, quer metilando
o promotor do gene IGFBP ou produzindo MMPs que clivam e inactivam as moléculas de IGFBP.

NOTA: O segundo maior factor etiológico para o desenvolvimento de cancro nos países
desenvolvidos é a obesidade. No caso dos tecidos hormono-dependentes, a correlação obesidade/cancro
é clara (por exemplo, a produção de estrogénios pelos adipócitos aumenta o risco de cancro do
endométrio em mulheres obesas). No entanto, outro mecanismo sistémico tem de explicar o aumento
de incidência de cancro em tecidos não hormono-responsivos. Uma hipótese está relacionada com a
associação da obesidade e o estado de hiperinsulinémia, que aumenta a biodisponibilidade de IGF-1
circulante e suprime a síntese de IGFBP-1. A activação do IGF-1R resulta na sinalização através da via PI3K-
Akt/PKB que providencia sinais anti-apoptóticos às células (pré-)malignas. Outras teorias relevantes na
área envolvem a associação da obesidade com níveis cronicamente aumentados de vários marcadores
sistémicos da inflamação (a inflamação promove a progressão tumoral).

As células cancerosas arrasam a maquinaria apoptótica de várias maneiras. Durante a


progressão tumoral, as células são expostas a muitos stresses fisiológicos que ameaçam a sua
existência, na medida em que constituem “gatilhos” da apoptose. É indispensável que estas
células desmantelem a maquinaria apoptótica latente. A estratégia anti-aptótica mais explorada
é a inactivação da via p53. É conseguida por perda de função da p53 e da proteína ARF ou por
ganho de função da proteína Mdm2.

A erradicação da função p53 pode não ser suficiente para muitos tipos de tumor que tentam
sabotar outros componentes da maquinaria apoptótica. Por exemplo, em muitos melanomas há

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metilação do promotor do gene APAF1, que codifica a proteína citosólica forma o apoptossoma,
conjuntamente com o citocromo c. O gene Bax também se encontra mutacionalmente
inactivado em mais de metade dos cancros colo-rectais que revelam instabilidade de
microssatélites. Até metade dos tumores humanos podem sobrexpressar a proteína Bcl-2.

Outra manobra muito efectiva para adquirir resistência à apoptose deriva da hiperactivação
da via PI3K-Akt/PKB. A cinase Akt pode fosforilar e inibir proteínas pró-apoptóticas, como a
Bad, a caspase 9 e o IkB, bem como fosforilar e activar a proteína Mdm2, antagonista da p53.

A activação da expressão do factor de transcrição NF-kB representa outro mecanismo de


protecção contra os efeitos anti-neoplásicos da apoptose. Quando o NF-kB se transloca para o
núcelo, activa a transcrição de genes que codificam proteínas pró-inflamatórias, pró-
angiogénicas e anti-apoptóticas, como os IAPs.

As acções da via extrínseca de apoptose também são determinantes fulcrais no


comprometimento da evolução tumoral. Algumas células cancerosas expressam a proteína
FLIP que bloqueia os domínios de morte dos receptores de morte.

Azul – Proteínas pró-apoptóticas (níveis ou actividade estão diminuídos no cancro);

Vermelho – Proteínas anti-apoptóticas (níveis ou actividade estão aumentados no cancro).

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NOTA: A apoptose é indiscutivelmente um grande obstáculo à sobrevivência das células cancerosas.
Contudo, não é o único. As células cancerosas podem entrar em necrose, devido a extensos períodos de
carência de aporte de nutrientes (glucose, aminoácidos) e de privação de oxigénio, motivados pela falta
de vasculatura funcional – isquemia. A necrose cursa com lise celular e inflamação localizada, causada
pela exposição de conteúdos intracelulares da célula necrótica. Os núcleos necróticos de muitos tumores
são o testemunho da importância da necrose como um processo que limita o crescimento tumoral.
Adicionalmente, se a resposta apoptótica estiver bloqueada por algum dos mecanismos anteriores, a
exposição da célula a um ligando de morte pode desencadear a necrose.

