Brucella 2008-1

VETERINÁRIA UFRGS
BACTERIOLOGIA
Microbiologia Clínica VET3225
www.ufrgs.br/labacvet
Gênero Brucella spp
Prof. Marcos J. P. Gomes
SINÔNIMOS:
Nos Bovinos, Doença de BANG, Aborto Contagioso, Aborto Infeccioso, Aborto Enzoótico
e "Slinking of the calf".
Nos Suínos, Aborto Contagioso.
No Homem, Febre Ondulante, Febre de Malta ou do Mediterrâneo, Febre Maltesa, Febre de
Bang.
INTRODUÇÃO
Cocos, cocobacilos ou bastonetes curtos com 0,5-0,7 X 0,6-1,5 µm. Arranjos
individuais e, menos freqüentemente aos pares ou como cadeias curtas ou mesmo em
pequenos grupos. Cápsula verdadeira não é produzida. Geralmente não mostram coloração
bipolar verdadeira. Formas de resistência não são conhecidas. Gram negativas. Imóveis a
não flageladas. Aeróbias, possuindo metabolismo do tipo respiratório. Possui um sistema
de transporte de elétrons baseado no sistema citocromo, e como aceptor final de
elétrons, oxigênio ou nitrato. Nitrato redutase é produzido. Muitas amostras requerem
CO2 suplementar para seu crescimento, especialmente no cultivo primário. As colônias
no agar dextrose ou outro meio claro são transparentes, elevadas, convexas com bordos
inteiros, lisos e com superfície brilhante. Elas possuem cor de mel quando iluminadas com
luz transmitida. Variantes não lisas de espécies lisas existem. Existem também espécies não
lisas estáveis com uma preferência por determinados hospedeiros (caninos e ovinos).
Temperatura ótima é de 37ºC. O crescimento ocorre entre 20ºC - 40ºC e pH ótimo entre 6,6
a 7,4. Catalase positiva e geralmente oxidase positiva, mas existem cepas negativas.
Quimiorganotróficas. A maioria das cepas requer meios de cultivo seletivo e complexo,
contendo aminoácidos, tiamina, nicotinamida e íons de magnésio. Algumas cepas podem
ser induzidas ao crescimento em meio mínimo, contendo sais de amônio como única
origem de nitrogênio. O crescimento é promovido pela adição de soro ou sangue, entretanto
hemina (Fator X) e nicotinamida adenina dinucleotídio (NAD Fator V) não são essenciais.
Produz ácido, mas não de carboidratos em meios convencionais, exceto para a B.
neotomae. Não produz indol. Não liquefaz a gelatina ou soro coagulado. Não lisa hemácia
e não produz metil carbinol (Teste de Voges-Proskauer). Vermelho de metila negativo.
Possuem antígenos intracelulares específicos para o gênero. São parasitos intracelulares.
São agentes transmissíveis para muitas espécies animais, incluindo o Homem.
HISTÓRICO:
A primeira espécie do gênero Brucella foi isolada, em 1887, por David Bruce, em
amostras (baço) colhidas durante a necropsia de militares que morreram vítima dessa
enfermidade nas costas do Mediterrâneo ou com Febre de Malta. O organismo foi mais
tarde denominado de Brucella melitensis. Dez anos mais tarde, em 1897, um veterinário
dinamarquês chamado Bernard Bang, isolou a Brucella abortus de um feto bovino
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abortado. A B. suis foi isolada, em 1914, por Jacob Traum, de um leitão abortado. Na Nova
Zelândia, uma doença genital de ovinos foi associada ao organismo do gênero Brucella spp
por M.B. Buddle & Boyes, em 1953. Um organismo, provavelmente idêntico ao isolado na
Nova Zelândia foi isolado de carneiros infectados por Simmons & Hall, em 1953. A B.
neotomae foi isolada, pela primeira vez, em roedores do deserto de Nevada, em 1957, por
Stoenner, nos EUA e a B. canis foi isolada em 1966, nos EU e, posteriormente descrita por
Carmichael, em 1969. As espécies B. ovis e a B. canis são mais adaptadas aos seus
hospedeiros do que a B. abortus, B. melitensis ou a B. suis. Em 1994, novas espécies do
gênero Brucella spp foram isoladas e identificadas de focas e cetáceos, nas costas da
Escócia, por Ross e colaboradores e nos EU de um golfinho capturado, por Ewalt e
colaboradores. As amostras isoladas desses animais marinhos e os testes sorológicos
demonstraram que a infecção brucélica ocorre em um grande numero de espécies marinhas.
CARACTERÍSTICAS DO GÊNERO
O gênero Brucella contém até o presente momento, 6 espécies e um hospedeiro
principal: B. abortus (bovinos); B. melitensis (caprinos); B. suis (suínos); B. canis
(caninos); B. ovis (ovinos) e B. neotomae (rato do deserto, Neotomae lepida). Todas,
exceto a B. neotomae são importantes patógenos para os animais domésticos e o Homem,
causando uma doença que é denominada genericamente de brucelose.
As alterações causadas pela brucelose são encontradas nos órgãos reprodutores e
tecido retículo-endotelial. As lesões no trato reprodutor, na placenta e no feto de bovinos,
ovinos, suínos e caprinos levam à infertilidade, associadas ou não ao abortamento e com
perdas econômicas importantes.
A facilidade com que algumas espécies do gênero Brucella podem ser transmitidas
(direta ou indiretamente) aos animais e ao homem mostra a importância no controle desta
enfermidade.
As características culturais e morfológicas não são suficientemente para diferenciar
as 6 espécies ou os seus vários biovares. Não podemos sempre associar o isolamento de
uma espécie ou biotipo a um hospedeiro, muito embora, cada espécie tenha predileção por
certos hospedeiros. O isolamento de bastonetes Gram negativos de amostras suspeitas de
brucelose requerem observância dos testes laboratoriais antes da identificação final da
espécie ou biotipo, conforme a Tabela 1.
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Brucella abortus
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BRUCELOSE BOVINA
INTRODUÇÃO
O isolamento de Brucella abortus foi obtido nas diversas populações bovinas
distribuídas pelo mundo, muito embora seja rara em países onde houve programas bem
sucedidos de controle ou erradicação da brucelose bovina.
MORFOLOGIA & COLORAÇÃO

A B. abortus é um bastonete curto ou cocobacilo, medindo 0,5 a 0.7 por 0,6 a 1,5
µm. Os bastonetes são tão curtos que podem ser facilmente confundidos com cocos. Eles
estão presentes em arranjos individuais, muito embora possam formar cadeias curtas. A B.
abortus por ser um parasito intracelular facultativo é freqüentemente encontrada em
aglomerados e em esfregaços de exsudatos. A B. abortus é Gram negativa, corando-se, com
alguma dificuldade, pelos corantes comuns. Ela não é álcool ácido resistente, mas pode
resistir à descoloração com alguns ácidos fracos; esta propriedade confere a base para
algumas colorações especiais tais como a coloração de KÖSTER em que o organismo cora-
se de vermelho vivo. B. abortus não é móvel, não forma esporos e não possui cápsula bem
desenvolvida. A presença desta cápsula pode ser demonstrada em cepas isoladas, utilizando
corantes especiais.
RESISTÊNCIA
Todas as espécies são mortas pela pasteurização em 10 e 15 minutos; são destruídas
rapidamente pelos desinfetantes comuns tais como os compostos do cresol 3% ; hidróxido
de sódio a 2%; compostos de ortofenóis 3-5% ; mercuriais e álcool 70%.
SOBREVIVÊNCIA
Geralmente é aceita que o crescimento de B. abortus fora da célula dos mamíferos
hospedeiros não tem importância na epidemiologia da doença, pois ela não multiplica fora e
somente persiste no ambiente. A viabilidade dela fora do hospedeiro é influenciada pelas
condições ambientais. Assim, a viabilidade é aumentada em temperatura mais amena e
umidade e diminuída quando há alta temperatura, luz solar direta e ao dessecamento.
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Quadro 1. As principais espécies de Brucella spp e seus hospedeiros.
Hospedeiros Espécie Principal Outras espécies

_______________________________________________________________________________
Bovinos B. abortus B. melitensis**
B. suis
Ovinos B. melitensis** B. abortus
B. ovis (Epididimite)
Caprinos B. melitensis** B. abortus

