A ulas Práticas do

Laboratório de
M icrobiologia

P rim eiro Sem estre

HAMILTON R. F. BAVUTTI
BAVUTTI 2012
HUMBERTO VALVASSORI
MARIA RAQUEL MANHANI
 BIOSSEGURA
BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de EPI: avental de

mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos
fechados ou pró-pés;
2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem;
3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele;
4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho –
eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação;
5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura
figura 1),
1 que deverá estar acesa durante a maior parte
do tempo;
6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra
similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!);
7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o
que fazer, a cada passo;
8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não
pegar mais material que o necessário nem material indevido;
9. Todo o material deve ser devidamente identificado;
10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas:
11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas;
12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto;
13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante,
lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar;
14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do
trabalho;
15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser
autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado;
16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório;
17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino
embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão.

Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no

laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas:

• Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o
mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível;
• Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o
trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;

Figura 1 – Bico de Bunsen

2
 • Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente; eles devem ser
mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen, na posição mais horizontal possível e deve ter sua
“boca” novamente flambada antes de ser fechado. Quando você flamba o tubo, o calor cria uma
corrente de convexão, que força o ar para fora, impedindo a entrada de contaminantes;

• Os tampões de algodão ou roscas dos frascos

frascos não podem ser largados nem colocados sobre
nenhuma superfície;
superfície devem permanecer na mão do operador, entre o dedo mínimo e a palma da
mão durante todo o procedimento

• Durante as manipulações, as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em
contato com o ar o menor tempo possível;

• As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos
estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis
como, por exemplo, panos, superfície da bancada, paredes externas de placas ou tubos, etc.

1. Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-

níquel-cromo

alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior, como se faz com um lápis
(dedo polegar, indicador e médio), num ângulo próximo à posição vertical. Essa posição deixa o dedo
mínimo livre para segurar os tampões dos tubos.

alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em
determinações quantitativas.

"Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça, pois depois do uso em culturas, o
aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Deve-se
proceder da seguinte maneira:

1. Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama - essa é a região "fria" da chama;
2. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama, acima do cone azul claro,
mantendo-a até que fique completamente vermelha;
3. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro");
4. Esfriar a alça no ar, mantendo-a na mão, sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se
contamine outra vez); alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo
ou placa de Petri (regiões estéreis);
5. Usar imediatamente;
6. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso.
Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2.

3
 Segure a alça como se
fosse um lápis, quase na
vertical

Posicione a ponta na
região fria da chama

Esfrie no ar, próximo Aqueça gradualmente

à chama toda a extensão "ao
rubro"

Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação

2. Flambagem de tubos e frascos

• Afrouxe o tampão do frasco ou tubo, para que ele saia facilmente;

• Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita,
mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão, rode o frasco e
não o tampão - o tampão fica fixo);
• Passe a boca do tubo para frente e para trás, dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso,
não se esqueça, o tampão fica preso na mão do operador;
• Depois de usar, antes de fechar, repita a operação acima;
• Feche o tubo, recolocando o tampão, rodando o tubo e não o tampão.
A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3.

4
 Remova o tampão com
o dedo mínimo

Segure o tampão entre o

dedo e a palma da mão

Passe a boca do tubo

dentro da chama

Recoloque o tampão,
girando o tubo

Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos

3. Manuseio de pipetas

• As pipetas graduadas ou de Pasteur, com algodão na ponta, previamente esterilizadas,

acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser
manuseadas na frente do bico de Bunsen;
• Segurá-las pela região do bocal, como um lápis, colocando o aspirador e mantendo o dedo
mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido;
• Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos;
• A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante, imediatamente após o
uso, para ser transportada.

5
 PREPARO DE MATERIAL DE LABORATÓRIO
LABORATÓRIO PARA ANÁLISES
MICROBIOLÓGICAS

I - INTRODUÇÃO

A preparação do material de laboratório para utilização em análises microbiológicas envolve

todas as atividades para garantir que os frascos, utensílios, instrumentos e vidraria destinados ao
contato com amostras se encontrem devidamente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e
biológicos, no momento das análises. Este trabalho envolve a descontaminação, descarte de resíduos
contaminados, lavagem, acondicionamento e esterilização.

a) Descontaminação
Descontaminação e descarte de resíduos contaminados
Todo material proveniente de análises microbiológicas é muito contaminado, um vez que os
métodos analíticos promovem a multiplicação dos micro-organismos presentes, elevando seu número
em vários milhares de vezes, em comparação com as contagens normalmente encontradas nas
amostras. Esse material não inclui somente os meios de cultura, onde foi obtido o crescimento
microbiano, mas também toda a vidraria e demais utensílios que tenham entrado em contato com os
micro-organismos. Para a descontaminação, deve-se submeter todo o material à esterilização em
autoclave, a 121o C por 30 minutos, observando-se os seguintes cuidados:
 afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca;
 adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os
resíduos e facilitar a posterior remoção.

b) Lavagem
É uma etapa fundamental no preparo do material de laboratório, principalmente quanto à
escolha dos detergentes e aos métodos de enxágüe.
Os detergentes mais utilizados são aniônicos, principalmente aqueles que contêm substâncias
alcalinas como silicatos, carbonatos ou fosfatos.
O enxágüe dos utensílios deve ser feito de maneira que garanta a completa remoção dos
resíduos de detergente ou outro agente de limpeza empregado. Os resíduos podem interferir
negativamente nos resultados das análises. São necessárias entre seis e doze enxágües sucessivos em
água corrente, seguidos de pelo menos um enxágüe em água destilada. Procedimento para lavagem:
1. A remoção de todo o material descontaminado presente nos frascos e utensílios deve preceder
à lavagem. Meios de cultura sólidos devem ser removidos das placas com espátula e quando contidos
em tubos e outros frascos de boca estreita, devem ser aquecidos até fusão e vertidos em recipiente para
posterior solidificação e descarte.
2. Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho por 2 horas ou um pouco
mais. Fazer uma pré-lavagem dos frascos e utensílios em água corrente (com isso evita-se o
desenvolvimento de maus odores nas bacias de lavagem). Os tubos de Durhan devem ser colocados de
molho em frasco separado, resistente ao calor e submetidos a vapor fluente por 15 minutos, para
remoção dos resíduos de meios de cultura. Remover o algodão do bocal das pipetas antes de deixá-las
de molho.
3. Com auxílio de esponjas e escovas, esfregar os frascos e demais utensílios, removendo
também anotações de lápis e canetas vidrográficas.

6
 4. Enxaguar todo o material em água corrente, por dez vezes. A seguir, enxaguar em água
destilada. Recomenda-se o uso de um lavador de pipetas, onde o enxágüe deve ser contínuo por pelo
menos uma hora.

c) Acondicionamento
a. Placas de Petri: devem ser acondicionadas em estojo porta-placas metálico, em grupos de mesma
dimensão ou embrulhadas em papel Kraft, em grupos de até 10 placas.
b. Pipetas: preenher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta-pipetas metálicos, em grupos
de mesma capacidade, com as pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do estojo. Colocar um
chumaço de gaze ou algodão no fundo do estojo para proteger as pontas das pipetas. Alternativamente,
embrulhar individualmente em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que
deve ser aberta no momento da análise.
c. Tubos de ensaio vazios: fechar com tampão de algodão ou com as respectivas tampas, no caso de
tubos rosqueáveis. Acondicionar em grupos, em cestas apropriadas, lembrando-se de afrouxar as
tampas dos tubos de rosca. Cobrir a parte superior dos tubos com papel Kraft e amarrar com barbante.
d. Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: embrulhar individualmente em papel Kraft,
lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.

d) Esterilização
Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras,
etc) pode ser esterilizado em estufa a 170oC por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos. Ao
sair da autoclave, o material deverá ser seco em estufa.

Preparo de vidraria nova

nova para ser colocada em uso
Mergulhar e manter por 24 horas em água destilada. Enxaguar em água destilada e realizar teste
de pH, antes do uso.
Tampas de plástico ou de borracha devem ser mergulhadas em água destilada, autoclavadas a
121o C por 15 minutos e enxaguadas em água destilada para remoção de resíduos tóxicos.

Teste para verificação da eficiência da lavagem e enxágüe

Verificação de pH:
Escolher aleatoriamente alguns frascos de uma batelada de material lavado e adicionar algumas
gotas de solução de 0,04% de azul de bromotimol, observando a cor. Em pH neutro, a solução mantém-
se verde, em condições ácidas (pH < 6,5) ocorre viragem para amarelo e em pH alcalino (pH > 7,3)
ocorre viragem para azul. Tiras de papel indicador de pH também podem ser utilizadas.

7
 MICROB 01 - MANOBRAS ASSÉPTICAS

I - INTRODUÇÃO

As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de micro-organismos onde estes não
são desejados, ou seja, garantem a boa assepsia. Estas impedirão que micro-organismos presentes
no ar ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira, venham a contaminar materiais
estéreis do laboratório como meios de cultura, soluções e equipamentos ou, ainda, culturas puras de
micro-organismos. Também impedem que os micro-organismos com que estamos trabalhando nos
contaminem ou ao ambiente.

As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente:

1. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção, para reduzir o número

de potenciais micro-organismos contaminantes.
2. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*, ou seja, os recipientes (tubos de
ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da
chama do bico, sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras.
3. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação.
4. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança,
preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura.
5. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo micro-organismos ou meio estéril,
imediatamente após abri-los, ou antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a
bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha
durante a inoculação.
Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4.

6. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança, flambá-la rapidamente e mantê-la

nesta região durante todo o trabalho.

* Operações com micro-organismos patogênicos que podem gerar aerossóis, como por exemplo,
agitação intensa, centrifugação, seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana
devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas
devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5).

II - MATERIAL NECESSÁRIO

- pipetador
- pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar
- estante para tubos
- tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura
estéril)
- tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril)
- alça de platina ou de níquel-cromo
- tubos de ensaio vazios

8
 - Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura
estéril), com tampão de algodão
- bico de Bunsen
- placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar

III - OBJETIVOS
1. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais
frequente em Microbiologia.

2. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas.

3. Desenvolver habilidade de: a. manipular tubos contendo meios estéreis, b. realizar diluições
seriadas, c. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas.

IV - PROCEDIMENTOS

Parte A. Mostrar a vidraria principal (pipetas, placas, tubos, etc) e outros objetos de frequente
manipulação (alça, agulha de inoculação, bico de Bunsen, etc).

Parte B. Treinamento de manobras assépticas

- Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados

1. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.

2. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir, a

válvula da tubulação de gás).

3. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. (Atenção! Este

procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen).

4. Distribuir 1 mL de solução de corante, contida em um tubo, para outro tubo vazio, usando
pipeta estéril de 1 mL. (Atenção!
Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de
corante, imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre
a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha
durante a inoculação; este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de
Bunsen). Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica.

- Realização de diluições seriadas

1. A partir do tubo contendo solução de corante, transferir, com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL,
de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen), 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. Agitar
suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. A partir deste tubo, transferir 1 mL
para outro tubo contendo 9 mL de água, agitando suavemente. Deste último tubo, transferir 1 mL para
outro tubo contendo 9 mL de água.

- Transferência
Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri

1. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.

2. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir, a

válvula da tubulação de gás).

9
 3. Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen.

4. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada

uma das placas. (Atenção!
Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de
corante, imediatamente após abri-lo, ou antes de fechá-lo. Repetir quantas vezes forem necessárias
até se obter domínio da técnica.

Figura 4 - Manobras assépticas. Fonte: VERMELHO (2006)

Figura 5 - Esterilizador de alças e agulhas

V – Questões
Questões para fixação de conhecimento

1. Quais os principais objetivos das manobras assépticas?

2. Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de

contaminação ambiental, do operador e do material em estudo.

3. Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado?

10
 MICROB 02 - COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA

I - INTRODUÇÃO
As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos:
Tamanho: as bactérias são microscópicas, medindo desde 0,3 por 0,8 µm até 10 por 25 µm. Sendo
assim, não é possível visualizá-las a olho nu, precisando de um microscópio óptico comum.

Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:
 Cocos: células esféricas;
 Bacilos: células cilíndricas, em forma de bastonetes;
 Espirilos: células espiraladas. Algumas células comportam-se como bacilos curvos, que podem
ser denominados víbrios. Entre as bactérias espiraladas, existem as espiroquetas, as quais são
células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão.

