12.

1 Introdução: Cultura de tecidos na agricultura moderna

Houve um progresso significativo nos últimos anos na área da agricultura, onde a tecnologia desempenha um
papel fundamental, em geral na produtividade agrícola (Gwynne, 1999). De acordo com o Relatório do Banco
Mundial de 1997, cerca de 12% da superfície total do mundo é usada para o cultivo, cerca de 30% são florestas
ou bosques e 26% são pastagens ou prados. O restante, um terço, é usado para outros fins humanos ou é
inutilizável por causa do clima ou da topografia. Em 1961, a quantidade de terra destinada à produção de
alimentos era de 0,44 ha per capita. Atualmente, é de 0,26 ha per capita e, com base em projeções populacionais,
estará na vizinhança de 0,2% ao ano e continuará a cair (Banco Mundial, 1997). Portanto, é necessário aumentar
a produtividade por hectare para alimentar a crescente população com a quantidade decrescente de terra
disponível para cultivo. O desafio é imenso porque, até 2050, a demanda global por alimentos poderá ser três
vezes maior do que hoje (ONU 2013).
Sabe-se que a agricultura foi possível graças aos avanços da tecnologia. Da mesma forma, a agricultura permite
novos aumentos na população. À medida que as pessoas entram em contato umas com as outras, há difusão das
culturas, além de trocarem experiências diferentes no processamento de produtos agrícolas, experiências de vida,
entre outras que resultaram em maior diversidade de alimentos para consumo e uso cada vez melhor ( Bunders et
al., 1997; Ríos e Wright, 2000). A lista de 23 plantas que formam a base da agricultura mundial é indicada na
Tabela 12.1 (Borlaug 1981), denotando a pouca diversidade nessas linhas.
Uma vantagem importante da biotecnologia como tecnologia é que ela pode ser aplicada em muitas espécies
agrícolas com características muito diferentes e contribuir com diversos métodos e procedimentos para sua
propagação acelerada, saúde, uso mais eficiente e conservação ex situ. Atualmente, esses aspectos são de
interesse devido à deterioração ambiental, perda de biodiversidade e efeitos das mudanças climáticas, que
causam diferentes estresses bióticos e abióticos em culturas de importância agrícola (Zarafshar et al. 2014;
Prabha e Kumar 2014).
A biotecnologia é amplamente definida como qualquer técnica que utilize organismos vivos (ou partes de
organismos), como bactérias, vírus, fungos, leveduras, células animais, células vegetais, etc., para produzir ou
modificar um produto, melhorar plantas ou animais ou desenvolver microrganismos para usos específicos. A
biotecnologia é a priori uma busca interdisciplinar. Nas últimas décadas, uma característica do desenvolvimento
da ciência e da tecnologia tem sido o recurso crescente a estratégias multidisciplinares para a solução de vários
problemas (Hamon et al. 1998; Etienne et al. 2002). Um biotecnólogo pode utilizar técnicas derivadas da
química, microbiologia, bioquímica, engenharia química e ciência da computação.
As biotecnologias vegetais desempenham um papel fundamental na produção massiva de variedades melhoradas
de culturas (através da cultura de tecidos in vitro seguida de propagação clonal), bem como no seu
aprimoramento genético. Eles também podem ajudar na propagação de espécies vegetais, que contêm
substâncias úteis e biologicamente ativas, por exemplo, aditivo alimentar, pigmento, produtos farmacêuticos,
biopesticidas, etc. A cultura de tecidos e células de órgãos pode ser mais eficiente do que a extração
convencional (Cruz-Cruz et al. 2013). Baseada na agricultura, a biotecnologia é uma coleção de técnicas
científicas usadas para melhorar plantas, animais e microorganismos. A biotecnologia é frequentemente
aclamada como a nova ciência "revolucionária", e é o uso de organismos vivos e seus componentes na
agricultura, alimentação e outros processos industriais (Smith, 1988).
As aplicações da pesquisa biológica moderna na agricultura e produção de alimentos oferecem uma variedade de
ferramentas e técnicas que não envolvem modificação genética e ainda podem dar grandes contribuições à
agricultura (González et al. 2012; Kumar et al. 2009). Nesse sentido, com base no banco de dados da
Organização para a Agricultura e a Alimentação (FAO) sobre biotecnologias nos países em desenvolvimento
(BioDeC), ele se concentra em quatro tipos de biotecnologia não-GM: cultura de tecidos, marcadores
moleculares, técnicas de diagnóstico e produtos microbianos (FAO 2017 )
Haberlandt (1902) visualizou o conceito de cultura de tecidos vegetais e forneceu as bases para o cultivo de
células, tecidos e órgãos vegetais em cultura. A cultura de tecidos vegetais pode ser definida como a cultura de
todos os tipos de células, tecidos e órgãos de plantas em condições assépticas. Atualmente, as aplicações de
cultura de tecidos vegetais abrangem muito mais do que a propagação clonal, que é uma forma de cultura de
tecidos, aumentando a quantidade de material de plantio para facilitar a distribuição e o plantio em larga escala.
Dessa maneira, milhares de cópias de uma planta podem ser produzidas em pouco tempo. A gama de tecnologias
de rotina se expandiu para incluir embriogênese somática, hibridação somática, eliminação de vírus, bem como a
aplicação de biorreatores à propagação em massa (Martínez et al. 2016; González et al. 2011). De uma maneira
geral, a cultura de tecidos manipula células, anteras, grãos de pólen ou outros tecidos, de modo que eles vivem
por longos períodos em condições de laboratório ou se tornam organismos inteiros, vivos e em crescimento.
Empresas e instituições divergentes em todo o mundo investiram ou se especializaram nessa atividade, para
fornecer aos agricultores e cultivadores material de plantio saudável e de alta qualidade (Loh e Ingram 1982).
Os benefícios que essas técnicas oferecem permitem gerar novas metodologias de aplicação importante do ponto
de vista cognitivo, prático e econômico (Hamon et al. 1998; Rovelli et al. 2000).

