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Capitulo FISH
Capitulo FISH
Marcelo Guerra
Departamento de Botânica – UFPE
Figura 1.1 Principais etapas da técnica de hibridização in situ. A marcação da sonda (a)
é feita independentemente da preparação da lâmina (b). Em seguida, a sonda e o DNA
cromossômico são desnaturados (c, d) e, quando colocados em contato, a sonda hibridiza
in situ (e) com o DNA-alvo. A marcação da sonda pode ser detectada por anticorpos ligados
a fluorocromos (f) e visualizada diferencialmente ao microscópio (g).
A PREPARAÇÃO DA LÂMINA
Embora permita alcançar os objetivos em poucos experimentos e apresente boa
repetibilidade de resultados, a HIS é um procedimento relativamente longo e
dispendioso, exigindo controle rigoroso da qualidade das lâminas. Lâminas com
muitas metáfases e com cromossomos bem espalhados são fundamentais para se
obterem resultados inequívocos e tornar a técnica economicamente viável. A
preparação das lâminas segue os mesmos procedimentos utilizados na preparação
de lâminas para a coloração com fluorocromos, apresentados detalhadamente por
vários autores (veja, por exemplo, Guerra e Souza, 2002).
Para controlar a qualidade das lâminas, antes de serem utilizadas na HIS, elas
podem ser analisadas na microscopia de contraste de fase, que permite visualizar os
cromossomos sem corantes, ou após coloração rápida, por exemplo, com DAPI
(abreviatura do corante fluorescente 4’-6-diamidino-2-phenilindole). As melhores
lâminas devem ser descoradas e estocadas secas em caixas hermeticamente fechadas
a –20 ou –80 oC. Nessas condições, as lâminas podem ser conservadas por alguns
meses antes de serem utilizadas para HIS. Em alguns organismos nos quais a técnica
de preparação de lâminas produz um grande número de boas metáfases, como em
humanos e mamíferos em geral, esse controle de qualidade é simplificado ou
dispensado.
TIPOS DE S ONDAS
Sondas são seqüências de DNA isoladas que se encontram representadas no
cromossomo uma única vez ou que apresentam milhares de cópias em cada
cromossomo. Essas seqüências repetidas podem estar organizadas no cromossomo
em tandem, ou seja, uma em seguida à outra, formando blocos relativamente grandes
de DNA-alvo, ou podem se encontrar dispersas no complemento cromossômico,
intercaladas com diversos outros tipos de seqüências.
seqüência que codifica o precursor 45S dos RNAs ribossomais 28S, 18S e 5,8S,
geralmente referidos como DNAr 5S e 45S, respectivamente.
Uma característica importante dos DNAr 5S e 45S é que a seqüência de
nucleotídeos desses genes é muito conservada evolutivamente, o que significa que
elas são muito similares em todos os eucariotas. Por exemplo, uma sonda de DNAr
45S produzida a partir do genoma de trigo, denominada pTa71 (Gerlach e
Bedbrook, 1979), foi utilizada para localizar o DNAr em muitas outras plantas,
inclusive gimnospermas e pteridófitas (veja, por exemplo, Kawakami et al., 1999;
Murray et al., 2002), e até mesmo em organismos tão diferentes quanto peixes
(Pendas et al., 1993) e gafanhotos (Rocha, 2002).
O DNA ribossômico 45S, geralmente referido apenas como DNAr, é uma
seqüência moderadamente repetitiva, que forma blocos com muitas repetições, em
um ou mais pares cromossômicos. Cada unidade de repetição contém três genes
(DNAr 18S+5,8S+28S) e seus espaçadores, sempre transcritos juntos em um
único RNAm. Os sítios do DNAr 45S correspondem às constrições secundárias,
observadas por técnicas de coloração convencional. Entretanto, sítios muito
pequenos ou pouco ativos podem não ser visíveis com essas técnicas mas serem
detectados com HIS. No feijão caupi (Vigna unguiculata), por exemplo, apenas um
ou dois cromossomos são observados com constrições secundárias, enquanto com
HIS aparecem blocos de DNAr 45S em cinco dos seus 11 pares cromossômicos
(Guerra et al., 1996). No homem, os genes de DNAr 45S estão nas constrições
secundárias dos cromossomos acrocêntricos 13, 14, 15, 21 e 22, havendo cerca de
150 a 200 cópias no genoma.
