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Plaquetas

ISSN: (Impresso) (Online) Página inicial da revista: https://www.tandfonline.com/loi/iplt20

Avaliação in vivo da biocompatibilidade e

biodegradação de um novo plasma desnaturado
membrana combinada com PRF líquido (Alb-PRF)

Ezio Gheno , Carlos Fernando de Almeida Barros Mourão , Rafael Coutinho

de Mello-Machado , Emanuele Stellet Lourenço, Richard J Miron , Carolina
Ferreira Farias Catarino , Adriana Terezinha Alves , Gutemberg Gomes Alves
& Mônica D. Calasans-Maia

To cite this article: Ezio Gheno , Carlos Fernando de Almeida Barros Mourão , Rafael Coutinho de
Mello-Machado Emanuele Stellet
, Lourenço , Richard J Miron Adriana Terezinha , Karoline Ferreira Farias Catarino ,
Alves , Gutemberg Gomes Alves & Mônica
(2020): In vivo D. Calasans-Maia
avaliação da biocompatibilidade e biodegradação de uma nova membrana plasmática desnaturada
combinado com PRF líquido (Alb-PRF), Plaquetas, DOI: 10.1080/09537104.2020.1775188
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Publicado on-line: 12 de junho de 2020.

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Plaquetas, Early Online: 1–

13 © 2020 Taylor & Francis Group, LLC. DOI: https://doi.org/10.1080/09537104.2020.1775188

Avaliação in vivo da biocompatibilidade e biodegradação de uma nova

membrana plasmática desnaturada combinada com PRF líquido (Alb-PRF)
Ezio Ghenoa,b, Carlos Fernando de Almeida Barros Mourão , Rafael Coutinho de Mello-Machadoa ,
uma

Emanuele Stellet Lourençoa , Richard J Mironc, Karoline Ferreira Farias Catarinod , Adriana Terezinha Alves
e
,
Gutemberg Gomes Alvesf , & Mônica D. Calasans-Maia g*

uma b
Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, Brasil, Di.SC Departamento de Ciências Cirúrgicas e Estudante de Graduação
c d
Diagnostics, Universidade de Génova, Itália, Departamento de Periodontologia, Universidade de Berna, Berna, Suíça, Integrada, Odontologia
e
School, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil, Departamento de Patologia Oral, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, Brasil,
f
Departamento de Biologia Molecular e Celular, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, Brasil, eg Departamento de Cirurgia Oral, Odontologia
School, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil

Abstrato Palavras-chave

A regeneração óssea guiada (GBR) é um processo que envolve a regeneração de defeitos ósseos através da aplicação de Alb-PRF, albumina, PRF estendido, centrifugação
membranas oclusivas que excluem mecanicamente a população de células não osteogênicas do tecido mole circundante. horizontal, fibrina rica em plaquetas
Curiosamente, a fibrina rica em plaquetas (PRF) foi proposta anteriormente como uma membrana GBR autóloga, apesar de
seu período de reabsorção de curto prazo de 2 a 3 semanas. Observações clínicas recentes demonstraram que, aquecendo História
uma camada de plasma líquido pobre em plaquetas (PPP) e misturando a zona de buffy coat rica em células, as propriedades
Recebido em 2 de abril de 2020
de reabsorção do gel de albumina aquecido com líquido-PRF (Alb-PRF) podem ser significativamente melhoradas .
Revisado em 21 de abril de 2020
Aceito em 24 de maio de 2020
O objetivo deste estudo foi avaliar a reação inflamatória, biocompatibilidade e propriedades de degradação estendida de uma
Publicado on-line xx xxx xxxx
nova membrana autóloga Alb-PRF em comparação com o PRF padrão comumente utilizado após a implantação de
camundongos nude, de acordo com a ISO 10993-6/2016.
Duas preparações padrão de PRF (L-PRF e H-PRF) foram comparadas com o novo Alb-PRF após implantação subcutânea
em 7, 14 e 21 dias. Todos os grupos demonstraram excelente biocompatibilidade devido às suas fontes autólogas. No
entanto, vale a pena notar que, enquanto as membranas L-PRF e H-PRF demonstraram reabsorção significativa ou completa
em 21 dias, a membrana Alb-PRF permaneceu estável em volume durante todo o estudo. Este estudo demonstra - pela
primeira vez, até onde sabemos - uma melhora acentuada na estabilidade da membrana de Alb-PRF. Isso indica seu
potencial futuro para uso como membrana de barreira biológica para procedimentos de ROG com meia-vida de longa
duração, ou como material de preenchimento biológico em aplicações de medicina estética. Assim, mais estudos são
necessários para explorar futuras aplicações clínicas em vários campos da medicina.

Introdução
A regeneração óssea guiada (GBR) é um tratamento guiado onde a
regeneração de defeitos ósseos é obtida de forma previsível através da
aplicação de membranas oclusivas, que excluem mecanicamente a população
de células não osteogênicas do tecido mole circundante [1-3]. Isso facilita o
repovoamento de células osteogênicas – especificamente oriundas do osso
nativo – que então habitam o defeito ósseo, levando à formação de novo osso
[1–3]. Uma das abordagens mais relevantes para o GBR é o uso de uma
membrana que reveste o tecido ósseo no local da cirurgia, mitigando o risco
de invasão pelo tecido conjuntivo [2,4]. Com isso em mente, várias membranas
reabsorvíveis e não reabsorvíveis têm sido utilizadas em estudos experimentais
e clínicos [1-3]. As características desejáveis para membranas de barreira
usadas na terapia de GBR incluem biocompatibilidade, propriedades de
oclusão celular, integração do tecido hospedeiro e eficiência do espaço [2,4].
Embora as membranas de barreira de colágeno mais comumente usadas
sejam reabsorvíveis, o uso de
A fibrina rica em plaquetas (PRF) também tem sido proposta como alternativa
ao uso de membranas sintéticas para GBR. O PRF foi descrito pela primeira
vez como um biomaterial autólogo originário do sangue periférico humano
após centrifugação sem aditivos[5]. Desde então, o PRF tem sido utilizado em
muitos campos da medicina e odontologia regenerativa, incluindo cirurgia oral
e implantodontia.
5
Os concentrados de plaquetas de segunda geração induzem maior
cicatrização de tecidos moles e duros, aumentando a concentração de fatores
de crescimento, como fator de crescimento transformador b (TGF-b), fator de
crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento derivado de
plaquetas (PDGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de
crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) [5,6].
No entanto, uma das questões mais importantes que afetam a aplicabilidade
do PRF é a curta permanência local deste material autólogo quando implantado
in vivo[7]. Várias tentativas de aumentar a estabilidade desta membrana nos
sítios cirúrgicos têm sido

#Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho

*
Correspondence: Mônica Calasans-Maia , Niteroi, RJ,
Brazilmonicacalasansmaia@gmail.com
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2 E. Gheno et al. Plaquetas, Early Online: 1–13

realizado alterando o protocolo de centrifugação, mas também combinando
PRF com outros biomateriais que, se também autólogos, poderiam contribuir
para melhorar a cicatrização óssea e de tecidos moles, alterando a
biodegradabilidade da membrana [1,8–11].
Nesse sentido, um estudo recente propôs um novo protocolo para a
produção de membranas, que utilizou o tratamento térmico da camada de
plasma após centrifugação para melhorar as propriedades de trabalho do
PRF[12]. Embora o teor de fator de crescimento encontrado no PRF seja
tipicamente perdido durante os protocolos de aquecimento padrão, métodos
recentes para reincorporar o PRF líquido, incluindo células da camada de buffy-
coat, foram propostos para favorecer o maior teor de células e fatores de
crescimento (Alb-PRF). [12] Desde então, o Alb-PRF demonstrou incorporar
células vivas com altos níveis de liberação de fator de crescimento por até 10
dias ou mais[13]. Alb-PRF é uma membrana moldável sólida, mais estável e
opaca que foi proposta para uso como barreira de tecido mole. É também um
biomaterial promissor para aplicação como preenchedor em cirurgia oral,
implantodontia e dermatologia.
O objetivo deste estudo foi avaliar a reação inflamatória, biocompatibilidade
e propriedades de degradação estendida de uma nova membrana autóloga de
Alb-PRF em comparação com protocolos de PRF padrão comumente utilizados
após a implantação de camundongos nude, de acordo com a ISO 10993-6/2016 . Nos grupos controle, o PRF foi preparado com o sangue periférico de um
Métodos
número 12126919.7.0000.5243] e realizado seguindo os padrões éticos do
comitê de ética em pesquisa do instituto e a declaração de Helsinque de 1964.
A criação e experimentação dos animais foram realizadas de acordo com as
diretrizes convencionais do NIH Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals, seguindo a Diretriz Brasileira de Cuidados e Uso de Animais para Fins
Científicos e Didáticos - DBCA e as Diretrizes de Prática de Eutanásia do
CONCEA. Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do Programa
3Rs (Redução, Refinamento e Reposição), cujo objetivo é reduzir o número de
animais utilizados durante a experimentação e minimizar a dor e o desconforto.
O protocolo de pesquisa deste trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense (CEUA/UFF), sob
protocolo número CEUA/UFF: 7190181118. Este estudo foi relatado de acordo
com as diretrizes da ARRIVE referentes aos itens relevantes [14] e
complementado por PREPARE [15].
Preparação de Biomateriais de Controle
doador saudável (CFABM), coletado em tubos de vidro red cap de 9 ml, sem
aditivos. Todas as amostras de PRF neste estudo foram coletadas do mesmo
doador para limitar a variabilidade neste estudo, pois grandes diferenças foram
relatadas anteriormente nesse aspecto [16]. As únicas fontes de variabilidade

Considerações éticas
Amostras de sangue foram coletadas com o consentimento informado de
doadores voluntários saudáveis, procedimento que foi aprovado pelo
Comitê de Ética da Universidade Federal Fluminense [CAAE
foram a preparação dos animais e os protocolos seguidos. Para o protocolo
padrão de controle, amostras de leucócitos e fibrina rica em plaquetas (L-PRF)
foram processadas a 2700 rpm por 12 minutos (~700 RCF-max) [17] usando um