Eqüinos B abortus B. suis
Suínos B. suis B. melitensis**
B. abortus
Caninos B. canis B. abortus
B. melitensis**
B. suis
Homem B. abortus B. canis
B. melitensis**
B. suis
Roedores B. neotomae
**Não Há registro de infecção pela B. melitensis no Brasil, até o presente momento.
Quadro 2. Sobrevivência da B. abortus, segundo as Condições Ambientais e o Tempo.
Ambiente Tempo
Luz direta 4,5 h
Solo
Seco 4 dias
Úmido 66 dias
Frio 151 – 185 dias
Fezes
Fluidas 8 –240 dias
Altas Temperaturas 2 dias
Urina 5 dias
Água
Tratada 5 – 114 dias
Poluída 30 – 150 dias
Feto à sombra 180 dias
A resistência fora do corpo do hospedeiro é de aproximadamente: 5 dias em estopa

à temperatura ambiente; 30 dias em estopa no porão; 37 dias quando secas lentamente no
solo; 75 dias no feto abortado em clima temperado.
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O tempo de sobrevivência nas fezes parece ter importância, especialmente em
muitos sistemas produtivos. O tempo de sobrevivência das fezes líquidas varia, sendo
dependente da temperatura de estocagem; na temperatura de 45 – 50 ºC a sobrevivência da
B. abortus é de 4 horas, enquanto que na temperatura de 15ºC é de aproximadamente 8
meses.
Outras fontes de Infecção

Podemos citar o papel dos animais silvestres, touros, eqüinos, caninos e
transferência de embriões.
O papel dos touros na transmissão da Brucella abortus tem sido objeto de muitas
investigações. A B. abortus pode causar orquite, epididimite e vesiculite seminal e a
localização nesses lugares resulta na eliminação do agente pelo sêmen. Seu potencial de
transmissão está associado ao método de reprodução (monta natural, I.A.) e,
freqüentemente touros infectados permanecem funcionalmente férteis.
Eqüídeos domésticos são susceptíveis à infecção com B. abortus havendo pouca
evidência que sugira que eles possuam um papel significante na epidemiologia da doença.
A B. abortus geralmente localiza-se na bursa, tendões, músculos e articulações assim como
tecidos e trato reprodutivo. O achado clínico clássico é o abscesso fistulado denominado
“Mal das cernelhas” ou “Mal das Cruzes”.
CARACTERISTICAS CULTURAIS & BIOQUÍMICAS

O crescimento é aeróbio, mas muitas cepas necessitam tensão aumentada de CO2
para o seu crescimento, especialmente no isolamento primário (B. abortus e B. ovis). A B.
abortus é catalase e oxidase positivas, produzindo H2S de proteínas ou peptídeos ricos em
aminoácidos e enxofre. Geralmente produz urease. Há 8 biotipos reconhecidos pelos
seguintes testes: sensibilidades aos corantes; necessidade de CO2 ; produção de H2S e
presença do antígeno de superfície A ou M.
A B. abortus não é hemolítica não liquefaz a gelatina e não produz ácido da glicose
ou outro carboidrato, possuindo um padrão de oxidação de substrato.
O crescimento de B. abortus é incrementado pela adição de sangue ou soro. Meios
com composição complexa tais como soro dextrose agar ou Albimi Brucella agar ou caldo
devem ser utilizados no isolamento primário e / ou na manutenção de cepas. Muitos
antimicrobianos podem ser adicionados ao meio básico (polimixina B 5.000 UI/L;
bacitracina 25.000 UI/L; ciclohexamida 100 mg/L; ácido nalidíxico 5mg/L; nistatina
100.000UI/L e vancomicina 20 mg/L), inibindo o crescimento de contaminantes em
amostras de: placenta, secreções vaginais, leite ou do abomaso do feto abortado.
As colônias de B. abortus no isolamento primário são de crescimento lento e,
raramente visíveis, antes das 48 horas. Elas atingem o crescimento máximo após 5 a 7 dias
a 37ºC. As colônias isoladas podem ser do tipo lisa, caracterizada por serem colônias
convexas, redondas com o bordo inteiro ou podem estar dissociadas até rugosas
caracterizadas por serem colônias chatas, grandes com aparência granular e opaca. O
crescimento é esparso no meio fluido.
A quantidade de C+G do ADN é de 57 B. abortus mostra 100% de homologia com
as outras brucelas, exceto a Brucella ovis.
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FAGOTIPAGEM
A fagotipagem é utilizada para identificar culturas de espécies de Brucella spp,
incluindo as amostras de B. abortus. Os fagos normalmente utilizados na rotina são as
cepas: Tb, Wb, Fi, Bk2 e R. A diluição do fago é conhecida como RTD (“Routine Test
Dilution”) que corresponde a 104-105 unidades formadoras de placas por mililitro
(UFP/ml). O RTD é o número mínimo de fagos responsável pela lise confluente numa cepa
propagante. Os procedimentos para fagotipagem são descritos em detalhes por Corbel &
Hendy (1985). A fagotipagem é uma ferramenta rápida e segura na identificação de
espécies do gênero Brucella.
ANTÍGENOS
A parede celular da B. abortus consiste de uma camada externa de
lipopolissacarídio nas quais as cadeias de polissacarídeos são expostas. As cadeias de
polissacarídeos possuem o antígeno de superfície principal (A ou M) os quais estão
envolvidos nas reações de aglutinação. Estes antígenos de B. abortus cepa lisa estão
relacionadas com antígenos de superfícies encontrados na Yersinia enterocolitica 09, sendo
fonte de confusão na interpretação de testes sorológicos para a brucelose.
As proteínas da parede celular estão agrupadas em 3 categorias de acordo com o peso
molecular (PAGE-SDS). As proteínas possuem:
a) 8.000 a 94.000
b) 35 000 a 40.000 (porinas) e
c) 25.000 a 30.000.
Se Aceita que o antígeno protéico estimula a reação de hipersensibilidade retardada,
provavelmente uma porina. Os antígenos envolvidos na resposta celular não estão
identificados.
EPIZOOTIOLOGIA
A B. abortus é um organismo intracelular facultativo de bovinos, e algumas
espécies de ruminantes, sendo transmitido pela ingestão do alimento ou secreções
contaminadas. A transmissão venérea é possível, mas pouco comum. A transmissão
congênita ou intramamária pode também ocorrer. Eqüinos, ovinos, aves e cães podem
infectar-se, mas a transmissão, nestas espécies, para o hospedeiro primário é pouco
provável. A doença é encontrada em todas as regiões criatórias de bovino no mundo, exceto
nas áreas onde os programas de erradicação tiveram sucesso.
A B. abortus não é resistente à luz solar e à dissecação, sobrevivendo mais no
inverno do que no verão. Sobrevive no leite, mas é destruída pela pasteurização.
No Brasil, a brucelose foi detectada pela primeira vez por Gonçalves Carneiro, em
1913, que fez o relato de um caso de brucelose humana. Desde lá vários inquéritos
epidemiológicos revelaram a presença da enfermidade nos animais domésticos de todo o
país. A brucelose bovina causada pela B. abortus é a mais prevalente das infecções
brucélicas no Brasil seguida da B. suis em suínos. A B. melitensis e a B. neotomae nunca
foram isoladas no país (Poester et al., 2002).
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A perda econômica com a brucelose bovina foi estimada, em 1971, como algo em
torno de 32 milhões de dólares anuais (Poester et al., 2002)
Em 1977, um levantamento nacional mostrou a prevalência para cada região do
país. Sendo assim a região Norte apresentou uma prevalência de 4,1%; a região Nordeste
com 2,5%; a região Centro-Oeste com 6,8%; Sudeste com 7,5% e região Sul com 4%.
(Brasil, 1977).
Tabela 2. Características Diferenciais do gênero Brucella e seus Biovares.
__________________________________________________________________________________
C r e s c i m e n t o em c o r a n t e s A g l u t i n a ç ã o do s o r o
Espécies Biovar CO2 H2S Tionina Fucsina básica A M R
_________________________________________________________________________________
B. melitensis 1 n n + + n + n
2 n n + + + n n
3 n n + + + + n
B. abortus 1 (+) + n + + n n
2 (+) + n n + n n
3 (+) + + + + n n
4 (+) + n (+) n + n
5 n n + + n + n
6 n n + + + n n
7 +/- + + + + + n
9 n + + + n + n
B. suis 1 n + + n + n n
2 n n + n + n n
3 n n + + + n n
4 n n + (-) + + n
5 n n + n n + n
B. canis n n + (n) n n +
B. ovis + n + n n n +
B. neotomae n + (n) n + n n
* n = negativo- + = positivo
No Rio Grande do Sul, poucos levantamentos regionais revelaram que a situação

