SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE

ÓXIDO DE ZINCO PARA APLICAÇÃO COMO AGENTE

ANTIBACTERIANO

A. L. NOGUEIRA1, B. JUSTI1, G. ROZZA2; J. da SILVA2 e L. A. D. KOSLOWSKI2

1
Universidade da Região de Joinville, Departamento de Engenharia Química
2
Universidade Estadual de Santa Catarina, Departamento de Engenharia Sanitária
E-mail para contato: nogueira.a.l@hotmail.com

RESUMO – As nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) têm atraído cada vez mais
atenção das indústrias e pesquisadores no sentido de desenvolver aplicações inovadoras
com este nanomaterial em áreas como a da saúde e de alimentos. Neste sentido, uma
potencial aplicação de grande interesse mundial é a desinfecção de águas para o
consumo humano. Dentre os patógenos mais comuns encontrados na água, a Escherichia
coli (E. coli) está entre os mais nocivos. O presente trabalho teve como principal objetivo
sintetizar, caracterizar, e avaliar a atividade antibacteriana de nanopartículas de ZnO
vislumbrando a possibilidade de aplicação destas nanoestruturas no tratamento de água
para consumo. O método do poliol foi empregado nas sínteses, na presença e ausência da
poli(vinil pirrolidona) – PVP, para se avaliar a influência deste agente estabilizante nas
propriedades morfológicas das nanopartículas produzidas. Os produtos obtidos foram
caracterizados por espectrofotometria de UV-Vis, DRX, MEV-FEG e MET. Os resultados
obtidos demonstraram que o método do poliol foi capaz de produzir nanopartículas de
ZnO com elevado grau de pureza e diâmetro médio em torno de 20 nm, na ausência ou
presença do PVP. Os ensaios microbiológicos comprovaram que as nanopartículas de
ZnO produzidas possuem excelente atividade antibacteriana contra a bactéria
Escherichia coli quando aplicadas em concentrações acima de 50 mg.L-1.

1. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento e a aplicação prática de nanotecnologias têm atraído cada vez mais a
atenção das indústrias e de pesquisadores devido às notáveis propriedades que se pode alcançar com
os materiais quando estes se encontram na escala nanométrica de tamanho (Couto, 2006). No que
concerne o desenvolvimento de nanoestruturas com propriedades antibacterianas para aplicações
diversas, é possível encontrar na literatura trabalhos envolvendo o uso de nanopartículas de prata
(Nogueira et al., 2014), cobre (Bagchi et al., 2013), óxido de zinco (Liu et al., 2009), dióxido de
titânio (Xing et al., 2012) e dióxido de estanho (Talebian et al., 2014). O uso de nanopartículas
metálicas para aplicação como agentes antibacterianos aparece como uma importante alternativa aos
tradicionais organoclorados (que são compostos contendo ao menos um átomo de cloro ligado
covalentemente na sua estrutura) e aos derivados de arsênio, usualmente empregados para esta
finalidade. Além disso, o uso de nanopartículas é extremamente vantajoso do ponto de vista da
eficácia do produto, pois a elevada relação área superficial por volume exibida pelas nanopartículas
permite que mínimas quantidades destes materiais sejam suficientes para conferir excelentes
propriedades antibacterianas ao produto final (Nogueira et al., 2014).

Em comparação aos compostos orgânicos, as nanopartículas de ZnO são extremamente

vantajosas, principalmente pelo fato de serem resistentes ao calor (Saliani et al., 2015), o que permite
sua aplicação em processos como o de transformação de plásticos. Entre os diversos materiais
metálicos nanoestruturados utilizados como agentes antimicrobianos, o ZnO vem recebendo cada vez
mais atenção não só devido a sua excelente eficiência bactericida e fungicida, mas também por não
ser classificado como um metal pesado, como é o caso da prata. Além de ser um material que
apresenta baixíssima toxicidade aos seres humanos, é seguro e biocompatível (Liu et al., 2009), o que
contribui para que o mesmo seja utilizado como agente ativo em medicamentos para aplicação
dermatológica devido a sua atividade antimicrobiana (Talebian e Zavvare, 2013). Atualmente é
possível encontrar aplicações do ZnO nas indústrias farmacêutica (pomadas ou pós antisépticos),
cosmética (desodorantes e protetores solares) (Muñoz, 2013) e de alimentos (embalagens ativas para
aumento do tempo de prateleira de produtos) (Hatzigrigoriou e Papaspyrides, 2011).