Arranjo:
Arranjo grupamentos bacterianos. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as
bactérias continuam unidas, podem aparecer os seguintes arranjos:
- Cocos:
Divisão em um plano:
- Aos pares: diplococos
- Em cadeias: estreptococos

Divisão em dois planos:

- Tétrades

Divisão em três planos:

- Feixes cúbicos: sarcina
- De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos)

- Bacilos e Espirilos:
Apresentam-se, em geral, como células isoladas, porém, ocasionalmente, pode-se observar: bacilos aos
pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).

Coloração de Gram
Em 1884, o médico dinamarquês Christian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes
histológicos com violeta de genciana, através do método de Ehrlich (1882), que bactérias que eles
continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele
adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica) e estabeleceu, a partir daí,
uma nova metodologia de coloração diferencial.
Ao longo desses anos, o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. Surgiram
muitas modificações, contudo sem afetar substancialmente a idéia original.
O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular, sendo que as
Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos, e as Gram-negativas,
uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de
lipoproteínas, fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração de Gram, o
tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou
permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal
11
violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular
das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode
ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de
bactérias. Nas bactérias Gram-positivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo
álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de
peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem
suficientemente grandes, mesmo após tratamento com álcool-acetona, possibilitando a extração do
complexo CV-I.
De acordo com Trabulsi (2008), na etapa diferencial com álcool-acetona, as bactérias Gram-
negativas, devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta
camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo
corado extraído pelo álcool, que deixa as células descoradas.
A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. As culturas jovens
respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar
com Gram variável, pela perda da capacidade de retenção do corante. Enzimas líticas, excretadas
normalmente por culturas envelhecidas, podem causar danos à parede celular, como por exemplo,
alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal
violeta poderá ser retirado da célula.

Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-

gram-positivas e gram-
gram-negativas
Soluções e ordem de aplicação Reação e aspecto das bactérias
Gram-positivas Gram-negativas
1 – Cristal violeta Coradas em violeta Coradas em violeta
2 – Solução de lugol Formação do complexo CV- Formação do complexo CV-
I no interior da célula, que I no interior da célula, que
permanece violeta permanece violeta
3 – Álcool-acetona Desidratação da parede Extração dos lipídeos da
celular, diminuição da parede celular, aumento da
porosidade e da porosidade; o complexo
permeabilidade;o complexo CV-I é removido da célula
CV-I não pode sair da
célula, que permanece
violeta
4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada, A célula adquire o corante,
permanecendo violeta tornando-se vermelha.

II - OBJETIVOS
Executar a técnica de coloração de Gram, relacionar a composição da parede celular das
bactérias com os corantes de Gram, classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram, verificar
a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico, citar as formas das
bactérias e descrever seus arranjos.

12
III – MATERIAL

- Culturas de micro-organismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, etc)

mantidas em meio de cultura líquido ou em meio sólido.
 Cristal violeta para Gram
 Solução de Lugol
 Solução de fucsina ou de safranina para Gram
 Solução de álcool-acetona
 Solução salina fisiológica
 Microscópio óptico
 Bico de Bunsen
 Alça e agulha de inoculação
 Pinça
 Lâminas para microscopia
 Lenços de papel absorvente
 Óleo de imersão

IV – MÉTODO
As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6.

a) Preparação de esfregaço de micro-

micro-organismos
organismos

A partir de meio líquido:

1. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril, colocar duas alíquotas de cultura
bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia;

2. Espalhar sobre a lâmina, fazendo movimentos circulares de dentro para fora;

3. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente;

4. Em seguida, realizar a fixação, passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen;

5. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração.

A partir de meio sólido:

1. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina, com auxílio de
uma alça de platina;

2. Flambar a alça, esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano, fazendo uma suspensão homogênea;

3. Flambar novamente a alça;

4. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente;

5. Em seguida, realizar a fixação, passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen;

6. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração.

b) Técnica de coloração de Gram

1. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar o corante na
pia;
13
2. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol, aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o
corante na pia;
3. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca
de 30 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
4. Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina e secá-la ao ar
(sem esfregá-la).
5. Observar ao microscópio, com objetiva de imersão.
6. Desenhar as estruturas e arranjos observados.

Figura 6 - Seqüência de preparação de esfregaço.

Fonte: VERMELHO (2006)

14
V – Questões para fixação de conhecimento

1. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço.

2. Qual a importância de se realizar a fixação?

3. Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram.

4. As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram, na qual o operador

deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio?
Explique.

15
 MICROB 03 - COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD
MÉTODOD DE
WIRTZ

I – INTRODUÇÃO

Uma característica importante, tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de

bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação.
Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo, no
interior de uma célula bacteriana. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e
fisiologicamente da célula que o originou. Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem
genética, que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias, mostrando um aumento de
resistência ao calor, dessecação, congelamento, alterações químicas e radiações.
Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o
citoplasma celular. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa, desidratada é
aquecida em um meio aquoso. Elas manifestam grande resistência ao calor. Mas esta não é a única
propriedade associada ao fenômeno.
A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). Por esta razão,
uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através
de um microscópio ótico de contraste de fase.
As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes
comuns, tais como cristal violeta, azul de metileno. Isto, indubitavelmente, é reflexo da característica
particular de seu envoltório. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico,
substância ausente na estrutura de células vegetativas. Normalmente, o ácido dipicolínico encontra-se
na forma de sal – dipicolinato de cálcio, devido à grande quantidade de cátions Ca2+ na célula. O
material genético, cromossomo, está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da
própria membrana interna da forma vegetativa, dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de
desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas.
A esporulação é um processo demorado, o qual pode levar horas para se completar, dependendo
das condições de cultivo. Uma vez formado, o esporo pode permanecer estável por muitos anos, sem
uma fonte externa de nutrientes. Quando colocado em um meio de cultivo adequado, pode até ser
ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar.
É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular
bacteriana. Do ponto de vista morfológico (forma, tamanho, localização intracelular) os esporos
desempenham importante papel na sistemática bacteriana, pois estes detalhes não são muito repetidos
nas várias espécies.
Existem esporos ovais e esféricos, localizados no corpo da célula vegetativa em posição central,
subterminal ou terminal, e com dimensões variadas, que vão de valores que permitem a inclusão do
esporo no corpo celular até dimensões maiores, causando deformações nas células.
Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908), o qual
emprega o verde malaquita e safranina, como corante e contra-corante, respectivamente. Neste método,
o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. O
contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos.

16
II – OJBJETIVOS

Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos.

Identificar através da coloração, a presença, dimensão, forma e localização celular de esporos em
bactérias.

III - PROCEDIMENTO
1. Em uma lâmina limpa, preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida
há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja).
2. Deixar secar ao ar naturalmente;
3. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes);
4. Deixar esfriar;
5. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até
desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a
100o C por 5 a 10 minutos). Não deixar a preparação secar, acrescentando mais corante;
6. Deixar esfriar;
7. Lavar em água corrente;
8. Corar rapidamente, por 30 segundos, com uma solução aquosa de safranina a 1%;
9. Lavar em água corrente;
10. Deixar secar;
11. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão).

IV - INTERPRETAÇÃO
 Células vegetativas: cor vermelha
 Endosporo: cor verde
 Bactérias não esporuladas: cor vermelha
 Esporos bacterianos livres: cor verde

Anotar os resultados, em relação à forma, dimensão e localização intracelular do esporo.

 Aspecto do bacilo: normal ou dilatado

 Forma do endósporo: oval ou esférico
 Localização do endósporo: central, subterminal ou terminal

V – Questões para fixação de conhecimento

1. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários
dias em meio de cultura.
2. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos?
3. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos?

17
4. Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus
subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo, que estruturas seriam observadas
na lâmina após a coloração?

18
 MICROB 04 - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

I - INTRODUÇÃO

Até cerca de 1880 os micro-organismos eram cultivados em meios líquidos, quando Robert Koch
e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies
isoladas (culturas puras), separando-as de espécies contaminantes.
Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que
fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de micro-organismos fora do seu meio
natural. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos micro-organismos, existem vários tipos de
meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso
fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos micro-organismos, tais como pH,
pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia), dentre
outras.
Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos,
sólidos quando contêm
agentes solidificantes, principalmente ágar entre 1 e 2%. O ágar é um polímero - sulfato de ácido
poligalacturônico, extraído de várias espécies de algas, principalmente do gênero Gellidum, cuja função
é solidificar os meios de cultura. Geralmente, a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. Os meios
semi-
semi-sólidos contêm de 0,075 a 0,5 %, de ágar, dando uma consistência intermediária, de modo a
permitir o crescimento de micro-organismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da
motilidade e também para conservação de culturas; os meios líquidos,
líquidos não contêm agentes
solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de
micro-organismos, provas bioquímicas, dentre outros.
Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em
naturais ou complexos,
complexos quando emprega ingredientes com composição química não definida,
definida tais como
extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne,
cérebro, fígado, caseína, etc.) e de micro-organismos (levedura) e artificiais,
artificiais sintéticos ou ainda
quimicamente definidos quando a composição química
química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa)
e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos micro-organismos, em fontes de
carbono, nitrogênio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando então são conhecidas as
necessidades nutricionais específicas. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos)
ou complexos.

Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer, contudo, nenhuma
exigência em especial (Ex. caldo e ágar simples).

Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados micro-organismos, como meio de
infusão de cérebro e coração, ágar sangue, ágar chocolate (ágar simples fundido, adicionado de sangue
e aquecido a 80°C), meio de carne cozida (com fragmentos de fígado - para anaeróbios), meios Shahidi
Ferguson Perfringens (SFP), Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) , Baird-Parker (com gema de ovo) (meios
ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas), etc.

De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica, os meios especiais podem ser

classificados em:

19
Meios de pré-
pré-enriquecimento - são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de micro-
organismos injuriados, ou seja, para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou
químico). Ex. água peptonada tamponada, caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos).

Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de micro-

organismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como micro-
organismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de
determinados micro-organismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de
outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos), Caldo
Tioglicolato para Clostridium perfringens.

Diferenciais - quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre micro-organismos
muito parecidos, tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes), Ágar
MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias, Ágar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e
diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).

Seletivos - os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de

micro-organismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios com telurito de potássio (para
isolamento de Corynebacterium diphtheriae), ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey, meios
com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de
sódio, meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibióticos para
isolamento de diversos micro-organismos (TSC, SFP, etc.). A maioria deles é também diferencial,
permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos micro-organismos.

Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e
identificação perfunctória ou presuntiva de muitos micro-organismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio
Escola Paulista de Medicina – EPM, meio motilidade, indol, lisina – MILi, caldo ou ágar uréia, etc.)

Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de

organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação, ágar citrato, caldo nitrato, meio
semi-sólido, caldo triptofano, meio de sulfito indol motilidade, etc.

Dosagem - empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos.

Contagem - empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem

padrão em placas – PCA, ágar triptona de soja – TSA, ágar batata dextrose - PDA, ágar Baird-Parker,
etc.)

Estocagem ou manutenção - utilizados para conservação de micro-organismos no laboratório, ou seja,

garantem a viabilidade de micro-organismos (ágar Sabouraud, para fungos; meio com leite; ágar
sangue, ágar simples; ágar triptona de soja; meio semi-sólido, etc).

II – OBJETIVOS

Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e

líquidos, de diluentes, além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização.

20
III - PROCEDIMENTOS

A. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral

1. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL, pesar quantidade necessária para o

preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou
Ágar Triptona de Soja - TSA) e adicionar 100 mL de água destilada, com auxílio de proveta;

2. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen), agitando freqüentemente com auxílio de
bastão de vidro, até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido);

3. Adicionar tampão de algodão e gaze, proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar);

4. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos;

5. Após a esterilização, armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da
luz).

B. Preparação de meio de cultura líquido – caldo

caldo triptona e soja

1. Em um béquer de 150 mL, pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja
– TSB e adicionar 100 mL de água destilada. Com auxílio de um bastão de vidro, agitar até completa
dissolução do meio e cultura;

2. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa
rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos);

3. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo, um béquer de vidro ou lata de

alumínio), protegendo-os com papel manilha ou kraft;

4. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos.

5. Após esterilização, armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.

Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma, porém se for necessário utilizar
algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios
(aminoácidos, açúcares), as mesmas são esterilizadas à parte por filtração, através de membranas (de
nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0,22µm de diâmetro (Millipore, Sartorius), e depois
incorporadas, assepticamente, ao meio previamente esterilizado.