pouco mudou desde então. O programa bem sucedido de vacinação contra a brucelose
bovina fez despencar a prevalência de 2% para 0, 6% em 1986.
Conforme os dados oficiais, a prevalência da brucelose bovina no Brasil variou
entre 4-5%, no período de 1989-1998 (Brasil, 2001). Estudos realizados no país
mostraram que foram isolados e identificados a B. abortus biovares 1,2 e 3 e B. suis,
segundo Garcia-Garrillo, em 1987.
Giorgi et al. (1972), em São Paulo, isolaram 23 amostras de B. abortus e B. suis de
bovinos, suínos e eqüinos.
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No Rio Grande do Sul, Poester (1974; 1977) isolaou B. abortus biótipo 1 e B. suis
de bovinos, eqüinos e suínos
No Rio de Janeiro, Langenegger et al. (1975), isolaram e identificaram 10 amostras
B. abortus, sendo 4 cepas de B. abortus biotipo 1 e 6 do biotipo 3 de bovinos em
matadouro.
A maioria dos casos de brucelose humana está ligada a atividade profissional do
trabalhador e essencialmente relacionada com o magarefe.
A prevalência da infecção humana ou animal muito provavelmente esteja
subestimado, pois dispomos de um número reduzido de trabalhos sobre esses assuntos.
Em Minas Gerais, Godoy et al. (1977) estimaram em 0,28%de reagentes dentre
9360 amostras de doadores de sangue.
Barufa (1978), no Rio Grande do Sul, evidenciaram que a enfermidade era mais
freqüente em pessoas da zona rural; mais freqüente no homem do que na mulher e que o
consumo de queijo não pasteurizado seria a fonte de infecção para o homem.
Nos EU, 85% das infecções são causadas pelo biotipo 1; as remanescentes pelo
biotipo 2 e 4. As propriedades com maior tamanho são mais prováveis de possuírem
infecções maiores que as pequenas propriedades pela manutenção de animais, latentemente
infectados. O uso de áreas de pastejo comunitárias pode ser um fator na transmissão de B.
abortus entre as propriedades.
Há relatos, nos EUA, de infecção por B. abortus em várias espécies silvestres tais
como: bisão, veado e alce. O convívio destas espécies com bovinos aumenta a possibilidade
da ocorrência de infecções cruzadas, representando uma via pouco freqüente. Na África, a
situação parece ser bem diferente, ocorrendo casos de brucelose bovina devido à
transmissão através dos animais silvestres.
Os animais pré-púberes, geralmente são resistentes à infecção, mas há um aumento
da suscetibilidade à infecção com o amadurecimento sexual e prenhez. A infecção da
terneira pode ocorrer no útero da mãe ou pela ingestão de leite contaminado.
Animais expostos podem desenvolver infecções latentes que não são detectáveis
através de testes sorológicos. A freqüência de tais infecções está estimada em 2 a 3 % dos
animais expostos. Os animais com infecção latente podem permitir a transmissão da
infecção ao produto e disseminar a brucelose em uma propriedade (tida como) limpa.
Os machos são resistentes à infecção, mas já foi registrada ocorrência de epididimites e
orquites, entretanto estes touros podem transmitir a brucelose através do seu sêmen.
A principal porta de entrada da B. abortus é a mucosa oral de terneiros ou
terneiras que ingerem leite contaminado; a nasofaringe e a mucosa conjuntival e, mais
raramente, o trato genital de machos e de fêmeas. Sob condições experimentais, o
organismo penetra as peles íntegras de cobaias, suínos e bovinos. Após a penetração a B.
abortus dirige ao linfonodo regional e, posteriormente a corrente circulatória sangüínea. A
fase de bacteremia resulta na disseminação do organismo ao úbere, útero e linfonodos
associado.
A B. abortus é uma bactéria intracelular facultativa, podendo sobreviver e
multiplicar-se em macrófagos e células epiteliais. A sobrevivência nas células fagocíticas
do hospedeiro, em parte, está relacionada à falha do organismo em estimular um nível
efetivo de desgranulação após a ingestão do agente. Este efeito é mais aparente em B.
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abortus com variantes lisas do as rugosas. A B. abortus possui uma resistência natural à
morte intraleucocitária.
O organismo prolifera, maciçamente em células com altos níveis de eritritol, como
aquelas encontradas no trato genital de machos e de fêmeas prenhes. Os organismos
penetram nas células epiteliais do córion e proliferam, produzindo placentite e endometrite
com ulceração da camada de revestimento do útero. As lesões no feto incluem: edema,
congestão pulmonar, hemorragias do epicárdio e da cápsula esplênica. A morte fetal segue,
mas não é certo que seja devido às endotoxinas da B. abortus ou interferência da função
placentária.
A presença do organismo induz a inflamação das membranas, interferindo com a
circulação do feto pode explicar o porquê do aborto. O organismo é encontrado no
estômago e pulmões do feto abortado O aborto, geralmente ocorre no terço final da
prenhez.
Após o parto ou aborto a B. abortus está presente nas descargas uterinas por poucos
dias, sendo gradualmente eliminadas do trato reprodutivo. A infecção pode ser mantida
sistema microcítico fagocitário e úbere. Grande número de organismos é eliminado no leite
o qual é fonte de infecção para terneiros e para o Homem. A maioria dos animais infectados
permanece portador por toda a vida, eliminando o organismo no exsudato e no leite, após
cada parto. A B. abortus pode ser, ocasionalmente encontrada nos linfonodos do trato
digestivo e no baço de animais infectados, podendo também ser encontrado no sangue e em
higromas do joelho. O higroma da articulação do joelho possui alta correlação com abortos
causados por B. abortus em animais no continente africano. Grande número de organismos
virulentos está presente no fluido.
B. abortus pode infectar eqüinos em uma freqüência bem menor que a dos bovinos.
Nos eqüinos, as localizações preferenciais são: bursas, articulações ou bainhas tendíneas, e
tem sido encontrados em bursites supra-atlantal, bursites supra-espinosa e em cernelhas
fistulosas (Mal das cernelhas). Esta bactéria pode também infectar ovinos, caprinos e
suínos, mas numa freqüência menor.
IMUNIDADE
A B. abortus é um organismo intracelular facultativo, e assim facilmente escapa do
efeito bactericida do anticorpo ou complemento do plasma. A imunidade protetora
depende, principalmente da resposta celular na qual a atividade bactericida dos macrófagos
é iniciada, após a ativação das linfocinas pelos linfócitos T. A opsonização pelo anticorpo
aumenta a morte intracelular. Os organismos multiplicam-se mais lentamente, em
macrófagos de animais vacinados do que em animais controle.
O anticorpo humoral pouco está correlacionado com a imunidade protetora. Fêmeas
vacinadas com B19, quando terneiras, mostram-se resistentes ao desafio, após os títulos
caírem a níveis abaixo dos detectáveis. Entretanto grandes doses de soro hiperimune podem
interromper a difusão de Brucella spp nos animais infectados.
Após a infecção, aglutininas da classe IgM são as primeiras imunoglobulinas a
aparecerem no plasma, atingindo o seu pique em 2 semanas. Os anticorpos IgG aparecem
pouco mais tarde, superando os títulos de IgM em 4 a 6 semanas, permanecendo como
anticorpo dominante. Bovinos infectados possuem altos títulos de anticorpo não aglutinante
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da subclasse IgG1. Estes anticorpos não aglutinantes não possuem atividade opsonizante e
nenhum efeito sobre a eliminação do organismo e por isto foi sugerido que eles poderiam
contribuir com a cronicidade da infecção por B. abortus. Eles bloqueiam, competitivamente
os anticorpos IgM e IgG2. O tratamento com ácido pH 3,6 ativa esta habilidade
aglutinante.
Em bezerras vacinadas com a cepa 19, a produção de IgM aumenta rapidamente. O
anticorpo IgG1 eleva-se, mais lentamente, não atingindo altos níveis nem persistindo. Os
anticorpos de IgG1 são muito mais baixos nos animais vacinados do que dos animais
naturalmente infectados.
DIAGNÓSTICO
A infecção causada pela B. abortus pode ser identificada através:
a) Diagnóstico bacteriológico
b) Diagnóstico sorológico
c) Diagnóstico molecular.
Diagnóstico bacteriológico
O isolamento da B. abortus é acompanhado pelo cultivo no meio base como o agar
triptose ou agar Albimi com a adição de soro e antimicrobianos. O cultivo é incubado à
37ºC em uma atmosfera de 10 % de CO2, durante 2 a 3 dias. A identificação final é feita,
tendo como base, as características listadas na Tabela 2.
As amostras podem ser examinadas de feto abortado; placenta; exsudato uterino;
leite e abscessos. A prova biológica consiste na inoculação de tecidos ou fluidos macerados
em cobaias, devendo ser sacrificados 3 a 6 semanas, mais tarde. O soro é testado para a
presença de anticorpos e os órgãos como o baço, fígado, linfonodos regionais e testículos
devem ser cultivados para o reisolamento de B. abortus.
O exame direto de tecidos pode ser ainda realizado ou através da IF
(Imunofluorescência) Esta técnica pode ser importante, especialmente em amostras
contaminadas (membranas fetais, cotilédones, secreções vaginais ou fetais).
Diagnóstico sorológico
Os testes sorológicos para diagnóstico da brucelose tiveram inicio, em 1897, com o
desenvolvimento do teste de aglutinação de Wright (Wright & Smith, 1897). Problemas de
reações sorológicas positivas resultantes de exposição a outras bactérias ou reações
cruzadas foram detectadas. De lá para cá muita melhoria dos testes existentes e
desenvolvimento de novos testes tiveram lugar. Muitos testes sorológicos são utilizados a
nível mundial. Não existe outra doença infecciosa que afete aos animais domésticos
com uma variedade de testes no diagnóstico da brucelose. Estes meios incluem testes
aplicados ao soro, ao sangue total, ao muco vaginal, ao plasma seminal, ao leite dessorado
ou leite.
O diagnóstico da brucelose, de um modo geral, enfrenta situações específicas e
próprias que podem interferir com o desempenho dos testes aplicados (sensibilidade e
especificidade). Reações inespecíficas atribuídas a anticorpos naturais ou seus produtos
catabólitos de organismos que compartilham antígenos de estruturas semelhantes às da
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Brucella. Reações cruzadas com outros microorganismos como: Salmonella urbana,
Escherichia coli O:116 ou O:157, Pseudomonas maltophilia e Yersinia enterocolitica O:9
são alguns desses exemplos.
A membrana externa da brucela lisa é composta de fosfolipídios, proteínas e LPS-S.
A maioria dos testes sorológicos particularmente aqueles que utilizam suspensão de
bactérias totais como o antígeno, tais como o teste de soro-aglutinação lenta (SAL) em
tubo; o teste de Rosa de Bengala, antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e o teste de
Fixação do Complemento (FC); a maioria dos ELISAs, o Teste do Anel do Leite (TAL)
foram desenvolvidos para detectar anticorpos contra a cadeia O do LPS-S (Alton et al.
1988; Anon, 1986; Anon, 2000). Estes testes são úteis em levantamentos, campanha em
larga escala e em programas de controle, erradicação da enfermidade, e com fins
comerciais. Eles são testes aplicados em “screening” baratos, simples, com alta
sensibilidade, desde que seguidos de testes confirmatórios mais específicos.
Teste do Rosa de Bengala