Na forma de nanopartículas, o ZnO é efetivo no controle de uma grande quantidade de

microrganismos, pois apresenta a capacidade de alterar os componentes da membrana celular da
bactéria, distorcendo-a e rompendo-a, o que leva à perda do componente intracelular e a consequente
morte do microorganismo (Bell, 2014). Por esta razão, nanopartículas de ZnO vem sendo cada vez
mais estudadas e utilizadas em aplicações nas quais propriedades antibacterianas são requeridas. Uma
potencial área de aplicação para estas nanopartículas é a biomédica, na qual existe a problemática do
desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos. Outra área promissora para a aplicação das
nanopartículas de ZnO, e que é de grande interesse mundial, é a desinfecção de águas para o consumo
humano. Dentre os patógenos mais comuns encontrados na água, a Escherichia coli (E. coli) está
entre os mais nocivos, pois pode causar inflamação do cólon, diarréia, dores abdominais e, nos casos
mais graves, a evacuação de sangue (Liu et al., 2009). Atualmente existem estudos (Lv et al., 2009,
Cabala, 2013, Gutierrez et al., 2014) e até mesmo produtos comerciais que usam prata coloidal para
aniquilar bactérias em unidades de tratamento de água. Contudo, o uso da prata é questionável do
ponto de vista de toxicidade, tanto aos serem humanos quanto ao próprio meio ambiente. Neste
contexto, o uso de nanopartículas de óxido de zinco, em detrimento ao uso das nanopartículas de
prata, aparece como uma alternativa viável, saudável e ecologicamente correta para o
desenvolvimento de filtros com propriedades antibacterianas. Desta forma, o presente trabalho teve
como principal objetivo sintetizar, caracterizar, e avaliar a atividade antibacteriana de nanopartículas
de ZnO contra a bactéria Gram negativa E. coli, vislumbrando a possibilidade de aplicação destas
nanoestruturas no tratamento de água para consumo humano. As sínteses das nanopartículas de óxido
de zinco foram realizadas empregando-se a rota do poliol, usando o etileno glicol como solvente e
agente de nucleação das nanopartículas. De acordo com Lee et al. (2008), a nucleação das
nanopartículas mediante o uso do etileno glicol na presença de água ocorre conforme o mecanismo
reacional apresentado a seguir:
Zn(CH3COO)2 + H2O → Zn(OH)(CH3COO) + CH3COOH (1)
Zn(CH3COO)2 + Zn(OH)(CH3COO) → Zn2(O)(CH3COO)2 + CH3COOH (2a)
Zn(OH)(CH3COO) + Zn(OH)(CH3COO) →Zn2(O)(CH3COO)2 + H2O (2b)
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Síntese das Nanopartículas
As nanopartículas de ZnO foram preparadas utilizando-se acetato de zinco dihidratado
(CH3COO)2Zn∙2H2O (99,995%, Quiminorte) como sal precursor, monoetilenoglicol (Quimidrol)
como agente redutor, poli(vinil pirrolidona) – PVP (Mw = 55.000 g.mol-1, Sigma-Aldrich) como
agente estabilizante, e água deionizada como iniciador das reações de hidratação e condensação
responsáveis pela nucleação das nanopartículas. Todos os reagentes foram utilizados conforme
recebido, sem purificação prévia.

As sínteses das nanopartículas de ZnO foram realizadas em um erlenmeyer de 250 ml com um

condensador de refluxo instalado para evitar o escape de gases. Inicialmente, adicionou-se no sistema
reacional o monoetileno glicol (100 mL), seguido pelo acetato de zinco di-hidratado (8,76 g), e o
sistema foi mantido sob vigorosa agitação a temperatura ambiente até a completa solubilização do sal
precursor. Em seguida, nas sínteses que foram conduzidas na presença do agente estabilizante,
adicionou-se 1,0 g PVP seguido de 1,0 mL de água deionizada. Nas sínteses conduzidas na ausência
do PVP, apenas 1,0 mL de água deionizada foi adicionada após a solubilização do sal precursor. Após
a adição de todos os compostos químicos no sistema reacional, o sistema, mantido sob vigorosa
agitação, foi aquecido até 205oC e mantido nestas condições por 220 minutos. Ao final da reação, o
produto obtido foi resfriado até a temperatura ambiente. Posteriormente, as partículas produzidas
foram diluídas em acetona (Anidrol) numa proporção 1:3 e submetidas a sucessivas etapas de
centrifugação a 3500 RPM e 25oC por 30 minutos (centrífuga marca Sigma, modelo 3k12). Por fim, o
produto coletado foi submetido à secagem em estufa por 24 horas à 50oC.