12.2 Do século XX ao cenário atual

Desde que Gottlieb Haberlandt, em 1902, enunciou a teoria da totipotência das células vegetais, foram feitas
tentativas de cultivar células, tecidos e órgãos in vitro. O próprio Haberlandt deu o primeiro passo nessa direção,
embora sem sucesso, por ter tentado cultivar células muito maduras e ter usado uma solução nutritiva muito
simples (Krikorian e Berquam 2003).
A descoberta dos principais reguladores de crescimento (auxinas, citocininas, giberelinas) nas décadas de 1920 a
1960, bem como a formulação de diversos meios de cultura que incluíam nutrientes essenciais para as plantas -
conhecimentos derivados dos avanços alcançados na fisiologia das plantas - contribuíram decisivamente para
superar a relutância de muitas espécies à cultura in vitro. Um marco foi a publicação de um meio de cultura
(Murashige e Skoog 1962), que embora tenha sido concebido para a cultura in vitro de Nicotiana, tenha sido útil
para a maioria das espécies de plantas com modificações maiores ou menores, especialmente complementando-o
com várias concentrações de reguladores de crescimento.
Desde a década de 1960, começou a verdadeira "decolagem" da cultura in vitro de células, tecidos e órgãos.
Protocolos para a cultura de calos, meristemas, suspensões celulares, anteras, protoplastos e outras variantes
abundam na literatura. Hoje é difícil estimar com certeza a quantidade de espécies de plantas que foram
cultivadas com maior ou menor sucesso. As conquistas permitiram que a cultura in vitro fosse incorporada ao
conjunto de ferramentas aplicadas pela agricultura moderna para tornar processos de produção mais eficientes.
Em 1974, Toshio Murashige já apreciava a utilidade que a cultura de tecidos teria no futuro, localizada em
quatro grandes áreas (Murashige 1974):
• Rápida multiplicação clonal de variedades selecionadas
• Melhoramento genético das culturas
• Recuperação de clones livres de doenças e preservação de germoplasma valioso
• Produção de drogas e outros produtos naturais
Assim, serão revisados os principais elementos da história e o atual desenvolvimento da cultura in vitro nessas
áreas de aplicação.

12.3 Multiplicação acelerada de plantas

Aparentemente, o primeiro a considerar a cultura in vitro como um caminho para a multiplicação acelerada de
plantas e aplicá-la na prática foi Georges Morel, na França, com seu trabalho sobre a multiplicação in vitro de
orquídeas (Morel, 1960). Depois disso, Steward e Mapes (1963), tendo demonstrado que a partir de tecidos de
Daucus carota L. plantas inteiras podiam ser regeneradas, conseguiram intervir no ciclo bianual da cenoura para
obter plantas de células somáticas que preenchiam a lacuna entre uma geração e outra. o outro. Com base nesses
resultados, e em parte devido à falta de conhecimento sobre o 
Nos processos de organogênese das décadas de 1960 e 1970 do século passado, os primeiros estudos a
multiplicar plantas foram desenvolvidos por meio da formação de calos e subsequente regeneração de plantas em
espécies como crisântemo (Hill 1968) e cana-de-açúcar (Heinz e Mee 1969) . O sucesso desses primeiros
trabalhos levou ao surgimento de novos protocolos de propagação que usavam calogênese em Gladiolus
(Simonsen e Hildebrandt 1971) e Antúrio (Pierik et al. 1974), entre outros.
Entretanto, as variações cromossômicas observadas por vários autores em células e calos cultivados in vitro
(Heinz et al. 1969; Kao et al. 1970; Niizeki e Grant 1971) questionaram a utilidade da calogênese como técnica
de propagação, devido à instabilidade citológica. demonstrado pelas células cultivadas in vitro, o que constituía
uma barreira à preservação das características dos genótipos multiplicados dessa maneira (Street 1974). Assim,
ao mesmo tempo, começou a ser testada uma nova rota para a rápida multiplicação de plantas: o cultivo de
ápices e brotos axilares, que se mostraram lucrativos em orquídeas (Morel 1960), aspargos (Hasegawa et al.
1973), maçã ( Jones 1976), morango (Boxus 1974), gerbera (Murashige et al. 1974), cana-de-açúcar (Sauvaire e
Galzy 1978; Hendre et al. 1983; Lee 1984), banana e banana (Krikorian e Cronauer 1984). Hoje, muitas espécies
podem ser micropropagadas in vitro por essa rota com relativa facilidade (Fig. 12.1).
Já em 1970-1980, a micropropagação começou a se desenvolver como uma indústria. Naquela época, mais de
500 milhões de plantas foram produzidas em quase 500 laboratórios na Europa Ocidental e nos Estados Unidos
(Pierik 1991; Kitto 1997). Na América Latina, a tendência não era a existência de grandes biofábricas (Pérez et
al. 1998), embora Cuba, por exemplo, tenha conseguido produzir por micropropagação uma parte significativa
de suas sementes certificadas de cana de açúcar, banana e batata em 1980-1990. (Héctor et al. 2016). A partir
dessa abordagem de produção industrial de propágulos, foram projetados sistemas automatizados de propagação,
que simplificam as operações nos laboratórios, reduzem o pessoal necessário e aumentam as quantidades de
propágulos obtidos. Uma linha de desenvolvimento tem sido os sistemas de imersão temporária (TIS). Neste
método, os explantes são multiplicados em frascos de volume de 1 litro ou mais, e é adicionado meio de cultura
líquido, que é periodicamente reciclado por bombas controladas por software. O estado físico do meio de cultura
favorece a absorção de nutrientes, e a periodicidade da imersão reduz as possibilidades de ocorrência de hiper-
hidricidade nos explantes (Berthouly e Etiénne 2005). Desde seu surgimento na década de 1990, o TIS tem sido
bem-sucedido na multiplicação de culturas que ocupam grandes áreas da produção mundial, como bananas
(Alvard et al. 1993), cana-de-açúcar (Lorenzo et al.
1998), abacaxi (Escalona et al. 1999) e batata (Jiménez et al. 1999).
Outra alternativa explorada desde as décadas de 1980 e 1990 foi o uso de embriões somáticos para
encapsulamento em uma cobertura protetora, forçando-os a funcionar como sementes convencionais
(Redenbaugh et al. 1986), que tem sido chamada de “semente artificial”. Esse sistema é tecnologicamente
apoiado no uso de biorreatores. O obstáculo fundamental ao desenvolvimento maciço dessa tecnologia é a
assincronia dos embriões somáticos que ocorrem em inúmeras espécies. No entanto, alguns resultados
promissores foram obtidos, principalmente na alfafa (Datta e Potrykus 1989; Senaratna et al. 1990) e em menor
grau no café (García e Menéndez 1987).
Nas duas décadas decorridas neste milênio, as técnicas convencionais de multiplicação foram disponibilizadas
para vegetais (Estopá 2005), tamareiras (Adel Ahmed e Shaimaa Mohamed 2010), Musaceae (Rahman et al.
2013), orquídeas (Teixeira 2013 ) e outras espécies comerciais. Os sistemas de imersão temporária foram
estendidos na produção de propágulos de várias espécies (Alister et al. 2005; Mordocco et al. 2009; Lezcano et
al. 2010; Akdemir et al. 2014; Othmani et al. 2017; Regueira et al. 2018). Também foram feitos alguns
progressos na obtenção de sementes artificiais (Bekheet 2006; Asmah et al. 2011; Vdovitchenko e Kuzovkina
2011; Gantait et al. 2015).