C. Preparação de solução fisiológica (0,85% de NaCl)

NaCl estéril

1. Em um béquer de 250 mL, pesar 0,85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água
destilada. Com auxílio de um bastão de vidro, agitar até completa dissolução;

2. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa
rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos);

3. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo, um béquer de vidro ou lata de

alumínio), protegendo-os com papel manilha ou kraft;

4. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos.

5. Após esterilização, armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.

21
D. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização

1. De acordo com orientação de seu professor, embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2
mL em papel manilha (ou similar);

2. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos
(neste caso, o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado);

3. Após esterilização, armazená-lo em lugar seco.

IV – Questões para fixação de conhecimento

conhecimento

1. De acordo com o estado físico, como os meios de cultura são classificados?

2. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais.

3. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas.

4. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC?

22
 MICROB 05 - ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE

I – INTRODUÇÃO

A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais, como meios

de cultura e instrumentação cirúrgica, através de calor úmido (vapor d’ água). Funciona sob altas
pressões e temperaturas, exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. A figura

II – OBJETIVOS
Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual, de acordo com as
normas de segurança.

III - PROCEDIMENTO
1. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave.
2. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave.
3. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes
de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles).
4. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança.
5. Ligar a autoclave, deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo.
6. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor
condensado.
7. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira, indicando que o ar quente foi expulso e a
câmara está saturada de vapor, fechar a válvula.
8. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas
(geralmente: 1 atm e 121ºC, respectivamente).
9. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas, reduzir a velocidade de aquecimento e
marcar o tempo de esterilização (geralmente, 15 minutos). Atenção!!! Não deixar que haja
oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave)
para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão.
10. Após o tempo de esterilização, desligar o equipamento.
11. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor).
12. Com auxílio de luvas de cano longo, abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total
do vapor.
13. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente, levantar a tampa.
14. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado.

b.
a.

Figura 7 - Autoclave vertical. a. cesto; b. resistência para aquecimento da água e geração de vapor 23
MICROB 06 - ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA
HUMANA

1 - OBJETIVOS
1. Aplicar as técnicas de manobras assépticas.
2. Verificar a presença de micro-organismos em partes do corpo humano, superfícies e ar.

2 - PROCEDIMENTOS

1. Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em
banho-maria em placas de Petri estéreis. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de
cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação);

2. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas;

3. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório,
elevador, rampa, saguão, etc) durante 15 minutos;

4. Com as placas restantes, realizar algumas das seguintes opções:

• Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e, em seguida,

espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!);

• Fazer o mesmo em outro tipo de superfície;

• Com auxílio de um swab, retirar material de partes do corpo humano: saliva, língua, ouvido,
superfície das mãos, região inferior da unha, nariz e, em seguida, espalhá-lo na superfície dos
meios de cultura;

• Depositar alguns fios de cabelo, unhas sobre os meios de cultura;

• Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura;

• Soprar, tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios;

• Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns

segundos.

5. Incubar as placas a 35º C por 48 horas.

III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura, com diferentes
tamanhos, aspectos, cor.

2. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos.

3. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram.

4. Descrever as características (morfologia, arranjo, gram) das colônias submetidas à coloração.

IV – Questões para fixação

fixação de conhecimento

1. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril
nas placas de Petri?
2. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente
em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações?
24
 MICROB 07 - AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO DE SUPERFÍCIES ATRAVÉS
DE MÉTODOS RÁPIDOS – PETRIFILMTM E RODAC

I - Introdução
Introdução

PetrifilmTM (3M Company é uma modificação da contagem de Unidades Formadoras de Colônias

(UFC) em placas, composto por dos filmes estéreis reidratáveis, impregnados pelo meio de cultura e por
substâncias geleificantes solúveis em água fria.
A inoculação é feita no filme inferior que, depois de inoculado, é coberto com o filme superior. O
inoculo é espalhado com um difusor plástico, por leve pressão manual e, depois da solidificação do gel,
as placas são incubadas para desenvolvimento das colônias.
Existem vários tipos de Petrifilm, destinados ao cultivo de diferentes micro-organismos, como
por exemplo: para contagem de micro-organismos hetrotróficos; bolores e leveduras; coliformes;
Staphylococcus aureus.
O Petrifilm para micro-organismos heterotróficos é suplementado com cloreto de
feniltetrazolium (TTC), indicador que, ao sofrer redução, confere coloração vermelha às colônias,
facilitando sua visualização.
A AOAC – Association of Official Analytical Chemists validou vários tipos de Petrifilm para
coliformes totais e E. coli, com diferentes escopos de aplicação:
- Petrifilm Coliform Count Plate: para coliformes totais;
- Petrifilm High Sensitivy Coliform Count Plate: para coliformes totais em produtos lácteos;
- Petrifilm Rapid Coliform count Plate: para coliformes totais;
- Petrifilm E. coli Count Plate: para coliformes totais + E. coli .
Em todos estes Petrifilm para coliformes, o meio de cultura base é o Vermelho Violeta Bile (VRB),
seletivo para enterobactérias é suplementado com cloreto de feniltetrazolium (TTC) e contém lactose
que, fermentada pelos coliformes ou E. coli, produz bolhas de gás em torno das colônias. As colônias
típicas são vermelhas com bolhas de gás. No Petrifilm para Coliformes + E. coli, o meio contém ainda
BCIG, substrato cromogênico para a β-glicuronidase, que permite diferenciar E. coli pela formação de
um precipitado azul em torno das colônias. O Petrifilm de alta sensibilidade permite a inoculação de
volumes de 5 mL e o Petrifilm para contagem rápida permite a obtenção do resultado em 6 a 14 horas.

A placa de RODAC - Replicate Organism Detection And Counting contém meio de cultura
destinado a diferentes micro-organismos. Quando colocada em contato com a superfície a ser avaliada
(por exemplo: equipamentos, mesas, etc), os micro-organismos são transferidos para a placa. Este
método limita-se a superfícies planas.

II - Procedimento

a) Amostragem da superfície através de swab e inoculação em Petrifilm

1. Umedecer um swab estéril em 10 mL de solução salina estéril contida em tubo de ensaio,
retirando o excesso de líquido apertando o swab contra as paredes do tubo.

2. Amostrar a superfície escolhida com o swab, mantendo-o inclinado a um ângulo de 45º.

25
 3. Recolocar o swab na solução salina (cortar, com auxílio de tesoura, a porção da haste tocada
pela mão do operador) e homogeneizar vigorosamente, para que os micro-organismos se
desprendam do algodão e migrem para a solução salina.

4. Com auxílio de pipeta estéril, transferir 1 mL da solução salina contendo o swab para outro tubo
contendo 9 mL do mesmo diluente (esta é a diluição 10-1).

5. Com auxílio de pipeta estéril, inocular 1 mL das duas diluições da amostra em Petrifilm para
micro-organismos heterotróficos e para coliformes. Para tanto seguir as orientações do
fabricante, apresentadas a seguir: colocar a placa em uma superfície plana, levantar o filme
superior e posicionar a ponta da pipeta perpendicular ao centro do filme inferior. Depositar o
volume de 1 mL e baixar o filme superior sobre o líquido, evitando a formação de bolhas.
Posicionar o difusor plástico sobre o centro do filme superior, com o lado liso para baixo. Com
leve pressão, espalhar o líquido sobre todo o filme inferior. Não arrastar o difusor sobre a placa,
apenas pressionar levemente. Remover o difusor e aguardar 2 a 5 minutos, para total
solidificação do gel.

6. Incubar as placas com o lado transparente para cima a 35º C por 24 horas.

7. Selecionar para contagem as placas contendo entre 15 e 150 colônias.

8. No Petrifilm para heterotróficos, contar todas as colônias vermelhas.

9. No Petrifilm para coliformes, contar apenas as colônias típicas, vermelhas com bolhas de gás.

10. Determinar o número de UFC/mL multiplicando o número de colônias típicas pelo inverso da
diluição.

Figura 08 - Petrifilm Coliform Count Plate

b) Amostragem de uma superfície através do contato com placa de RODAC

Método de RODAC

• Amostrar a superfície, colocando o meio de cultura (Ágar Padrão para Contagem) da placa de
RODAC em contato com a mesma por 30 segundos.

• Incubar a placa a 35oC por 48 horas.

• Contar as colônias por placa e expressar em UFC/cm2.

26
c) Avaliação do grau de higienização de mãos pelo método de esponja

c.1) Amostragem antes da sanitização

1. Colocar 10 mL de solução de água peptonada no interior de um saco plástico contendo uma esponja
de celulose previamente esterilizada em autoclave, hidratando a esponja;

2. Retirar o excesso da solução segurando-a e espremendo-a com a mão envolvida em saco plástico ou
luva estéril;

3. Amostrar a mão direita, passando a esponja umedecida na palma da mão da seguinte forma: passe a
esponja da porção proximal (punho) para a porção distal (dedos) da mão, repetindo este movimento 6
vezes, sempre neste sentido, de modo que toda a palma seja amostrada; depois passe a esponja entre
os dedos; não amostre o dorso da mão.

4. Retornar a esponja no saco plástico original e homogeneíze-a espremendo-a diversas vezes;

5. Retirar 1 mL de líquido e fazer diluições seriadas em água peptonada até 10-2;

6. Plaquear as diluições em ágar para contagem padrão (PCA) pelo método "pour plate"; (item I.1)

7. Incubar as placas a 35oC por 48 horas;

8. Contar o número de colônias (placas com 25 a 250) e calcule o número de micro-organismos

(UFC/mão)

c.2) Sanitização

1. Umedecer as mãos em água corrente;

2. Colocar 5 mL de sanizante sobre as palmas das mãos e esfregá-los durante 15 segundos fazendo 4
movimentos diferentes, repetindo cada movimento 5 vezes, na seguinte seqüência:
a. esfregar as palmas e os dedos juntos;
b. esfregar a palma esquerda sobre o dorso direito;
c. esfregar a palma direita sobre o dorso esquerdo;
d. entrelaçar os dedos.

c.3) Amostragem após a sanitização

Fazer uma amostragem na mão esquerda como no item c.1 (se necessário, usar um diluente com
neutralizante).

27
 MICROB 08 - CONTROLE MICROBIANO – AÇÃO DO CALOR E DA PRESSÃO
OSMÓTICA

I - INTRODUÇÃO

Os micro-organismos podem ter seu desenvolvimento controlado por agentes químicos e físicos,
os quais podem eliminá-los completamente ou impedir seu crescimento.:

II - OBJETIVOS
Avaliar a resistência térmica de diferentes bactérias e o efeito da pressão osmótica sobre estes
organismos.
Avaliar diferentes tipos de anti-sépticos empregados no controle do crescimento de micro-
organismos.

III - PROCEDIMENTOS

Ação do calor
calor
Esta prática deve ser feita para os dois micro-organismos. Cada grupo escolhe uma das cepas
bacterianas: Escherichia coli ou Staphylococcus aureus

Separar cinco tubos contendo caldo triptona de soja ou similar estéril e inocular cada tubo com
duas gotas de cultura bacteriana. Em seguida, os meios inoculados devem ser submetidos às diferentes
condições apresentadas a seguir e incubados a 37o C por 24-48 horas.
- Primeiro tubo: controle (sem aquecimento)
- Segundo tubo: Banho-maria, 100o C, 5 minutos
- Terceiro tubo: Banho-maria, 100o C, 10 minutos
- Quarto tubo: Banho-maria, 100º C, 15 minutos
- Quinto tubo: Banho-maria, 100º C, 20 minutos

Ação da pressão osmótica

Esta prática deve ser feita para os dois micro-organismos. Cada grupo escolhe uma das cepas
bacterianas: Escherichia coli ou Staphylococcus aureus

Separar quatro tubos contendo caldo triptona de soja ou similar estéril com diferentes
concentrações de NaCl (0%, 5%, 10% e 20%) e inocular cada um deles com duas gotas de cultura
bacteriana. Incubar os tubos a 37oC por 24-48 horas. Após este período, realizar interpretação dos
resultados.

Ação de anti-sépticos

Demarcar na placa de Petri, contendo o meio sólido ágar triptona de soja, com caneta para
retroprojetor três regiões distintas: 1, 2 e 3.
- Região 1: pressionar levemente o polegar
- Região 2: lavar o polegar com sabonete comum, deixar secar e pressionar nesta região
- Região 3: aplicar solução anti-séptica em estudo, deixar secar e pressionar nesta região.

Incubar as placas a 37ºC por 48 horas. Após este período, realizar a interpretação dos resultados.

28
IV – Questões para fixação de conhecimento

1. Defina: desinfecção; esterilização; assepsia e anti-sepsia.

2. Como será possível determinar o tempo à temperatura de aproximadamente 100º C necessário para
destruir as células bacterianas em estudo?