2.2. Caracterização das Nanopartículas

As caracterizações por espectrofotometria de UV-Vis foram realizadas diluindo-se 0,2 g das
amostras das partículas secas de ZnO em 20,0 mL de água deionizada, e submetendo estas amostras
diluídas em um banho de ultrassom por 20 minutos. Em seguida realizaram-se as leituras de absorção
em uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 10 mm. O equipamento utilizado foi o
espectrofotômetro Shimadzu UV-1601PC. Esta análise foi conduzida com o intuito de se avaliar e
comprar com a literatura os espectros de absorção de luz na região do ultravioleta das partículas de
ZnO sintetizadas.

As análises de microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (MEV-FEG) foram

realizadas em um microscópio JEOL – JSM 6701 (Field Emission Scanning Electron Microscope)
operando com 10 kV. As amostras foram aderidas em uma fita adesiva dupla face sobre o suporte, e
posteriormente ar comprimido foi passado sobre as amostras para retirada do excesso de partículas.
As amostras ainda foram recobertas por uma fina camada de ouro para que pudessem ser visualizadas
no microscópio. Para as análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET), 1,0 g das partículas
de ZnO sintetizadas foram solubilizadas em 10 mL de água deionizada, e as dispersões produzidas
foram colocadas em um banho de ultrassom durante 30 minutos para desagregação das partículas. Em
seguida, 10 gotas de cada amostra foram pingadas em grids de cobre de 300 mesh recobertos com
filme de carbono (Formvar). As imagens foram realizadas em um microscópio eletrônico de
transmissão JEOL JEM-2100, que foi operado com resolução de 200 kV para realização das imagens.
As análises de microscopia eletrônica de varredura e transmissão foram realizadas para se avaliar as
características morfológicas das partículas de ZnO produzidas.
 Análises de difratometria de raios-X foram conduzidas para se avaliar a estrutura cristalográfica
e o grau de pureza das partículas sintetizadas. Para isso, utilizou-se o equipamento Philips X’pert
operando com radiação CuK de 40kV, 30 mA (λ = 1,5406 Å) e um passo de 0,02º. As leituras foram
realizadas com ângulo de difração variando entre 30 e 90º.

Os testes de avaliação da atividade antibacteriana das nanopartículas de ZnO foram realizados

com base na norma ASTM E2149 – Determinação da Atividade Antimicrobiana de Agentes
Antimicrobianos sob Condições de Contatos Dinâmicos”. A bactéria Gram negativa Escherichia
coli (CCT-8739) foi selecionada para os ensaios pelo fato desta bactéria estar diretamente relacionada
a problemas de saúde gerados pelo consumo de água contaminada. Os ensaios antibacterianos foram
realizados com concentrações de 0, 25, 50 e 100 mg.L-1 das nanopartículas de ZnO sintetizadas sem
PVP. O inóculo foi preparado solubilizando-se 0,8 g de ágar bacteriológico em 100 mL de água
destilada. Essa solução foi autoclavada durante 15 min a 121ºC. Nesta solução, após seu resfriamento,
foi adicionada uma determinada quantidade das bactérias E. coli e, em seguida, a solução resultante
foi incubada por 18 horas na temperatura de 37 ºC e agitação de 130 RPM. O preparo do cultivo
sólido foi realizado pela diluição, sob agitação, de 22 g de caldo Mueller Hinton em 1000 mL de água
destilada. Em seguida, a solução foi aquecida e autoclavada nas mesmas condições do inóculo. Esta
solução foi acondicionada em placas de Petri para que se solidificasse. Esta etapa foi realizada em
uma capela de fluxo laminar previamente esterilizada com radiação ultravioleta para evitar a
contaminação do meio de cultura sólido. Por fim, as placas forma tampadas e lacradas com parafilm.

