PRÉ-PROJETO

ALUNO:

TEMA: Prospecção de compostos de Tephrosia vogelii com propriedades inseticidas

contra larvas de Aedes Aegypti

1- PROBLEMA

Com o processo de urbanização desordenado, crescimento populacional, tratamento de água e

esgoto inexistentes ou incorretos, destino inadequado do lixo com acúmulo de recipientes não
biodegradáveis, aumenta a dificuldade de controle da doença por ações de combate ao mosquito
vetor. Além disso, sua alta capacidade reprodutiva é um dos principais fatores que dificultam o
controle da sua população em uma área endêmica.
O controle e a prevenção do inseto A. aegypti são feitos principalmente pelo Programa Nacional
de Controle da Dengue (PNCD), que conta com uma série de medidas, tais como: a eliminação
de criadouros por métodos mecânicos, aplicação de produtos químicos, educação ambiental e
monitoramento da resistência à inseticidas.
O aparecimento de resistência em diversas populações de insetos com a utilização dos
inseticidas químicos convencionais, o efeito que eles exercem em outros organismos úteis,
incluindo o homem, as alterações ambientais, tais como a contaminação de alimentos, solo e
água e a busca por compostos que fossem mais seletivos para o inseto alvo, serão fatores
predominantes para o ressurgimento do interesse pelos inseticidas de origem botânica. Além de
eficazes, os extratos vegetais possuem baixo custo e são menos agressivos ao ambiente,
demonstrando ser uma boa alternativa, quando integrada aos métodos de controle atualmente
aplicados.
Estudos recentes verificaram a eficácia de extratos de Tephrosia vogelii contra o besouro
Hypothenemus hampei (Coleoptera) larvas de Aedes albopictus (Diptera) e o percevejo
Euschistus heros (Hemiptera). Além disso, extratos aquosos de T. vogelli podem ser utilizados
no controle de insetos e ácaros em plantações.
Esta planta é uma leguminosa nativa do oeste da África, onde é utilizada como biopesticida e
adubo verde. As atividades pesticidas e inseticidas de T. vogelii provavelmente são devidas à
presença de rotenoides, como a rotenona, que age inibindo a respiração celular através da
interferência direta na cadeia transportadora de elétrons. Sua utilização como inseticida pode
ser na forma de pó de partes da planta ou extratos, obtidos por processos laboratoriais. Embora
a planta T. vogelii já tenha sido utilizada como medida de controle de insetos e outros
organismos, seu efeito ainda é desconhecido sobre o inseto A. aegypti.
2- OBJETIVO GERAL
Avaliar e quantificar a eficácia de extratos de T. vogelii contra os diferentes estágios larvais do
mosquito A. aegypti.

3- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar e quantificar os efeitos tóxicos do pó de sementes e folhas de T. vogelii contra os

diferentes estágios larvais do mosquito A. aegypti.
• Avaliar e quantificar os efeitos de diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas
de T. vogelii contra os diferentes estágios larvais do mosquito A. aegypti.
• Quantificar os níveis de rotenona presentes em diferentes concentrações do extrato
aquoso de folhas de T. vogelii
• Avaliar e quantificar os efeitos de diferentes concentrações do extrato proteico de
sementes de T. vogelii contra os diferentes estágios larvais do mosquito A. aegypti.

4- METODOLOGIA

4.1- Obtenção de ovos e manutenção da colônia de insetos

Os ovos de Aedes aegypti utilizados nos experimentos serão gentilmente cedidos pelo professor
Dr. Francisco José Alves Lemos, a parir de uma colônia da linhagem Rockfeller, mantida no
Laboratório de Biotecnologia (LBT), localizado no Centro de Biociências e Biotecnologia
(CBB) da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF). Após a
oviposição das fêmeas, os ovos serão mantidos aderidos em papel filtro branco até o início dos
experimentos.
Para a eclosão larval, os ovos serão submersos em 1,5 L de água proveniente do abastecimento
público em bacia de cor branca, contendo dois grãos de ração de coelho, a temperatura
ambiente. A alimentação das larvas será feita diariamente utilizando a mesma ração triturada.
Os mosquitos adultos serão mantidos a temperatura ambiente em gaiolas apropriadas até seu
descarte final, por afogamento.
4.2- Coleta de material botânico
O material vegetal utilizado nos experimentos será proveniente de coletas realizadas no Sítio
Santa Terezinha, localizado em Purilândia, 2º Distrito de Porciúncula – RJ. Um dia após a coleta
as folhas e sementes de T. vogelii serão liofilizadas por 12 horas e logo em seguida maceradas
na presença de nitrogênio líquido até a obtenção de um pó fino, que será novamente liofilizado
por 1 hora, para a completa retirada da humidade gerada pela baixa temperatura do nitrogênio.
Após todo o procedimento, o pó desidratado será mantido em potes plásticos fechados
hermeticamente, devidamente etiquetados e mantidos em uma temperatura de -70 ºC para
posterior utilização.