O teste do Rosa de Bengala é uma modificação do teste de aglutinação em placa. O
antígeno é corado pela Rosa de Bengala e tamponado a um pH de 3,65. Nesse pH as
“aglutininas não específicas” são destruídas e a IgG, o anticorpo mais abundante no soro
dos animais infectados, aglutinam fortemente. Iguais volumes de soro e antígeno (30 l)
são misturados; mexidos por 4 minutos e observados em caixa de iluminação ou aparelho
de visualização de Raio-X. O teste é barato e fácil de fazer. Resultados falsos positivos são
raros e geralmente associados aos casos crônicos. Apesar de melhorar a especificidade num
pH ácido, um grande percentual de falso positivos ocorrem, geralmente devido a presença
de IgM como resultado da vacinação pela B19 (Aguirre et al. 2002). Este teste é o teste
indicado e prescrito pela OIE para o comercio internacional de bovinos.
Fixação do Complemento
Este teste é tido por todo o mundo como o teste confirmatório na detecção
sorológica de anticorpos de animais infectados. Ele foi modificado, padronizado e adaptado
ao sistema de microplacas (Alton et al. 1988; Anon, 2000). Ao contrário do SAL, os títulos
não diminuem quando a doença torna-se crônica. Os resultados são expressos em unidades
internacionais (UI) e o ponto de corte definido em 20 UI que á aplicada rigorosamente onde
a vacina B19 não tiver sido utilizada por muitos anos, como acontece na União Européia ,
EU e Austrália. Sua aplicação restrita em países que aplicam a B19, tais como África do
Sul (Brasil), freqüentemente tem problemas com um número inaceitável de falsos positivos,
pois a vacinação induz títulos sorológicos. Como conseqüência é necessária expertise e
experiência para certificar como livres de brucelose rebanhos ou animais individualmente
quando são classificados como positivos pelo teste.
Os títulos vacinais tendem a declinar mais rápido do que aqueles devido à infecção
com cepas de campo. O declínio de títulos é também dependente da dose vacinal Embora o
teste de FC seja útil na diferenciação de títulos vacinais de bezerras e títulos de doença.
Existe uma dificuldade na diferenciação as reações vacinais daquelas causadas por cepas
selvagens quando os animais são repetidamente vacinados (quando somente uma vacina
seja desejada) ou tornam-se maduros sexualmente.
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A vacinação de novilhas e animais adultos pode resultar em muita confusão na
interpretação de testes laboratoriais, sendo essencial o registro de vacinações e de datas de
nascimento para permitir a correta interpretação dos resultados do testes de FC. Este teste é
preconizado em bovinos para comercio internacional (Anon, 2000)
Soroaglutinação lenta (tubo)

O teste de soro-aglutinação em tubo (SAL) foi o teste utilizado nos programas de
erradicação da brucelose em muitos países O antígeno e as condições do teste têm sido o
objeto de padronizações internacionais. O teste é realizado em pequenos tubos e com
diluições do soro. A aglutinação completa na diluição 1: 100 ou maior é considerada
positiva. Mais tarde utilizou-se o teste de SAR (soro aglutinação rápida), o Card Test ou
Teste do Antígeno Acidificado (AAT) ou o teste do Rosa de Bengala.
Em alguns países, o SAL foi e ainda é utilizado como teste de “screening” nos
programas de erradicação e controle da brucelose. Ele é considerado como de baixa
especificidade e alguns autores desencoraja o seu uso, especialmente para propósitos
comerciais (Nielsen, 2002). Aglutininas não específicas no soro são diminuídas pela adição
de EDTA, sem a redução nos títulos de B. abortus de animais infectados (Garin et al. 1985;
Macmillan & Cockrem, 1985).
O SAL-EDTA é um teste muito mais específico e particularmente útil na detecção
de infecções novas, particularmente naquelas com duas semanas de curso como
demonstradas em condições experimentais (Godfroid & Kasbohrer, 2002), mas sua
utilidade em rebanhos que estão cronicamente infectados é mais limitada, pois alguns
animais infectados poderiam ser classificados como negativos pelo teste, pois a infecção
está na fase crônica (Saegerman et al. 1999). O teste de SAL é ainda muito útil como teste
suplementar para indicar os níveis de anticorpos IgM, a imunoglobulina após a vacinação
com a B19 (Herr & Te Brugge, 1985; Herr et al. 1982; Herr et al. 1986)
ELISA indireto (ELISAi)

O teste de ELISA indireto (ELISAi) é o teste mais sensível que o AAT, SAL e o FC
na detecção de anticorpos contra a Brucella spp, mas muito cuidado deve-se ter quando
aplicado em animais vacinados com a vacina B19 (Cargill et al. 1985; Nielsen, 2002;
Sutherland, 1984). Alguns autores têm sugerido que este teste poderia substituir o teste de
FC, mas também outros 2 testes em uso; o AAT e o SAL. O teste tem sido indicado para o
comercio internacional de bovinos pela OIE (Anon, 2000)
ELISA competitivo (ELISAc)