Figura 1. Esquema para produção de membranas PRF. uma. Para a produção de amostras de L-PRF, o sangue total foi coletado e processado a 2700 rpm por
12 minutos; b. Para a produção de amostras de H-PRF o sangue total foi coletado e processado em centrifugação horizontal, a 700 RCF-max por 8 minutos, e c.
Para a produção das amostras Alb-PRF foram coletadas as amostras de sangue total e aplicado o protocolo para H-PRF para obtenção da fase líquida (plasma +
porção rica em células) - 8 minutos de centrifugação a 700 RCF-max. Aproximadamente 2 ml de plasma foram coletados e inseridos em um dispositivo para
desnaturação de proteínas no plasma humano por 10 minutos a uma temperatura de 75°C. Subsequentemente, 4 ml da porção rica da camada de buffy coat
foram coletados, adicionados à camada de PPP aquecida no recipiente de vidro e misturados suavemente. Após 5 minutos a membrana estava formada.
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DOI: https://doi.org/10.1080/09537104.2020.1775188
Centrífuga Intraspin (Biohorizons, Alabama, EUA). A centrifugação horizontal
(H-PRF), a 700 RCF-max por 8 minutos (Eppendorf 5702, Hamburgo,
Alemanha), também foi usada para produzir PRF (Figura 1a-b).
Preparação de Membranas Alb-PRF
O mesmo doador de sangue foi utilizado para a produção de Alb-PRF.
As amostras de sangue total foram coletadas em tubos plásticos PET sem
quaisquer aditivos. Para produzir cada membrana, dois tubos foram
colocados em uma centrífuga de rotor horizontal (Bio-PRF, Venice, Florida,
EUA), e o protocolo para H-PRF foi aplicado para obter a fase líquida (plasma
+ porção rica em células)—8 minutos de centrifugação a 700 RCF-max. Após
o processamento, foi possível utilizar o plasma e o restante material
sanguíneo decantado contendo hemácias.
Aproximadamente 2 ml da porção inicial de plasma foram coletados com
seringa com agulha 18 G (Injex®, São Paulo, Brasil), enquanto o restante do
sangue (porção rica em células e hemácias) foi preservado em ambiente
temperatura (20°C).
As seringas contendo plasma pobre em plaquetas (PPP) foram inseridas em
um dispositivo para desnaturação de proteínas no plasma humano (Bio-Heat,
Bio-PRF, Venice, Flórida, EUA). Após 10 minutos à temperatura de 75°C, as
seringas foram armazenadas em temperatura ambiente por mais 10 minutos
para permitir o resfriamento (conforme recomendação do fabricante).
Em seguida, utilizando uma seringa de 10 ml com agulha 18 G (Injex®,
Brasil), os 4 ml da porção rica da camada leucocitária foram coletados,
adicionados à camada de PPP aquecida no recipiente de vidro e misturados
suavemente. Após a conclusão do processo de polimerização da fibrina
(aproximadamente 5 min), a membrana foi formada (Figura 1c).
Caracterização Animal e Grupo Experimental
Neste estudo, foram utilizados 30 camundongos nude fêmeas, com idade
entre 30 e 40 dias, pesando 20 a 30 gramas, fornecidos pelo Centro de
Animais de Laboratório (NAL) da Universidade Federal Fluminense, Niterói,
Brasil. Camundongos nus foram usados porque são deficientes em linfócitos
T. Portanto, os animais não rejeitam transplantes de outras linhagens ou
espécies. Eles têm sido amplamente utilizados em vários outros estudos e
demonstraram boa compatibilidade com biomateriais implantados [8,18,19].
Antes e após os períodos experimentais, os animais foram mantidos em
isoladores - com no máximo 5 animais em cada - e alimentados com ração
peletizada e água ad libitum. Um veterinário sênior monitorou os parâmetros
nutricionais, cuidados com os animais e jejum pré e pós-operatório dos
animais.
Os animais foram divididos em quatro grupos com igual tamanho de
membrana PRF (1 cm × 0,5 cm)—Grupo 1: Sham (sem implantação de
membrana); Grupo 2: L-PRF; Grupo 3: H-PRF; e Grupo 4: Alb-PRF. Todos
os grupos experimentais foram subdivididos de acordo com seu período
experimental (7, 14 e 21 dias), com cinco animais em cada período
experimental de cada grupo.
Procedimentos cirúrgicos
Todos os aspectos do cuidado e acomodação dos animais foram realizados
de acordo com a ISO 10993-2 e ISO 10993-6. Vários parâmetros de resposta
biológica foram avaliados e registrados, incluindo o seguinte:
(1) A extensão da camada da cápsula de fibrose e inflamação, medida
semiquantitativamente (ver Tabela I).
(2) A degeneração, determinada pela avaliação de alterações na morfologia
do tecido.
(3) o número e distribuição de células inflamatórias, ou seja, células
polimorfonucleares, linfócitos, células plasmáticas,
Avaliação in vivo da membrana plasmática desnaturada 3
Tabela I. Sistema de avaliação histológica semiquantitativa — Tipo celular/resposta.
Pontuação
Tipo de célula/resposta 0 1 2 3 4
Células 0 Raro, 1 a 5/phf 5 a 10/pf Embalado
polimorfonucleares Infiltrado pesado
Linfócitos 0
Células plasmáticas 0
Macrófagos 0
Células gigantes 0 Raro, 1 a 2/phf 3 a 5/pf Lençóis
Necrose 0 Mínimo Suave Moderado Grave
eosinófilos, macrófagos e células multinucleadas, em função da
distância da interface material-tecido.
(4) A presença e extensão da necrose.
(5) Outras alterações teciduais, como vascularização, infiltração gordurosa,
formação de granulomas, mineralização e formação óssea.
(6) Parâmetros do material, como fragmentação ou presença de detritos,
incluindo a forma e localização do material degradado.
(7) A qualidade e quantidade de crescimento de tecido para materiais de
implante porosos e absorvíveis.
Antes da realização dos procedimentos cirúrgicos, todos os animais
ficaram em jejum de 24 horas e receberam anestesia geral intraperitoneal,
seguindo o protocolo da Universidade Federal Fluminense, utilizando injeção
de 0,6 mL da solução anestésica preparada com 1,0 mL de cetamina a 10%
(Dopalen® -100 mg/mL), 0,5 mL de xilazina a 2% (Anasedan® 20 mg/mL) e
8,5 mL de solução salina estéril (KabiPac®).
Três minutos depois, foi realizada a degermação com soluções de
clorexidina degermante e clorexidina alcoólica a 2% (Riohex Scrub®,
Rioquimica; São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil). Foi feita uma incisão
de aproximadamente 1 cm no epitélio da região dorsal do animal, seguida
de divulsão da fáscia muscular com bisturi e tesoura de ponta romba para
expor o tecido subcutâneo para facilitar a inserção da membrana (1 cm × 0,5
cm) na região subcutânea. Seguiu-se sutura com náilon 5-0 (Technofio,
Permed, Mafra, Santa Catarina, Brasil) e antissepsia com gaze e solução
alcoólica de clorexidina no pós-operatório. Os animais foram alojados no
Laboratório de Experimentação Animal (AEL/UFF) e separados em diferentes
miniisoladores de acordo com seus grupos experimentais, onde receberam
alimentação e água ad libitum (Figura 1). No dia da cirurgia e em cada um
dos dois dias seguintes, 5 mg/kg de Meloxicam (Eurofarma Laboratórios
LTDA, São Paulo, SP, Brasil) foram administrados por via subcutânea a cada
24 h. Todos os animais foram observados diariamente para avaliação e
registro de eventuais complicações pós-operatórias.
Os camundongos foram eutanasiados após seus respectivos períodos
experimentais com doses letais de solução anestésica e amostras -
juntamente com tecido subcutâneo adjacente (± 5 mm com margens de
segurança) - foram coletadas, fixadas, desidratadas, clarificadas e colocadas
em parafina para obter 5 ÿm fatias grossas. As fatias foram coradas com
hematoxilina e eosina (HE) e observadas em microscópio de campo de luz
com aumento de 40x (OLYMPUS BX43, Tóquio, Japão). Essas imagens
foram capturadas com uma câmera digital de alta resolução (OLYMPUS
SC100, Tóquio, Japão) com lentes objetivas Acroplan 10× e 40× no
Laboratório de Biotecnologia Aplicada—UFF (LABA, Niterói, Brasil) para
análise histológica descritiva e semiquantitativa. avaliação sobre o
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4 E. Gheno et al. Plaquetas, Early Online: 1–13