12.4 Usos da tecnologia de cultura de tecidos vegetais

A cultura de tecidos de plantas tem impacto direto na agricultura atual e tem sido a causa direta do levantamento
da agricultura moderna nos países desenvolvidos. Por exemplo, as bananas ocupam, entre frutas tropicais, uma
posição comparável à das maçãs entre frutas temperadas. Um número maior de clones comestíveis é cultivado na
Índia do que em qualquer outro país. No entanto, popularizando os diferentes aspectos do cultivo de banana e as
vantagens da cultura de tecidos, as bananeiras podem expandir a comercialização do material de plantio (Biswas
e Kumar 2010).
 
A batata-doce oferece vantagens econômicas para muitos países e principalmente para Cuba, pois pode ser usada
na nutrição humana e animal, bem como na indústria. Nos estudos realizados nos clones Cemsa 78-354, Inivit B
90-1, Inivit B 93-1, Yabu-8 e Jewel, foram obtidos bons resultados na indução de calos morfogênicos. A indução
do processo de regeneração foi mais favorecida com o emprego do análogo do bronze-esteróide Biobras-6
combinado com ácido indolacético (AIA-0,05 mg L-1) e cinetina (0,2 mg L-1) (González et al. Na mesma safra,
Bressan (2002), ao inocular embriões somáticos com esporos de Glomus etunicatum em diferentes meios de
cultivo (MS e White), encontrou respostas diferenciadas de colonização, dependendo das concentrações de
nutrientes nos meios e constatou que quando a sacarose foi adicionada (3%) ao meio, foi produzido um efeito
depressor no crescimento das hifas e na colonização radical.A micorrização na micropropagação,
particularmente o uso de fungos micorrízicos arbusculares, agora está ganhando força devido ao impacto
positivo demonstrado no pós-transplante desempenho de plantas cultivadas in vitro (Rai 2001).
Outras aplicações de interesse são baseadas em protocolos para o cultivo de meristemas, anteras e produção
haplóide dupla de Carica mamão. Embriões zigóticos maduros de C. papaya "Sunrise Solo" foram utilizados
como explantes para indução de embriogênese em meio de cultura MS com 2 mg L − 1 2,4-D (ácido 2,4-
diclorofenoxiacético). A formação direta de embriões somáticos foi observada a partir de células epidérmicas
hipocotiledôneas apenas a partir do explante 18 dias após a inoculação. Os embriões somáticos formados
indiretamente foram originados de células superficiais embriogênicas de complexos pré-embrionários
localizados nas camadas celulares periféricas e internas do calo, 49 dias após a inoculação (Mata e Jonás 2006).
Outro exemplo consiste no comportamento das suspensões celulares; três genótipos de Coffea canephora P. var.
Os robusta foram avaliados para definir a idade do calo mais adequada para o estabelecimento de culturas de
suspensão celular. Calos de 7, 14, 21, 28, 35, 42 a 56 dias de cultivo foram utilizados. Diferentes meios de
cultura foram estudados para proliferação celular: (1) MMC-1 com 0,2 mg L-1 de cinetina e 0,5 mg L-1 de 2,4-D
(controle) e (2) MMC-2, onde o 2,4 -D foi substituído por 0,7 mg L -1 de um extrato auxínico de origem
bacteriana. A idade ideal de calo para indução de culturas em suspensão foi de 28 e 35 dias. Os melhores
resultados foram obtidos com a multiplicação do meio MMC-2 (González et al. 2009).
Imagens relacionadas ao processo de micropropagação por embriogênese somática no café são indicadas na Fig.
12.2 (González 2003), denotando a reatividade e o potencial morfogenético desse genótipo.
A embriogênese somática, uma variação da micropropagação, onde os embriões são regenerados diretamente em
vez de folhas ou brotos e raízes, está sendo amplamente utilizada para café e óleo de palma, respectivamente. No
início dos anos 80, várias organizações investigaram a possibilidade de algumas culturas usar embriões
somáticos que poderiam ser encapsulados com diferentes compostos químicos e biológicos. Essas "sementes
artificiais" foram plantadas e tratadas como sementes. Os benefícios potenciais teriam sido tremendos do ponto
de vista do melhoramento de plantas, produção de sementes e tratamento de sementes (Yamakawa, 1985; Kitto e
Janick, 1985; McKersie et al., 1988).
Do mesmo modo, a conservação ex situ representa a conservação dos componentes da diversidade biológica fora
de seu habitat natural; é outra aplicação da cultura de tecidos na agricultura moderna. Isso implica amostragem,
transferência e armazenamento do material vegetal, da área de coleta até o local onde será conservado. Está
dividido em diferentes aspectos técnicos: o armazenamento de sementes, a conservação no campo, a conservação
in vitro, a conservação de crioconservação, o armazenamento de pólen e o armazenamento de DNA (Engelmann
e Dulloo 2007).
A conservação in vitro constitui parte essencial da estratégia geral para a conservação e o intercâmbio de
recursos genéticos em todo o mundo. Oferece a possibilidade de armazenar um grande número e variedade de
amostras em uma área reduzida (Engelmann 1991). Uma metodologia para manter e armazenar variedades de
batata (Solanum tuberosum L.) foi desenvolvida sob condições mínimas de crescimento com duas variedades de