Em alternativa à necrose, a célula pode activar o programa de autofagia, que permite a degradação
dos organelos celulares, de forma a reciclar os seus conteúdos. Os organelos envoltos em vesículas
membranares, os autofagossomas, fundem-se com os endossomas citoplasmáticos que, por sua vez, se
fundem com os lisossomas. Os produtos reciclados podem ser utilizados para gerar energia e metabolitos
intermédios necessários para que a célula mantenha viabilidade e recupere. Em resposta ao défice
nutritivo, a célula péra a proliferação e activa um programa organizado de conservação de energia e
nutrientes. Assim, a autofagia parece favorecer a sobrevivência das células cancerosas incipientes. Ainda
assim, a influência da autofagia na progressão tumoral não é totalmente inequívoca, pois existem tumores
onde parece deletéria.

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RESUMO:

Muitos dos sistemas subcelulares das células pré-neoplásicas funcionam mal, colocando a
célula em risco de enfrentar a citostase, a senescência, a autofagia, a apoptose ou a necrose, o
que impedirá a progressão maligna a menos que estas células incipientes desenvolvam
tentativas de evadir estes perigos. De facto, apesar de, em média, cada ser humano experienciar
1016 divisões celulares durante a vida, a maioria não desenvolve neoplasias malignas devido à
existência destes múltiplos impedimentos;

A perda da função p53 é vantajosa para as células neoplásicas, desde as etapas mais iniciais
até às etapas mais avançadas da progressão tumoral – cria um estado permissivo que permite
a aquisição de alterações que noutras circunstâncias seriam letais;

Além disso, o sucesso da maioria das terapias anti-cancro existentes é baseado na capacidade
de os agentes terapêutico danificarem o genoma das células tumorais, activando a apopotse.
Logo, a perda da função p53 torna os tumores menos responsivos à terapêutica;

A função p53 está envolta de uma grande complexidade: a p53 regula a expressão de pelo
menos 120 genes e sofre pelo menos 6 tipos de modificações pós-traducionais que afectam a
sua estabilidade, concentração intracelular e interacção com outros reguladores da transcrição;

Algumas investigações recentes indicam que possam existir formas citoplasmáticas da p53
que interajam com proteínas da família Bcl-2 para facilitar a abertura dos canais mitocondriais.

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Eternal Life: Cell Immortalization and
Tumorigenesis
A aquisição de traços neoplásicos pelas células teciduais é um processo muito moroso que
pode requerer décadas. Durante este período, as populações celulares atravessam uma longa
sucessão de ciclos de crescimento e divisão. Esta proliferação é incompatível com uma
propriedade fundamental das células normais humanas: têm um potencial replicativo finito.
Consequentemente, as células cancerosas incipientes têm de quebrar esse limite proliferativo,
de forma a completarem os vários passos do desenvolvimento tumoral. Ao neutralizarem a
maquinaria regulatória que condiciona a proliferação celular, as células conseguem proliferar
indefinidamente – o fenótipo de imortalidade celular.

As populações celulares normais registam o número de gerações celulares que as separam


das populações ancestrais embrionárias. O indivíduo adulto compreende quase 1014 células e
o número de divisões celulares que ocorrem durante a vida é astronómico – 1016. Durante o
desenvolvimento humano, as células embrionárias tornam-se fundadoras de linhas celulares
específicas que se comprometem em assumir os vários fenótipos teciduais celulares, ou seja,
em diferenciar-se. Uma medida rude da capacidade replicativa duma determinada linha celular
pode ser estimada através da cultura in vitro de células de interesse. Os trabalhos desenvolvidos
nesta óptica demonstraram que após um número pré-determinado de divisões, as células
param de proliferar e entram em senescência replicativa. Estas células senescentes são
metabolicamente activas mas perderam irreversivelmente a capacidade de reentrar em ciclo
celular activo (aparência de “ovo estrelado”). Os factores de crescimento ajudam a suster a
viabilidade celular das células senescentes mas não conseguem provocar uma resposta
proliferativa. De facto, as células senescentes têm receptores de factores de crescimento à
superfície mas as vias de sinalização acopladas a jusante estão inactivadas.