presença de infiltrado inflamatório, neoformação vascular, extensão e usando o software GraphPad Prism. Todos os dados foram comparados
tipo de necrose, presença de infiltrado gorduroso, fibrose e reabsorção com o grupo controle L-PRF.
de membrana.

Avaliação da Liberação do Fator de Crescimento

Análise Estrutural por MEV e Avaliação Histológica
Para determinar a capacidade de liberar fatores de crescimento (L-PRF,
Imediatamente após a produção, as membranas L-PRF, H-PRF e Alb- H-PRF e Alb-PRF), as membranas (n = 3 por grupo) foram incubadas em
PRF foram cortadas em dois pedaços e um foi fixado com solução de placas de cultura de 6 poços (TPP, EUA) na presença de 4 ml de DMEM
Karnovsky e pós-fixado com solução de cacodilato de sódio 0,2 M e (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA) sem antibióticos,
solução de tetróxido de ósmio a 1%. Foi desidratado sequencialmente em atmosfera umidificada a 37°C/5% CO2.
em soluções de álcool (15% a 100%) e hexametildissilazano (HMDS), Os meios de cultura condicionados foram coletados após 7 dias de
seguido de metalização com ouro e observação a 15 kV em microscópio cultura e armazenados a -80°C. Para a detecção de fatores de
eletrônico de varredura (JEOL JSM-6490 LV, JEOL, Japão). crescimento, o ensaio imunoenzimático convencional (ELISA) foi
empregado usando kits comerciais (Peprotech, Rocky Hills, NJ).
A análise histológica descritiva foi realizada para todas as amostras, Os ensaios foram realizados para a presença de FGF2, VEGF e PDGF-
seguida de análise semiquantitativa, de acordo com a ISO 10993-6 bb em três experimentos independentes com cinco repetições técnicas.
(Tabela I e 2). Neste esquema semiquantitativo, infiltrados de células A densidade óptica final foi medida usando um leitor de microplacas
inflamatórias e necrose foram pontuados usando o esquema de pontuação Synergy II (Biotek, EUA).
mostrado na Tabela I. Neovascularização, fibrose e infiltração gordurosa
são pontuados usando o esquema de pontuação mostrado na Tabela II.
De acordo com as normas ISO 10993-6, devido à maior importância dos
Análise estatística
infiltrados de células inflamatórias e necrose — em comparação com os
parâmetros de neovascularização, fibrose e infiltração gordurosa — no Após um teste de normalidade de D'Agostino-Pearson, os resultados dos
cálculo da resposta tecidual total de cada um dos materiais implantados, ensaios ELISA foram comparados usando ANOVA de uma via com um
esses parâmetros foram multiplicados por um fator de 2 para fornecer um teste post-hoc de Tukey. Os resultados referentes às alterações da área
valor ponderado (ver Tabela II). Na Tabela I complementar , os valores da membrana com o tempo após o implante foram avaliados por ANOVA
totalizados são mostrados, juntamente com uma pontuação média para de duas vias com teste de comparações múltiplas de Dunnett,
os tratamentos teste e controle. A análise estatística foi realizada usando considerando um erro alfa de 5%, utilizando o software GraphPad Prism
ANOVA de duas vias com um teste de Bonferroni 7.0 (GraphPad®, EUA).

Tabela II. Sistema de avaliação histológica semiquantitativa — Resposta tecidual.

Pontuação

Resposta 0 1 2 3 4

Neovascularização 0 Proliferação capilar mínima, Grupos de 4 a 7 capilares com Banda larga de capilares com Extensa faixa de capilares com
focal, 1 a 3 brotos estruturas fibroblásticas de suporte estruturas fibroblásticas de suporte estruturas fibroblásticas de suporte

Fibrose 0 Banda estreita Banda moderadamente grossa Banda grossa Banda extensa
Infiltrado gorduroso 0 Quantidade mínima de gordura Várias camadas de gordura e fibrose Acúmulo alongado e amplo Extensa gordura circundando
associada à fibrose de células de gordura sobre o local do completamente o implante
implante

Figura 2. Após 21 dias da implantação, macroscopicamente, observou-se o volume no dorso do animal, referente ao ALB-PRF, que permaneceu no local durante todos os períodos
experimentais. A. Dorso do animal com volume ALB-PRF (seta); B. L-PRF; C. H-PRF; D. Alb-PRF.
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DOI: https://doi.org/10.1080/09537104.2020.1775188 Avaliação in vivo da membrana plasmática desnaturada 5

Figura 3. Quantificação da área da superfície da

membrana. Ambos os grupos L-PRF e H-PRF
observaram reabsorção completa no dia 21. Alb-PRF
demonstrou estabilidade de volume superior ao longo
do tempo (p < 0,05; * área de superfície
significativamente maior quando comparado a todos os outros grupos).