3. Após aplicar um anti-séptico nas mãos, deixando-o pelo tempo estabelecido pelo fabricante, toda a
microbiota das mãos será eliminada? Por quê?

29
 MICROB 09 - ISOLAMENTO E CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
MICRORGANISMOS

Introdução

Isolamento de microrganismos para obtenção de culturas puras

Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura pura, as mais
comumente utilizadas são as técnicas de esgotamento e das diluições em placas. Ambas baseiam-se no
princípio de que uma célula microbiana isolada, quando depositada em um meio de cultura sólido
adequado, dará origem ao um agrupamento macroscopicamente visível chamado de colônia. Assim,
colônia é um conjunto de células idênticas que tem como origem uma única célula ou esporo. No caso
particular de bactérias que formam agrupamentos, como os estafilococos e os estreptococos, a colônia
pode ser proveniente de um destes agrupamentos de células semelhantes, ao passo que no caso
específico de bactérias ou fungos filamentosos, a colônia também poderá ser proveniente de um
fragmento de hifa.
A técnica do isolamento em placa tem dupla aplicação, podendo ser empregada tanto para o
isolamento quanto para a contagem de microrganismos.
O esgotamento consiste em semear, com auxílio de uma alça de inoculação, uma porção da
suspensão de microrganismos, fazendo na superfície do meio uma seqüência de estrias não
sobrepostas, que vão das bordas para o centro da placa, em três setores distintos como esquematizado
na Figura 09.a, de maneira que a quantidade de material contida na alça seja progressivamente menor.
Desta maneira, ao final do procedimento, as células microbianas contidas na alça irão se depositar na
superfície do meio separadamente umas das outras. Após incubação por tempo e temperatura
adequados, cada célula isolada dará origem a uma colônia isolada. Na Figura 09.b, observa-se o aspecto
da placa estriada após incubação.
O sucesso do procedimento será garantido levando-se em conta as seguintes observações:
 Realizar o maior número de estrias possíveis.
 Não perfurar ou rasgar o ágar.
 Não voltar com a alça sobre as estrias, sobrepondo-as.
 Iniciar a semeadura com uma pequena quantidade de material na alça de inoculação.
Existem algumas variantes desta técnica, porém o princípio básico é sempre o mesmo, tentar esgotar o
material ao longo das estrias de modo a depositar células isoladas no meio sólido, que darão origem a
colônias isoladas. Cada colônia isolada poderá ser então passada para um meio de cultura novo, de
modo a se obter uma cultura pura, contendo células idênticas que, por exemplo, quando coradas ao
Gram deverão apresentar a mesma morfologia celular e tintorial.

Figura 09 - . Técnica do esgotamento para obtenção de cultura pura. a. modo de espalhamento do

inoculo. b. aspecto da placa estriada após incubação. Fonte: VERMELHO et al. (2006)
30
 Contagem de microrganismos

Os diversos métodos existentes para contagem de microrganismos podem ser divididos em dois
grupos principais, aqueles que quantificam o número de células e aqueles que quantificam a massa
celular. Alguns métodos determinam somente as células viáveis (vivas), enquanto outros determinam as
células totais (vivas e mortas).

Contagem em Placas
Este é o principal método de contagem de células viáveis. É demorado, visto que é necessário
aguarda a multiplicação de uma célula isolada no meio sólido, de modo que esta forme uma colônia
macroscopicamente visível, a ser contada. Pode ser empregado tanto para materiais com alta
concentração microbiana, neste caso sendo utilizado o método das diluições seriadas, como também
para materiais líquidos com pouca concentração microbiana, nos quais o método da filtração é o mais
apropriado.

Método das diluições em placas

Também conhecido como método das diluições seriadas, é empregado tanto para o isolamento
como para a contagem de microrganismos. Pode-se partir de uma determinada amostra, a qual pode
ser solo, alimento, urina ou outro material qualquer. No caso de amostras sólidas, em pó ou muito
viscosas, é feita uma homogeneização inicial, e a partir desta são preparadas diluições sucessivas em
tubos contendo volume conhecido de um determinado diluente.
Os diluentes mais utilizados são solução salina ou soluções tamponadas. Estas diluições são
seqüenciais, na razão de 1 para 10, de modo a se obter diluições 1/10 ou 10-1, 1/100 ou 10-2, 1/1000
ou 10-3 ou superiores. Em seguida, realiza-se a semeadura (plaqueamento), ou seja, distribuição
homogênea de uma alíquota da referida diluição em meio sólido adequado, de maneira que, após
incubação, por tempo e temperatura adequados, as células ou pequenos agrupamentos de células
idênticas espalhadas cresçam isoladamente, dando origem a colônias que serão contadas na diluição
apropriada e, portanto denominadas unidades formadoras de colônias (UFC). Este método está ilustrado
na Figura 10. Deve-se salientar que nos tubos muito diluídos não haverá células suficientes, enquanto
que nos tubos com diluições menores (mais concentrados), haverá um excesso de células, não
permitindo contagem adequada nas respectivas placas.
O ideal é que cada placa escolhida para contagem tenha um número considerado significativo no
método em questão, o que para bactérias, em geral, é de no mínimo 20 a 30 colônias e no máximo 200
a 300 colônias. Para que os resultados obtidos sejam estatisticamente válidos, sugere-se que sejam
preparadas pelo menos duas placas-réplica para cada diluição. Após os cálculos adequados, lendo-se
em conta os volumes utilizados, e as diluições empregadas, determina-se o número de microrganismos
presentes em um determinado peso ou volume do material inicial.
O método das diluições em placas permite duas variantes: inoculação em superfície e inoculação
em profundidade. No método do espalhamento em superfície o inóculo, geralmente de 0,1 a 1,0 mL, é
espalhado uniformemente na superfície do meio já solidificado, com auxílio de alça de Drigalsky, de
modo a separar ao máximo as células microbianas presentes. Neste caso, somente crescerão colônias
na superfície do meio sólido. Este método está ilustrado na Figura 11.
Para a contagem de microrganismos anaeróbios ou microaerófilos, geralmente, emprega-se uma
camada de cobertura (“over-lay”) sobre o inóculo.
Já no método do espalhamento em profundidade (“pour plate”), o inóculo, geralmente de 1,0 mL, é
adicionado ao fundo da placa de Petri estéril, vazia, e o meio de cultura contendo ágar, ainda liquefeito,
mantido à temperatura de 40-45o C, é vertido sobre ele. A homogeneização do inóculo com o meio é
31
feita através de movimentos rotacionais suaves. É preciso garantir que o meio não solidifique antes da
homogeneização, nem fique muito quente para não matar as células microbianas. As colônias crescerão
não somente na superfície, como também no interior do meio de cultura.

Figura 10 - Método das diluições em placas.

Fonte: VERMELHO et al. (2006)

Figura 11 - Técnicas de semeadura de inóculo. a. espalhamento em superfície. b. espalhamento em

profundidade.
Fonte: VERMELHO et al. (2006)

32
 Método da filtração

É utilizado para materiais líquidos nos quais se espera uma pequena quantidade de
microrganismos, como por exemplo, a água de abastecimento das cidades, que deve apresentar um
baixo número de bactérias, uma vez que é previamente tratada com cloro ou outro agente desinfetante.
Neste método, volumes de cerca de 100 mL da amostra são filtrados em uma membrana porosa
adequada, que deverá reter os microrganismos. Em seguida, esta membrana é colocada na superfície de
uma placa de Petri contendo meio de cultura. A difusão dos nutrientes pela membrana permite que os
microrganismos retidos se multipliquem e formem colônias, as quais poderão então ser contadas. Nesta
técnica, em virtude do tamanho da membrana filtrante, são consideradas significativas as contagens em
placas que apresentem de 20 a 200 colônias.
Deve-se ressaltar que o método exige que se trabalhe com repetições para que os resultados
possam ser estatisticamente válidos.
Alguns sistemas utilizados para filtração são fabricados pelas indústrias Millipore e Gelre. Estes
podem ser feitos de aço inox ou de material polimérico resistente ao calor.

Contagem de microrganismos do ar
Diferentes metodologias são propostas para quantificação dos microrganismos no ar. Algumas
delas são bastante simples, como o “método da exposição de placas ou de sedimentação”. Neste caso,
as placas são expostas ao ar do ambiente por um determinado tempo, quando os microrganismos se
depositam pela ação da gravidade sobre o meio de cultura. As colônias que ali se desenvolvem poderão,
então, ser contadas. Apesar de sua simplicidade, este método, por todas as suas imprecisões técnicas e
por não quantificar os microrganismos em relação a um volume de ar, não é muito recomendável.
É possível também fazer a impactação, ou borbulhamento de um volume definido de ar em um
diluente, e depois quantificar os microrganismos capturados pelo líquido pelo método de contagem em
placa. Embora apresente vantagens em relação ao anterior, o método é muito trabalhoso, sendo
também pouco utilizado.
Outro método sugerido é a filtração de um volume definido de ar através de uma membrana, e a
posterior quantificação dos microrganismos de forma semelhante ao descrito no item Método da
filtração. No entanto, este método apresenta a desvantagem de expor os microrganismos capturados na
membrana a um fluxo muito elevado de ar, que, por sua ação desidratante, pode causar a morte de
muitos deles.
O método considerado mais adequado para contagem de microrganismos no ar é o de
impactação em um meio sólido, que emprega um equipamento chamado de amostrador de Andersen.
Neste, uma corrente de ar de alta velocidade incide sobre a superfície de um meio de cultura sólido que
capturará as partículas de ar contendo os microrganismos. A placa contendo o meio é incubada, e o
número de colônias que se desenvolvem poderá ser quantificado e correlacionado ao volume analisado.

Contagem direta em câmara de contagem

Neste método, a suspensão microbiana em questão, que deverá ser bastante densa para garantir
resultados significativos, é colocada em uma lâmina especial, dentro de um poço com dimensões
conhecidas, cujo fundo é quadriculado.
Após adição de uma lamínula, ela é levada ao microscópio para a realização da contagem direta
das células em vários campos visuais. O número de células totais será a média das contagens obtidas
nos diversos campos, multiplicada por um fator que correlaciona a contagem obtida ao volume de
suspensão analisado.

33
 Este método fornecerá a contagem total de células vivas e mortas, e não se aplica a qualquer
microrganismo. Assim sendo, não será possível utilizá-lo para contagem de fungos ou bactérias
filamentosas. Microrganismos móveis, tais como alguns protozoários e bactérias também não podem
ser contados. Apresenta como vantagem a rapidez na execução, dispensando incubações. Um exemplo
de câmara para contagens é a câmara de Petroff-Hausser.
Contadores eletrônicos de partículas também são muito utilizados em laboratórios de análises
clínicas para contagem de células sangüíneas. Estes podem registrar a magnitude e duração de
mudanças de condutividade de ma suspensão de células bacterianas à medida que as mesmas passam
através de um pequeno orifício. Desta maneira, podem ser registrados o número e a distribuição do
tamanho de uma população de células. É um método rápido, porém apresenta como inconveniente a
possibilidade de partículas inanimadas poderem ser tratadas erroneamente como células.

Método do Número Mais Provável

Esta é uma técnica estatística a qual volumes da amostra original, em geral 10 e 1 mL, ou
volumes correspondentes às suas diluições decimais, em geral, 0,1 e 0,01 mL, são inoculados em séries
de tubos contendo um meio de cultura líquido apropriado. Geralmente, são empregadas três séries, de
três ou cinco tubos cada, nas quais são inoculadas replicatas correspondentes de cada volume ou
diluição da amostra original.
Após incubação pelo tempo apropriado, conta-se o número de tubos nos quais é observado
crescimento, ou uma reação diferencial típica, como a mudança de cor do indicador de pH ou a
produção de gás, em cada um dos tubos de cada série.
Com o número obtido pela combinação do número de tubos positivos de cada série pode-se
determinar o número mais provável de microrganismos na amostra, a partir da consulta de tabelas
específicas.
Sendo um método estatístico, os resultados obtidos garantem apenas 95% de probabilidade de
que o número de microrganismos determinados na análise corresponda ao número real de
microrganismos presentes na amostra.