A base deste teste é o uso de um anticorpo monoclonal seletivo (Mab) que compete
com um anticorpo de baixa afinidade. O ELISA competitivo utiliza um Mab específico para
um dos epitopos da B. abortus O-OS que possuem uma alta especificidade do que o ELISA
indireto (Nielsen et al. 1995; Rylatt et al. 1985; Sutherland, 1985) O ELISA competitivo foi
capaz, em parte, de eliminar os problemas de reação cruzada (B19 ou bactérias).
Infelizmente, o ELISAc resolve parcialmente o problema. Realmente, ainda
persistem os anticorpos após a infecção com Yersinia enterocolitica O:9 (Godfroid et al.,
2002; Nielsen, 1990) e pela vacinação com B19 (1). Entretanto a atividade do anticorpo
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residual devido à vacinação ou reação cruzada foi menos persistente do que com os outros
testes (Aguirre et al., 2002). Este teste é recomendado como teste alternativo no comercio
internacional de bovinos pela OIE (Anon, 2000)
Fluorescence Polarization Assay (FPA) ou Ensaio da Polarização Fluorescente (EPF)

O ensaio de polarização fluorescente é uma técnica rápida e simples para mensurar a
interação antígeno-anticorpo, sendo útil tanto no laboratório quanto em trabalhos de campo
(Nielsen & Gall, 2001). O mecanismo do teste é baseado na rotação aleatória das moléculas
em solução. O antígeno marcado com fluorcromo de baixo peso molecular (um fragmento
do polissacarídio O da B abortus LPS-S) é adicionado ao soro ou outros fluidos a ser
testado. Se o Ac estiver presente, há a ligação ao Ag marcado causando uma diminuição de
taxa de rotação que pode ser medida. O EPF tem sido muito bem aceito (Nielsen & Gall,
2001). Este teste é recomendado côo uma alternativa para o mercado internacional de
bovinos, pela OIE.
Milk Ring Test (MRT) ou Teste do Anel em Leite (TAL)

O TAL é utilizado na detecção de anticorpos no leite. O desenvolvimento de reação
positiva depende de 2 reações:
a) Glóbulos de gordura no leite são agregados pelos anticorpos no leite (aglutininas
glóbulos de gordura)
b) Brucelas coradas (antígeno) que são adicionadas ao leite que formam um
complexo de anticorpos para brucela e glóbulos de gordura que ascendem, formando uma
camada colorida no topo (Alton et al. 1988).
É um teste de “screening” sensível, que utiliza o leite do tarro tanto na detecção de
animais infectados (rebanho) quanto para monitorar rebanhos livres. A sensibilidade é de
alguma forma reduzida quando ela é aplicada a rebanhos muito grandes com poucos
reagentes, entretanto essa perda na sensibilidade do teste aplicada em rebanhos grandes de
150 ou mais animais pode ser contrabalançada pela diminuição da proporção do antígeno
adicionada à amostra de leite (Alton et al., 1988). Apesar de sua reduzida sensibilidade em
grandes rebanhos, o TAL tem tido sucesso no monitoramento de rebanhos livre de
brucelose no gado leiteiro. Após um teste positivo no tarro, pelo TAL, as vacas que
contribuíram com esse leite são, individualmente testadas pela sorologia, na identificação
da vaca ou vacas infectadas.
Alguns fatores podem causar resultados falsos-positivos, incluindo:
1- Alta prevalência de mastites;
2- Alta proporção de vacas no início e fim de lactação;
3- Vacinação recente (3-4meses) com B19 e
4- Leite coagulado.
As amostras de leite devem ser preservadas para o TAL pela adição de 0,5 mL de
sol. formalina (7,5 mL de 37% de formaldeído em 1 litro de água destilada) para 10 ml de
leite.
No “Milk Ring Test”, ou Teste do Anel em Leite (TAL) o antígeno é uma
suspensão morta de B. abortus, coradas pela hematoxilina. Leite fresco misturado ao
antígeno na proporção de 1 mL do leite para cada gota de antígeno. A mistura é incubada a
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37ºC, durante 1 hora. Se positivar, a reação há agrupamentos de organismos na porção
superficial levados pelos glóbulos de gordura. Assim, um teste positivo é evidenciado pela
formação de um anel de coloração violeta azulada na porção superior do tubo. Fonte de erro
inclui mastites e presença de colostro. A duração e temperatura na qual as amostras são
estocadas podem causar reações falso-positivas (em particular temperaturas maiores de 45º
C por 5 min) As amostras pasteurizadas não devem ser testadas pelo TAL (Alton et al.,
1988).
Vários países têm trocado o TAL pelo ELISAi para o leite, embora essa técnica não
esteja padronizada, ela está sendo recomendada no comercio de bovinos pela OIE.
O teste do 2 Mercaptoetanol (2ME) ou Rivanol é utilizado para auxiliar na
distinção de aglutininas causadas pela infecção natural (crônica) ou vacinação pela B19.
Uma variedade de ELISA foi desenvolvida para aumentar a sensibilidade e especificidade
dos testes diagnósticos.
Diagnóstico molecular
PCR
Numerosos ensaios, utilizando o PCR foram desenvolvidos na identificação de
espécies do gênero Brucella spp (Da Costa et al. 1996), especialmente em estudos
epidemiológicos. Varias estratégias têm sido exploradas na diferenciação dos biovares de
Brucella, incluindo “locus specific multiplexing” como, por exemplo, o PCR baseado no
IS711 que permite a diferenciação da vacina B19 e RB51; PCR-RFLP no lócus omp2
(Cloeckaert et al. 1995). Infelizmente, até o presente momento, não há nenhuma técnica
robusta o suficiente que permita a diferenciação entre cepas pertencentes ao mesmo biovar
(Bricker, 2002). Inicialmente, esses ensaios foram dirigidos ao DNA purificado de
organismos cultivados, mas tão logo novas amostras foram identificadas (leite e queijo)
outros avanços como a remoção de inibidores da PCR permitiu a melhoria dessa técnica
diagnóstica em laboratórios (Bricker, 2002).
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

A B. abortus é sensível a gentamicina, canamicina, tetraciclina e rifampicina. A
tetraciclina é, freqüentemente associada com a estreptomicina no tratamento de brucelose
humana. A combinação de cotrimoxazol com rifampicina ou tetraciclina e estreptomicina
com rifampicina é também usado. A localização intracelular do organismo requer uma
terapia prolongada. Bovinos não devem ser tratados tanto na profilaxia quanto na terapia.
VACINAS
Existem 3 imunógenos importantes no controle da infecção pela B. abortus; a cepa
B19, a cepa 45/20 rugosa de B. abortus de MacEwen e a RB51. O primeiro imunógeno é
vivo e o segundo morto e o terceiro é vivo. A cepa 19 consiste de uma cultura viável e
caracterizada pela pouca virulência em cobaias e bovinos, mas com excelente propriedade
imunizante. Esta cepa possui grande estabilidade Alguns pesquisadores revelam cuidado
com esta amostra mas a sua virulência não foi alterada desde 1930. A cepa B19 é uma
amostra lisa de B. abortus levemente patogênica para cobaias. Bovinos prenhes podem
abortar pela inoculação de grandes doses da cepa B19; nesses casos os organismos vacinais
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podem ser demonstrados, sem dificuldades, nas membranas fetais e feto. A cepa vacinal,
raramente é eliminada pelo leite. Ela pode causar infecção no Homem, geralmente de
forma leve com período de recuperação mais curto que do que nas cepas virulentas. Esta
vacina é perigosa para o Homem, devendo ser manipulada com cautela.
As bezerras devem ser vacinadas entre 4 e 8 meses, dependendo das raças. A
vacinação nessa idade é recomendada para evitar a permanência de aglutininas e,
conseqüentemente criando problemas no diagnóstico da infecção, mais tarde.
A cepa B19 protege cerca de 65% a 70% dos animais por 4 a 5 gestações, sendo
mais efetiva na proteção de animais jovens de cria quando aplicada sob bases
populacionais. Animais adultos vacinados com a B19 são protegidos mas desenvolvem
aglutininas, persistentemente. Há evidências que se reduzirmos a dose vacinal haveria uma
menor persistência de aglutininas. A vacinação de vacas no período de prenhez inicial com
grandes doses (60 bilhões) de B19 produz uma alta probabilidade de infecção uterina. O
risco é menor quando a dose é reduzida (300 milhões).
A cepa morta (45/20) de MacEwens é uma cepa rugosa não utilizada em nosso
meio, mas amplamente utilizada na Irlanda e Europa para controle da brucelose bovina.
CONTROLE & PREVENÇÃO