A seqüência do DNAr 5S é um pouco mais variável que a do DNAr 45S.
Cada espécie possui, geralmente, uma só seqüência de DNAr 5S repetida muitas
vezes em tandem em um único par de sítios cromossômicos ou, menos freqüente-
mente, em dois ou mais pares. No homem, os genes do DNAr 5S estão localizados
no cromossomo 1 (200-300 cópias). Em algumas espécies podem ocorrer seqüên-
cias de DNAr 5S ligeiramente diferentes, formando blocos de repetições distintas,
localizadas por HIS em diferentes regiões do genoma (veja, por exemplo, Martins
e Galetti, 2001).
Afora o DNA ribossômico, duas outras seqüências repetitivas, organizadas em
tandem e de função conhecida, têm sido amplamente estudadas. A primeira, e mais
conservada, é a seqüência do DNA telomérico (Richards et al., 1993). Esse DNA
ocorre caracteristicamente nas regiões terminais de cada cromossomo, embora
excepcionalmente seja encontrado em outras regiões cromossômicas, princi-
palmente próximo aos centrômeros de alguns animais (veja discussão no Capítulo
4) e plantas (Guerra e Kenton, 1996; Kondo e Tagashira, 1998). A segunda, menos
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 5
SONDAS GENÔMICAS
Em plantas, principalmente, têm sido muito utilizadas as chamadas sondas genômicas,
formadas pelo DNA genômico total de uma espécie. A sonda genômica, constituída
por um grande número de seqüências únicas e repetitivas, funciona da mesma
maneira que uma seqüência repetitiva dispersa por todo o genoma, marcando todos
os cromossomos igualmente, com a vantagem de ser muito mais facilmente obtida.
Essa técnica, denominada de hibridização genômica in situ ou GISH (Genomic In Situ
Hybridization), tem sido aplicada com sucesso na análise de híbridos interespecíficos
e no estudo evolutivo de diversas espécies poliplóides (Stace e Bailey, 1999). Em
animais, as sondas genômicas também têm sido utilizadas (veja, por exemplo,
Svartman e Vianna-Morgante, 1999), embora esse tipo de sonda encontre aplicação
maior no estudo dos poliplóides – raros em animais.
Por exemplo, para distinguir os cromossomos das duas espécies que deram
origem a um tetraplóide natural, como o tabaco, o DNA total de um dos supostos
pais diplóides é extraído, marcado e hibridizado com os cromossomos do poliplóide
(Figura 1.2). Se a espécie da qual se extraiu o DNA for realmente um dos pais do
tabaco, metade do conjunto cromossômico tetraplóide deverá ser diferencialmente
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 7
marcada (no caso em que cada pai contribuiu com igual quantidade de cro-
mossomos – que é o mais freqüente). Caso não haja marcação, é uma indicação
de que aquela espécie não foi envolvida na formação do tetraplóide. Por outro lado,
se todos os cromossomos hibridizarem com a sonda genômica de um diplóide, é
provável que a espécie em questão seja um autopoliplóide ou descenda de duas
espécies muito próximas (Figuras 1.2 e 2.9).
DNA marcado de uma espécie junto com o DNA da outra espécie sem marcação
e em concentração mais alta. Este último DNA funcionará como bloqueador (ou
supressor) das seqüências exclusivas desta espécie e das seqüências comuns a ambas.
Dessa maneira, apenas o genoma oriundo do diplóide que está sendo testado
aparecerá marcado.