batata Kennebec USA e Patrone USA. Microcortes de 1 cm de comprimento foram plantados in vitro, em
diferentes meios de cultura contendo sais básicos de MS (1962), com várias concentrações de manitol (0 a 4%),
sacarose (1,5 a 4%), ágar (1,5 a 2%), BAP (benzilaminopurina-0-2 mg L-1), ABA (ácido abscísico 1,5-2 mg L-
1) e cloreto de cloro-colina (0-4 mg L-1). As microestacas plantadas foram expostas a 2 µmol / m2 / s (2000 lux)
por 12 horas a 20 ± 2 ° C e 50-80% de umidade relativa. O período de avaliação durou 5 meses. Os microcortes
de Kennebec USA sob T3 e T5 mostraram uma tendência a ser mais curta em comprimento, bem como a
desenvolver menos raízes (Páez e González 2002).
García et al. (2004) preservaram, com qualidade por 6 meses sem realizar subculturas, plantas de cana-de-açúcar
in vitro, com a redução dos sais MS (1962) entre 25% e 50% de sua concentração normal. Reduziram o
crescimento do comprimento de cana-de-açúcar in vitro com o aumento da concentração de manitol no meio de
cultura; desta forma, as plantas poderiam ser preservadas por 12 meses consecutivos a uma temperatura de 15 °
C. No cultivo do café, a conservação in vitro e a conservação crioconservada constituem os métodos
biotecnológicos de maior relevância para a conservação ex situ (Dussert et al. 2000; Vasquez et al. 2005).
Algumas investigações indicam a viabilidade da conservação de plantas de Coffea arabica e C. canephora por
um período de 6 meses em MS médio a 50%, com 30 sacarose g L-1, manitol a 40% e temperatura de
refrigeração de 9 ° C. A recuperação do material vegetal foi realizada em meio de cultura com 0,9 mg L-1 de
extrato auxiliar de bactéria que permitiu obter porcentagens de recuperação entre 95% e 97% e estimular o
desenvolvimento das plantas previamente submetidas ao processo de conservação (Fig. 12.3). A aclimatação das
plantas também foi favorecida com o emprego dessa biopreparação em estado sólido e líquido, sendo alcançado
um nível de desenvolvimento significativo das plantas. O comportamento da estabilidade e / ou variabilidade
genética das plantas conservadas foi avaliado e recuperado em relação às plantas doadoras, por meio de estudos
bioquímicos e moleculares que demonstraram que mantinha a estabilidade genética das mesmas (González et al.
2007).
Pesquisas sobre a criopreservação de calos com estruturas embriogênicas e somáticas estão associadas ao
programa de regeneração de plantas por meio da estratégia de sementes artificiais, que constitui uma alternativa
potencial para aumentar a eficiência e a proliferação de espécies. Foi estabelecida uma metodologia para crio-
preservação de calos com estruturas embriogênicas obtidas a partir de inflorescências imaturas (Martínez et al.
1998, 2006) aplicando um procedimento simples de resfriamento sem o uso de um freezer programável e tendo
como precedente os trabalhos de Withers (1985) , que o utilizou com sucesso na suspensão celular de Nicotiana
e Musa, respectivamente. Imagens relacionadas ao processo de criopreservação por simples resfriamento são
indicadas na Fig. 12.4 (Martínez et al. 2006).
Uma alternativa é um novo procedimento de vitrificação modificado (Leunufna e Keller 2003; Panis et al. 2005),
que se baseia na combinação do procedimento de micro-gotejamento e do procedimento amplamente utilizado
de vitrificação. Nas frutas cítricas, dos ápices das plantas juvenis, o regime de congelamento lento comparado ao
rápido foi mais favorável, pois permitiu obter a sobrevivência dupla (40%), todos os ápices recuperados após a
criopreservação produziram novas plantas sem a necessidade de estar extraído das cápsulas sintéticas (González-
Arnao et al. 2013). Nas frutas cítricas, dos ápices das plantas juvenis, o regime de congelamento lento
comparado ao rápido foi mais favorável, pois permitiu obter dupla sobrevivência (40%), todos os ápices
recuperados após a criopreservação produziram novas plantas sem necessidade a ser extraído das cápsulas
sintéticas (González-Arnao et al. 2013). A biotecnologia faz um uso responsável e sustentável da biodiversidade,
por meio do desenvolvimento de uma tecnologia eficaz, limpa e competitiva para facilitar a solução de
problemas importantes em questões de produção agrícola e industrial e remediar os danos ao meio ambiente
( Serageldin 1999).
Os países em desenvolvimento e os países com economias em transição se beneficiarão enormemente da
biotecnologia. Isso é particularmente verdadeiro para as culturas de interesse limitado para a indústria de
sementes, como raízes e tubérculos, banana ou leguminosas, que são culturas básicas de alimentos nos países
menos avançados. A cultura de tecidos já é usada em alguns desses países para acelerar a multiplicação de
materiais de plantio de alta qualidade (Juma e Konde 2002).
A aplicação da biotecnologia moderna à produção de alimentos apresenta novas oportunidades e desafios para o
desenvolvimento humano. A introdução de novas características em certas culturas pode oferecer maior
produtividade agrícola ou melhorias na qualidade do conteúdo nutricional delas, para que possa, eventualmente e
diretamente, melhorar a saúde das pessoas (Rosegrant e Cline 2003).