A capacidade de duplicação das células em cultura depende da espécie a partir da qual são
preparadas, do tecido de origem e da idade do dador. As células dos indivíduos mais velhos já
esgotaram muito do seu potencial replicativo.

O comportamento das células estaminais embrionárias contrasta com o da maioria das


células. Quando se providenciam os nutrientes adequados, estas células são imortais em
cultura, ou seja têm potencial replicativo ilimitado. É a formação de linhas celulares específicas
que constringe um número pré-determinado de divisões pós-embrionárias. O comportamento
replicativo das células cancerosas relembra, em sentido lato, o das células estaminais
embrionárias. Nas condições adequadas, também estas células conseguem proliferar para
sempre em cultura.

A imortalização é uma componente integral da transformação neoplásica e é imprescindível


para o desenvolvimento dum tumor. A existência dum potencial replicativo finito é um
mecanismo de defesa anti-cancro do organismo, que previne a proliferação descontrolada duma
célula alterada e o crescimento exponencial duma população tumoral. A credibilidade desta
ideia depende do número de gerações que separam a célula ancestral transformada das células
que integram um tumor clinicamente detecável e do número de gerações que é garantido às
linhas celulares normais do organismo.

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Alguns tipos de células normais humanas conseguem propagar-se durante 50 a 60 ciclos de crescimento em
cultura até atingirem a senescência. Estas 50 a 60 gerações de crescimento exponencial são o suficiente para criar
uma massa celular tumoral de 1018 células (≈109 cm3 ≈ 106 kg). Como seria de esperar, estes números estão enviesados
por uma premissa errada: assumem a expansão exponencial da população tumoral (duplicação a cada ciclo).

A realidade biológica do crescimento


tumoral é muito distinta – os mecanismos
de defesa tecidual (privação de factores
de crescimento e de oxigénio, apoptose,
entre outros) dificultam imensamente a
expansão clonal e, em cada geração
celular, um número muito significativo de
células morre.

Portanto, o número de gerações celulares requerido para formar uma massa tumoral excede
largamente o número previsto pela simples cinética de crescimento exponencial. Esta revisão
dos cálculos suporta a credibilidade da ideia inicial.

As células individuais normais têm um historial replicativo e esta memória é apagada pelas
células cancerosas. O relógio biológico que realiza a contagem das gerações celulares é
autónomo ao nível celular, ou seja, é intrínseco e não influenciável pelas interacções com as
células vizinhas e com o organismo como um todo. Obviamente, este relógio geracional também
tem de ser estável a nível bioquímico.

NOTA: Inicialmente, pensou-se que o processo de contagem dependesse da concentração de


moléculas intracelulares solúveis sintetizadas precocemente no desenvolvimento, que estão presentes
em concentrações elevadas nas células embrionárias e que se vão diluindo por um factor de 2 cada vez
que uma célula da linhagem se divide. A senescência seria desencadeada quando os níveis destas
moléculas caíssem abaixo dum certo nível limiar. Bioquimicamente, este modelo matemático plausível,
é incomportável – nenhuma molécula pode estar presente numa única célula na concentração de 2 50 a
260.

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A investigação encontrou dois mecanismos regulatórios da capacidade proliferativa das
células: um que mede o stress fisiológico cumulativo e que pára a proliferação quando o dano
excede um certo limiar, levando à entrada em senescência, e outro que emite um alarme mais
drástico quando a quota replicativa atinge o seu limite – as células entram em estado de crise,
o que resulta na apoptose da população.

Os stresses fisiológicos celulares impõem uma barreira à replicação ilimitada. A entrada em


senescência é acompanhada pelo aumento da expressão de dois CKIs, o p16 e o p21. Estes CKIs
são capazes de impedir a progressão do ciclo celular e de impelir a célula para um estado não
proliferativo. Nas células em cultura, a expressão forçada de p16 é suficiente para impor este
estado biológico pós-mitótico. Além disso, a expressão ectópica da CDK4, que sequestra o p16,
pode evitar a entrada em senescência celular.