SONDAS CROMOSSÔMICAS
Um conjunto de seqüências gênicas ou nao-gênicas localizadas em determinado
cromossomo pode ser reunido para formar uma sonda capaz de “pintar” apenas
aquele cromossomo. Para isso é necessário reunir um bom número de seqüências
distintas e que estejam distribuídas aleatoriamente por todo o cromossomo. Dessa
maneira, foram construídas sondas que marcam, distintamente, cada um dos 23
pares de cromossomos humanos em toda a sua extensão. Essa técnica, chamada
de pintura cromossômica (chromosome painting), tem tido numerosas aplicações na
citogenética clínica e no estudo da evolução de aves e mamíferos.
As sondas cromossomo-específicas levaram ao desenvolvimento de técnicas
que permitem corar simultaneamente cada cromossomo humano em uma cor
diferente (ver Capítulos 6 e 7). Para isso foi necessário desenvolver também novos
equipamentos de microscopia, programas de análise de imagens apropriados e
diversas outras melhorias na técnica e nos reagentes utilizados (Schröck et al., 1996;
Eils et al., 1998). A hibridização de sondas cromossomo-específicas humanas em
outros mamíferos tornou possível identificar regiões cromossômicas homólogas em
espécies tão diferentes quanto o homem e o cavalo, separados há 70-80 milhões
de anos (Raudsepp et al., 1996). A análise comparada de cariótipos de espécies distintas,
utilizando-se sondas cromossômicas, é denominada Zoo-FISH (Capítulo 4).
Essas sondas permitem também visualizar os cromossomos no núcleo
interfásico, onde se encontram descondensados, formando territórios cromossômicos
individualizados. Nesses casos, a análise cromossômica geralmente é feita em
microscopia confocal, que permite observar o núcleo em numerosos planos focais
distintos e integrar essas imagens em uma reconstrução tridimensional (veja, por
exemplo, Habermann et al., 2001).
Sondas do tipo pintura são também conhecidas para alguns outros mamíferos,
aves e drosófila (Fuchs et al., 1998; Griffin et al., 1999). Em plantas não foi ainda
possível pintar cada um dos cromossomos de um cariótipo distintamente, mas já
são conhecidas pinturas para alguns poucos cromossomos (Schubert et al., 2001).
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 9
OBTENÇÃO DA SONDA
O tipo de sonda mais fácil de ser obtido é o utilizado na hibridização genômica in
situ, formada pelo DNA total, fragmentado e marcado. Se a sonda desejada for um
DNA satélite, ela poderá ser isolada do DNA total da espécie por intermédio de
um gradiente de densidade. Nesse caso, o DNA satélite é separado do DNA principal
pela diferença na proporção de AT:GC entre essas duas frações, que se reflete em
diferença de densidade entre elas.
Sondas de DNA satélite são mais facilmente obtidas por digestão do DNA
genômico com enzimas de restrição. Uma enzima de restrição que produza um corte
em uma unidade de repetição produzirá cortes idênticos em todas as demais
unidades desse DNA repetitivo organizado em tandem. Isso resultará na formação
de fragmentos de DNA de igual tamanho, os quais aparecerão em um gel de
eletroforese como uma banda característica. Eventualmente, alguns monômeros
poderão conter mutações no sítio de restrição, levando à formação de dímeros,
trímeros, etc., produzindo no gel de eletroforese um padrão de bandas em escada.
Esse padrão também pode ser obtido quando se realiza digestão enzimática por
tempo insuficiente para que ocorram todos os cortes (digestão parcial). Em ambos
os casos, o padrão de bandas em escada constitui indicação clara de que o DNA
repetitivo se encontra em tandem. A banda produzida pela digestão total contendo
os monômeros poderá ser recortada do gel e seu DNA poderá ser extraído, marcado
e utilizado como sonda.
No caso do DNA repetitivo disperso, o isolamento dessa seqüência deverá
ser feito a partir de uma biblioteca genômica (coleção de fragmentos de DNA
inseridos em vetores de clonagem que juntos cobrem todo o genoma de um
organismo), exigindo grande número de testes para encontrar a seqüência
repetitiva desejada.