12.6 Obtenção de plantas saudáveis e conservação do germoplasma

Em muitas espécies vegetais, os vírus são instalados como hospedeiros sistêmicos de quase todas as células e,
portanto, são disseminados através dos propágulos tradicionalmente usados em sua reprodução vegetativa. Uma
das formas propostas para obter plantas saudáveis tem sido a cultura in vitro de meristemas, uma vez que o
tecido do ápice meristemático geralmente ainda não foi invadido por vírus.
Morel (1960) foi o primeiro a cultivar meristemas de plantas, e mais tarde Quak (1977) conseguiu eliminar vírus
em várias espécies. Posteriormente, obter plantas livres de vírus é uma prática comum em laboratórios. O
desenvolvimento de procedimentos de cultura in vitro permitiu a combinação da cultura de meristemas com
outras técnicas que aumentam a eficiência do saneamento, como termoterapia, microenxertos e sistemas de
imersão temporária para a propagação rápida e maciça de plantas saudáveis (Koeda et al. 2015; Hu et al. 2017;
Shen e Hsu 2018).
O germoplasma conservado em coleções in situ ou ex situ sob condições naturais corre o risco de desaparecer
devido a causas como pragas, catástrofes e vandalismo (Noor et al. 2011), e a manutenção dessas coleções é
cara. Por outro lado, a cultura in vitro permite conservar acessos em espaços muito pequenos, sob condições
controladas e livres dos perigos mencionados. Dois tipos de procedimentos são usados para esse fim. Um deles é
o cultivo de ápices e brotações em condições que retardam seu crescimento, como a redução de nutrientes no
meio de cultura, a adição de agentes osmóticos ao meio e baixas temperaturas. Os rebentos assim cultivados,
com mudanças periódicas do meio de cultura, podem permanecer nessas condições por períodos que variam de
alguns meses a alguns anos, mantendo as características das espécies (Reed et al. 2013). O segundo método é a
criopreservação em nitrogênio líquido (-196 ° C) (Engelmann 1991). Desde que a criopreservação de tecidos e
células vegetais começou a ser testada na década de 1980, sabe-se que nem todos esses materiais são capazes de
suportar satisfatoriamente os processos de congelamento e descongelamento, de modo que diferentes agentes
protetores têm sido utilizados em sua preservação. Mais recentemente, foi dada importância a estudos sobre os
processos de estresse oxidativo sofridos pelos explantes após a criopreservação, que afetam negativamente sua
recuperação (Chen et al. 2015).

12.7 Produção de drogas e outros produtos naturais

As plantas produzem um grande número de metabólitos que são valiosos como medicamentos ou para uso em
processos tecnológicos; portanto, alguns exemplos são os medicamentos usados para tratar câncer de mama,
vincristina, vinblastina, taxol e outros mais conhecidos como morfina e codeína (DiCosmo e Misawa 1995).
Hoje, as técnicas de cultura de tecidos são aplicadas não apenas para acelerar a multiplicação de plantas das
espécies que produzem essas substâncias (Sharma e Vashistha 2015), mas também para obtê-las nos próprios
frascos de cultura.
Nesta era atual, duas linhas de pesquisa / produção adquiriram grande atenção nos últimos anos. A primeira é a
cultura de células em suspensão, que possibilitou a produção de paclitaxel (Taxol) a partir de células de Taxus
brevifolia em quantidades 50 vezes maiores do que as extraídas da planta cultivada in situ (McCoy e O'Connor
2008). Essa variante promete resultados favoráveis, uma vez que nem sempre é possível multiplicar os materiais
in vitro para obter rendimentos superiores aos cultivados em campo, como ocorreu com a produção de
compostos fenólicos nas folhas e nos grãos de Fragaria vesca (Yildirim e Turker 2014 ) A segunda linha é o
cultivo de raízes peludas, que tem sido útil para obter vários compostos fenólicos (Szopa e Ekiert 2012) e ácido
rosmarínico (Thiem et al. 2013). Para aumentar o rendimento dos metabólitos dos tecidos e células cultivados,
começaram a ser utilizados elicitores desses processos (Dong et al. 2010; Vuković et al. 2013).
Considerando a alta demanda desses metabólitos e as vantagens da cultura in vitro para sua produção, a
tendência do uso desses procedimentos para esse fim deve continuar crescendo nos próximos anos.