4.3- Extração aquosa de folhas de T. vogelii

Para a realização dos extratos, serão adicionados 400 g de pó de folhas de T. vogelii em 1 L de
água destilada. A mistura será mantida em homogeneização branda por 12 horas e, logo em
seguida, filtrada em cone de papel filtro de café. O líquido obtido após filtragem será congelado
na presença de nitrogênio líquido, liofilizado até a sua completa desidratação e mantido em
temperatura de -70 ºC até sua utilização nos testes de toxicidade.

4.4- Extração proteica de sementes de T. vogelii

Proteínas do pó de sementes serão extraídas na proporção de 1:10 em tampão PBS (fosfato de

sódio 100 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,6) sob agitação por 1 h a 4 °C. O extrato será centrifugado a
10000 x g a 4 °C por 20 min. O sobrenadante será precipitado com sulfato de amônio (0-70 %)
e deixado em repouso por 12 h a 4 °C. As amostras serão centrifugadas a 10000 x g por 20 min
a 4 °C e o sobrenadante será novamente precipitado de 70-90 % de saturação com sulfato de
amônio. O extrato será deixado em repouso por 12 h a 4 °C e centrifugado a 10000 x g a 4 °C
por 20 min. O precipitado resultante será diluído em PBS, dialisado contra água destilada por
72 h e liofilizado. A fração resultante, rica em vicilinas, será denominada F70-90 e usada para
os experimentos posteriores.

4.5- Avaliação da atividade larvicida no extrato aquoso e proteico

Para avaliação da atividade larvicida dos extratos de T. vogelii serão utilizadas diferentes
concentrações. Alíquotas de cada uma das concentrações de extratos serão transferidas para
placas de vidro estéreis (9 cm diâmetro/150 mL capacidade). Dez larvas de primeiro, segundo,
terceiro e quarto estágios serão introduzidas separadamente em diferentes placas contendo
concentrações graduadas dos extratos. As mortalidades larvais serão registradas a partir do
primeiro dia (24 h) após a exposição às soluções de teste. As larvas serão observadas com
auxílio de um estereoscópio (Leica EZ4 HD, Alemanha), onde as mortas serão identificadas
quando não conseguiram se mover após a sondagem com uma agulha no sifão ou na região
cervical. Os experimentos serão realizados em triplicata e repetidos em três dias diferentes, em
uma temperatura de 25-30 ºC e 80–90% de umidade relativa.

4.6- Quantificação da concentração de rotenona presente nos extratos aquosos

A concentração de rotenona presente nos extratos aquosos de folhas de T. vogelii será

mensurada quantitativamente por um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC
- Shimadzu LC-20A, Japão) com um detector ultravioleta visível e uma interface para o
software de processamento de dados LC solution (Shimadzu, Japão). A cromatografia será
realizada utilizando uma coluna Agilent Zorbax TC-C18 (250 mm x 94.6 mm, 5 µm) com
acetonitrila/água (70/30, v/v) como fase móvel, a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. O
comprimento de onda de detecção será estabelecido em 299 nm e o tempo de retenção de
rotenona será de aproximadamente 7,67 min. O controle será estabelecido com padrões de
referência de rotenona com uma pureza de 98% (Sigma - Aldrich). A rotenona será dissolvida
e diluída em série utilizando solução aquosa de acetona 2% (V/V).

4.7- Plotagem dos dados e análise estatística

Todos os experimentos serão feitos em triplicata e com um mínimo de três repetições

independentes. Os dados apresentados são a média e desvio padrão calculados com base em
todas as repetições. A plotagem dos dados e cálculos estatísticos serão feitos utilizando o
programa Graph-Pad Prism 5.0.

5- RESULTADOS ESPERADOS

Do extrato aquoso de folhas de T. vogelii espera-se uma alta toxicidade contra larvas de
Aedes albopictus, devido aos seus altos níveis de rotenona. Por outro, lado do extrato proteico
de sementes espera-se que a possível toxicidade contra as larvas esteja relacionada às vicilinas.
Estão proteínas possuem papel de defesa contra insetos por apresentarem sítios de ligação à
quitina, componente principal da parede intestinal