II.

OBJETIVOS

Observar os parâmetros cinéticos da fosfatase alcalina através da confecção de uma

curva padrão que fornecerá a relação entre a concentração de PNP e as absorbâncias, e
determinar a formação de produto em reações da enzima com e sem inibidor, com
utilização desta curva padrão.

Examinar as influências da variação de concentração de substrato em uma reação

enzimática, e observar a influência da variação inversamente proporcional entre a
concentração de substrato e inibidor. Confeccionar as curvas padrão da reação enzimática
com e sem inibidor, através da relação entre Vo e concentração de substrato.

III. MATERIAL

a. Material por Grupo:

• Pipetas de 1, 2 e 5 mL

• Pró-pipetes

• Pipetador automático 20 – 200 µ L

• Tubos de ensaio

• Cubetas

• Béckers

b. Equipamentos:

• Vortex

Marca: Vertex

Modelo: QL – 901

Voltagem: AC 110V

• Banho-maria (37°C)
 Marca: De Leo & Cia. Ltda.

• Espectrofotômetro

c. Reagentes:

• Solução padrão p-nitrofenol (PNP) 0,1mM em tampão Tris-HCl pH 9,5

• Solução de p-nitrofenolfosfato (PNPP) 1mM em tampão Tris-HCl pH 9,5

• Solução tampão Tris-HCl 0,2mM pH 9,5

• Solução de NaOH 2M/L

• Solução de enzima: fosfatase alcalina 2 µ g/mL (E.C. 3.1.3.1)

IV. MÉTODOS

a. CURVA PADRÃO DE PNP:

Transferiu-se, com o auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas de solução padrão de

PNP para tubos de ensaio numerados de 1 à 6, e para um sétimo tubo, o branco, cujos
valores se encontram na tabela 1. Em seguida, pipetou-se alíquotas de solução tampão Tris-
HCl (pH 9,5) para tais tubos, e, imediatamente após, alíquotas de solução de NaOH 2M/L,
cujos valores também se encontram na tabela mencionada acima.

Então, com auxílio do vortex, os tubos foram homogeneizados e, após isso, as

soluções contidas nestes foram transferidas para cubetas, a fim de se realizar a leitura das
respectivas absorbâncias, a 405 nm, através do espectrofotômetro.

Tabela 1

Solução padrão Tampão Tris- Solução de Volume Total

Tubo nº
de PNP (mL) HCl 9,5 (mL) NaOH 2M/L (mL)
B - 3,2 1,0 4,2
1 0,3 2,9 1,0 4,2
2 0,6 2,6 1,0 4,2
3 0,9 2,3 1,0 4,2
4 1,2 2,0 1,0 4,2
5 1,5 1,7 1,0 4,2
6 1,8 1,4 1,0 4,2
Tabela 1: Quantidade de solução em cada tubo.

b. CURVA DE SUBSTRATO:

Foram transferidas, com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas da solução tampão

Tris-HCl (pH 9,5) e, em seguida, de solução de PNPP, para tubos de ensaio, enumerados de
1 à 13 e para um 14º tubo, denominado branco. Os valores se encontram na tabela 2. Após
tais procedimentos, os tubos foram pré-encubados em banho-maria (37ºC) por 5 minutos.

Com a ajuda de um pipetador automático, acrescentou-se 0,2 mL da solução de

enzima aos tubos numerados de 1 a 13, em intervalos de 30’’, homogeneizando-os a cada
adição. Feito isso, os tubos foram encubados em banho-maria, por 15 minutos.

De acordo com o horário específico de cada tubo, adicionou-se aos mesmos 1,0 mL
de NaOH 2M/L também em intervalos de 30’’, rigorosamente, homogeneizando-os a cada
adição.

Com relação ao tubo denominado branco, a solução de NaOH foi adicionada

primeiro e depois a solução da enzima, e então este pôde ser encubado por 15 minutos.

Ao término de tais métodos, amostras das soluções contidas nos tubos foram postas
em cubetas, as quais foram levadas ao espectrofotômetro, a fim de ler as suas absorbâncias,
a 405 nm.