Para a realização do teste antibacteriano, o inóculo foi diluído até que atingisse uma leitura de
280 nm em espectrofotômetro (SP-22 BIOSPECTRO). A seguir, a amostra foi submetida a uma
diluição seriada até se alcançar uma diluição de 1,0x105 UFC/mL. A amostra de referência foi
preparada adicionando-se apenas 50 mL do inóculo diluído em um Erlenmeyer de 100 mL. Para se
avaliar a eficiência antibacteriana das nanopartículas de ZnO produzidas, outras três amostras foram
preparadas em Erlenmeyers diferentes, cada um contendo 50 mL do inóculo mais 10 mL de uma
solução aquosa contendo distintas concentrações de ZnO. Estas soluções aquosas foram preparadas
solubilizando-se 0,125 g, 0,25 g e 0,50 g de ZnO nanoparticulado em 10 mL de água deionizada.
Estas soluções aquosas, quando adicionadas aos 50 mL do inóculo, resultaram em soluções com
respectivamente 25, 50 e 100 mg.L-1. Para garantir uma boa dispersão e fragmentação dos grumos de
ZnO, estas soluções que foram colocadas em banho de ultrassom por 30 minutos. Após 24 horas sob
agitação em shaker, e temperatura controlada (37oC), as amostras foram novamente diluídas até
atingirem uma diluição de 1,0x10³ UFC/mL para que se pudesse ter uma quantidade de colônias na
placa de Petri factível de ser contada. Em tréplicas, alíquotas de 0,1 mL foram espalhadas sobre a
superfície do ágar nas placas de Petri, com auxílio de uma alça triangular de vidro Drigalski, até a
completa absorção. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e, após este procedimento,
efetuou-se a contagem das unidades formadoras de colônias (UFC).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, para avaliar se as amostras produzidas realmente se tratavam de óxido de zinco,
analisou-se a as propriedades ópticas por espectrofotometria de UV-Vis das nanopartículas
sintetizadas com e sem PVP, e os resultados foram comparados àqueles reportados na literatura. De
acordo com os resultados obtidos no presente estudo, e apresentados na Figura 1, nota-se que entre
350 e 400 nm ocorre uma pronunciada absorção da radiação incidente sobre a amostra. Além de estes
resultados serem condizentes com os reportados por Tuzemen et al. (2013), percebe-se que as
amostras sintetizadas com PVP absorveram mais radiação do que aquelas sintetizadas sem PVP.
Acredita-se que a presença do PVP levou a uma melhor dispersão das nanopartículas no meio aquoso
e uma melhor manutenção da estabilidade coloidal, o que contribuiu para que um número maior de
nanopartículas permanecesse em suspensão durante a realização da análise.
3.0
sem PVP
2.5 com PVP

2.0
Absorbância

1.5

1.0

0.5

0.0
300 400 500 600 700 800 900 1000
Comprimento de Onda (nm)

Figura 1 – Espectros de absorbância das nanopartículas de ZnO sintetizadas com e sem PVP.

As análises de DRX foram realizadas com o objetivo de se caracterizar a estrutura

cristalográfica do produto obtido e, mediante comparação com difratogramas publicados na literatura,
confirmar se o produto sintetizado era realmente óxido de zinco. Na Figura 2 são apresentados os
difratogramas de raio-X para as amostras sintetizadas com e sem PVP. De acordo com os resultados,
fica evidente que o uso do agente estabilizante não afetou a estrutura cristalográfica do produto.
Todos os picos de difração de Bragg, devidamente especificados nos difratogramas, são típicos de
cristais de óxido de zinco com estrutura hexagonal, conforme reportado na literatura (Lee et al., 2008,
Zanatta, 2009). A não existência de picos extra de difração de Bragg demonstram que os nanocristais
de ZnO sintetizados possuem elevado grau de pureza, além de uma estrutura hexagonal e monofásica
condizente com a da wurtzita.
(101)

ZnO sem PVP

ZnO com PVP
Intensidade (A. U.)

(100)

(002)

(110)

(103)

(212)
(102)

(201)
(200)

(004)

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
2(graus)

Figura 2 – Difratogramas de raios-X das nanopartículas de ZnO sintetizadas com e sem PVP.
 Os difratogramas de raios-X também foram utilizados para se estimar o tamanho médio das
partículas sintetizadas mediante o uso da fórmula de Scherre (Tuzemen et al. 2013), apresentada
a seguir. Tomando como base o pico de difração de Bragg predominante (100), localizado em
torno de 36,28º, e considerando-se que os grãos tendem à forma esférica (k = 0,9), o diâmetro
médio estimado das partículas de óxido zinco ficou em torno de 23 e 21 nm para as
nanopartículas de ZnO sintetizadas sem e com PVP respectivamente. Estes resultados indicam
que o uso do PVP como agente de estabilização, na concentração específica utilizada, causou
pouca influência no tamanho médio das nanopartículas produzidas.