Figura 4. Fotomicrografias do Grupo Sham. A e B) círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido conjuntivo (TC) com células inflamatórias
focais intensas e difusas (*); fibras musculares (MF) e tecido de adipócitos (AT) são anotados. c e d: círculo: epiderme (EP) e derme papilar com folículo piloso (HF), tecido
conjuntivo em recuperação (TC) com células inflamatórias focais moderadas (*). e e f: círculo: epiderme (EP) e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido
conjuntivo (TC). Células inflamatórias raras (*) são observadas. A e B: 7 dias; c e d: 14 dias; E e F: 21 dias. A, C e E: ampliação de 40 x, barra de escala: 500 µm; b, d e f:
ampliação de 400 x, barra de escala: 50 µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina.
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6 E. Gheno et al. Plaquetas, Early Online: 1–13

Resultados em ambos os lados da linha média do animal com L-PRF e Alb-PRF.

Avaliação Histológica após Implantação
A resposta biológica foi avaliada avaliando a resposta tecidual
(neovascularização, fibrose e infiltrado gorduroso) e a presença de
células inflamatórias (polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos,
macrófagos, células gigantes e necrose) em função do tempo. A
resposta da amostra de teste foi comparada com a obtida no local da
amostra de controle. Após 21 dias, observou-se macroscopicamente
que a maioria das amostras implantadas com L-PRF ou H-PRF
apresentou reabsorção significativa ou completa, enquanto o grupo Alb-
PRF demonstrou apenas uma pequena alteração nas dimensões de
volume (Figura 2).
A Figura 2a mostra um animal que foi implantado subcutaneamente
Observe a reabsorção completa do grupo L-PRF; no entanto, um bolus
permaneceu no grupo oposto Alb-PRF (Figura 2a).
A Figura 2b-d mostra ainda que o grupo L-PRF e H-PRF demonstraram
reabsorção completa no dia 21. O grupo Alb-PRF exibiu vascularização
ao redor do biomaterial implantado com notável estabilidade de volume
durante toda a duração do estudo (Figura 2d).
A quantificação da área de superfície do tamanho da membrana
demonstrou que ambos os grupos L-PRF e H-PRF perderam
aproximadamente 50% de volume em comparação com o grupo Alb-PRF em 7 dias
Aproximadamente 25% do volume foi perdido no dia 14 e a reabsorção
completa foi observada no dia 21 para os grupos L-PRF e H-PRF
(Figura 3). Em contraste, do dia 7 ao dia 21, o grupo Alb-PRF

Figura 5. Fotomicrografias do grupo L-PRF. a e b: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), tecido conjuntivo em recuperação (TC) com
células inflamatórias moderadas e difusas (*) circundando o PRF (PRF). tecido de adipócitos (AT) são observados acima do epitélio. c e d: círculo:
epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), tecido conjuntivo recobrindo (TC) com células inflamatórias moderadas e difusas (*) circundando PRF
(PRF). E e F: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido conjuntivo (TC). são observadas raras células inflamatórias
entre as fibras musculares (mf) e o tecido adipocitário (AT). A PRF não foi observada neste período. a e b: 7 dias; c e d: 14 dias; e e f: 21 dias. a, c e e:
ampliação de 4 x, barra de escala: 500 µm; b, d e f: ampliação de 40 x, barra de escala: 50 µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina. a e b: 7 dias; c e d:
14 dias; e e f: 21 dias. a, c e e: ampliação de 40 x, barra de escala: 500 µm; b, d e F: ampliação de 400 x, barra de escala: 50 µm. Coloração: Hematoxilina
e Eosina.
Machine Translated by Google
DOI: https://doi.org/10.1080/09537104.2020.1775188 Avaliação in vivo da membrana plasmática desnaturada 7

perdeu aproximadamente 10% do seu volume original, demonstrando células plasmáticas; presença rara a moderada de linfócitos e macrófagos; e
estabilidade volumétrica superior ao longo do tempo (Figura 3). ausência de células gigantes (Figura 4c-d).
Após 21 dias, as células inflamatórias estavam ausentes e linfócitos e
macrófagos eram raros. Além disso, fibrose, necrose e infiltrado gorduroso
estavam ausentes, enquanto a presença de proliferação capilar focal mínima,
Grupo Simulado
de 1 a 3 gemas por campo, foi observada (Figura 4e-f).
Após sete dias, observou-se ausência de fibrose e infiltrado gorduroso com
mínima proliferação capilar focal, de 1 a 3 gemas por campo. Os escores
semiquantitativos para células polimorfonucleares, linfócitos e macrófagos
foram moderados; células gigantes e células plasmáticas eram raras; e havia Grupo L-PRF
ausência total de necrose (Figura 4a-b).
Após 7 dias, observou-se ausência de células gigantes e rara presença de
plasmócitos; entretanto, a infiltração de células polimorfonucleares, linfócitos e
Após 14 dias, fibrose, infiltrado gorduroso e necrose estavam ausentes;
macrófagos foi moderada. Um grupo de 4 a 7 capilares – juntamente com
além disso, foi observada proliferação capilar focal mínima – de 1 a 3 gemas
estruturas fibroblásticas de sustentação – foi observado para cada campo
por campo. Havia apenas uma discreta presença de células inflamatórias,
avaliado, caracterizando neovascularização moderada (Figura 5a-b). Depois
como polimorfonucleares e