Tabela 2

Tubo nº Tampão PNPP 1mM ENZIMA Solução de Total

Tris-HCl pH (mL) (mL) NaOH (mL)
 9,5
B 2,9 0,1 0,2 1,0 4,2
1 2,9 0,1 0,2 1,0 4,2
2 2,8 0,2 0,2 1,0 4,2
3 2,7 0,3 0,2 1,0 4,2
4 2,6 0,4 0,2 1,0 4,2
5 2,4 0,6 0,2 1,0 4,2
6 2,2 0,8 0,2 1,0 4,2
7 2,0 1,0 0,2 1,0 4,2
8 1,8 1,2 0,2 1,0 4,2
9 1,5 1,5 0,2 1,0 4,2
10 1,2 1,8 0,2 1,0 4,2
11 0,9 2,1 0,2 1,0 4,2
12 0,6 2,4 0,2 1,0 4,2
13 0,3 2,7 0,2 1,0 4,2
Tabela 2: Quantidade de solução nos tubos de ensaio.

c. INFLUÊNCIA DO INIBIDOR:

Com auxílio de pipeta e pró-pipete, transferiu-se alíquotas (determinadas segundo a

tabela 3) de solução tampão Tris-Pi-HCl, pH 9,5, para tubos de ensaio numerados de 1 à 13
e para um 14° tubo, o branco. Também segundo a tabela 3, pipetou-se alíquotas do
substrato (solução de PNPP, 1 mM) para os referidos tubos. Os tubos foram pré-incubados
a uma temperatura de 37°C durante 5 minutos.

Com uma pipeta automática, transferiu-se 0,2 mL de enzima para os tubos de 1 a

13, com intervalos de 30’’, e determinou-se o horário exato do início do ensaio. Os tubos
foram incubados durante 15 minutos a uma temperada de 37°C. Após esse período,
acrescentou-se as tubos 1,0 mL de NaOH e homogeneizou-se. No tubo branco, a solução de
NaOH foi transferida anteriormente a enzima, com utilização dos mesmos métodos; ele
também foi incubado durante 15 minutos.
 Tabela 3
ENZIMA Solução de
Tampão
PNPP ( NaO
Tubo n0 Tris-PI-HCl pH
1 mM (mL) m H
9,5
L) (mL)
B 2,9 0,1 0,2 1,0
1 2,9 0,1 0,2 1,0
2 2,8 0,2 0,2 1,0
3 2,7 0,3 0,2 1,0
4 2,6 0,4 0,2 1,0
5 2,4 0,6 0,2 1,0
6 2,2 0,8 0,2 1,0
7 2,0 1,0 0,2 1,0
8 1,8 1,2 0,2 1,0
9 1,5 1,5 0,2 1,0
10 1,2 1,8 0,2 1,0
11 0,9 2,1 0,2 1,0
12 0,6 2,4 0,2 1,0
13 0,3 2,7 0,2 1,0
Tabela 3: Composição das soluções em cada tubo.

Assim como nos procedimentos anteriores, a leitura das absorbâncias dos tubos foi
realizada no espectrofotômetro e devidamente analisadas.

V. RESULTADOS

a. CURVA PADRÃO DE PNP:

Ao serem executados os procedimentos, foi realizada a leitura no espectrofotômetro
da absorbância, a 405 nm, de cada tubo. Os resultados obtidos constam na tabela a seguir:
Tabela 4
Tubo Nº B 1 2 3 4 5 6
0,000 0,175 0,276 0,354 0,466 0,586 0,692
ABS. 405 nm
Tabela 4: Relação entre os tubos e as suas respectivas Absorbâncias.
 As diferentes diluições da solução de PNP 0,1mM resultaram em diferentes
concentrações finais. Estas concentrações foram calculadas através do fator de diluição,
conforme demonstrado abaixo:

Fator Diluição:
(Volume inicial / Volume Final) x Concentração Inicial:
(0,3 / 4,2) x 0,1 = 0,7142857.10-2

O mesmo cálculo acima foi utilizado para as outras cinco soluções, e as

concentrações resultantes estão tabeladas abaixo:

CURVA PADRÃO DE PNP

Solução Padrão
-2
Absorbância x 10-2
Tubo de PNP 0,1mM [PNP] x 10 (mM)
(405nm)
(mL)
1 0,3 0,7142857 17,5
2 0,6 1,4285714 27,6
3 0,9 2,1428571 35,4
4 1,2 2,8571429 45,6
5 1,5 3,5714286 58,6
6 1,8 4,2857143 69,2
Tabela 5: Volume e concentração final de PNP em cada uma das soluções, e as respectivas absorbâncias.