Turbidimetria
Este é um método indireto no qual são contadas células totais, a partir da turvação observada no
meio líquido onde ocorre o crescimento microbiano. Dentro de certos limites, quanto maior o número
de células presentes, maior a turvação do meio. Aplica-se apenas a microrganismos capazes de crescer
como células isoladas, não sendo útil para bactérias ou fungos filamentosos.
Para esta contagem, é necessário que se seja obtida uma curva-padrão para cada microrganismo
estudado, onde será relacionado o número de células conhecido com a turvação correspondente
(expressa pela absorbância ou densidade ótica), medida em espectrofotômetro ou colorímetro.
Este método não é muito sensível, uma vez que exige um número mínimo de células bastante
alto para ser significativo. Apresenta as vantagens de ser rápido, fácil e de não destruir a amostra.
A escala de McFarland também é considerada um método turbidimétrico e utiliza uma escala de
turvação baseada numa suspensão de sulfato de bário, um sal insolúvel.
Neste caso, adquire-se um conjunto de tubos lacrados contendo suspensões do referido sal em
quantidades crescentes, em que quanto maior a quantidade de sal, maior a turvação da suspensão. A
medida é feita através de comparação visual entre as turvações da escala de McFarland e a turvação da
suspensão microbiana. Existe uma equivalência, descrita pelo fabricante, entre densidade a densidade
ótica de cada tubo da escala e a concentração de bactérias ou leveduras presentes.

34
 MICROB10
MICROB10 - IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS ATRAVÉS DE TÉCNICA DE
MICROCULTIVO EM LÂMINA

Introdução

Os fungos de interesse médico, agentes de micoses, são de dois tipos morfológicos: leveduras,
leveduras
que são unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, que são multicelulares. Existe um subgrupo
dentro dos filamentosos, chamados fungos dimórficos,
dimórficos que se apresentam sob ambas as formas,
dependendo principalmente da temperatura, mas sob influência também do teor de CO2 e condições
nutricionais.
As leveduras têm como estrutura primária, células que se reproduzem por brotamento,
brotamento único ou
múltiplo, em geral, de forma arredondada.
arredondada Estas células são esporos de origem assexual e se
denominam blastoconídios.
blastoconídios Alguns gêneros de leveduras menos importantes em micologia médica,
reproduzem-se por fissão.
Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte básico a hifa,
hifa que pode ser
septada ou não septada (cenocítica). A partir da hifa formam-se esporos,
esporos para propagação das espécies.
Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de conídios, pois nascem
diretamente delas ou sobre estruturas ligadas a elas.
Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificação de um fungo,
fungo pois a
classificação de filamentosos é feita, em regra, pelas características morfológicas,
morfológicas tanto macroscópicas
(cor, aspecto, textura da colônia, etc.), quanto microscópicas
microscópicas (forma e cor da hifa, presença ou não de
septos, tipo e arranjo de esporos, etc.), além da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rápida).
A identificação de leveduras,
leveduras ao contrário, é feita, principalmente, por características fisiológicas,
fisiológicas desde
que, a morfologia destes fungos não é muito variada e não permite distinção entre espécies e, em regra,
entre gêneros.

Estruturas microscópicas básicas de fungos: a, b, c - filamentosos, d – leveduras:

leveduras:

35
 No microcultivo em lâmina, as estruturas permanecem íntegras além de ser utilizado um meio de
cultura (ágar batata ou ágar Sabouraud), que estimula a produção de macro e microconídeos, que na
maioria das vezes identificam o fungo. Estimula, também, a formação de pigmento.

Procedimento

· Esterilizar placas de Petri com 3 lâminas no interior (duas servem para suporte e a outra para realizar
o microcultivo).
· Preparar ágar batata em placa.
· Cortar em quadradinhos (um pouco menores do que uma lamínula) com auxílio de bisturi estéril.
· Colocar um pedaço de ágar batata (ou Sabouraud) no centro da lâmina do microcultivo.
· Com a alça em “L”, cortar pedaços bem pequenos da colônia do fungo filamentoso cultivado
previamente em ágar batata ou Sabouraud e colocar nos quatro lados do pedaço de ágar batata (ou
Sabouraud).
· Cobrir com lamínula estéril, pressionando levemente.
· Colocar um pouco de água destilada estéril e incubar a 25ºC, repondo a água estéril, sempre que
necessário. O período de incubação deve ser de 10 a15 dias, dependendo da velocidade do crescimento
do fungo.
· Para fazer a montagem, retirar a lamínula com pinça estéril. Fixar o fungo na lamínula colocando 1 a 2
gotas de álcool e esperar secar. Montar essa lamínula em lâmina limpa, com 1 gota de Lactofenol
azulalgodão.
· A lamínula pode ser vedada com esmalte de unha ou Entellan para conservar por mais tempo.

Técnica de montagem de lâminas a partir de microcultivo

Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente, uma vez que nela deverão estar
aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodão (“Cotton
Blue”) e montar sobre uma lâmina. Desprezar o cubo de ágar e, em seu lugar, pingar outra gota de
corante azul e recobrir com lamínula, para visualizar esporos e hifas também aderidos à lâmina.
Observar em microscópio ótico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma disposição e formação
de esporos.
O corante azul de lactofenol-azul algodão, utilizado na microscopia de culturas de fungos
filamentosos, é formulado e preparado da seguinte forma:

36
Preparação do Lactofenol azul-
azul-algodão:

Fenol cristalizado: 20g

Ácido láctico: 20mL
Glicerina: 40mL
Água destilada: 20mL
Azul-algodão: 0,05g
Fundir o fenol separadamente. Misturar o ácido láctico, glicerina e água com o fenol. Colocar o corante e
filtrar em papel.

37
 MICROB 11
11 - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA
ONT
I – INTRODUÇÃO

Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos,
físicos, químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde
(BRASIL, 2004).
A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela
Portaria nº518, de 25 de março de 2004, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2004), apresentado na Tabela
abaixo:

Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano

PARÂMETRO VMP
(1)

(2)
Água para consumo humano

Escherichia coli ou coliformes termotolerantes

(3) Ausência em 100mL

Água na saída do tratamento

Coliformes totais Ausência em 100mL
Água
Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede)

Escherichia coli ou coliformes termotolerantes

(3) Ausência em 100mL

Coliformes totais Sistemas que analisam 40 ou

mais amostras por mês:
Ausência em 100mL em 95% das
amostras examinadas no mês;
Sistemas que analisam menos de
40 amostras por mês:
Apenas uma amostra poderá
apresentar mensalmente resultado
positivo em 100mL.

NOTAS:
(1) Valor Máximo Permitido.
(2) água para consumo humano em toda e qualquer situação, incluindo fontes individuais como poços,
minas, nascentes, dentre outras.

(3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada.

II – OBJETIVOS
Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral.

III - PROCEDIMENTOS

a) Seleção e preparação dos

dos frascos para coleta das amostras de água

Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos, de material aprovado para contato com água
destinada ao consumo humano e, de preferência, autoclaváveis ou pré-esterilizados. Podem-se também

38
empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados, comercialmente
disponíveis.

Procedimento para coleta:

- Água mineral engarrafada:

engarrafada deve ser coletada na embalagem original, lacrada. Havendo necessidade de
coletar volumes menores, a partir de embalagens de maior capacidade, deve-se homogeneizar todo o
conteúdo, invertendo a embalagem várias vezes, desinfetar o bocal com etanol 70% e,assepticamente,
abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. Desprezar o volume inicial e coletar a
amostra em um frasco estéril.

- Água de torneira ou tubulações:

tubulações limpar a área externa da saída com etanol 70%, flambar, se o material
for resistente ao calor, deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. Amostras de água clorada devem ter o
cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. Para tal, adicionar ao frasco de coleta, antes
da esterilização, 0,1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1,8% para cada 100 mL de água que se
pretende coletar.

b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica:

analítica: antes de abrir as embalagens deve-se
desinfetar a área externa com etanol 70%, para remoção dos contaminantes presentes. A abertura e a
retirada da unidade analítica devem ser feitas, preferencialmente, no interior de câmaras de fluxo
laminar, para prevenir qualquer contaminação da amostra. Se não houver fluxo laminar, deve-se
trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio, chama azulada, com as
portas e janelas do laboratório fechadas, para evitar correntes de ar.
Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das
unidades analíticas (tesouras, pinças, facas, espátulas, etc) devem ser previamente esterilizados em
autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso.
Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida,
deve-se submeter metade à análise, reservando a outra metade como contra-amostra.

c) Métodos de análise de água

heterotróficos
I. Contagem de heterot róficos-
róficos - plaqueamento em profundidade (“pour plate”)

Também conhecida como contagem padrão em placas, é um procedimento que objetiva estimar
o número de bactérias heterotróficas na água, particularmente como uma ferramenta para acompanhar
variações nas condições de processo, no caso das águas minerais, ou a eficiência das diversas etapas de
tratamento, no caso de águas tratadas, permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes
pontos da rede de distribuição.

1. Inoculação: através de pipeta estéril, adicionar 1 mL e 0,1 mL da amostra de água em placas de Petri
vazias estéreis.

2. Adição do meio de cultura:

cultura verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem
(PCA), previamente fundido e resfriado a 45o C. Misturar o inóculo com o meio de cultura
movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos na forma de oito ou em
movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário.

39
3. Incubação:
Incubação aguardar a completa solidificação do meio de cultura, distribuindo as placas numa
superfície plana. Após a solidificação, inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas.

Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as
colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o UFC por mL da amostra
multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Usar notação exponencial e
apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
UFC/mL = No de colônias/diluição

II. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos

Introdução
Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram
negativos, não esporogênicos, aeróbias ou anaeróbias facultativas, capazes de fermentar a lactose com
produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. O grupo inclui cerca de 20 componentes, dentre os quais
encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente,
como também diversos gêneros e espécies não entéricas, como Serratia e Aeromonas. Por essa razão,
sua quantificação em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal,
do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. coli.

Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma da coliformes totais, porém,

restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 horas a
45,5o C. Esta definição objetivou, em princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato
intestinal. Atualmente, sabe-se, entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três
gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas
de origem não fecal. Por este motivo, a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos
representativa, como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. coli, porém
muito mais significativa do que a presença de coliformes totais, dada a alta incidência de E. coli no
grupo fecal.

II.1. Teste presuntivo:

presuntivo

1. Com uma pipeta de 10 mL estéril, adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de

caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan.
2. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. Em
caso positivo, passar aos itens subseqüentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48
horas e repetir a leitura, passando para os itens subseqüentes, em caso de crescimento com
produção de gás. A não ocorrência gás após 48 h, indica ausência de coliformes (totais ou fecais)
nos 50 mL de amostra.

II.2. Confirmação de coliformes totais:

totais

1. A partir de cada tubo positivo no item anterior, transferir uma alçada bem carregada de cultura
para tubos de caldo Verde brilhante (VB). Incubar os tubos a 35oc por 24 a 48 h e observar se há
crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes totais.

40
 2. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de
coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1).

3. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra.

II.3. Confirmação de coliformes termotolerantes

termotolerantes:

1. A partir de cada tubo positivo de LST (item II.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura
para tubos de caldo EC.

2. Incubar os tubos a 45,5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás,

confirmativo de coliformes termotolerantes.

3. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes

termotolerantes/50mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1). A
não ocorrência de gás após 24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra.

Número Mais Provável (NMP) - nível de 95% de probabilidade, para diversas combinações de tubos
positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo.

Número de tubos positivos NMP/50mL

1 < 2,2

2 2,2

3 4,4

4 7,2

5 10,2
Fonte: SILVA et al. (2005)

IV – Questões para fixação de conhecimento

1. Explique como os micro-organismos coliformes são classificados em nível laboratorial.

2. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de
tubulações são exatamente os mesmos? Por quê?
3. Uma alíquota de 0,1mL de água mineral foi inoculada, em duplicata, através da técnica de
semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA), seguido de
incubação a 35-37ºC por 48 horas. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e
77. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada.
4. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável, empregando-se 5
tubos, encontraram-se:
a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás
b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás.
Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra.

IVIIV - V -

41
 MICROB 12
12 - DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO
CROMOGÊNICO
ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA
ÁGUA

Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea

de coliformes totais e de Escherichia coli. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 35-
37ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos).

À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert, eles utilizam ß-galactosidase para

metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. E. coli utiliza ß-
glucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. Juma vez que a maioria dos não coliformes
não conta com estas enzimas, eles não podem se reproduzir e interferir. Os poucos não coliformes
que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do
Colilert.