A redução da tensão de oxigénio em cultura para valores mais semelhantes aos


experienciados pelas células in vivo resulta no aumento significativo da duração da vida
replicativa das células. Isto ilustra o contributo do dano oxidativo para a entrada das células em
senescência. Outras condições, como a presença dum estroma de suporte e o tipo de meio
utilizado, podem ter efeitos robustos na longevidade das populações celulares em cultura.
Conclui-se que a entrada em senescência não é o reflexo do tempo decorrido, ou seja, do
envelhecimento celular, mas é sim o reflexo do stress sustido ao longo do tempo.

À medida que as condições de cultura celular se têm vindo a aproximar das condições
experienciadas pelas células nos tecidos a vida das células em cultura tem aumentado
progressivamente, o que levanta a questão de a senescência não ser mais do que um artefacto
da cultura in vitro. Esta questão complica-se pelo facto de existirem poucos marcadores
bioquímicos para identificar as células senescentes nos tecidos, que residem entre grandes
populações de células no estado G0. Um destes marcadores é a enzima β-galactosidase e a sua
utilização suporta a ocorrência de senescência in vivo.

NOTA: Há alterações covalentes nas histonas que formam a cromatina que também podem funcionar
como marcadores específicos. Os focos de heterocromatina no núcleo das células senescentes – SAHFs
(senescence-associated heterochromatic foci) - correspondem a zonas de silenciamento génico
(dependente da função pRb, que medeia a repressão da transcrição) Não são encontrados em células
quiescentes e podem ser detectados com recurso a anticorpos que reagem com as histonas modificadas
covalentemente. Outro marcador associado à cromatina são histonas modificadas na extremidade de
DSBs que, em células normais, atraem a maquinaria reparadora, desaparecendo, mas que, em células
senescentes persistem, sugerindo que as quebras são irreparáveis.

Como processo fisiológico e não artefactual, a senescência replicativa também é induzida por
stressores fisiológicos in vivo (hiperoxia, dano no DNA provocado por EROs, raio-X, agentes
quimioterapêuticos, telómeros disfuncionais, sinalização aberrante, entre outros).
Adicionalmente, o aumento do número de células senescentes poderá estar implicado no
envelhecimento do organismo como um todo.

NOTA: A introdução do oncogene ras em células em cultura, por intermédio dum vector viral, pode
induzir a entrada em senescência. Aparentemente, as células que adquirissem este oncogene não seriam
os percursores de tumores vigorosos. No entanto, a activação do proto-oncogene ras endógeno resulta
em crescimentos hiperplásicos. A diferença crítica reside na “dose” da oncoproteína viral, que é função
do promotor transcripcional, muito mais activo nas células transfectadas. Contudo, na segunda situação,

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pode haver amplificação génica com o avanço da progressão tumoral, sendo que a eliminação da função
p53 é crítica, para permitir a sobrevivência e a proliferação destas células mais agressivas .

No contexto do cancro, como a senescência é geralmente irreversível é provavelmente tão


eficaz como a apoptose em prevenir que as células tumorais continuem a contribuir para a
progressão tumoral. Paradoxalmente, a senescência celular pode promover a tumorigénese. O
SASP (senescence-associated secretory phenotype) é caracterizado pela secreção de citocinas
pró-inflamatórias, IGFBPs e TGF-β. As citocinas secretadas incluem as que actuam de maneira
autócrina para promover a senescência e aquelas que actuam de forma parácrina para recrutar
células pró-inflamatórias do sistema imunitário inato e que podem promover a progressão
tumoral. O facto de as células senescentes poderem persistir durante semanas a meses (em vez
de desparecerem rapidamente como as células apoptóticas) significa que conseguem libertar
estes sinais inflamatórios durante extensos períodos de tempo, perturbando o microambiente
circundante.