A melhor reta foi traçada entre os pontos marcados no gráfico através do fator de
calibração médio (FCM), que permite a obtenção do valor do coeficiente angular desta reta.
O cálculo está demonstrado abaixo:

a = 16,9267 (mmol/l)-1
 b. CURVA DE SUBTRATO:
A partir da leitura das absorbâncias em cada tubo, pôde-se relaciona-las na tabela abaixo:

Tabela 6

Tubo n0 Abs. 405 nm Tubo n0 Abs. 405 nm

1 0,207 8 0,536
2 0,274 9 0,610
3 0,333 10 0,577
4 0,418 11 0,605
5 0,471 12 0,609
6 0,441 13 0,690
7 0,556 B 0,000
Tabela 6: As Absorbâncias em seus respectivos tubos de ensaio.

c. INFLUÊNCIA DO INIBIDOR:
Com o auxílio do espectrofotômetro, as absorbâncias analisadas foram devidamente
tabeladas, como se encontram a seguir:

Tabela 7

Tubo n0 Abs. 405 nm Tubo n0 Abs. 405 nm

1 0,050 8 0,244
2 0,056 9 0,287
3 0,064 10 0,337
4 0,108 11 0,400
5 0,114 12 0,438
6 0,186 13 0,477
7 0,210 B 0,000
Tabela 7: As Absorbâncias e os tubos de ensaio.

VI. DISCUSSÃO

a. CURVA PADRÃO DE PNP:

Essa experiência serve para a análise do efeito da concentração do produto formado
na leitura da absorbância. Observe que esta é uma relação linear, porque quanto maior a
concentração de PNP na solução, maior é a absorbância. Usando esta relação, poderemos
analisar os dados obtidos nas próximas experiências, pois sabemos que a leitura realizada
tem relação linear com o produto formado.
A leitura do tubo "branco" serviu como referencial para a realização das leituras de
absorbância nos tubos numerados de 1 a 6. A leitura da absorbância no "branco" foi
definida como 0, ou seja, o valor dela foi descontado do valor de absorbância obtido nos
outros tubos. Isso se deve ao fato de que a solução tampão mais NaOH também absorver
parte da luz incidida, alterando o resultado de todos os outros tubos analisados no aparelho,
por isso foi necessário a efetuação da correção dos valores medidos.
Com os resultados obtidos no espectrofotômetro sobre a absorbância de cada tubo
com diferentes concentrações de solução de PNP, foi possível calcular o fator de calibração
para cada solução e calcular o fator de calibração médio, o coeficiente angular desta reta.

b. CURVA DE SUBSTRATO:
O PNPP, um substrato comumente usado na identificação da enzima fosfatase
alcalina em um meio, naturalmente se decompõe, por ação da luz e do calor, em PNP,
liberando uma molécula de Fosfato inorgânico, podendo ser visualizado facilmente com a
mudança na coloração da solução, de incolor para amarelo. Dessa forma, podemos
demonstrar a reação:

Desse
modo, na
determinação da absorbância de uma substância, comumente se utiliza um tubo
denominado “branco”. O “branco” então, na curva de substrato, é muito importante na tara
do espectrofotômetro, descartando a Absorbância correspondente à formação de PNP
inespecífico.
 A partir dos dados, pôde-se construir dois tipos de gráficos: o de Michaelis-Menten
e o de Lineweaver-Burk (ou Duplo-recíproco). Segundo a análise feita dos gráficos,
observou-se uma linearidade inicial e depois a formação de uma curva, seguida de uma
espécie de plator. A linearidade indica que, conforme há o aumento da concentração de
substrato, a velocidade da reação tende a subir. Porém, como indicado pela curva, de forma
cada vez mais lenta, até um ponto em que não será mais possível aumenta-la, já que todos
os sítios ativos da enzima estarão ocupados, efeito demonstrado pelo plator.

c. INFLUÊNCIA DO INIBIDOR:
De acordo com os valores obtidos, foi feita a construção de dois gráficos, o de
Michaelis-Menten e o de Lineweaver-Burk, juntamente com os da Curva de Substrato, pois
é necessária a comparação entre eles para se determinar qual o tipo de inibidor utilizado.
A partir do gráfico segundo Michaelis-Menten, pôde-se observar que se trata de um
inibidor competitivo, já que, tanto na curva de substrato quanto na de inibidor, as
velocidades máximas eram as mesmas, além do Km na curva de inibidor ser maior do que
na curva de substrato.
A posição da curva de inibidor é muito mais abaixo em relação à curva de substrato,
o que pode ser explicado pela presença do inibidor na solução. Este faz com que o substrato
precise desloca-lo para se ligar à enzima, sendo necessário muito mais moléculas de
substrato para se chegar à metade da Velocidade máxima. Desse modo, o Km é muito maior,
o que pode-se concluir que somente com uma concentração muito alta de substrato a reação
atingirá sua velocidade máxima.