Seqüências muito pequenas, como o DNA telomérico ou os microssatélite,
podem ser sintetizadas por encomenda a laboratórios especializados. Sondas para
genes específicos podem ser obtidas diretamente a partir do RNAm citoplasmático,
transcrito para DNA (DNAc) por meio da enzima transcriptase reversa e
amplificado em um sistema de clonagem bacteriano. Diversas sondas podem
também ser obtidas por PCR, desde que se conheçam as seqüências que flanqueiam
o DNA-alvo, de maneira a permitir escolher os iniciadores de síntese (primers)
corretos. Neste caso, a mistura de nucleotídeos que fornece a matéria-prima para
a síntese das novas cadeias pode conter uma fração de nucleotídeos marcados,
permitindo que se faça amplificação e marcação da sonda simultaneamente.
10 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Figura 1.3 Esquema da separação cromossômica por fluxo. Gotas contendo determinado
cromossomo podem ser reconhecidas pela fluorescência do cromossomo, marcadas com uma
carga elétrica e desviadas do fluxo normal para um coletor à parte.
ser separadas por eletroforese, isoladas e testadas como sondas para HIS. Aquelas
que hibridizarem unicamente, ou predominantemente, em um cromossomo serão
utilizadas para compor a sonda cromossômica.
AMPLIFICAÇÃO DA SONDA
Da mesma maneira que as sondas cromossomo-específicas, os demais tipos de
sonda precisam também ser amplificados, para se dispor de um estoque da sonda.
A amplificação geralmente é feita pelos métodos usuais de clonagem. Para isso a
seqüência a ser amplificada deve ser inserida em um vetor, por exemplo um
plasmídio bacteriano, que é introduzido na Escherichia coli. A multiplicação da
bactéria resulta na multiplicação do plasmídio e, conseqüentemente, na ampli-
ficação do número de cópias da seqüência de DNA inserida, ou inserto. Quando
a colônia bacteriana é suficientemente grande, as bactérias são lisadas e os
plasmídios (em número de milhões) são isolados. A sonda pode ser preparada com
o plasmídio inteiro (o DNA estritamente plasmidial não deve ter correspondência
no DNA cromossômico e por isso não interfere na hibridização) ou o inserto pode
ser retirado do plasmídio, por meio de enzimas de restrição, e separado por
eletroforese.
Os plasmídeos bacterianos aceitam geralmente insertos de até 10 kb de
tamanho. Para amplificar seqüências maiores poderá ser necessário utilizar outro
tipo de vetor, como os cosmídios (insertos de 30 a 44 kb), bacteriófago P1 (70-100
kb), PACs (130-150 kb), BACs (até 300 kb) ou YACs (0,2 a 2 Mb).
A técnica de PCR pode ser utilizada na amplificação de fragmentos de DNA
cuja seqüência de nucleotídeos é conhecida, como o DNAr 5S ou 18S. No caso de
cromossomos isolados para obtenção de sondas cromossomo-específicas, todo o DNA
precisa ser amplificado. Nesse caso, a amplificação é feita por um tipo particular de
PCR, denominado DOP-PCR (degenerate oligonucleotide-primed PCR). Esta PCR
utiliza iniciadores de síntese com seqüências muito variadas, que irão se ligar em um
grande número de sítios, amplificando qualquer DNA fornecido como molde.
TAMANHO DA SONDA
O tamanho dos segmentos a serem hibridizados é crítico nos experimentos de HIS,
sendo o tamanho ideal entre 50 e 500 nucleotídeos. Seqüências maiores ou
menores podem ser utilizadas, mas apresentam problemas adicionais. Se a
seqüência a ser hibridizada contiver 20 kb, por exemplo, ela deverá ser quebrada
em fragmentos menores, em torno de 400-500 pb. Seqüências muito pequenas,
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 13
MARCAÇÃO DA SONDA
MARCAÇÃO COM ISÓTOPOS RADIOATIVOS
Inicialmente, as sondas de DNA ou RNA eram marcadas exclusivamente com
isótopos radioativos, produzindo as chamadas sondas quentes. O isótopo mais
comumente empregado é o trítio (3 H), por emitir radiação de baixa energia,
garantindo melhor resolução da sonda. Por outro lado, o trítio tem a desvantagem
de exigir exposição demorada, usualmente acima de duas semanas (compare esses
dados na Tabela 1.1). Em alguns experimentos é preferível utilizar um radioisótopo
de mais alta emissão de energia, como o 32P, embora a resolução da sonda seja
sensivelmente reduzida em decorrência de maior dispersão da radiação.