A proliferação também é limitada pelos telómeros cromossómicos. Para além da


senescência replicativa já descrita, outro perigo enfrentado pelas células é a entrada em crise.
A expressão ectópica da oncoproteína large T do vírus SV40 consegue evitar a senescência, mas
não imortaliza as células onde essa expressão é estimulada. Após algumas gerações adicionais
ao ponto de entrada em senescência celular, as populações celulares entram em crise e exibem
apoptose generalizada. Note-se que a oncoproteína large T inactiva a p53 e nem isso detém a
morte apoptótica associada com esta crise. Portanto, a senescência representa a paragem de
proliferação com retenção da viabilidade celular durante um período considerável, enquanto o
estado de crise envolve a morte por apoptose. No primeiro caso, o cariótipo é relativamente
estável, enquanto no segundo há caos cariotípico.

O cerne mecanístico da crise é o DNA cromossómico. Ao contrário dos mecanismos que


levam à senescência, o aparelho molecular que inicia a crise é verdadeiramente um aparelho de
contagem, que regista o número de ciclos de crescimento-divisão que as linhas celulares
atravessaram desde a sua origem embrionária. A estrutura do DNA é altamente estável e
conservada, o que não se coaduna com a existência dum “relógio geracional” intra-
cromossómico que depende de mudanças moleculares progressivas a cada geração.

As técnicas de transfecção evidenciaram que as moléculas de DNA linear tendem


rapidamente a fundir-se ponta a ponta por acção de DNA nucleases e ligases. Esta instabilidade
contrasta com a estabilidade do DNA linear cromossómico nas células normais onde coexistem
com as mesmas enzimas modificadoras do DNA. Os telómeros, localizados nas extremidades
dos cromossomas, explicam esta estabilidade. Actuam como “escudos” que protegem as células
da fusão cromossómica.
O DNA telomérico é composto por milhares de
repetições da sequência 5’-TTAGGG-3’ e encurta
progressivamente a cada ciclo de crescimento e
divisão. Por analogia, este encurtamento é o
registo do número de gerações que cada célula
passou desde a origem embrionária. Os eventos
catastróficos da crise são despoletados quando as
células perdem os telómeros funcionais.

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(A) Os cromossomas que perdem os telómeros fundem-se, formando megacromossomas com dois ou mais
centrómeros. Inicialmente, os eventos de fusão ocorrem entre cromatídeos irmãos, pois são mantidos em proximidade
pelos seus centrómeros unidos e também porque a taxa de encurtamento telomérico é diferente consoante o braço do
cromossoma que se está a analisar – os dois DNAs teloméricos homólogos possuem estruturas moleculares idênticas e
consequentemente, estados de fragilidade e vulnerabilidade a eventos de fusão semelhantes.

(B, C) Quando os dois centrómeros dos cromatídeos fundidos forem puxados pelo fuso mitótico em direcções
opostas, criam pontes anafásicas. O aparelho mitótico acabará por quebrar o cromossoma dicêntrico num local
aleatório entre os dois centrómeros, gerando-se duas extremidades cromossómicas sem telómeros. Estas extremidades
desprotegidas podem fundir-se entre si ou com extremidades desprotegidas de outros cromossomas não homólogos.
Neste último caso, o destino do novo cromossoma dicêntrico é ambíguo: em metade dos casos os dois centrómeros são
puxados na mesma direcção e não ocorrem quebras; na outra metade ocorre o processo já descrito para os cromatídeos
irmãos fundidos, reiniciando-se novos ciclos de quebras cromossómicas.

Esta sequência de eventos é designada por ciclo de BFB (breakage-fusion-bridge) – ciclos de


quebra de cromossomas dicênctricos, com subsequente fusão das extremidades de DNA
atelomérico e nova formação de pontes anafásicas. A instabilidade cariotípica que ocorre
durante a crise – catástrofe genética - é tão severa que a apoptose é activada mesmo na
ausência de função p53.