Figura 6. Fotomicrografias do grupo H-PRF. a e b: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido conjuntivo (TC) com
células inflamatórias intensas e difusas (*) circundando o PRF (PRF). tecido adipócitos (AT) são observados acima do epitélio. c e d: círculo: epiderme e
derme papilar com folículo piloso (HF), tecido conjuntivo recobrindo (TC) com células inflamatórias focais moderadas (*) ao redor de PRF (PRF), fibras
musculares (MF) e tecido adiposo (AT) são anotados . e e f: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recuperando tecido conjuntivo
(TC). células focalmente inflamatórias fibras musculares estriadas (seta). A PRF não foi observada neste período. a e b: 7 dias; c e d: 14 dias; e e f: 21
dias. a, c e e: ampliação de 40x, barra de escala: 500 µm; b, d e f: ampliação de 400x, barra de escala: 50 µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina.
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8 E. Gheno et al. Plaquetas, Early Online: 1–13

Aos 14 dias de implantação, a presença de linfócitos e macrófagos Grupo H-PRF

foi constante, enquanto foi detectada diminuição de
Os resultados do grupo L-PRF e do grupo H-PRF foram
polimorfonucleares e plasmócitos em comparação ao grupo de 7 dias.
comparáveis quanto à biocompatibilidade e resposta inflamatória.
Não foram observadas reações teciduais como necrose, fibrose e
Após 7 dias da implantação, observou-se presença moderada de
infiltrados gordurosos, sendo observada proliferação capilar mínima
polimorfonucleares e macrófagos, enquanto os plasmócitos eram
(1 a 3 gemas por campo) (Figura 5c-d). Após 21 dias, observou-se
raros e as células gigantes e necrose estavam ausentes (Figura 6a-b).
que todas as células da inflamação diminuíram significativamente
A redução no número de células inflamatórias foi dependente do
devido à reabsorção da membrana L-PRF. A exceção a isso foram
tempo ao longo do período de estudo. No dia 21, menos células
os linfócitos que - embora raros - estavam presentes (Figura 5e-f).
foram observadas e menos neovascularização (de moderada a rara) foi

Figura 7. Fotomicrografias do grupo Alb-Prf. a e b: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido conjuntivo (TC) com
células inflamatórias moderadas e focais (*) circundando PRF (PRF). Destacando a presença de grupos leucocitários no interior da membrana (seta
branca); c e d: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido conjuntivo (TC) com células inflamatórias moderadas (*)
circundando PRF (PRF); E e F: círculo: epiderme e derme papilar com folículo piloso (HF), recobrindo tecido conjuntivo (TC) com células inflamatórias
dispersas (*) circundando PRF); presença de grupos leucocitários no interior da membrana (seta branca) aeb: 7 dias; c e d: 14 dias; e e f: 21 dias. a,
c e e: ampliação de 40 x, barra de escala: 500 µm; B, D e F: ampliação de 400 x, barra de escala: 50 µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina.
Machine Translated by Google
DOI: https://doi.org/10.1080/09537104.2020.1775188 Avaliação in vivo da membrana plasmática desnaturada 9

Tabela III. Avaliação semiquantitativa utilizada para avaliar a reação do tecido e a biocompatibilidade, conforme destacado na ISO 10993-6. O presente
exemplo é para os 5 animais avaliados aos 7 dias para o grupo L-PRF. Foram avaliadas 5 secções por animal.

7 dias Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5

L-PRF 1234512345 123 45123451 2345

Células polimorfonucleares 22322 3322132221212233 12122 1

Linfócitos 2222212222222132112121222221222231000000 22222222
Células plasmáticas 0000010 0 010 0 10 O
0010
1010000 1 1211 10133 222111 1
Macrófagos 33 11 11 1
Células gigantes
Necrose 0000000000000000000000000
Pontuação de células inflamatóriasSoma = 8, 8, 8, 8, 8 Soma = 6, 7, 4, 8, Soma = 7, 8 7, 6, 7, 6 Soma = 7, 9, 8, 9, 5 Soma = 6, 6, 6, 7,
SUBTOTAL (X 2) 6 16, 16, 16, 16, 16 7 12, 14, 8, 16, 14 14, 16, 14, 12, 14, 12 14, 18, 16, 18, 10 12, 12, 12, 14, 12
Neovascularização 1211223033122111112201211
Fibrose 0000000000000000000000000
Infiltrado gorduroso 0000000000000000000000000
SUBTOTAL da resposta do tecido 1 2 1 12230331221 1 1 1 1220121 1
TOTAL 17 18 17 17 18 14 17 8 19 17 15 18 16 15 13 15 19 17 20 12 12 13 14 15 13
MÉDIA 17,4 15 15,4 16,6 13,4

