166122 SET-RPLA 263x385 14/1/2004 10:44 am
SET-RPLA TD09000A PRECAUÇÕES
SET - RPLA TEST- Kit para 20 testes
KIT SET-RPLA KIT DE DETECÇÃO DE TOXINAS
Código: TD0900
Kit de Teste de Enterotoxina Estafilocócica para a
detecção das enterotoxinas estafilocócicas A, B, C e D
em amostras de alimentos ou filtrados de cultura através
da aglutinação passiva invertida de látex.
INTRODUÇÃO
A intoxicação alimentar estafilocócica é causada
pela ingestão de alimentos contaminados com
enterotoxinas produzidas durante o crescimento
de certas cepas de Staphylococcus aureus. Foram
publicados relatórios sobre o ensaio dessas
toxinas por aglutinação passiva de látex invertida
(RPLA).1,2,3 A técnica de aglutinação passiva de
látex invertida, ou RPLA, permite a detecção de
antígeno solúvel, como toxinas bacteriológicas,
em um ensaio de aglutinação.
Em um ensaio de aglutinação normal, o
anticorpo solúvel reage com um antígeno
particulado como, por exemplo, células
bacterianas. Contudo, em um ensaio de
aglutinação INVERTIDA, o anticorpo, que está
ligado a partículas, reage com o antígeno
solúvel. As partículas (neste caso de látex) não
desempenham em si uma função na reação, e
por isso são designadas PASSIVAS. A ligação
cruzada das partículas de látex, provocada pela
reação específica antígeno/anticorpo, resulta
numa reação visível de AGLUTINAÇÃO DE
LÁTEX.
O kit de teste SET-RPLA baseia-se nos relatórios
feitos por Shingaki et al.1 e Oda et al.4 O teste
foi desenvolvido sob a orientação do Tokyo
Metropolitan Research Laboratory of Public
Health (laboratório japonês de saúde pública).
O teste SET-RPLA pode também ser usado para
detectar enterotoxinas estafilocócicas numa
grande variedade de alimentos, e para fornecer
um resultado semi-quantitativo. O teste também
pode ser usado para demonstrar a produção de
enterotoxinas em isolados de S. Aureus criado
em cultura. Deve-se reparar que foram isolados
estafilococos negativos a coagulase, que também
produzem enterotoxina em intoxicações
alimentares estafilocócicas. 5
PRINCÍPIO DO ENSAIO
Partículas de látex de poliestireno são
sensibilizadas com antisoro purificado extraído
de coelhos, individualmente imunizados as
enterotoxinas estafilocócicas purificadas A, B, C
e D. Estas partículas de látex se aglutinam na
presença da correspondente enterotoxina. Um
reagente de controle é fornecido, que consiste
de partículas de látex sensibilizadas com
globulinas de coelho não imunes. O teste é
realizado em placas de poços em V para
microtítulos. Formulam-se diluições do extrato
de alimentos ou filtrado de cultura em cinco
filas de poços, adiciona-se a cada poço um
volume da suspensão apropriada de látex e
mistura-se o conteúdo. Se as enterotoxinas
estafilocócicas A, B, C ou D estiverem presentes,
ocorre a aglutinação, que resulta na formação
de uma estrutura de treliça. Ao assentar, essa
estrutura forma uma camada difusa na base do
poço. Se as enterotoxinas estafilocócicas
estiverem ausentes, ou presentes a uma
concentração inferior a do nível de detecção do
ensaio, não será formada nenhuma estrutura de
treliça, e pode-se observar então um botão
apertado.
O diluente fornecido contém hexametafosfato
de sódio, que demonstrou reduzir a incidência
de reações não específicas com componentes de
matrizes de alimentos.6
TD902 Látex sensibilizado com anti-
Este produto serve apenas para aplicações em
diagnósticos in vitro.
Não congelar.
Não misturar reagentes com números de lotes
diferentes.
Os reagentes e o diluente contêm 0,1% de azida
de sódio como produto conservante. A azida de
sódio poderá reagir com a tubagem de chumbo
ou cobre, produzindo azidas metálicas que são
explosivas por detonação de contato. Para evitar
a acumulação de azida nos canos, lavar com
grandes quantidades de água a pressão logo
após o descarte dos desperdícios.
ARMAZENAGEM
O Kit SET-RPLA deve ser armazenado a 2-8ºC.
Nessas condições, os reagentes reterão sua
reatividade até a data indicada na caixa do kit.
Após a sua reconstituição, os controles da
enterotoxina devem ser armazenados a 2-8ºC.
Nessas condições, os controles das
enterotoxinas reconstituídas reterão sua
reatividade por 3 meses, ou até a data indicada
na caixa do kit, seja qual for a primeira data.
PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
1. Matrizes de Alimentos
1.1 Pode testar-se uma grande variedade de
alimentos para verificar o conteúdo de
enterotoxinas estafilocócicas;contudo,
processo de extração pode exigir a modificação
de certos alimentos. O principal requisito é obter
um extrato não turvo, livre de gordura. Convém
ter um fator de diluição baixo, para aumentar a
sensibilidade, mas se a natureza do alimento
exigir uma maior diluição durante a extração, o
resultado será uma redução da sensibilidade.
1.2 Para obter uma amostra representativa de
um lote, recolhe-se, de diferentes locais do lote,
uma série de porções de 10 g (ver os planos de
amostragem T.P.I., U.S.D.A., ou equivalentes).
2. Filtrados de Cultura
Os estafilococos de fontes clínicas ou de
matrizes de alimentos podem ser recuperados e
identificados por meio de técnicas apropriadas
descritas em livros escolares normais.
MÉTODO DE UTILIZAÇÃO
1. Materiais necessários mas não fornecidos
Misturador ou homogeneizador
Placas para microtítulos (poços em V) e
tampas
Pipetas e tubos de distribuição fixos ou
variáveis (25µl)
Centrifugador com capacidade para gerar
900g (tipicamente 300 rpm em um
centrifugador pequeno de bancada)
Unidade de filtração de membrana usando
filtros descartáveis de baixa ligação às
proteínas com uma porosidade de 0,2 a 0.45
µm (como o Millipore SLGV)
Caldo de Soja Triptona (CM129)
Solução de cloreto de sódio (0,85%)
Solução de hipocloreto de sódio (>1,3%p/v)
Conta-gotas de 25 µl (opcional)
Diluidor de 25 µl (opcional)
Micromisturador (opcional)
Caixa umidificadora (opcional)
2. Componentes do Kit
TD901 Látex sensibilizado com anti-
enterotoxina A. Suspensão de látex
sensibilizada com anticorpos específicos (IgG
de coelho) contra enterotoxina A
estafilocócica.
5. Método de Ensaio
enterotoxina B. Suspensão de látex
sensibilizada com anticorpos específicos (IgG de
coelho) contra enterotoxina B estafilocócica.
TD903 Látex sensibilizado com anti-
enterotoxina C. Suspensão de látex
sensibilizada com anticorpos específicos (IgG de
coelho) contra enterotoxina C estafilocócica.
TD904 Látex sensibilizado com anti-
enterotoxina D. Suspensão de látex
sensibilizada com anticorpos específicos (IgG de
coelho) contra enterotoxina D estafilocócica.
TD905 Controle de látex. Suspensão de látex
sensibilizada com globulinas não imunes de
coelho.
TD906 Controle A de enterotoxina
estafilocócica
TD907 Controle B de enterotoxina
estafilocócica.
TD908 Controle C de enterotoxina
estafilocócica.
TD909 Controle D de enterotoxina
estafilocócica.
TD910 Diluente. Solução salina fosfatada
o tamponada contendo albumina de soro bovino e
hexametafosfato de sódio.
Folheto de instruções
3. Extração ou Produção de Toxinas
Extração de Matrizes de Alimentos
3.1 Misturar 10 g da amostra com 10 ml de
solução de cloreto de sódio (a 0,85%) em um
misturador ou homogeneizador.
3.2 Centrifugar a amostra misturada a 900g a
4º C durante 30 minutos.
NOTA: Em caso de não estar disponível um
centrifugador com refrigeração, esfriar a
amostra até 4º C antes de efetuar a centrifugação.
3.3 Filtrar o sobrenadante através de um filtro
de membrana de baixa ligação às proteínas de
0,2 µm a 0,45 µm.
Reter o filtrado para efetuar uma análise de
seu conteúdo de toxinas.
Produção de Enterotoxinas em Líquidos de Cultura
3.4 Inocular o organismo isolado em Caldo de
Soja Triptona (CM129) e incubar a 37º C durante
18 a 24 horas, preferivelmente sem agitar.
3.5 Após o crescimento, ou centrifugar a 900g
durante 20 minutos a 4º C ou filtrar por uma
membrana usando um filtro de baixa ligação às
proteínas de 0,2 µm. Reter o filtrado para
efetuar uma análise de seu conteúdo de
toxinas.
4. Controle
Cada controle de toxina reconstituído causará a
aglutinação com seu respetivo látex sensibilizado.
O uso de controles de toxinas fornecerá
referências para os padrões positivos ilustrados
em baixo (ver a Interpretação dos Resultados dos
Testes). Os controles devem ser usados de
tempos em tempos, somente para confirmar o
funcionamento correto do látex do teste. Os
controles de toxinas não são fornecidos a um
nível especificado e portanto não devem ser
usados como meios de quantificação dos níveis
de toxinas detectadas nas amostras de testes.