Os telómeros são estruturas moleculares complexas difíceis de replicar. Nas células


normais, os telómeros consistem em 5 a 10 kb de sequências repetitivas. Há proteínas que
reconhecem a sequência hexanucleotídica dos DNA telomérico (na realidade, dá-se o nome de

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telómero ao conjunto do DNA telomérico com estas proteínas). Outro traço distintivo é que a
cadeia rica em guaninas (5’-TTAGGG-3’, em oposição à cadeia complementar 5’-CCCTAA-3’, rica
em citosinas) é mais longa do que a complementar na ordem das centenas de nucleótidos.

Apenas as repetições
puramente teloméricas
protegem os limites dos
cromossomas e a perda
dessa protecção verifica-se
quando o número de
repetições decresce abaixo
de doze repetições.

A cadeia simples assume


a configuração de um t-loop
(lariat), protegendo a
extremidade de DNA linear.

A maquinaria replicativa que opera durante a fase


S tem muita dificuldade em copiar o DNA das
extremidades cromossómicas, porque a iniciação da
síntese de DNA requer uma extremidade 3’-hidroxil
que serve como primer. Na ausência dum primer de
DNA, a extremidade 3’ duma molécula de RNA pode
servir como primer para a síntese de DNA. A enzima
primase deposita o primer de RNA a alguma distância
da extremidade 3’ da cadeia molde de DNA. Assim a
DNA polimerase inicia a síntese duma nova cadeia à
qual faltam uma série de bases complementares às da
extremidade 3’ da cadeia molde. Como tal as
sequências nucleotídicas da ponta de uma das cadeias
molde (cadeia lagging) não são replicadas. Este
problema de replicação explica o encurtamento
telomérico a cada ciclo celular (entre 50 a 100 bp).
Para além disso, existem exonucleases que digerem
lentamente as extremidades teloméricas, contribuindo
para a erosão dos telómeros.

Como o encurtamento dos telómeros limita o potencial replicativo constitui um obstáculo


ao aparecimento de cancro. As células cancerosas incipientes podem escapar à crise
expressando a enzima telomerase. As populações pré-neoplásicas irão eventualmente entrar
em crise após terem passado um grande número de gerações replicativas e terem sofrido erosão
extensa dos seus telómeros. No entanto, surgem variantes imortalizadas, que escaparam ao
colapso telomérico. A solução que encontraram é simples: regeneraram os seus telómeros,
apagando o registo molecular que bloqueia a proliferação ou que incita a crise. Tal regeneração
é fruto da acção da enzima telomerase que alonga o DNA telomérico. A actividade da
telomerase é detectável em 85 a 90% dos tumores humanos, mas é mínima nas células

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normais. De facto, nas células normais esta actividade só serve o propósito de manter
minimamente as extremidades teloméricas (por exemplo, a reparação do t-loop), não
prevenindo a erosão cíclica. A expressão da telomerase é elevada durante o início da
embriogénese e vai diminuindo com a diferenciação tecidual. Assim, a maioria das células
somáticas normais, embora possuindo os genes que codificam a telomerase, não a expressa em
níveis significativos (há excepções, como as células germinativas dos testículos e os linfócitos
activados). As células tumorais imortalizadas livraram-se da repressão dos genes que codificam
a telomerase e adquiriram expressão constitutiva desta enzima, alongando os telómeros e
permitindo manter a proliferação.

A telomerase possui uma subunidade com


função DNA polimerase, mais propriamente
uma transcriptase reversa, que incorpora uma
segunda subunidade, uma template de RNA
que serve como molde para a transcriptase. Nos
humanos, a subunidade catalítica, a proteína
hTERT, sintetiza uma molécula de DNA
complementar aos seis nucleótidos presentes na
molécula de RNA associada (hTR), ligando estes
nucleótidos à extremidade 3’ rica em guaninas.
A cadeia complementar do DNA telomérico é
presumivelmente sintetizada por DNA
polimerases convencionais.

A subunidade hTERT é a única que está em falta nas células normais e a sua expressão é
suficiente para escapar à crise e gerar descendentes imortais, porque su