Interpretação dos
dos resultados - COLILERT

Incolor:
Incolor frasco com 100 mL de amostra de água.
Amarelo:
Amarelo teste positivo para presença de coliformes totais.
Amarelo/Fluorescência azul teste positivo para presença de E. coli. AMBIENTAL
Amarelo/Fluorescência azul:

42
 Passos para uso do COLITEST:

1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest,
incubando-o a 37ºC por 18-48h

3) Interpretação dos resultados:

43
 13 - PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE Escherichia
MICROB 13
coli
I- Introdução

Os testes bioquímicos são muito úteis na identificação de micro-organismos. Estes testes

baseiam-se na capacidade de os micro-organismos fermentarem carboidratos específicos, produzirem
gás a partir da fermentação, metabolizarem determinados aminoácidos, hidrolisarem gelatina, dentre
outras habilidades.
As cepas de Escherichia coli podem ser identificadas através de quatro testes: produção de indol
a partir do triptofano, fermentação ácido-mista a partir da glicose (prova do vermelho de metila),
produção de acetoína a partir da glicose (prova de Voges-Proskauer) e crescimento em ágar citrato. A
maioria das cepas de E. coli produz indol e realiza fermentação, porém não produz acetoína e não
utiliza o citrato como [única fonte de carbono.

II - Procedimentos

Teste de vermelho de metila (VM):

a. Princípio:
Princípio testar a habilidade de um micro-organismo em produzir ácido orgânicos relativamente
estáveis, a partir da fermentação da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampão existente no
meio de cultivo.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas neste teste será pesquisada a fermentação ácida mista, em que as bactérias
utilizam a glicose como substrato e liberam grande concentração de ácidos como produto final. E. coli
realiza esta fermentação.

Glicose ácido lático

ácido acético
ácido fórmico H2 + CO2
ácido succínico

c. Composição do meio:
meio
Meio de Clark & Lubs (VM-VP)
peptona tamponada 7,0 g
fosfato dipotássico 5,0 g
glicose 5,0 g
água destilada 1000 mL

d. Técnica:
Técnica
Inocular uma alçada de cultura contida em caldo triptona soja ou em caldo nutriente em tubo
contendo 3,5 mL de meio VM-VP e incubar a 35-37oC por 2 a 5 dias.
No momento da leitura, retirar 2,5 mL do meio e acrescentar cinco gotas de uma solução
hidroalcólica de corante vermelho de metila. O vermelho de metila é um indicador que já é ácido e
indicará os graus de acidez por alterações de cor de uma escala de pH de 4,4 a 6,0. Em pH 4,4 o
indicador ficará vermelho. Com a diminuição da acidez (pH = 6,0), o indicador passará para a cor
amarela.
44
 Resultados Cor do meio
meio Interpretação
positivo vermelho pH 4,5
negativo amarelo pH 6,0

e. Interpretação:
Interpretação
Com o pH ácido de 4,4, o meio fica suficientemente ácido para manter o indicador vermelho.

Os micro-organismos VM (+) fermentam a glicose produzindo ácidos e originando um pH final

muito baixo, vencendo o sistema tampão de fosfato e mantendo o ácido.

Os micro-organismos VM (-) produzem ácidos, porém o pH é mais elevado (pH = 6,0) porque

eles continuam metabolizando os produtos iniciais da fermentação, produzindo acetoína.

Teste de Voges-Proskauer (VP):

a. Princípio:
Princípio determinar a habilidade de um certo micro-organismo em produzir um composto neutro, o
acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas neste teste será pesquisada a fermentação butilenoglicol, na qual as bactérias
utilizam a glicose como substrato e liberam acetoína como principal produto final. Os principais gêneros
que realizam esta fermentação são Enterobacter e Aeromonas.

c. Composição do meio:
meio Meio de Clark & Lubs (item anterior)

d. Técnica:
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as normas do item anterior.
No momento da leitura, retirar 1,0 mL do meio VM-VP e adicionar o seguintes reativos de Barrit,
nesta ordem:
1. 0,6 mL de solução de alfa-naftol a 5%;
2. 0,2 mL de solução de KOH a 40%;
3. agitar o tubo suavemente para oxigenar o meio, a fim de oxidar a acetoína e obter uma
reação de cor;
4. deixar o tubo em repouso pro aproximadamente 15 minutos antes de iniciar a interpretação.

Resultados Cor do meio Interpretação

Interpretação
positivo vermelho Presença de acetoína
negativo cobre Ausência de acetoína

e. Interpretação:
Interpretação
Depois de unir o alfa-naftol e KOH, deve-se agitar suavemente o tubo, para o oxigênio
atmosférico entrar e oxidar a acetoína, em diacetil, sendo que o KOH atua como agente oxidante o alfa-
naftol, como catalisador e intensificador da cor.
Como emprego de um agente oxidante, a cor produzida desaparece rapidamente, sobretudo
porque o complexo de reação diacetil-peptona pode ser rapidamente oxidado em um composto incolor.
Portanto, o resultado positivo será de rosa a vermelho, e o negativo será cobre, que é a reação
entre o KOH e o alfa-naftol.

45
Teste do citrato:

a. Princípio:
Princípio determinar se um micro-organismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de
carbono para seu crescimento com conseqüente alcalinização do meio de cultura.

b. Bases bioquímicas: neste teste serão observadas as bactérias que metabolizam o substrato citrato
pelo ciclo de Krebs (oxidação) ou pelo ciclo de fermentação, resultando como produto final pH alcalino,
acetato e formiato. O meio utilizado para a fermentação do citrato contém sais de amônia inorgânica.
Um micro-organismo que é capaz de de usar citrato como uma única fonte de carbono utiliza também
sais de amônia como sua única fonte de nitrogênio. Os sais de amônia são desdobrados em amoníaco
com conseqüente alcalinização do meio reacional.

c. Composição do meio de cultura:

Meio de citrato Simmons

Sulfato de magnésio 0,2g
Fosfato diidrogenado de amônia 1,0g
Fosfato dipotássico 1,0g
Citrato de sódio 2,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Ágar 15,0g
Sol. alcoólica azul-de-bromotimol a 1% 0,8 mL
Água destilada 1000 mL

Indicador de pH azul de br
bromotimol:
omotimol

Ácido: coloração amarela, pH=6,0

Alcalino: coloração azul-prússia, pH=8,4
Meio não inoculado: coloração verde, pH=6,9

d. Técnica:
Técnica
Inocular uma alçada de cultura de bactéria-teste contida em caldo triptona soja ou caldo
nutriente em superfície de ágar inclinado de citrato Simmnos. Incubar a 35-37oC por 24 horas ou mais
tempo, se necessário.

Resultados Cor do meio Interpretação

positivo azul Meio alcalino
negativo verde Meio neutro sem crescimento

e. Interpretação
As bactérias que utilizam o citrato como única fonte de carbono farão com que o meio adquira
cor azul (pH alcalino), que é um produto do metabolismo do sal inorgânico acrescentado ao meio, pois o
produto do metabolismo do citrato é difícil detectar, porque são dois sais. Assim sabe-se que o citrato
foi metabolizado, através do produto do metabolismo do sal inorgânico de amônia.
No teste negativo o meio ficará verde e sem crescimento, pois a bactéria, por não conseguir
utilizar as fontes de carbono e de nitrogênio do meio, não sobreviverá.

46
Teste de produção de indol:

a. Princípio:
Princípio determinar a habilidade de um determinado micro-organismo em produzir o indol a partir
da molécula de triptofano.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas o triptofano é um aminoácido que, quando degradado por certas bactérias, leva à
formação principalmente dos seguintes produtos metabólicos intermediários: indol, escatol (metil-indol)
e ácido indol-acético. As várias enzimas intracelulares envolvidas neste processo fisiológico são
coletivamente denominadas de triptofanases. Os produtos intermediários formados em maior
quantidade na degradação do triptofano são representados pelo ácido indol-pirúvico, que produz indol
por desaminação, e pelo escatol formado pela descarboxilação do ácido indol-acético.

c. Composição do meio:
meio

Caldo triptona 1%

triptona 10,0g
NaCl 5,0g
Água destilada 1000 mL

d. Técnica:
Técnica
Inocular uma alçada de cultura de bactéria-teste contida em caldo triptona soja ou caldo
nutriente em caldo triptona 1%. Incubar a 35-37oC/24h.
No momento da leitura, adicionar 5 gotas de reativo de Kovacs.

Resultados Cor do meio Interpretação

positivo vermelho Presença de indol
negativo amarelo Ausência de jndol

Obs: o anel será formado na superfície do meio e ás vezes fica alaranjado devido à presença de escatol
(metil-indol).

e. Interpretação:
Interpretação
No teste positivo, a presença de indol no meio de cultivo é revelada pela adição do reativo de
Kovacs, ocorrendo então a seguinte reação química: o p-dimetl-amino-benzaldeído liga-se à molécula
de indol, produzindo um composto quinoidal de coloração vermelha, evidenciado pela formação de um
anel na camada alcoólica superficial do meio. A reação de cor, na realidade, é devida à reação dos
grupos CH2 do anel pirrólico da molécula do indol com o aldeído, que em um meio ácido forma uma
quinona.
No teste negativo, o meio fica amarelo, que é a cor do reativo de Kovacs.

III – Questões para fixação de conhecimento

1. Uma bactéria foi semeada em caldo VM-VP e incubada a 35ºC por 48 horas. Após este período,
transferiu-se uma alíquota de 2,5 mL deste meio de cultura para outro tubo de ensaio estéril e

47
 adicionaram-se cinco gotas de solução de corante vermelho de metila. Observou-se
descoramento no meio de cultura. O que se pode afirmar sobre a bactéria em estudo?

2. Para verificar se a bactéria da questão 1 é produtora de indol, explique como deve ser realizada a
prova bioquímica e sua interpretação.

3. Após cinco dias de incubação a 35ºC em ágar citrato, observou-se coloração azul intensa. O que
se pode afirmar sobre a bactéria semeada neste meio?

4. Explique as bases bioquímicas da prova de citrato.

48
MICROB 14
14 - TÉCNICAS DE AMOSTRAGEM, HOMOGENEIZAÇÃO E DILUIÇÃO
SERIADA DE ALIMENTOS SÓLIDOS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

1 - PROCEDIMENTOS

A. Coleta de alimento para análise microbiológica

1. Com auxílio de garfo e faca estéreis, retirar, no mínimo 100g de alimento (por exemplo: queijo
Minas-frescal)* e transferir para saco plástico apropriado para acondicionamento de alimento.

2. Fechar o saco de amostragem adequadamente e armazená-lo em caixa isotérmica contendo gelo

e enviá-lo para o laboratório.

* Observação: simulação de alimento exposto ao consumo (como, por exemplo, em restaurantes

self service).

Se o alimento a ser analisado estiver na embalagem original, enviá-lo desta maneira, ao laboratório
de análise.

B. Pesagem e diluição da amostra de alimento - Procedimento

1. Fazer a desinfecção da embalagem do alimento que será analisado, através de algodão embebido
em solução de álcool a 70%.

2. Abrir a embalagem do alimento na zona de segurança da chama do bico de Bunsen, com auxílio
de tesoura ou faca estéril (ou previamente mergulhada em solução de álcool a 70% e flambada).

3. Cortar o alimento em pedaços menores, na zona de segurança do bico de Bunsen, com auxílio
de faca e garfo estéreis,

4. Transferir 25g do alimento, com auxílio de espátula estéril ou previamente mergulhada em

solução de álcool a 70% e flambada para uma placa de Petri estéril tarada em balança semi-
analítica.

5. Transferir, de maneira asséptica, a alíquota de 25g para copo de liquidificador estéril e adicionar
225mL de diluente (solução salina a 0,85% estéril).

6. Homogeneizar por 1 a 2 minutos. Esta é diluição 1:10 ou 10-1.

7. Verter o homogeneizado no frasco que continha o diluente

8. Através de pipeta estéril, transferir 1mL da diluição 10-1 para tubo de ensaio contendo 9 mL de
diluente e agitar manualmente (ou em vortex) por 10 a 15 segundos. Esta é a diluição 10-2.

9. Transferir 1mL da diluição 10-2 para tubo de ensaio contendo 9 mL de diluente e agitar por 10 a
15 segundos. Esta é a diluição 10-3.

49
II – Questões para fixação
fixação de conhecimento
1. Cite o nome de um diluente normalmente utilizado em análises microbiológicas de alimentos.

2. Uma alíquota de 1mL de uma suspensão bacteriana foi transferida para 9mL de diluente e
submetida à homogeneização. A partir desta diluição, 1mL foi transferido para 9mL de diluente.
Desta diluição, 1mL foi novamente transferido para 9mL de diluente. Finalmente, 1mL desta
última diluição, foi transferido para 9mL de diluente. Qual o valor da última diluição realizada?

3. Descreva como deve ser a coleta de alimentos dispostos em balcão de restaurantes self service
para análise microbiológica.