Nesses casos os resultados do teste devem ser
considerados positivos, desde que a reação com
5.1 Reagentes de Trabalho o látex sensibilizado seja positiva a uma diluição
Os reagentes de látex e o diluente estão prontos mais elevada da amostra de teste que a diluição
a usar. Os reagentes de látex devem ser bem do controle de látex. O último poço de todas as
agitados antes de serem usados, até obter uma filas deve ser negativo. Se forem observados
suspensão homogênea. Para reconstituir os padrões positivos em alguns desses poços, a
reagentes de controle, adicionar 0,5 ml de reação deve ser considerada inválida.
diluente (TD910) a cada frasco. Agitar
NOTA: Sabe-se que certas cepas de
levemente até que o conteúdo fique dissolvido.
estafilococos produzem mais que uma
5.2 Organizar a placa de forma a que cada fila enterotoxina.
consista de 8 poços. Cada amostra necessita de
usar 5 de essas filas. LIMITES DO TESTE
5.3 Usando uma pipeta ou conta-gotas, Foi estabelecido que a sensibilidade deste teste
depositar 25 µl de amostra de teste no primeiro para detectar as enterotoxinas é de 0,5 ng/ml no
poço de cada uma das 5 filas. extrato de teste. Quando um extrato de alimento
é preparado com uma relação de diluição de 1 :
5.4 Usando uma pipeta ou diluidor, e
1 com diluente, a sensibilidade é, assim, de 1 ng/
começando no primeiro poço de cada fila, pegar
g de matriz de alimento. O limite de detecção
25 µl e efetuar diluições duplas ao longo de cada varia de acordo com quaisquer diluições
uma das 5 filas. Parar no 7.º poço, deixando que adicionais exigidas pelo tipo de matriz alimentar.
o último poço contenha apenas diluente. A concentração de enterotoxina no extrato de
5.5 A cada poço da primeira fila, adicionar 25 alimento pode ser efetuada por uma série de
µl de látex sensibilizado com anti-enterotoxina A. métodos, como por exemplo a ultrafiltração. A
produção em cultura de SETs depende das
5.6 A cada poço da segunda fila, adicionar 25
condições de crescimento. Um resultado positivo
µl de látex sensibilizado com anti-enterotoxina B.
obtido pela cultura demonstra a produção de um
5.7 A cada poço da terceira fila, adicionar 25 µl
ou mais SETs nessas circunstâncias, e não implica
de látex sensibilizado com anti-enterotoxina C. a produção in vivo de toxinas a esses níveis.
5.8 A cada poço da quarta fila, adicionar 25 µl
de látex sensibilizado com anti-enterotoxina D.
5.9 A cada poço da quinta fila, adicionar 25 µl
de controle de látex.
Oxoid Limited
5.10 Para misturar o conteúdo de cada poço,
Wade Road, Basingstoke
fazer rodar a placa, usando um micromisturador, Hampshire, RG24 8PW
ou agitar manualmente. Ter cuidado para não England
entornar o conteúdo dos poços. Telephone: National 01256 841144 International:
5.11 Para evitar a evaporação, cobrir a placa +441256 841 144
com uma tampa. Uma alternativa aceitável é Telex 858793 13
Facsimile 01256 463388
colocar a placa dentro de uma caixa
umidificadora. Deixar a placa, sem tocar nela, Manufactured for Oxoid by Denka Seiken Ltd
sobre uma superfície livre de vibrações, à (Japan) Oxoid is a trademark
temperatura ambiente, durante 20 a 24 horas. A
Importado e Distribuído por:
colocação da placa sobre papel preto durante
toda essa incubação facilitará a subsequente PHADIA DIAGNOSTICOS LTDA
leitura do teste. Rua Eugênio de Medeiros, 303 – 11° andar
5.12 Examinar cada poço de cada fila, Pinheiros – São Paulo
procurando vislumbrar sinais de aglutinação CNPJ: 04.930.429/0001-39
contra um fundo preto.
5.13 Os tubos do centrifugador, filtros de SET - RPLA TEST
Uso exclusivo para Diagnóstico in vitro
membrana, placas para microtítulos, tampas, 80254180285
pipetas e tubos de distribuição devem ser esteri- Farm. Resp: Elaine Briguenti Ferraz - CRF-SP 29.698
lizados em autoclave a 121º C ou desinfetados
antes de serem descartados para dentro de SAC: 0800-551535
soluções de hipocloreto (>1.3% p/p).
5.14 Descartar os extratos de cultura, extratos
de alimentos, amostras e controles de toxinas,
colocando-os em soluções de hipocloreto
((>1.3% p/p).
INTERPRETAÇÃO DOS
RESULTADOS DOS TESTES
O padrão de aglutinação deve ser avaliado em
comparação com a seguinte ilustração.
Os resultados classificados como (+), (++), e (++
+) são considerados positivos.
Os resultados da fila de poços contendo o
controle de látex devem ser negativos. Em alguns
casos, pode se observar uma aglutinação não
específica.
X2829D November 2003