12.8 Avanço da nanotecnologia na cultura de tecidos vegetais

A nanotecnologia, atualmente, é uma das áreas importantes para investigação em ciências de materiais modernos
baseados em propriedades de nanopartículas (NP) que são específicas, como tamanho, forma e distribuição. As
aplicações com o uso de nanomateriais e PNs estão se desenvolvendo rapidamente (Jain et al. 2009). Na cultura
de tecidos vegetais, existem várias pesquisas baseadas em nanotecnologia, especificamente o uso de NPs na
germinação de sementes, melhoria de crescimento de plantas, modificação genética de plantas, proteção de
plantas e outras (Wang et al. 2016; Ruttkay-Nedecky et al. 2017 )
Na germinação de sementes, Siddiqui e Al-Whaibi (2014) usaram dióxido de silício (SiO2) para o tratamento de
sementes de tomate (Solanum lycopersicum L.). Os autores aplicaram 8 g L-1 de SiO2 e a porcentagem de
germinação das sementes, tempo médio de germinação, índice de germinação das sementes, índice de vigor das
sementes, peso fresco das plântulas e peso seco. Duas cultivares de arroz (Tarom Mahalli e Tarom Hashemi)
foram tratadas com nitroxina, nano-potássio e nano-silício; para a primeira cultivar, o maior rendimento de arroz
em casca 4657 kg ha-1 foi obtido com o consumo de nitroxina e nano-potássio, e para o segundo, o maior
rendimento de arroz em casca (5000 kg ha-1) foi produzido com 34 kg N ha-1 e aplicação de nano-potássio. O
maior índice de colheita foi alcançado com o consumo de nitroxina e nano-silício (Delfani et al. 2014).
A incorporação de NPs de ouro no meio Murashige e Skoog (MS, 1962) foi relatada como aumento da
germinação e crescimento de mudas em Arabidopsis thaliana L. 10 μg mL − 1 e o mesmo tamanho desses PNs
em 10 e 80 μg mL − 1 melhoraram significativamente na taxa de germinação de sementes, crescimento
vegetativo e atividade de eliminação de radicais livres (Kumar et al. 2013).
Os efeitos da exposição ao NP do óxido de cério (CeO2) e do óxido de índio (In2O3) nas mudas de A. thaliana
após a inoculação em meio MS de meia força suplementado com 0–2000 ppm de NPs de CeO2 e In2O3 de 0 a
2000 ppm por 25 dias, foram respostas fisiológicas e moleculares. avaliado por Ma et al. (2013). A exposição a
250 ppm de CeO2 NPs aumentou significativamente a biomassa da planta, mas, em concentrações mais altas
(500–2000 ppm), o crescimento da planta diminuiu em até 85%. A produção total de clorofila e malondialdeído
(MDA) não foi afetada pela exposição ao In2O3 NP. A resposta molecular à exposição ao NP medida pelo
qPCR mostrou que ambos os tipos de elementos alteraram a expressão de genes centrais à resposta ao estresse,
como a via de biossíntese de assimilação de enxofre e glutationa (GSH), uma série de genes que se sabe serem
significativos na desintoxicação de toxicidade de metais em plantas.
A resposta fisiológica e expressão gênica de A. thaliana com três morfologias diferentes de NPs de prata
[triangular (47 ± 7 nm), esférica (8 ± 2 nm) e decaédrica (45 ± 5 nm) foram estudadas. Os autores descobriram
que os NPs de prata triangulares e esféricos exibiam os graus mais baixo e mais alto de atividade antimicrobiana,
respectivamente, e decaédricos induziam o maior grau de promoção do crescimento radicular (RGP); no entanto,
os NPs de prata esféricos não exibiram RGP e induziram os níveis mais altos de acúmulo de antocianina em
mudas de Arabidopsis (Syu et al. 2014).
Torney et al. (2007) utilizaram NPs de sílica com superfície funcionalizada em plantas; o uso desses PNs nas
plantas é limitado; eles foram usados para fornecer DNA e drogas nas células e tecidos animais; portanto, nesta
pesquisa, os autores desenvolvem um sistema NPs (MSN) de sílica mesoprosa em favo de mel com poros de 3
nm que podem transportar DNA e produtos químicos para células vegetais isoladas e intactas. folhas; eles
carregaram o MSN com o gene e seu indutor químico e tamparam as extremidades com NPs de ouro para
impedir que as moléculas se libertassem. Destampando o ouro, os NPs liberaram os produtos químicos e
desencadearam a expressão gênica nas plantas em condições de liberação controlada.
NPs de prata e sílica têm sido utilizados para proteção de plantas em cultura de tecidos vegetais. Neste tópico, os
PNs mostraram um grande potencial para a desinfecção da superfície dos explantes, pois reduzem a
contaminação microbiana em várias plantas. O uso de PNs com o meio de cultura elimina a contaminação
bacteriana e melhora o potencial do explante, mas eles podem induzir variação somaclonal (Hwan et al. 2017). A
desinfecção da superfície explante é o problema das fritas que devem ser resolvidas para prosseguir com a
colheita in vitro, porque, com a contaminação, o procedimento é interrompido e, às vezes, os materiais iniciais
têm muitos patógenos (Fig. 12.5).