Tabela 1.1 Características principais dos radioisótopos mais utilizados na HIS (baseada em
Leitch et al., 1994).
ligação normalmente é feita por meio de uma molécula espaçadora longa, de forma
a evitar interferência estereoquímica que afete o pareamento da sonda com o
DNA-alvo ou reduza a eficiência do reconhecimento posterior da molécula
marcadora (Figura 1.4). O tamanho da molécula espaçadora depende basicamente
do número de átomos de carbono que ela possui, e isso geralmente vem indicado
junto com o nucleotídeo marcado. Por exemplo, a biotina 16-dUTP possui uma
molécula espaçadora com 16 átomos de carbono separando a biotina do
nucleotídeo (Figura 1.4a).
do nucleotídeo marcado deve ser mais alta que a desse mesmo nucleotídeo não-
marcado, para compensar sua menor receptividade pela DNA-polimerase.
Figura 1.5 Marcação da sonda por nick-translation. A sonda em fita dupla (a) é inicialmente
atacada pela DNase, produzindo cortes aleatórios (setas) nas duas fitas (b). Moléculas de
DNA polimerase se ligam aos sítios cortados (c) e retiram os nucleotídeos à sua frente no
sentido 5'-3' (d). Um novo nucleotídeo é acrescentado à extremidade 3' em cada um dos
espaços vazios criados pela DNA polimerase (e), ficando o corte um nucleotídeo adiante
no sentido 5'-3' (setas). Ao final, todos os nucleotídeos serão substituídos por novos e, em
ambas as fitas, alguns deles estarão marcados.
Figura 1.6 Marcação da sonda por random primers. Para iniciar a reação é necessário reunir
a sonda, os nucleotídeos marcados e não-marcados e os iniciadores de síntese (a), além da
polimerase (não representada). Os iniciadores paream com regiões complementares da
sonda desnaturada (b). A partir dos terminais 3' dos iniciadores, novas fitas complementares
às originais são sintetizadas contendo nucleotídeos marcados (c).
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 19
A HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
NÍVEL DE ESTRINGÊNCIA
Tecnicamente, o nível de estringência indica a percentagem mínima de nucleo-
tídeos corretamente pareados, entre a sonda e o DNA-alvo, necessária para manter
a estabilidade da molécula híbrida. Em uma HIS com nível de estringência de 80%,
por exemplo, apenas as cópias da sonda com pelo menos 80% de sua seqüência de
nucleotídeos corretamente pareada com o DNA cromossômico permanecerão
hibridizadas após as lavagens pós-hibridização.
Hibridizações realizadas com nível de estringência alto produzem resultados
mais confiáveis, mas se o DNA-alvo não for abundante e de fácil acesso, poderá
não ocorrer hibridização em muitas células. Por outro lado, reduzindo-se o nível
de estringência, facilita-se o pareamento da sonda com o DNA-alvo, mas aumenta-
se também a chance de pareamento com seqüências não-alvo. Portanto, o nível
de estringência deve ser ajustado para o tipo de DNA-alvo visado.
20 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Figura 1.7 Visualização da sonda marcada com fosfatase alcalina biotinilada. A avidina
reage com a biotina da sonda e, posteriormente, com a biotina da fosfatase. A enzima quebra
o substrato, a molécula de BCIP, que reage com o NBT produzindo uma substância escura
onde se encontra a sonda.
22 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Tabela 1.3 Principais fluorocromos utilizados na HIS, com seus comprimentos de onda de
máxima excitação e máxima emissão e a cor da fluorescência emitida (baseada em
Schwarzacher e Heslop-Harrison, 2000).