(3)

Onde: - k é o fator de forma (igual a 0,9);

- λ é o comprimento de onda dos raios-X (igual a 1,5406 Å);
- β é o FWHM de um pico de difração de Bragg, dada em graus (considerado 0,3873 e
0,4206 para a amostra sem e com PVP, respectivamente);
- θ é ângulo de Bragg (considerado 36,28o para o pico predominante 101).

As análises de microscopia de eletrônica de varredura por emissão de campo (FEG) e de

transmissão eletrônica (MET) foram realizadas para que se pudesse avaliar a forma geométrica e
o tamanho médio das nanopartículas de ZnO sintetizadas. Como é possível notar a partir da
Figura 3, e principalmente a partir da Figura 4, as características morfológicas das nanopartículas
visualizadas nas imagens de microscopia são condizentes com as estimativas de tamanho obtidas
a partir dos difratogramas de raios-X. Nas imagens presentes na Figura 3, apesar das
nanopartículas estarem muito aglomeradas por estarem na forma de um fino pó seco, percebe-se
que o tamanho médio dos grãos é inferior a 50 nm. A partir dos resultados apresentados na Figura
4, percebe-se que a forma geométrica tende a esférica, e as estimativas de tamanho obtidas pela
fórmula de Scherre (equação 3) são bastante coerentes com as observações visuais.

A B

Figura 3 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (MEV-FEG)

das nanopartículas de ZnO produzidas: A) sem PVP; B) com PVP.

Por fim, a eficiência antibacteriana das nanopartículas de ZnO sintetizadas sem PVP foi
avaliada contra a bactéria Gram negativa Escherichia coli. Conforme foi exposto na seção dos
procedimentos experimentais adotados, concentrações de 0, 25, 50 e 100 mg.L-1 foram testadas. Os
resultados apresentados na Figura 5 mostram claramente que concentrações a partir de 50 mg.L-1
foram suficientes para inibir por completo o crescimento das bactérias E. coli.

A B

Figura 4 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) das nanopartículas de ZnO

produzidas: A) sem PVP; B) com PVP.

branco 50 mg.L-1 100 mg.L-1

25 mg.L-1

branco branco 25 mg.L-1 25 mg.L-1 50 mg.L-1 100 mg.L -1

50 mg.L -1 100 mg.L -1

Figura 5 – Resultados da quantidade de unidades formadoras de colônia (UFC) obtida nos ensaios
antibacterianos conduzidos na presença de 0, 25, 50 e 100 mg.L-1 das nanopartículas de ZnO
sintetizadas sem PVP.

4. CONCLUSÕES
O presente trabalho avaliou a rota química do poliol para sintetizar nanopartículas de óxido de
zinco (ZnO). As reações foram conduzidas na ausência e presença do agente estabilizante poli(vinil
pirrolidona) – PVP, e os resultados obtidos demonstraram que em ambos os casos foi possível
produzir nanopartículas de ZnO com formas geométricas tendendo à esférica e com tamanhos médios
muito semelhantes (23 nm sem PVP, e 21 nm com PVP). Apesar de pequena, a redução no tamanho
médio das nanopartículas quando o PVP foi usado no sistema reacional comprovou que este agente
estabilizante preveniu a agregação das nanopartículas durante a síntese. Outras concentrações de PVP
devem ser testadas para se avaliar o real efeito deste composto químico nas características
morfológicas das nanopartículas de ZnO. Os ensaios microbiológicos realizados indicaram que
concentrações de 50 mg.L-1 foram suficientes para inibir por completo o crescimento da bactéria
Gram negativa Escherichia coli. Estes resultados, associados ao fato de que o óxido de zinco é um
material atóxico e biocompatível, demonstram que a rota química do poliol pode ser usada na
produção de nanopartículas de ZnO com potencial para aplicação na desinfecção de água para o
consumo humano.
 5. REFERÊNCIAS
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