Fig. 12.5 Contaminação por fungos de ápices de batata: (a) minitubers variedade Atlântica, (b) minitubers e (c)
variedade Fianna
ão é um problema sério em sistemas de imersão temporária (TIS), as NPs de prata foram usadas em meio líquido
MS com diferentes concentrações (0, 25, 50, 100 e 200 mg L-1) para a baunilha (Vanilla planifolia Jacks. ex
Andrews) atira na regeneração. A contaminação bacteriana foi reduzida em 50, 100 e 200 mg L-1 de NPs de
prata, e estimulação do crescimento foi observada em 25 e 50 mg L-1, enquanto uma inibição significativa foi
detectada em 100 e 200 mg L-1 (Spinoso-Castillo et al. 2017).
Helaly et al. (2014) identificaram contaminantes biológicos em culturas in vitro de bananas e também avaliaram
o efeito de Zn ou ZnO NPs (50, 100, 200 mg L-1) em meio MS na eliminação de alguns contaminantes
bacterianos e fúngicos e sua influência regeneração. Nove cepas de contaminantes bacterianos (Cellulomonas
uda, Cellulomonas flavigena, Corynebacterium panrometabolum, Bacillus megaterium, Staphylococcus spp.,
Klebsiella spp., Erwinia cypripedii, Pseudomonas spp. E Proteus spp.) E quatro fúngicos (Fusarium. Foram
identificados contaminantes de Penicillium spp. E Candida spp.) Em meios livres de NPs de culturas de banana
in vitro. Eles acabaram levando a morte dos explantes. A porcentagem mais alta de embriogênese somática foi
observada em meios MS suplementados com 100 mg L-1 de Zn NPs, seguidos por ZnO NPs. Excelentes
plantações de enraizamento, enraizamento e regeneração também foram observadas em MS + 100 mg L -1 nano-
Zn e nano-ZnO. Plântulas regeneradas foram aclimatadas com sucesso com cerca de 98% de eficiência durante o
período experimental (1 mês). Os somaclones tratados com NP acumularam mais atividade de prolina, clorofila
e enzima antioxidante e desenvolveram mais acúmulo de peso seco do que o controle. Em conclusão, os
contaminantes microbianos na cultura da banana in vitro podem ser efetivamente eliminados pela incorporação
de partículas de nano-Zn e nano-ZnO em meios de crescimento em diferentes concentrações. No entanto, a dose
de 100 mg L − 1 foi preferível, pois mostrou os melhores efeitos no aumento da regeneração de plântulas com
sistemas radiculares bem formados. Mais estudos são necessários para investigar os mecanismos e os efeitos
colaterais dos NPs na estabilidade genética de culturas de banana in vitro.
Efeitos positivos de NPs foram observados na indução de calos, regeneração de brotações e crescimento de
explantes. O efeito das NPs de prata (5–80 mg L -1) isoladamente ou combinadas com 6-benzil amino-purina (6
BAP) e ácido indolacético (IAA) foi avaliado nas propriedades de crescimento de Tecomella undulata (Roxb.).
Os resultados mostram que a adição de NPs de prata (10 mg L-1) combinada com 2,5 mg L-1 BAP e 0,1 mg L-1
IAA no meio MS aumentou o número de brotos frescos por explante, a porcentagem de explantes que produzem
brotos e também a sobrevivência da planta devido à ação no bloqueio do etileno. Concentrações de NPs de prata
acima de 60 mg L-1 induziram redução na regeneração da parte aérea (Aghdaei et al. 2012).
Zafar et al. (2016) explante de caule cultivado de Brassica nigra L. em meio MS suplementado com NPs de
óxido de zinco (ZnO) em concentrações de 1 a 20 mg L-1, o que resultou na produção de raízes finas brancas
com pêlos grossos; com 10 mg L − 1 de ZnO NPs, foi observada a emergência da parte aérea e também as raízes
/ calos desenvolvidos.
As NPs de sulfato de cobre (CuSO4) foram usadas no meio MS por Genady et al. (2016) para comprimento de
parte aérea e raiz e peso fresco de mudas de noz de Verbena bipinnatifida nas concentrações de 5, 10 e 15 μM L-
1. Os resultados mostram que 5 mg L -1 de CuSO4 NPs no meio MS aumentaram o comprimento da parte aérea
(52% sobre o controle), o comprimento da raiz (21% sobre o controle) e o peso fresco (39% sobre o controle).
Nesta experiência, o conteúdo fenólico foi aumentado com o uso de CuSO4 NPs. Talankova-Sereda et al. (2016)
trabalharam com NPs de cobre (0,5 mg L-1) e cobalto (0,8 mg L-1) adicionados ao meio MS para avaliar
brotações, comprimento das brotações e enraizamento em Mentha longifolia L., e um aumento em todos os
parâmetros avaliados foi obtido.
O efeito de diferentes concentrações (0, 0,1, 1,0, 10, 100 ou 1000 mg L -1) de NPs de óxido de zinco (ZnO)
(tamanho de 34 nm) na fisiologia e produção de glicosídeo esteviol (rebaidiosídeo A e esteviosídeo) em brotos
micropropagados de Stevia rebaudiana Bertoni foi estudado. A maior porcentagem de formação de brotações
(89,6%) foi obtida com 1 mg L − 1 da concentração de ZnO NP. Além disso, os resultados da HPLC mostraram
um aprimoramento significativo dos glicosídeos de esteviol (quase o dobro em comparação com o controle) em
brotos micropropagados, cultivados sob estresse oxidativo de 1 mg L-1 de ZnO NPs. No entanto, as atividades
antioxidantes, a formação de metabólitos secundários e os parâmetros fisiológicos mostraram um declínio
repentino após cruzar o limiar de concentração de 1 mg L-1 de ZnO NPs e cair para um mínimo de 1000 mg L-1
(Javed et al. 2017 )
Foi estudado o efeito das NPs de óxido de cobre (CuO) (biossintetizadas via extrato foliar de Azadirachta indica
na calogênese e regeneração de variedades de Oryza sativa L.). Os autores usaram o meio N6 e concentrações de
1 a 20 mg L-1 e, como resultado, descobriram que os CuO-NPs exibem resultados muito promissores contra a
indução de calos e as concentrações de 15 a 20 mg L-1 aumentaram a organogênese (Anwaar et al. 2016 )
Diferentes concentrações (1: 2, 1: 3, 2: 1 e 3: 1) de NPs de prata e ouro sozinhas ou combinadas com ácido
naftaleno acético (NAA) em meio MS foram avaliadas quanto ao desenvolvimento da cultura de calos em
Prunella vulgaris L. mostraram que os NPs de prata (30 μg L − 1), NPs de prata e ouro (1: 2) e NPs de prata e
ouro (2: 1) em combinação com NAA (2,0 mg L − 1) melhoraram a proliferação de calos (100% ) em
comparação com o controle (95%) (Fazal et al. 2016).
A adição de NPs de prata no meio MS foi avaliada quanto à indução de calos em Solanum nigrum L. Diferentes
concentrações de NPs de prata aquosos foram usadas no meio MS (0, 2, 4 e 8 mg L-1). No tratamento controle
(sem NPs de prata), foram obtidos calos compactos com cor branca e esverdeada após 10 dias, enquanto calos
friáveis e aquosos com cor branca, esverdeada ou amarelada foram observados após 10 a 13 dias na cultura
suplementada com NPs de prata. Também quando NPs de prata foram adicionados ao meio, o peso fresco de
calos e a intensidade da formação de calos aumentaram, mas foram encontradas deformações na morfologia dos
calos, especialmente com concentrações mais altas de NPs (Ewais et al. 2015). Para a indução de calos a partir