4. Quais cuidados devem ser observados durante o transporte dos alimentos coletados que serão
submetidos a análise microbiológica?

50
 MICROB 15
15 - CONTAGEM E IDENTIFICAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASE
POSITIVA EM ALIMENTOS

I - INTRODUÇÃO

O queijo Minas frescal é um alimento de alto valor nutricional, além de possuir elevado teor e
umidade (superiores a 40%). Tais características contribuem significativamente para a alta perecibilidade
deste produto alimentício.

Dentre os vários micro-organismos que podem contaminar o queijo Minas, destacam-se os

coliformes termotolerantes, Staphylococcus coagulase positiva e Salmonella sp.

De acordo com a Resolução RDC no 12, de 02 de janeiro de 2001 – ANVISA, os padrões

microbiológicos para este alimento são: até 5,0 x 102 NMP de coliformes termotolerantes/g; até 5,0 x
102 UFC de Staphylococcus coagulase positiva/g; ausência de Salmonella sp/25g de alimento.

II – Procedimento

a) Pesagem e diluição da amostra

1. Fazer a desinfecção da embalagem do alimento que será analisado, através de algodão embebido
em solução de álcool a 70%.

2. Abrir a embalagem do alimento na zona de segurança da chama do bico de Bunsen, com auxílio
de tesoura ou faca estéril (ou previamente mergulhada em solução de álcool a 70% e flambada).

3. Cortar o alimento em pedaços menores, na zona de segurança do bico de Bunsen, com auxílio
de faca e garfo estéreis,

4. Transferir 25g do alimento, com auxílio de espátula estéril ou previamente mergulhada em

solução de álcool a 70% e flambada para uma placa de Petri estéril tarada em balança semi-
analítica.

5. Transferir, de maneira asséptica, a alíquota de 25g para copo de liquidificador estéril e adicionar
225mL de diluente (solução salina a 0,85% estéril).

6. Homogeneizar por 1 a 2 minutos. Esta é diluição 1:10 ou 10-1.

7. Verter o homogeneizado no frasco que continha o diluente

8. Através de pipeta estéril, transferir 1 mL da diluição 10-1 para tubo de ensaio contendo 9 mL de
diluente e agitar manualmente (ou em vortex) por 10 a 15 segundos. Esta é a diluição 10-2.

9. Transferir 1mL da diluição 10-2 para tubo de ensaio contendo 9mL de diluente e agitar por 10 a
15 segundos. Esta é a diluição 10-3.

51
 Staphyloco
b) Contagem de Staphylo coccus
co aureus
ccus aureus

1. Com auxílio de micropipeta e ponteira estéril, transferir assepticamente 0,1mL (100 µL) de cada uma
das diluições realizadas no item anterior para a superfície de placas contendo ágar Baird Parker.

2. Espalhar o inóculo com auxílio de alça de Drigalski até completa secagem.

3. Incubar as placas em estufa a 35ºC por 48 horas.

4. Após o período de incubação, realizar contagem das colônias típicas e submeter entre 3 e 5 colônias
à confirmação através de coloração de Gram, catalase e coagulase (ou DNAse)

Observação: As células de S. aureus são cocos Gram positivos, catalase e coagulase positivas.

c) Identificação de S. aureus

1. Escolher duas colônias e preparar esfregaços em lâminas para coloração de Gram.

2. Preparar um esfregaço em lâmina, fixá-lo na chama do bico de Bunsen e realizar coloração de Gram.
Descrever morfologia, arranjo e Gram das duas colônias.

3. Submeter estas mesmas colônias às provas de:

a. catalase: transferir uma pequena porção da colônia para uma lâmina limpa e adicionar uma gota
de solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 10%. Se houver liberação de bolhas, o teste é
considerado positivo para catalase (presença de enzima catalase que degrada o H2O2
transformando-o em água e oxigênio.

b. coagulase: transferir 0,5mL de plasma de coelho reidratado para tubo de ensaio estéril e
adicionar 0,2mL de caldo infusão de cérebro coração (ou caldo triptona e soja) contendo células
suspeitas de S. aureus reativadas a 35ºC/24 h. Incubar a 35ºC e observar após 6 horas se houve
formação de coágulo. Caso o resultado seja negativo, reincubar por até 24 horas.

c. DNAse: transferir uma alçada do caldo infusão de cérebro e coração (ou caldo triptona e soja)
contendo células suspeitas de S. aureus reativadas a 35oC/24h de para superfície de ágar DNA.
Incubar a 35ºC por 24 horas. Após incubação, adicionar solução de ácido clorídrico na superfície
do ágar. Uma zona mais clara ao redor do crescimento bacteriano indica presença de DNAse.

III – Questões para fixação de conhecimento

1. Qual a composição do ágar Baird Parker?

2. Quais as características fenotípicas de S. aureus nas placas de ágar Baird Parker?

3. Na contagem de S. aureus em um determinado alimento, obteve-se o seguinte resultado: 85 colônias

suspeitas na placa de Baird Parker inoculada com 0,1mL da diluição 10-2. Submeteram-se 5 (cinco)
colônias suspeitas aos testes bioquímicos (catalase, coagulase), das quais 4 (quatro) foram confirmadas
para S. aureus. Pede-se: expresse o resultado da contagem de S. aureus em UFC/g de alimento.

4. Explique como são interpretados os testes de catalase e de DNAse.

5. Faça um desenho das células de S. aureus observadas ao microscópio.

52
 16 - DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE Salmonella sp EM
MICROB 16
ALIMENTOS

I - PROCEDIMENTO

a) Pesagem e diluição da amostra

1. Fazer a desinfecção da embalagem do alimento que será analisado, através de algodão embebido
em solução de álcool a 70%.

2. Abrir a embalagem do alimento na zona de segurança da chama do bico de Bunsen, com auxílio
de tesoura ou faca estéril (ou previamente mergulhada em solução de álcool a 70% e flambada).

3. Cortar o alimento em pedaços menores, na zona de segurança do bico de Bunsen, com auxílio
de faca e garfo estéreis,

4. Transferir 25g do alimento, com auxílio de espátula estéril ou previamente mergulhada em

solução de álcool a 70% e flambada para uma placa de Petri estéril tarada em balança semi-
analítica.

5. Transferir, de maneira asséptica, a alíquota de 25g para copo de liquidificador estéril e adicionar
225mL de caldo lactosado ou solução peptonada tamponada.

6. Homogeneizar por 1 a 2 minutos. Verter o homogeneizado no frasco que continha o diluente

b) Detecção de Salmonella sp

1. Incubar o frasco contendo a mistura de alimento + caldo lactosado (ou solução peptonada
tamponada) em estufa a 35ºC por 24h para permitir o enriquecimento das células de Salmonella.

2. Após incubação, transferir 1 mL do caldo de enriquecimento para 1 tudo de ensaio contendo 10 mL

de caldo tetrationato de sódio (TT) e 10 mL de caldo selenito-cistina (SC), seguido de incubação a 35ºC
por 24 horas, para enriquecimento seletivo.

3. A seguir, retirar uma alçada de cada um dos tubos (TT e SC) e realizar estrias por esgotamento em
superfície dos meios: xilose desoxicolato (XLD) e Hektoen-Enteric (HE), com incubação a 35ºC por 24 h.

4. Selecionar entre 3 e 5 colônias típicas de cada um dos meios sólidos (róseas com ou sem centro preto
no XLD e azuis com ou sem centro preto no HE) e submetê-las às provas bioquímicas descritas a seguir
para Salmonella.

c) Identificação de Salmonella sp

1. Observação das características morfológicas de Salmonella nos meios sólidos XLD e HE

Observar as placas de ágar XLD e de ágar HE e anotar as características morfológicas das colônias
(tamanho, cor, brilho, etc).

53
2. Provas bioquímicas:

2.1. Teste de vermelho de metila (VM):

a. Princípio:
Princípio testar a habilidade de um micro-organismo em produzir ácido orgânicos relativamente
estáveis, a partir da fermentação da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampão existente no
meio de cultura.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas neste teste será pesquisada a fermentação ácida mista, em que as bactérias
utilizam a glicose como substrato e liberam grande concentração de ácidos como produto final. E. coli
realiza esta fermentação.
Glicose → ácido pirúvico várias enzimas ácido lático
ácido acético
ácido fórmico → H2 + CO2
ácido succínico

c. Técnica:
Técnica
Inocular uma alçada de cultura contida em caldo triptona soja ou em caldo nutriente em tubo
contendo 3,5 mL de meio VM-VP e incubar a 35-37oC por 2 a 5 dias.
No momento da leitura, retirar 2,5 mL do meio e acrescentar cinco gotas de uma solução
hidroalcólica de vermelho de metila. O vermelho de metila é um indicador que já é ácido e indicará os
graus de acidez por alterações de cor de uma escala de pH de 4,4 a 6,0. Em pH 4,4 o indicador ficará
vermelho. Com a diminuição da acidez (pH = 6,0), o indicador passará para a cor amarela.

Resultados Cor do meio Interpretação

positivo vermelho pH 4,5
negativo amarelo pH 6,0

d. Interpretação:
Interpretação
Com o pH ácido de 4,4, o meio fica suficientemente ácido para manter o indicador vermelho.

Os micro-organismos VM (+) fermentam a glicose produzindo ácidos e originando um pH final

muito baixo, vencendo o sistema tampão de fosfato e mantendo o ácido.

Os micro-organismos VM (-) produzem ácidos, porém o pH é mais elevado (pH = 6,0) porque

eles continuam metabolizando os produtos iniciais da fermentação, produzindo acetoína.

2.2. Teste de Voges-Proskauer (VP):

a. Princípio:
Princípio determinar a habilidade de um certo micro-organismo em produzir um composto neutro, o
acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas neste teste será pesquisada a fermentação butilenoglicol, na qual as bactérias
utilizam a glicose como substrato e liberam acetoína como principal produto final. Os principais gêneros
que realizam esta fermentação são Enterobacter e Aeromonas.

54
 H2 O

α-naftol + acetoína KOH  diacetil + guanidina cor vermelha

O2

c. Técnica:
Técnica
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as normas do item anterior.
No momento da leitura, retirar 1,0 mL do meio VM-VP e adicionar o seguintes reativos de Barrit,
nesta ordem:
5. 0,6 mL de solução de alfa-naftol a 5%;
6. 0,2 mL de solução de KOH a 40%;
7. agitar o tubo suavemente para oxigenar o meio, a fim de oxidar a acetoína e obter uma
reação de cor;
8. deixar o tubo em repouso pro aproximadamente 15 minutos antes de iniciar a interpretação.

Resultados Cor do meio Interpretação

Interpretação
positivo vermelho Presença de acetoína
negativo cobre Ausência de acetoína

d. Interpretação:
Depois de unir o alfa-naftol e KOH, deve-se agitar suavemente o tubo, para o oxigênio
atmosférico entrar e oxidar a acetoína, em diacetil, sendo que o KOH atua como agente oxidante o alfa-
naftol, como catalisador e intensificador da cor.
Como emprego de um agente oxidante, a cor produzida desaparece rapidamente, sobretudo
porque o complexo de reação diacetil-peptona pode ser rapidamente oxidado em um composto incolor.
Portanto, o resultado positivo será de rosa a vermelho, e o negativo será cobre, que é a reação
entre o KOH e o alfa-naftol.

2.3. Teste do citrato:

a. Princípio:
Princípio determinar se um micro-organismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de
carbono para seu crescimento com conseqüente alcalinização do meio de cultura.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas neste teste serão observadas as bactérias que metabolizam o substrato citrato
pelo ciclo de Krebs (oxidação) ou pelo ciclo de fermentação, resultando como produto final pH alcalino,
acetato e formiato. O meio utilizado para a fermentação do citrato contém sais de amônia inorgânica.
Um micro-organismo que é capaz de utilizar o citrato como uma única fonte de carbono utiliza também
sais de amônia como sua única fonte de nitrogênio. Os sais de amônia são desdobrados em amoníaco
com conseqüente alcalinização do meio reacional.

Indicador de pH azul de bomotimol presente no meio de cultura:

Ácido: coloração amarela, pH=6,0

Alcalino: coloração azul-prússia, pH=8,4
Meio não inoculado: coloração verde, pH=6,9

c. Técnica:
Técnica

55
 Inocular uma alçada de cultura de bactéria-teste contida em caldo triptona soja ou caldo
nutriente em superfície de ágar inclinado de citrato Simmnos. Incubar a 35-37oC por 24 horas ou mais
tempo, se necessário.