AMPLIFICAÇÃO DO SINAL
Quando o sinal emitido pela sonda for muito fraco, não permitindo observação ou
documentação fotográfica segura, torna-se necessário amplificar o sinal, aumen-
tando o número de moléculas marcadoras e sinalizadoras. A amplificação , nesse
caso, é feita adicionando um anticorpo contra a molécula marcadora, contendo esse
anticorpo outras moléculas marcadoras. Por exemplo, se a sonda for marcada com
biotina e reconhecida com avidina usa-se um anticorpo antiavidina biotinilado. Esse
anticorpo possui quatro radicais de biotina, podendo ligar-se à avidina por um
desses radicais e deixar os outros três livres para reagirem com novas moléculas de
avidina (Figura 1.9). Expondo-se novamente a célula à avidina-FITC, duas ou três
dessas moléculas conjugadas se ligarão às biotinas do anticorpo, amplificando
portanto o sinal.
24 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Figura 1.9 Amplificação do sinal da sonda marcada com biotina. A biotina é inicialmente
reconhecida pelo conjugado avidina-fluorocromo. Acrescentando um anticorpo anti-
avidina biotinilado, cada sítio com uma biotina fica agora com três biotinas livres. A reação
com o conjugado avidina-fluorocromo é repetida, resultando na amplificação do sinal.
técnica é muito empregada para localizar genes e outras seqüências curtas de DNA
no cromossomo (veja, por exemplo, Pedrosa et al., 2002).
A detecção do sinal pode também ser melhorada trabalhando-se com
cromossomos mais descondensados, como os paquitênicos da meiose, os politênicos
ou os cromossomos interfásicos. Um sítio bem pequeno, com 10 kb, aparecerá no
cromossomo metafásico como um pequeno ponto, enquanto em cromossomos
paquitênicos aparecerá como uma região mais longa e mais facilmente visível.
Em cromossomos mais distendidos, não apenas a sensibilidade mas também
a resolução da HIS aumenta, ou seja, melhora a capacidade de visualizar duas
sondas muito próximas como sinais distintos, sem superposição. Em humanos, duas
sondas precisam estar separadas por pelo menos um milhão de pares de bases (1
Mb) para serem visualizadas como sítios distintos em cromossomos metafásicos,
enquanto em cromossomos paquitênicos essa distância pode ser reduzida para perto
de 60 kb. Em fibras de DNA completamente distendidas a resolução da HIS é ainda
maior, passando para cerca de 0,7 kb (De Jong et al., 1999).
Figura 1.10 Marcação e detecção simultânea de quatro sondas. (a) Sondas distintas,
marcadas com diferentes proporções de biotina e digoxigenina foram hibridizadas em um
mesmo cromossomo. (b) A biotina é reconhecida por um conjugado (avidina + FITC) e
a digoxigenina, por outro (antidigoxigenina + rodamina), nas mesmas proporções da
marcação, resultando em sinal diferente para cada sonda.
Uma alternativa mais simples para localizar várias sondas em uma mesma
célula é fotografar as células com duas sondas e, em seguida, descorar a lâmina e
utilizar as mesmas células para outra HIS com outras sondas. Cheng et al. (2001),
por exemplo, mapearam dez seqüências diferentes de DNA em um braço cro-
mossômico de arroz, utilizando cinco re-hibridizações seguidas, cada uma com duas
sondas, sempre detectadas com FITC e rodamina. Müller et al. (2002) realizaram
quatro re-hibridizações em células humanas, utilizando em cada re-hibridização um
conjunto complexo de sondas cromossômicas, como as sondas para pinturas
cromossômicas múltiplas ou para Zoo-FISH.
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 27
Figura 1.11 FISH em fibras estendidas. Núcleos interfásicos sem citoplasma (a) são lisados
(b) e as fibras de DNA são impulsionadas para fora do núcleo por uma corrente líquida (c).
Em seguida, é feita a fixação e o DNA-alvo é localizado por FISH nas fibras estendidas (d).
Michalet et al. (1997) desenvolveram outra técnica para obter fios de DNA
estendidos em uma lâmina, denominada DNA combing, referindo-se ao fato de que
as fibras de DNA aparecem alinhadas ou penteadas (do inglês, to comb = pentear).