do explante foliar, também foi investigado o efeito de nanotubos de carbono de paredes múltiplas (25–500 mg
mL − 1) com meio B5, e o crescimento foi significativamente melhorado na concentração de 25 a 50 mg mL − 1,
mas concentrações mais altas (100–500 mg mL − 1) diminuíram a biomassa de calos (Ghorbanpour e Hadian
2015).
Kokina et al. (2013) trabalharam com um método para a entrega direta de NPs metálicos (ouro e prata) para
calos de linho e regeneram células por deposição a vácuo de nanocamadas metálicas no hormônio em pó,
seguida pela dispersão do hormônio metal combinado no meio MS e pela penetração e a localização dos NPs nos
calos e nas plantas regeneradas foi confirmada por espectroscopia de absorção óptica e microscopia eletrônica de
varredura. Foi encontrado um efeito significativo de ambos os NPs no tipo de regeneração dos calos de linho. A
inclusão de NPs de ouro e prata no meio MS aumentou a embriogênese (70% e 50%, respectivamente), mas o
mecanismo pelo qual os NPs de ouro melhoram a embriogênese ainda não está claro e precisa de mais pesquisas.
NPs de óxido de ferro (Fe3O4) (diâmetro de 6 nm com concentrações de 2,01 a 33,5 mg L − 1) no meio MS
foram utilizados para avaliar processos como crescimento celular, desdiferenciação e embriogênese no sistema
modelo in vitro Daucus carota L. Os resultados mostraram que a exposição ao Fe3O4 NP de 2,01 a 6,70 mg L-1
afetou levemente o crescimento, o índice mitótico e a desdiferenciação, e a 20,10 mg L-1 o crescimento celular e
o índice mitótico relativo caíram drasticamente e pararam completamente em 33,5 mg L-1 (Giorgetti et al.
2011).
De todas as pesquisas citadas, é possível concluir que os PN influenciam positiva ou negativamente, dependendo
da concentração utilizada, plântulas, proliferação de calos, multiplicação de brotações e embriogênese somática,
mas ainda há muito a ser investigado para elucidar o mecanismo de PN. açao.
Várias pesquisas foram desenvolvidas com plantas in vitro para a produção de metabólitos secundários usando
NPs. A presença de NPs de prata no meio MS para regeneração de Vanilla planifolia induziu a produção de ERO
(espécies reativas de oxigênio) e aumentou o conteúdo fenólico total, a capacidade antioxidante e a peroxidação
lipídica com 25 e 50 mg L − 1 (Spinoso- Castillo et al., 2017).
NPs de cobre (Cu) e cobalto (Co) foram utilizados na cultura de tecidos de Mentha longifolia
(L) plantas para avaliar o teor de óleo em concentrações de 0,5 mg L -1 e 0,8 mg L -1, respectivamente. As
soluções foram adicionadas ao meio nutriente MS e o teor de óleo com Cu 0,5 mg L -1 foi superior a 0,1%;
linalol (91,335%) e acetato de linalil (4689%) têm o maior conteúdo no óleo essencial das plantas de controle.
Além disso, no óleo essencial de M. longifolia em MS com Co 0,8 mg L-1 de 39 componentes individuais, 18
deles são apresentados em conteúdo superior a 0,1% e 21 deles em conteúdo inferior a 0,1%; linalol (93,003%) e
acetato de linalil (1568%) têm o maior conteúdo no óleo essencial das plantas de controle (Talankova-Sereda et
al. 2016).
Bhat e Bhat (2016) estudam o uso de NPs de prata em Capsicum frutescens L. que foram cultivadas em meio
MS para formação de calos, e determinou-se a elicitação do metabólito secundário capsaicina. Como resultado,
NPs de prata com 3 mg L-1 adicionados a um
A suspensão de células de C. frutescens aumentou em duas vezes o conteúdo de capsaicina. Javed et al. (2017)
relataram o efeito das NPs de óxido de zinco (0, 0,1, 1,0, 10, 100 ou
1000 mg L − 1) (34 nm de tamanho) na produção de glicosídeo de esteviol (rebaudiosídeo A e esteviosídeo) e
atividades antioxidantes na cultura de tecidos de rebentos de Stevia rebaudiana Bertoni. Os materiais iniciais
foram segmentados nodais que foram cultivados em meio MS sem reguladores de crescimento. A concentração
de 1 mg L-1 de NPs de óxido de zinco aumentou a capacidade antioxidante total, o poder redutor total, o teor
total de flavonóides e o conteúdo fenólico total. No entanto, as atividades antioxidantes, a formação de
metabólitos secundários e os parâmetros fisiológicos mostraram um declínio repentino após cruzar o limiar de 1
mg L-1 de concentração de NPs de óxido de zinco e cair para um mínimo de 1000 mg L-1. Os mesmos NPs
(óxido de zinco) em diferentes concentrações (0, 10, 25, 50, 75 e 100 mg L-1) e ácido húmico (HA; 0, 50, 100,
500 e 1000 mg L-1 ) foram adicionados ao meio MS com o explante Lilium ledebourii Baker, com o objetivo de
avaliar o conteúdo total de fenol, antocianina e flavonóides. Os resultados mostraram que os teores totais de
fenol, flavonóide e antocianina foram significativamente afetados (P ≤ 0,01). O teor fenólico máximo das
plântulas foi obtido no meio contendo 75 mg L − 1 de NP de óxido de zinco; o maior teor de antocianina foi
observado em plântulas tratadas com AH a 100 mg L-1, e o maior conteúdo flavonóide medido nos
comprimentos de onda 270, 300 e 330 nm foi obtido com NPs de óxido de zinco a 25 mg L-1 e óxido de zinco
NPs em 25 mg L-1 combinados com HA em 100 mg L-1, respectivamente (Chamani et al. 2015).
Raei et al. (2014) obtiveram calo do segmento de Aloe vera L. em meio MS suplementado com ANA (1 mg L-
1). A cultura de suspensão foi preparada suplementada com NPs de prata (0,625 mg L-1), óxido de NPs de
titânio (120 mg L-1), nitrato de amônio e sacarose para avaliar o conteúdo de aloína. Aloína é o metabólito
secundário mais importante em A. vera, não apenas pelas propriedades medicinais e cosméticas, mas também
por seu papel fisiológico. O conteúdo de aloína foi aumentado com elicitores NP 48 horas após o tratamento e
diminuiu gradualmente depois disso.
NPs de óxido de alumínio (˂50 nm; 0, 10, 20, 50 e 100 μg mL − 1) foram utilizados em meio MS com o objetivo
de estudar os efeitos de NPs na cultura de suspensão de células BY-2 do modelo de células vegetais. A aplicação
de NPs de óxido de alumínio na concentração mais baixa (10 μg mL − 1) diminuiu significativamente a
viabilidade celular, que foi de 77% após um tratamento de 96 horas. Na concentração mais alta (100 μg mL − 1),
a aplicação dos NPs diminuiu significativamente a viabilidade celular em menos de 24 horas (cerca de 84%). No
final do experimento, a viabilidade das células BY-2 era de apenas 22%. Os NPs estudados também aumentam o
conteúdo fenólico nas células BY-2 de 109,6 μg g − 1 FW para a menor concentração de NPs (10 μg mL − 1)
para 211,7 μg g − 1 FW para a maior concentração (100 μg mL − 1 ); para o controle (sem PN), 77,7 μg g − 1 de
FW foram detectados (Poborilova et al. 2013).
Toda a pesquisa mencionada demonstrou a importância do uso de NPs como elicitor secundário de metabólitos
na cultura de tecidos vegetais.