As perdas econômicas advindas da brucelose juntamente com o perigo de infecção
humana impuseram programas de controle e erradicação da doença. Os princípios
incorporados eram dependentes das condições locais, das de manejo e do número de
animais envolvidos.
1) Animais afetados devem ser detectados, marcados e eliminados da propriedade.
A detecção é normalmente realizada pela sorologia ou ainda utilizando o Teste do Anel no
Leite como teste populacional, seguido pelo teste de aglutinação de cada amostra animal.
Sacrifício dos reagentes.
2) A vacinação obrigatória com B19 de bezerras entre 4-8 meses deve aumentar a
resistência dos animais permanentes. É importante esclarecer que no RGS é aconselhado
fazer a vacinação de animais um pouco mais cedo, pois algumas raças européias ciclam
com 5-6 meses de idade.
3) Princípios gerais de higiene são impostas na prevenção da infecção ou re-
introdução da infecção. Se forem tomadas tais medidas a doença, geralmente desaparece
dentro de 2 anos e, ao final de 5 anos, os animais com infecção crônica.
Uma amostra de Brucella abortus resistente a rifampicina conhecida como RB 51 foi,
recentemente utilizada como modelo para elucidar a imunidade celular na brucelose bovina.
A amostra RB51 é uma cepa rugosa estável que não contém cadeia O, mas
comporta-se bioquimicamente como a cepa lisa 2308 em sua utilização do eritritol. A
RB51 induz a formação de anticorpos às proteínas da membrana externa, mas não a cadeia
O. Ela tem virulência reduzida aos camundongos por ter um período curto de "clearence"
no baço, podendo conferir imunidade ao camundongo imunizado com B. abortus 2308.
Deste modo, há um potencial no uso da vacina viva protetora, podendo não interferir nos
testes sorológicos para a resposta humoral ao LPS (lipopolissacarídio) da cadeia O.
A vigilância da propriedade deve ser mantida por meio de testes sorológicos
periódicos; pelo testes de animais comprados; pela ocorrência de sinais clínicos
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compatíveis com a enfermidade e pelo exame sorológico de animais enviados ao
matadouro.
Quadro 2. Resultado dos testes, segundo a técnica AAT, 2ME de brucelose LABACVET-UFRGS
Ano Amostras AAT 2ME % AAT 2ME % 2ME
2001 1.745 222 148 12,7 66,6 8,4
2002 1.433 208 143 14,5 68,7 9,9
2003 535 126 70 23,5 55,5 13,0
2004 61 0
2005 212 27 13 12,7 48,1 6,1
2006 6 2 33,3
2007 86 16 1 18,6 6,25 1,1
Total 4.078 601 377 14,7 62,7 9,2
Quadro 3 Amostras de soro trabalhadas no lABACVET-UFRGS entre 2001-2007.

Ano Bovino Eqüino Suíno Caprino Ovino Canino
2001 1745
2002 1433 11 0 15 70 16
2003 535 2 0 31 120 25
2004 61 2 0 1 26 141
2005 259 5 1 63 220 79
2006 41 9 0 1 97 184
2007 88 50 0 56 53 424
Total 4162 79 0 167 586 869
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Brucella ovis
Prof. Marcos J. P Gomes
BRUCELOSE OVINA ou EPIDIDIMITE OVINA

INTRODUÇÃO
A Brucella ovis causa uma enfermidade crônica nos ovinos caracterizada
principalmente por alterações testiculares com conseqüências sobre a fertilidade dos
carneiros, abortos ocasionais nas ovelhas e aumento da mortalidade de perinatal dos
cordeiros.
HISTÓRICO
A B. ovis foi isolada pela primeira vez, em 1952, por McFarlane e colaboradores, na
Nova Zelândia.
Simmons & Hall, em 1953, na Austrália, isolaram e descreveram o organismo como
semelhante a “brucella like organism”.
Buddle & Boyes (1953) considerou-a como uma mutante da Brucella melitensis. Buddle
propôs os nomes de Brucella ovis, tendo como base os antígenos de superfície comuns
entre a amostra e as amostras rugosas de B. abortus e B. melitensis. Propôs também o nome
da doença como “epididimite infecciosas dos carneiros”.
A homologia do DNA recentemente propôs a existência de uma única espécie, a B.
melitensis, no gênero Brucella e as demais espécies (de hoje) seriam biovares. Assim
teríamos B. melitensis biovar ovis
DISTRIBUIÇÃO
A infecção é cosmopolita, especialmente nos países onde há criação de ovinos. A
infecção, geralmente é bem maior quando detectada pela primeira vez, podendo variar de
20 a 60% dos carneiros e em 45 a 75% dos rebanhos testados.
A prevalência é bem baixa, nos países onde há programas de controle, entretanto a
erradicação é extremamente difícil de ser alcançada.
A B. ovis produz doença clínica ou subclinica em ovinos que é caracterizada por
lesões genitais em carneiros e placentite nas ovelhas. A principal consequencia da doença é
a marcada redução de fertilidade do macho, abortos esporádicos na fêmea e aumento da
mortalidade perinatal. A doença tem sido relatada na Argentina, Austrália, Brasil, Canadá
Chile, França, Alemanha, Hungria, México, Nova Zelândia, Peru, Romenia, Russia,
República Eslovaca, África do Sul, Espamha, Uruguai, EUA, mas provavelmente ela ocorra
na maioria dos paises produtores de ovinos.
IMPACTO ECONÔMICO
O impacto econômico é difícil de ser quantificado, entretanto a doença causa
prejuízos econômicos substanciais a criação de ovinos em rebanhos infectados que não
possuem programas de controle.
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AGENTE
A B ovis é cocobacilo ou bastonete Gram negativo não encapsulada, não forma
esporos, com um tamanho de 0,5 a 0,7 X 0,7 a 1,2 m. Podem ser coradas pela técnica de
coloração de Stamp ou de Köster.
B. ovis cresce bem em meios base (Trypticase Soy Agar, Blood Agar Base,
Columbia agar) enriquecidos com 5 a 10% de sangue ou soro
Pode ser seletivamente isolado no meio de Thayer-Martin modificado.
O crescimento necessita de uma atmosfera rica em 10 a 20% de CO2 no cultivo
primário, embora possa ser isolada cepa CO2 independente.
As colônias tornam-se visíveis após 3-5 dias de incubação a temperatura de 34 –
37ºC. As amostras também podem crescer a temperatura de 26 ºC, mas as colônias
aparecem em 6-10 dias.
As colônias não são hemolíticas.
São circulares, convexas, com bordos inteiros.
São consideradas pela iluminação oblíqua como do tipo não liso
Teste de acriflavina ou Rivanol positivas.
Perdeu a atividade de urease e não reduz nitrato a nitrito.
Catalase positiva
Oxidase negativa.
H2S negativa Cresce nas concentrações de fucsina básica e tionina.
Oxida : L-alanina, D-alanina, L-asparagina, D-asparagina, Ácido d-glutâmico, DL-
serina, e adonitol.
Não oxida: L-arabinose, D-galactose, D-glicose, D-ribose, meso-eritritol, D-xilose,
L-arginina, DL-citrulina, DL-ornitina e L-lisina.
A B. ovis não são lisadas pelos fagos: Tibilisi, Weybridge, M51-S708, Firenze, BK,
MC/75, D ou grupo R.
São lisadas pelo fago R/O ou tanto RTD = 104
Não há biotipos reconhecidos.
TRANSMISSÃO
A principal forma de transmissão é por via venérea. A transmissão macho para
macho também possível em que machos infectados e animais susceptíveis compartilham o
mesmo espaço. Sodomia é outro meio de transmissão.
A maioria dos surtos da doença ocorre após a estação de monta ou acasalamento.
Indubitavelmente existe mecanismo complexo que não estão totalmente conhecidos, mas a
transmissão venérea passiva de macho para macho via fêmea parece ser a mais importante
forma de transmissão para manter e difundir a doença. A probabilidade de infecção
depende principalmente da via, da dose e das características intrínseca do animal, tais como
idade e raça.
A infecção experimental no carneiro pode ser obtida com uma grande variedade de
rotas: oral, intravenosa, intratesticular, conjuntival, intraprepucial subcutânea, através de
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escarificações da pele, intraretal, e intranasal. Embora não haja grandes estudos
comparativos, os melhores resultados foram obtidos, através da inoculação intraconjuntival,
intraprepucial ou por ambas simultaneamente. Doses de 5 X 108 – 1010 UFC de B. ovis são
suficientes para obter as taxas de infecção próximas a 100%. Se a idade afeta e
susceptibilidade à infecção é alvo de controvérsia. A infecção tem sido demonstrada em
carneiros com 4 meses de idade, sugerindo que animais na puberdade ou logo após ela são
susceptíveis a B. ovis. Embora a transmissão venérea pareça ser a principal forma de
difusão, os animais adultos são mais susceptíveis à infecção natural. Alem disso, foi
observado que a incidência das alterações testiculares e da brucelose, ambas aumentam
com a idade e está relacionado com a experiência sexual dos animais. Não há informações
publicadas sobre o efeito da idade sobre a suscetibilidade à infecção sobre condições
experimentais.
SUSCETIBILIDADE E RESISTÊNCIA
As ovelhas, ao contrário dos carneiros, parecem ser relativamente resistentes à
infecção. Poucas fêmeas adquirem a infecção ativa com aborto e morte perinatal mesmo
quando cobertas por machos infectados. Quadro semelhante acontece com a infecção
experimental com fêmeas prenhes. A infecção que aconteceu numa primeira prenhez,
dificilmente acompanha a seguinte. Cordeiros nascidos de mães infectadas, dificilmente
tornam-se infectados, mesmo ingerindo leite infectado. Estas evidências demonstram que o
papel das fêmeas na transmissão ativa da infecção é menos importante.
Há muitas referências sugerindo que susceptibilidade pode variar entre as raças de
carneiros. A raça Merina Australiano parece ser menos freqüentemente infectado pela B.
ovis do que as raças britânicas no mesmo ambiente. A mesma observação tem sido feita
comparando raças importadas com raças nativas. Tendo como base os dados estatísticos, as
raças nativas da Espanha e a raças derivadas da raça Merina são mais resistentes à
brucelose ovina do que as raças européias importadas. Embora a resitência genética a
doença possa ser importante, se tem sugerido que a suscetibilidade possa também estar
relacionada à taxa de crescimento e precocidade e atividade sexual.
INFECÇÃO EM OUTRAS ESPÉCIES