presente (Figura 6c-f). É importante notar que a degradação da membrana L-
PRF ocorreu um pouco mais rápido do que a da membrana H-PRF, resultando
na presença de mais células inflamatórias aos 21 dias quando comparados os
dois grupos.
Grupo Alb-PRF
Após 7 dias, menos células inflamatórias foram observadas para todos os tipos
de células neste grupo. Poucos macrófagos e células gigantes, juntamente com
a presença de neovascularização foram observados neste momento inicial
(Figura 7a-b). Após 14 dias, o número de células inflamatórias aumentou
gradativamente de maneira semelhante aos demais grupos (Figura 7c-d). Aos
21 dias, o número de células inflamatórias continuou a diminuir, juntamente
com a neovascularização local (Figura 7e-f).
Fibrose, necrose, infiltrado gorduroso e células gigantes não foram relatados
neste grupo. Vale ressaltar também que, em comparação aos outros grupos, o
grupo Alb-PRF foi relativamente estável, com pouca reabsorção ao longo do
tempo.
Análise Semi-Quantitativa de acordo com a Norma ISO 10993-6
Após uma análise descritiva das membranas PRF implantadas, um sistema de
avaliação semiquantitativa que utilizou pontuação foi implementado de acordo
com a ISO 10993-6. A Tabela III demonstra uma avaliação amostral do grupo
L-PRF aos 7 dias (todos os dados podem ser encontrados na Tabela I
complementar). A pontuação foi realizada de acordo com as normas ISO, onde
a resposta inflamatória tecidual pode ser observada e comparada com a de
outros grupos.
A Figura 8 demonstra as respostas inflamatórias das células inflamatórias
(Figura 8a-f), juntamente com a reação geral do tecido (Figura 8g h), com os
resultados finais calculados relatados na Figura 8i. Observe que, devido à
natureza autóloga do PRF, todos os grupos responderam extremamente
favoravelmente - com apenas leves aumentos na inflamação - em comparação
com o controle Sham negativo (Figura 8).
uma superfície muito densa com deposição evidente de uma camada de
proteína desna turizada que revestiu completamente as fibras de fibrina e
circundou células e plaquetas aprisionadas (Figura 9c).
A capacidade das membranas de retenção ou produção de fatores de
crescimento foi avaliada através de um ensaio de eluição in vitro .
A Figura 10 demonstra a liberação do fator de crescimento de PDGF, VEGF e
FGF2 após 7 dias de eluição no meio de cultura.
Enquanto a liberação média de FGF2 de todos os grupos foi semelhante, uma
liberação significativamente maior (p < 0,05) de VEGF e PDGF foi observada
no grupo H-PRF, com concentrações finais aproximadamente duas vezes
maiores do que as encontradas para o L - Grupos PRF e Alb PRF (Figura 10).
Discussão
O objetivo da GBR é excluir células de tecido mole de crescimento mais rápido
do tecido ósseo subjacente. Para conseguir isso, é necessária uma manutenção
adequada do espaço durante um período de 2 a 3 meses[4].
As membranas de barreira de colágeno de origem animal são mais
frequentemente utilizadas devido à sua biocompatibilidade com o tecido humano.
No entanto, estratégias alternativas com melhor estabilidade da membrana ou
biocompatibilidade são necessárias para melhorar ainda mais os resultados
clínicos.
A fibrina rica em plaquetas já foi utilizada como uma membrana de barreira
regenerativa para vários procedimentos de GBR. Tem a vantagem de ser
completamente autólogo, mas estimula ainda mais a regeneração tecidual em
tecidos duros e moles, melhorando sua vascularização in vivo [20-22]. No
entanto, embora o PRF ofereça maior potencial regenerativo, ele se degrada
rapidamente in vivo, nas primeiras 2 a 3 semanas após a implantação.
Por essas razões, muitos autores recomendam o revestimento de membranas
de colágeno diretamente com PRF líquido ou colocando uma membrana PRF
padrão sobre uma membrana de barreira derivada de animais [23].
Mais de 20 anos se passaram desde que foi demonstrado que, ao aquecer

Caracterização da Membrana e desnaturar a albumina, uma modificação na estrutura secundária transforma

A avaliação ultraestrutural das membranas foi realizada por MEV, conforme
mostrado na Figura 9. A membrana PRF é caracterizada como uma densa rede
de fibrina com tramas unidas, semelhantes a fios de gaze, que aprisionam as
células entre as fibras (Figura 9a).
A membrana H-PRF foi similarmente caracterizada por uma malha de fibrina;
no entanto, teve uma presença aumentada de elementos celulares aprisionados
(Figura 9b). As membranas Alb-PRF demonstraram
a albumina em uma estrutura tridimensional, onde são criadas novas ligações
de hidrogênio e dissulfeto nas enzimas[24]. Isso favorece uma estrutura
tridimensional maior com mudanças drásticas em suas propriedades de
reabsorção e melhor estabilidade ao longo do tempo. [24]
Estudos anteriores já estudaram a mudança de temperatura para a
produção de membranas de fibrina [8,12,13,25]. Em 2015, Kawase et al.
investigaram as propriedades de degradação do PRF. Por
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10 E. Gheno et al. Plaquetas, Early Online: 1–13

Figura 8. Resposta das células inflamatórias (8A-F) e reação geral do tecido. (8 G, H) com os resultados finais calculados relatados em I. Observe que todos os
grupos responderam extremamente favoravelmente com apenas leves aumentos na inflamação quando comparados ao controle Sham negativo (dados ± desvio
padrão; p < 0,05;
grupo* L-PRF).
representa significativamente maior quando comparado ao grupo controle L-PRF; # representa significativamente menor quando comparado ao

Figura 9. Micrografias eletrônicas de varredura das membranas (a) L-PRF, (b) H-PRF e (c) Alb-CGF obtidas com um microscópio eletrônico de varredura (JEOL
JSM-6490 LV, JEOL, Japão) a 15 kV.