Resultados Cor do meio Interpretação

Positivo azul Meio alcalino
Negativo verde Meio neutro sem crescimento

d. Interpretação:
Interpretação
As bactérias que utilizam o citrato como única fonte de carbono farão com que o meio adquira
cor azul (pH alcalino), que é um produto do metabolismo do sal inorgânico acrescentado ao meio, pois o
produto do metabolismo do citrato é difícil detectar, porque são dois sais. Assim sabe-se que o citrato
foi metabolizado, através do produto do metabolismo do sal inorgânico de amônia.
No teste negativo o meio ficará verde e sem crescimento, pois a bactéria, por não conseguir
utilizar as fontes de carbono e de nitrogênio do meio, não sobreviverá.

2.4. Teste de produção de indol:

a. Princípio:
Princípio determinar a habilidade de um determinado micro-organismo em produzir o indol a partir
da molécula de triptofano.

b. Bases bioquímicas:
bioquímicas o triptofano é um aminoácido que, quando degradado por certas bactérias, leva à
formação principalmente dos seguintes produtos metabólicos intermediários: indol, escatol (metil-indol)
e ácido indol-acético. As várias enzimas intracelulares envolvidas neste processo fisiológico são
coletivamente denominadas de triptofanases. Os produtos intermediários formados em maior
quantidade na degradação do triptofano são representados pelo ácido indol-pirúvico, que produz indol
por desaminação, e pelo escatol formado pela descarboxilação do ácido indol-acético.

c. Técnica:
Técnica
Inocular uma alçada de cultura de bactéria-teste contida em caldo triptona soja ou caldo
nutriente em caldo triptona 1%. Incubar a 35-37oC/24h.
No momento da leitura, adicionar 5 gotas de reativo de Kovacs.

Resultados Cor do meio Interpretação

positivo vermelho Presença de indol
negativo amarelo Ausência de jndol

Obs: o anel será formado na superfície do meio e ás vezes fica alaranjado devido à presença de escatol
(metil-indol).

d. Interpretação:
Interpretação
No teste positivo, a presença de indol no meio de cultivo é revelada pela adição do reativo de
Kovacs, ocorrendo então a seguinte reação química: o p-dimetl-amino-benzaldeído liga-se à molécula
de indol, produzindo um composto quinoidal de coloração vermelha, evidenciado pela formação de um
anel na camada alcoólica superficial do meio. A reação de cor, na realidade, é devida à reação dos
grupos CH2 do anel pirrólico da molécula do indol com o aldeído, que em um meio ácido forma uma
quinona.
No teste negativo, o meio fica amarelo, que é a cor do reativo de Kovacs.

56
2.5. Teste de urease

Empregado para determinar se um micro-organismo é capaz de hidrolisar uréia em duas

moléculas de amônia (NH3) por ação da enzima uréase. Este teste é útil na distinção entre patógenos do
gênero Proteus e outras bactérias entéricas.
Utilizam-se meio ou caldo de uréia contendo extrato de levedura, uréia e o indicador de pH
vermelho de fenol, alça ou agulha de platina.

a. Princípio: a urease é uma enzima microbiana muito importante relacionada com a decomposição de
substâncias orgânicas. Esta enzima é considerada constitutiva porque é sintetizada por determinadas
bactérias, independentemente da presença ou ausência do seu substrato (uréia). O meio para o teste da
uréase contém uréia, fatores essenciais para o crescimento e o indicador de pH vermelho de fenol. O
indicador possui uma cor amarela ou amarelo/laranja em pH abaixo de 8,4. e vermelho em pH acima de
8,4. O meio para o teste foi desenvolvido para determinar a habilidade microbiana em converter uréia
em amônia (que é utilizada pela bactéria como fonte de carbono para produção de aminoácidos e
nucleotídeos), que aumenta o pH do meio com conseqüente mudança de cor do indicador.

b. Técnica: inocular o material a ser testado no meio teste com auxílio de uma agulha ou alça estéril.
Incubar a 35º C/24h para posterior análise da mudança de cor.

c. Interpretação: a enzima urease hidrolisa a uréia, dando origem a produtos finais alcalinos (ilustrado
na reação abaixo) que promovem aumento do pH do meio, causando uma mudança de cor do indicador,
para rosa, representando um resultado positivo. Para o teste. Nenhuma mudança de cor, ou uma
coloração levemente alaranjada, representa um teste de uréase negativo.

H2N urease
C=O → 2 NH3 + CO2
H2N

2.6. Teste de fermentação de carboidratos e produção de H2S – meio Três Açúcares e Ferro (TSI)

Este teste tem como objetivo determinar se ocorre a fermentação de açúcares (glicose, lactose e ou
sacarose), além da liberação de ácido sulfídrico (H2S) gasoso, promovida pelo metabolismo microbiano
de aminoácidos que contêm enxofre em sua estrutura. É muito utilizado para diferenciar membros
positivos da família Enterobacteriaceae, especificamente dos gêneros Salmonella, Francisella e Proteus,
dos membros negativos como Morganella morgagnii e Providencia rettigeri, além de outras bactérias
como Escherichia coli e Shigella flexneri.
Emprega-se um meio que contém glicose (0,5%), lactose (1%) e sacarose (1%), peptona (rica em
aminoácido cisteína → fonte de enxofre), tiossulfato de sódio, além de sulfato ferroso.

a. Princípio: o catabolismo do aminoácido cisteína pela enzima cisteína dessulforase durante o processo
de putrefação, ou ainda pela redução do tiossulfato no processo de anaerobiose, leva a uma redução do
enxofre, produzindo gás sulfídrico. Nos processos de putrefação, aminoácidos contendo enxofre, como
a cisteína, sofrem degradação pela ação da enzima dessulfurase, gerando ácido pirúvico, amônia e H2S
como produtos finais de reação. A amônia e o sulfeto de hidrogênio são excretados, pois são tóxicos
para a célula, e o ácido pirúvico é mantido no interior da célula para produção de energia, uma vez que
é intermediário do ciclo de Krebs. Nos processos de respiração anaeróbica, o enxofre inorgânico (neste

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caso, proveniente do tiossulfato adicionado ao meio) torna-se o aceptor final do elétron na cadeia
transportadora de elétrons. Assim, as bactérias capazes de utilizar os compostos que contêm enxofre
em sua estrutura podem ser identificadas por este teste pela detecção do gás sulfídrico liberado no
meio de reação.

b. Técnica:
Técnica: inocular o material a ser analisado com auxílio de uma agulha estéril de maneira
perpendicular, da superfície até o fundo do tubo contendo o meio de cultura. Após inoculação, incubar
o material a 35º c/24-48h.

c. Interpretação: se a cisteína presente no meio foi hidrolisada pela dessulfurase, ou se o tiossulfato

presente no meio foi reduzido, então houve produção de H2S. Este é capaz de se combinar com o
sulfato ferroso para formar sulfeto de ferro (FeS), de cor negra.

Cisteína cisteína dessulfurase NH3 + ácido pirúvico + H2S

→
H2S + FeSO4 → FeS + H2SO4 ou

H2S + acetato de chumbo → sulfeto de chumbo + ácido acético + H2O

Se a bactéria for capaz de fermentar apenas a glicose, somente a base do tubo ficará amarela (e o ápice
vermelho). Caso ela seja de fermentar dois ou mais açúcares, tanto a base como o ápice do meio de
cultura mudam para amarelo. Também é possível observar a produção de gás (CO2) oriundo da
fermentação dos carboidratos, pela presença de bolhas no meio de cultura.
Salmonella fermenta apenas glicose, enquanto E. coli fermenta glicose e lactose, com produção de gás.

2.7. Método rápidos para identificação de Enterobactérias

2.7.1. Meio EPM (Escola Paulista de Medicina):

Técnica: inocular o material a ser analisado com auxílio de uma agulha estéril de maneira perpendicular,
da superfície até o fundo do tubo contendo o meio de cultura. Após inoculação, incubar o material a
35ºC/24 h.
Os testes de produção de gás, na fermentação da glicose, H2S e produção da enzima urease, são verificados
na base. O teste da enzima L-triptofano desaminase, na superfície do meio.

Obs: Todas as enterobactérias fermentam a glicose.

a) GLICOSE - Fermentação desse açúcar, com produção de gás.

Prova positiva: base amarela, com presença de bolhas de ar.
Prova negativa:: base amarelada, sem bolhas de ar.

b) H2S
Prova positiva: base preta.
Prova negativa:: base amarela, azul ou inalterada.

c) UREASE
Prova positiva: base azul.
Prova negativa:: base amarela ou inalterada.

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d) TRIPTOFANO DESAMINASE
Prova positiva:: superfície verde escuro.
Prova negativa:: superfície azulada, amarela ou inalterada.

2.7.2. Meio de MILi (Motilidade, Indol e Lisina-descarboxilase):

Técnica: inocular o material a ser analisado com auxílio de uma agulha estéril de maneira
perpendicular, da superfície até 1/3 do fundo do tubo contendo o meio de cultura. Após inoculação,
incubar o material a 35ºC/24h.
os testes de Motilidade e L-Lisina descarboxilase são verificados na base e o teste do Indol é
feito, adicionando-se algumas gotas do reativo de Kovacs (dietilaminobenzaldeído) na superfície do
meio, retirando-se a tampa.

a) MOTILIDADE
Prova positiva: meio turvo.
Prova negativa:: meio límpido ou crescimento só no local do inóculo.

b) INDOL
Prova positiva: coloração vermelha.
Prova negativa:: coloração amarela.

c) L-LISINA
Prova positiva: coloração roxa.
Prova negativa:: coloração amarela.

TABELA PARA IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENTEROBACTÉRIAS

EPM MILI CITRATO

Bactérias Lactose Glicose H2S Ureas L-TD Motili Indol Lisina Citrato
com e -dade Descar
produção bo-
de gás xilase
Escherichia coli + + - - - - /+ + + -
Klebsiella pneumoniae + + - + - - - + +
Enterobacter cloacae + + - - /+ - + - - /+ +
Citrobacter freundii - /+ + - - /+ - + -/+ - +
/+
Arizona + + + - - + - + +
Shigella sp - - - - - - - /+ - -
Edwardsiella tarda - + - - - + + + -
/+
Salmonella sp - + + - - + - + +
Serratia marcescens - + - - /+ - + - + +
Proteus mirabilis - + -/+ + + + - /+ - - /+
Providencia rettgeri - + - - + + + - +
Yersinia enterocolitica - - - + - - /+ -/+ - - /+
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 L-TD: L-triptofano desaminase

Observação

As células de Salmonella apresentam, normalmente, os seguintes resultados nas provas bioquímicas:

Agar TSI: base amarela (ácido) e ápice vermelho (alcalino), uma vez que Salmonella fermenta apenas
glicose, com ou sem precipitado preto de sulfeto de ferro (indicando produção de H2S).

Agar Lisina e Ferro (LIA): coloração roxa, devido à descarboxilação da lisina.

Agar citrato: crescimento com viragem da cor do meio de cultura para azul.

Caldo uréia: sem alteração da cor do meio (este permanece amarelo), uma vez que Salmonella não
produz urease. No teste positivo ocorre a viragem do meio para rosa.

II – Questões para fixação de conhecimento

1. Cite as etapas envolvidas na detecção de Salmonella, bem como os reagentes e meios de cultura
empregados em cada uma delas.

2. Se uma colônia bacteriana apresentar coloração negra no ágar XLD, o que pode-se afirmar sobre esta
bactéria?

3. Quais são as características fenotípicas de Salmonella no ágar HE?

4. Quais provas bioquímicas são realizadas nos meios EPM e MILI?

5. Se após inoculação e incubação de uma bactéria, o caldo uréia apresentar cor rósea, o que se pode
afirmar sobre este micro-organismo?

6. Qual o resultado esperado no teste de citrato para Salmonella? De que cor fica o meio de cultura?

7. Qual o nome do reagente utilizado para se verificar a produção de indol a partir do triptofano por
uma bactéria?

8. Qual a cor do ágar MILI após inoculação e incubação de uma bactéria capaz de realizar a
descarboxilação da lisina?

9. Uma cepa bacteriana foi inoculada em ágar TSI. Após incubação, observou-se o seguinte: fundo e
ápice (rampa) amarelos. O que se pode afirmar sobre esta bactéria?

10. Se após adição do corante vermelho de metila ao caldo VM-VP, este adquirir uma coloração
vermelha, o que se pode afirmar sobre a bactéria em estudo?

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 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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self-service do
município de Limeira – SP.
SP 2006. 92 p. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) - Escola
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RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia prá

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VERMELHO, A. B. Práticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 239 p.

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