A B. ovis parece ser exclusivamente de ovinos e afeta essencialemtne carneiros.
Embora alguns levantamentos sorológicos sugerem o contágio do homem. Não há relato do
isolamento da B. ovis no homem.
Há referências da infecção experimental de outras espécies animais. A inoculação
experimental da B. ovis no macho caprino leva a colonização genital e extragenital em
alguns animais e, subseqüentemente o desenvolvimento de lesãoes semelhantes àquelas
observadas nos carneiros. O manejo extensivo em que caprinos e ovinos freqüentemente
coabitam pode facilitar a transmissão de ovinos para caprinos e vice-versa. Entretanto o
isolamento de B.ovis de casos naturais, em caprinos ainda não foi relatado. A infecção tem
sido também reproduzida no cervo silvestre.
Animais de laboratório têm sido infectados por várias rotas com doses variando de
10 – 1011 UFC com sucesso variável. Não há um animal experimental modelo para
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pesquisa em B. ovis, embora coelhos, ratos, gerbil, hamster, camundongo e cobaias tenham
sido utilizados.
PATOGENIA
Há um longo período de latência antes dos sinais clínicos tornarem-se evidentes,
assim como a infecção causada pelas outras brucelas. Sob condições experimentais, o
agente permanece confinado nos linfonodos próximos ao local de entrada por 2-3 semanas
e então ocorre bacteremia, segundo a infecção do sistema linfocítico fagocitário e
linfonodos mais distanciados (órgãos genitais e glândulas sexuais acessórias).
Nos carneiros experimentalmente infectados, a bactéria tem sido isolada do fígado,
rins, baço, testículo, epidídimo vesícula seminal, glândula bulbouretral, ampolas e
linfonodos ilíaco, pré-escapulares, pré-crural, submaxilar, parotídio e retrofaríngeo. Os
órgãos-alvo são epidídimo e glândulas sexuais acessórias com eliminação do agente,
através do sêmen, na maioria (nem todos) dos carneiros. Nos animais reagentes
(soropositivos), geralmente o cultivo é negativo, mas a bacteria pode estar localizada em
outros órgãos. Essa hipótese é consistente com o isolamento de B. ovis do baço e linfonodo
ilíaco de alguns animais experimentalmente infectados e que não foram isoladas dos órgãos
genitais e glândulas acessórias sexuais.
A localização inicial no epidídimo é acompanhada por edema perivascular e
infiltração dos linfócitos, monócitos e neutrófilos. Logo após o epitélio tubular inflamado
desenvolve uma hiperplasia papilar e degeneração hidrópica local com formação de cistos
intra-epitelial. Destruição epitelial, tanto pela bactéria quanto pela reação inflamatória leva
a um extravasamento de espermatozóides. A resposta do hospedeiro ao espermatozóide
extravasado leva a formação de um granuloma espermárico que pode bloquear
completamente o epidídimo com posterior degeneração e fibrose.
Na fêmea, a patogenia da B. ovis não é totalmente explicada. Fêmeas ovinas
experimentalmente expostas a B. ovis tanto antes da monta ou no final da gestação não
abortam. Somente femeas expostas no início ou no meio da prenhez desenvolvem infecção,
podendo eventualmente abortar. A infecção progride a bactéria torna-se localizada na
placenta e alcança o feto através dos vasos do córion. Embora o aborto não seja freqüente,
as fêmeas infectadas desenvolvem placentite, causando má nutrição fetal resultando daí em
cordeiros fracos. A resposta inflamatória, imunológica e granulomatosa da infecção pela B.
ovis ao feto são similares aquelas observadas no feto bovino causado pela B. abortus
PATOLOGIA NO MACHO
Mesmo que a B. ovis esteja associada à epididimite, alguns carneiros infectados não
desenvolvem epididimite palpável. Num levantamento conduzido com 267 carneiros
soropositivos, somente 125 (46,8%) mostraram alterações testiculares palpáveis. Apesar do
número animais que demostram alterações após o exame histológico dos testículos e
epididimo, uma proporção importante de carneiros infectados não evidencia lesões
escrotais. Na maioria dos casos, a localização testicular é unilateral com a cauda do
epidídimo o local mais comum. A cabeça e o corpo do epidídimo são também freqüentes. A
atrofia testicular e aumento da cauda do epidídimo são características da fase crônica da
doença. A aparência macroscópica dos testículos geralmente é normal, mas pode-se
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perceber granulomas e calcificação. O epidídimo afetado parece firme, mostrando
superfície esbranquiçada ao corte em conseqüência da proliferação de tecido conetivo.
Frequentemente são encontradas no tecido conetivo, abscessos contendo substancia
cremosa ou caseosa. Hemorragia e inflamação exsudativa na túnica vaginalis são achados
freqüentes como resultado da ruptura da lesão básica (espermatocele) do epidídimo. A
organização deste exsudato leva a formação de adesões entre essas duas camadas de túnica
vaginalis. As vesículas seminais são freqüentemente aumentadas com ductos dilatados e
com conteúdo fluido quando visualizadas ao corte. Nenhuma alteração macroscópica pode
ser observada na glândula bulbo-uretral, próstata e ampolas.
LESÕES NO MACHO
No exame microscopico dos epididimos infectados mostra edema intersticial,
fibrose e infiltrado perivascular de linfócitos e plasmócito. Os ductos epididimários
mostram hiperplasia epitelial com cistos intraepiteliais, contendo neutrófilos e restos
celulares. Granuloma espermático circundado por linfócitos, células gigantes e epitelióides
são achados frequentes. A Atrofia testicular deriva do processo regressivo do epitélio
testicular e suspenção da espermatogenesis. Pode também ocorrer: a) Proliferação do tecido
conetivo intertubular. B) pequeno granuloma espermático extratubular e necrose e
calcificação dos ductos seminíferos. As principais alterações das vesículas seminais são:
infiltração de linfócitos e plasmócitos; fibrose; hiperplasia epitelial difusa com cistos
intraepiteliais, contendo neutrófilos. A inflamação das ampolas está associada com a
epididimite. Áreas focais de hiperplasis com cistos intraepiteliais vazios e acúmulo de
neutrófilos no lúmen das dilatações do epitélio são freqüentemente observadas. Acúmulo de
células redondas e fibrose podem ser visualizados na lâmina própria. O exame
microscópico da próstata e da glândula bulbouretral revela uma discreta infiltração de
células redondas e hipertrofia glandular focal. Formações papiliformes e concreções
(corpora amilacea) são freqüentes nessas duas glândulas acessórias.
Nas ovelhas infectadas mostram um exsudato purulento, variando de uma pequena
quantidade sobre a superfície da membrana corioalantóide intacta até uma grande
quantidade na área interplacentoma. O exsudato contém bactérias, macrófagos neutrófilos e
células epiteliais de descamação. Fibrose, espessamento e edema da membrana
corioalantoide são observada nos casos mais severos. Os cotilédones podem evidenciar
vários graus de necrose. Células do epitélio coriônico podem estar aumentadas e conterem