Nesse caso, uma lamínula siliconizada é mergulhada em uma solução contendo
moléculas de DNA. Essas moléculas tendem a aderir por uma das extremidades
(eventualmente pelas duas) na superfície siliconizada. A lamínula é então retirada
lentamente da solução. Ao atravessar o menisco, as moléculas são tensionadas no
sentido contrário ao da retirada da lamínula, o que as torna ao mesmo tempo
estiradas e aderidas à superfície da lamínula (Figura 1.12). A lamínula pode ser
utilizada para FISH, com uma resolução semelhante à das fibras estendidas, que é
provavelmente o limite inferior que pode ser obtido com FISH.
Diversas outras variações da técnica de HIS procuram, por um lado, aprimorar
os métodos de marcação e detecção da sonda e, por outro, ampliar o nível de
resolução de sondas contíguas. Nesse ponto, as técnicas citomoleculares
confundem-se com as estritamente moleculares, formando um elo importante entre
a análise citogenética e a análise genômica. O seqüenciamento dos genomas
eucariotas revelou o padrão de organização de várias seqüências do DNA
cromossômico. A citogenética atual tem procurado entender o significado dessas
seqüências em vários organismos, verificando sua distribuição espacial em
diferentes tipos de núcleos (interfásicos, politênicos, meióticos) e em situações
especiais, como nos núcleos de híbridos artificiais e de patologias celulares.
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 29
Figura 1.12 Fibras de DNA alinhadas por DNA combing. Uma lâmina siliconizada é
mergulhada em uma solução contendo moléculas de DNA (a). Algumas moléculas de DNA
aderem à lâmina e quando esta é retirada da solução as moléculas de DNA são estendidas
pela tensão superficial do menisco, aparecendo alinhadas (b).
REFERÊNCIAS
AMBROS, P. F.; MATZKE, M. A.; MATZKE. A. J. M. Detection of a 17 kb unique sequence
(T-DNA) in plant chromosomes by in situ hybridization. Chromosoma, v. 94, p. 11-18, 1986.
BRANDES, A.; HESLOP-HARRISON, J. S.; KAMM, A.; KUBIS, S.; DOUDRICK, R. L.;
SCHMIDT, T. Comparative analysis of the chromosomal and genomic organization of Ty1-
copia-like retrotransposons in pteridophytes, gymnosperms and angiosperms. Plant Mol. Biol.,
v. 33, p. 11-21, 1997.
BUONGIORNO-NARDELLI, M.; AMALDI, F. Autoradiographic detection of molecular
hybrids between rRNA and DNA in tissue sections. Nature, v. 225, p. 946-947, 1969.
CANNIZZARO, L. A. Chromosome microdissection: a brief overview. Cytogenet. Cell
Genet., v. 74, p. 157-160, 1996.
CHENG, Z.; PRESTING, G. G.; BUELL, C. R.; WING, R. A.; JIANG, J. High-resolution
pachytene chromosome mapping of bacterial artificial chromosomes anchored by genetic
markers reveals the centromere location and the distribution of genetic recombination along
chromosome 10 of rice. Genetics, v. 157, p. 1749-1757, 2001.
CIONINI, P. G.; CAVALLINI, A.; CORSI, R.; FOGLI, M. Comparison of homologous
polytene chromosomes in Phaseolus coccineus embryo suspensor cells: morphological,
autoradiographic and cytophotometric analyses. Chromosoma, v. 86, p. 383-396, 1982.
COULTON, G. Non-radioisotopic labels for in situ hybridization histochemistry: a histochemist’s
view. In: HARRIS, N.; WILKINSON, D. G. (Eds.). In situ hybridisation: application to
developmental biology and medicine. Cambridge: Cambridge University Press, 1990. p. 3-32.
De JONG, J. H.; FRANSZ, P.; ZABEL, P. High resolution FISH in plants – techniques and
applications. Trends Plant Sci., v. 4, p. 258-263, 1999.
30 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
DOLEZEL, J.; MACAS, J.; LUCRETTI, S. Flow analysis and sorting of plant chromosomes.