aplicando o tratamento térmico às membranas PRF padrão através da
compressão da membrana, as propriedades de reabsorção das membranas
PRF foram dramaticamente melhoradas[8]. Embora tenham sido relatados
benefícios em termos de estabilidade, uma das limitações foi o fato de que,
durante o processo de aquecimento, as células normalmente passam por
apoptose e a atividade do fator de crescimento é drasticamente reduzida
durante sua desnaturação.
Uma pesquisa recente discutiu a necessidade de melhorar o manuseio do
PRF, uma vez que possui propriedades de rápida degradação com baixa
resistência à tração [25]. Eles, portanto, produziram uma membrana PRF estéril
e saturável criando um sistema fechado de seringa única (hypACT Inject) para
produzir uma membrana PRF com melhores características de manuseio por
um método de congelamento-descongelamento. Eles encontraram significativamente
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DOI: https://doi.org/10.1080/09537104.2020.1775188
Figura 10. Avaliação da liberação dos fatores de crescimento PDGF (A), VEGF (B) e FGF2 (C) do grupo L-PRF, H-PRF e Alb-PRF, respectivamente, após
7 dias de eluição em meio de cultura celular. As barras representam a média ±DP de três réplicas biológicas e cinco técnicas. Um asterisco indica uma
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p < 0,005).
maior resistência à tração, maior adesão celular e menor taxa de degradação das
membranas.
Ao contrário de qualquer PRF produzido anteriormente, Mourão et al propuseram
a utilização da camada de PPP como o componente tratado termicamente com
propriedades estendidas de reabsorção de PRF, juntamente com vantagens como
estabilidade da membrana ao longo do tempo[12]. No entanto, isso precisava ser feito
garantindo a retenção de células da camada de buffy coat e usando fatores de
crescimento para manter as propriedades regenerativas do PRF dentro da camada de
PPP aquecida [12]. Também foi demonstrado que essas membranas mantêm sua
capacidade de liberar fatores de crescimento por um longo período de tempo,
favorecendo a migração e proliferação de fibroblastos, além de induzir a síntese de
colágeno [13].
Neste estudo, observou-se mais uma vez que a liberação de fatores de crescimento de
Alb-PRF foi semelhante à de L-PRF e que o
O grupo H-PRF demonstrou níveis significativamente mais altos de fator de crescimento
do que qualquer um dos grupos[26].
O principal objetivo deste estudo foi investigar a biocompatibilidade e estabilidade
in vivo de membranas Alb-PRF em comparação com dois protocolos padrão utilizados
para a produção de PRF.
Verificou-se que todas as membranas PRF demonstraram excelente
biocompatibilidade, semelhante ao controle negativo (grupo Sham).
No entanto, vale ressaltar que, enquanto os protocolos padrão de L-PRF e H-PRF
demonstraram uma redução no tamanho da membrana entre 7 e 14 dias - e reabsorção
quase completa em 21 dias - observou-se que a membrana Alb-PRF manteve seu
volume
estabilidade mesmo aos 21 dias. Além disso, deve-se notar que pequenos roedores
têm uma taxa metabólica extremamente rápida em comparação com humanos;
portanto, a capacidade de manter a estabilidade do volume mesmo após 21 dias
correlaciona-se bem com relatórios demonstrando meses
Avaliação in vivo da membrana plasmática desnaturada 11
de estabilidade de volume de Alb-PRF quando usado como um enchimento biológico
ou membrana de barreira.
As propriedades de reabsorção estendidas de Alb-PRF têm inúmeras vantagens
em uma variedade de procedimentos clínicos. Além disso, o processamento adicional
adiciona apenas 10 a 20 minutos ao tempo de protocolo atual para PRF regular. Com
base nessas observações, é possível criar um verdadeiro biomaterial de “barreira” ou
“preenchimento” derivado de sangue total 100% autólogo, com propriedades de
reabsorção drasticamente melhoradas. Além disso, a capacidade de coletar facilmente
vários frascos de amostras de sangue de 10 mL torna este biomaterial extremamente
útil, especialmente para colheita de veias periféricas a um baixo custo. Atualmente
está sendo investigado na prática clínica para uso durante grandes procedimentos de
GBR em odontologia com uma malha de titânio. Os relatórios demonstraram uma taxa
de exposição de até 50% ao titânio [27–30]. Enquanto os médicos praticantes têm
utilizado PRF padrão sobre titânio para minimizar
exposição, a capacidade de criar uma membrana Alb-PRF mais duradoura
provavelmente proporcionará benefícios clínicos adicionais. Também serve como um
biomaterial atraente para vários pacientes que desejam evitar o uso de produtos
derivados de animais e preferem ser tratados com soluções autólogas mais naturais.
A pesquisa clínica futura será fundamental para entender melhor o potencial e usos
clínicos da Alb-PRF na prática médica.
Este estudo revelou a excelente biocompatibilidade de todos os grupos PRF
investigados quando implantados por via subcutânea de acordo com a ISO 10993-6.
Apenas uma resposta inflamatória leve foi relatada para todos os grupos, com
resultados comparáveis observados entre os grupos L-PRF, H-PRF e Alb-PRF. Vale
ressaltar que, dentro do presente estudo, o uso do
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12 E. Gheno et al.
A membrana plasmática desnaturada em combinação com PRF líquido (Alb-
PRF) foi suficientemente estável em volume em todos os momentos,
enquanto que ambos os grupos L-PRF e H-PRF mostraram reabsorção
significativa ou completa em 14 dias. Este estudo demonstra - pela primeira
vez, uma melhoria acentuada na estabilidade da membrana de Alb-PRF,
com potencial futuro significativo para uso como membrana de barreira
biológica para procedimentos de GBR e como material de preenchimento
biológico em várias aplicações médicas estéticas. Portanto, pode
potencialmente ser utilizado de maneira semelhante como um biomaterial
de xenoenxerto, como membranas de colágeno derivado de suínos, com
propriedades de degradação semelhantes, mas derivadas 100% de fontes
autólogas. Ao utilizar a membrana no local, ela retém células vivas que
contribuiriam ainda mais para a regeneração dos tecidos.
É importante estudar a presença da albumina na cicatrização do tecido
ósseo, como ativador de células progenitoras endógenas, tornando-se um
possível adjuvante eficaz e seguro aos procedimentos regenerativos
ósseos[31]. Este processo de incorporação de Alb-PRF com biomateriais
para defeitos ósseos ou mesmo seu uso isolado como substituto ósseo será
estudado em futuros estudos in vivo e ECRs.
Reconhecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro das agências governamentais brasileiras
CAPES e FAPERJ (número de concessão: E-26/202.713/2019).
Financiamento
This work was supported by the Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro [E-26/202.713/2019].
Declaração de Declaração de Interesse
Richard J Miron declara que possui propriedades intelectuais para os dispositivos
Bio PRF e Bio-Heat utilizados neste estudo. Todos os outros autores declaram
não ter conflito de interesses.
Material Suplementar
O material complementar para este artigo pode ser acessado aqui.
ORCID
Carlos Fernando de Almeida Barros Mourão http://orcid.org/
0000-0001-5775-0222
Adriana Terezinha Alves http://orcid.org/0000-0002-3665-
6568
Mônica D. Calasans-Maia http://orcid.org/0000-0001-5759-
7926
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