In: Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons, 1999. p. 5.3.1-5.3.33.
EILS, R.; UHRIG, S.; SARACOGLU, K.; SÄTZLER, K.; BOLZER, A.; PETERSEN, I.;
CHASSERY, J. M.; GANSER, M.; SPEICHER, M. R. An optimized, fully automated system
for fast and accurate identification of chromosomal rearrangements by multiplex-FISH (M-
FISH). Citogenet. Cell Genet., v. 82, p. 160-171, 1998.
FRANSZ, P.; De YOUNG, H.; ZABEL, P. Preparation of extended DNA fibers for high
resolution mapping by fluorescence in situ hybridization (FISH). In: Plant molecular biology
manual, G5. Wageningen: Kluwer, 1998. p. 1-18.
FUCHS, J.; KUHFITTIG, S.; REUTER, G.; SCHUBERT. I. Chromosome painting in
Drosophila. Chromosome Res., v. 6, p. 335-336, 1998.
GALL, J.; PARDUE, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in
cytological preparations. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 63, p. 378-383, 1969.
GERLACH, W. L.; BEDBROOK, Jr. Cloning and characterization of ribosomal RNA genes
from wheat and barley. Nucl. Ac. Res., v. 7, p. 1869-1885, 1979.
GLÄSER, B.; HIERL, T.; TAYLOR, K.; SCHIEBEL, K.; ZEITLER, S.; PAPADOPOULLOS,
K.; RAPPOLD, G.; SCHEMPP, W. High-resolution fluorescence in situ hybridization of
human Y-linked genes on released chromatin. Chromosome Res., v. 5, p. 23-30, 1997.
GOSDEN, Jr.; LAWSON, D. Oligonucleotide primed in situ DNA synthesis (PRINS). In:
GOSDEN, Jr. (Eds.). Methods in molecular biology, 29: chromosome analysis protocols.
Totowa: Human Press, 1994. p. 323-333.
GRIFFIN, D. K.; HABERMAN, F.; MASABANDA, J.; O’BRIEN, P.; BAGGA, M.;
SAZANOV, A.; SMITH, J.; BURT, D. W.; FERGUSON-SMITH, M.; WIENBERG, J.
Micro and macrochromosome paints generated by flow cytometry and microdissection: tools
for mapping the chicken genome. Cytogenet. Cell Genet., v. 87, p. 278-281, 1999.
GUERRA, M.; KENTON, A. Distribution of telomere DNA in mitotic and polytene nuclei
of the anther tapetum of a tetraploid hybrid bean, Phaseolus vulgaris x P. acutifolius. Braz. J.
Genet., v. 19, p. 313-318, 1996.
GUERRA, M.; KENTON, A.; BENNETT, M. D. rDNA sites in mitotic and polytene
chromosomes of Vigna unguiculata (L.) Walp. and Phaseolus coccineus L. revealed by in situ
hybridization. Ann. Bot., v. 78, p. 157-161, 1996.
GUERRA, M.; SOUZA, M. J. Como observar cromosomos: um guia de técnicas em
citogenética vegetal, animal e humana. Ribeirão Preto: FUNPEC, 2002. 132 p.
HABERMANN, F. A.; CREMER, M.; WALTER, J.; KRETH, G.; VON HASE, J.; BAUER,
K.; WIENBERG, J.; CREMER, C.; CREMER, T.; SOLOVEI, I. Arrangements of macro-
and microchromosomes in chicken cells. Chromosome Res., v. 9, p. 569-584, 2001.
HESLOP-HARRISON, J. S. Comparative genome organization in plants: from sequence
and markers to chromatin and chromosomes. Plant Cell, v. 12, p. 617-636, 2000.
KAWAKAMI, S. M.; KONDO, K.; KAWAKAMI, S. Analysis of nucleolar organizer
constitution by fluorescent in in situ hybridization (FISH) in diploid and artificially produced
haploid sporophytes of the fern Osmunda japonica (Osmundaceae). Pl. Syst. Evol., v. 216,
p. 325-331, 1999.
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 31