bactérias. Necrose focal epitélio intercotiledonário e coriônico são freqüentemente
observados. Lesões arteriais são bem comuns com trombos fibrinosos no interior de vasos,
células endoteliais aumentadas células proliferativas do endotélio da túnica intima. Não há
lesões patognomônicas na infecção causada pela B. ovis.
ISOLAMENTO DO AGENTE
As amostras mais valiosas para o isolamento de B. ovis de animais vivos inclui:
sêmen, suábio vaginal e leite. O sêmen (fluido genital) pode ser coletado facilmente em
suábios tomados da cavidade prepucial, apos a eletroejaculação. Se o eletro não é
disponível podemos coletar da vagina de fêmeas livre da infecção, imediatamente após a
monta natural.
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A melhor técnica de diagnóstico direto é o isolamento bacteriano em meio de
cultivo adequado. Amostras de sêmen, suábio vaginal, ou leite deve ser semeado
diretamente em placas contendo meios adequados; incubadas a 37°C numa atmosfera de 5-
10% de CO2. Os tecidos devem ser macerados e triturados com pequena quantidade de
salina estéril ou PBS em triturados de tecidos antes de ser semeado.
A melhor amostra de sêmen menos contaminada pode ser obtida pela exposição e
limpeza do penis e o ejaculado colhido em frasco estéril.
Nos animais mortos, a colheita de amostras para isolamento da B. ovis são: o
epididimo, vesículas seminais, ampolas linfonodos inguinais no macho e útero, linfonodos
ilíacos, supramamário nas fêmeas. Entretanto para obter sucesso máximo podemos incluir
outros órgãos e linfonodos tais como: baço, linfonodos cranial escapular, prefemural e
testiculares.
Cordeiros mortos e placenta devem ser examinados. As amostras preferenciais
devem colhidas como o fluido do abomaso e pulmão.
As amostras para cutivo devem ser refrigeradas e transpostadas para o laboratório o
mais rápido possível após a coleta. O organismo permanece viável por até 72 horas a
temperatura ambiente e a sobrevivência pode ser aumentada a 4 ºC ou preferencialmente
pelo congelamento das amostras teciduais. Esfregaços vaginais e de sêmen podem ser
corados pela técnica de Stamp onde cocobacilos característicos podem ser demonstrados na
maioria dos animais infectados. O exame de amostras coradas pelo Stamp (trato genital do
carneiro, linfonodo inguinal, placenta, conteúdo do abomaso e pulmão de feto) pode
permitir um diagnóstico presuntivo rápido. Entretanto outras bactérias com morfologia
similar ou características tintorial (B. melitensis, Coxiella burnetii e Chlamydophila spp)
podem estra presentes em tais amostras, tornando o diagnóstico difícil para pessoal menos
experiente. A microscopia deve ser sempre confirmada pelo cultivo do agente.
IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE
A existência de lesão macroscópica (epididimite uni ou bilateral) no carneiro pode
ser indicativa de infecção, mas exames laboratoriais são necessários para confirmar a
doença, através de métodos diretos e indiretos.
Esfregaços diretos podem ser examinados através da coloração de Gram ou Stamp e
a presença de cocobacilos demonstrado em muitos animais infectados. Entretanto outras
bactérias com similar morfologia ou características tintoriais (B melitensis, Chlamydophila
spp) podem também estar presentes em tais amostras.
O diagnóstico direto é realizado, atraves do isolamento da B. ovis do sêmen ou
tecidos do carneiro ou ainda das secreções ou leite de fêmeas em médio seletivo. Técnicas
de biologia molecular como PCR e eletroforese de campo pulsante têm sido aplicadas, mas
as técnicas indiretas baseadas nos testes sorológicos são preferidas no diagnóstico de rotina.
O sêmen do carneiro pode ser obtido facilmente por meio da eletroejaculação. Para
o exame bacteriológico o sêmen pode ser colhido em dsacos plásticos ou por meio de
suábio tomado da cavidade prepucial após a eletroejaculação.
No isolamento da B. ovis as amostras de sêmen são semeadas diretamente em
plascas de AS apropriada (Thayer-Martin); incubadas a 10% de CO2.
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A colheita e transporte de amostra é tarefa enfadonha, pois alguns animais
infectados não excretam ou eliminam intermitentemente a B. ovis e, portanto o
bacteriológico de sêmen não é uma medida prática e útil no diagnóstico da infecção,
especialmente em programas de larga escala.
CARACTERIZAÇÃO BACTERIOLÓGICA
As colonias de Brucella ovis não são hemolíticas. Elas são circulares, convexas,
possuem bordos inteiros e sempre são do tipo rugoso quando examinadas pela luz oblíqua e
positiva ao teste de acriflavina. B. ovis perdeu a atividade de urease, falha na redução de
nitrato para nitrito, é catalase positiva e oxidade negativa, não produz H2S e que embora
não cresça na presença de violeta de metila, geralmente cresce na presença de
concentrações de fucsina básica e tionina.
A maioria dos laboratórios não é equipada para a completa identificação e um
esquema prático e presuntivo de identificação é necessário. A maioria das B. ovis pode ser
corretamente identicadas tendo como base as caracteristicas de crescimento, observação
direta utilizando a luz refletida oblíqua, coloração de Stamp ou Gram, catalase, oxidase
urease e teste de acriflavina. Entretanto, a identificação definitiva deve ser realizada no
laboratório de referência com experiência na identificação e tipificação de Brucella spp.
Recentemente um método de eletroforese de campo pulsante foi desenvolvido para o
gênero Brucella spp e com essa técnica é possível diferenciar B. ovis das outras espécies.
FAGOTIPAGEM
Os cultivos não são lisadas pelos bacteriófagos do grupo Tbilisi, Weybridge e Iz, no
teste de rotineiro de diluição (RTD) ou 104 RTD, enquanto são lisados pelo bacteriófago
R/C.
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Teste de Imunodifusão em gelose de agar (IDGA) test, Teste de Fixação do
Complemento (FC) e, ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando antígenos de superfície
solúveis da B. ovis, pode ser utilizados alguns ELISA utilizando proteínas recombinantes e
anticorpos monoclonais estão em teste pesquisa de campo. As sensibilidades dos testes
(IDGA e ELISA) são semelhantes e algumas vezes o ELISA é de maior sensibilidade do
que o teste de FC. A combinação da IDGA e ELISA parece que dá os melhores resultados
em termos de sensibilidade, Embora em relação a simplicidade e custo, o teste de IDGA é o
teste mais prático no diagnóstico da brucelose ovina. O teste prescrito ou indicado para o
comercio internacional permanece sendo o teste de FC.
O LPS da superfície celular é o principal antígeno de superfície da maioria das
bactérias Gram negativas, sendo também verdade para as brucelas lisas. Entretanto a B. ovis
é permanentemente rugosa e, portanto sua superficie celular difere das demais brucelas
lisas. A principal diferença na estrutura da parede celular entre as brucelas lisas e rugosas é
seus correspondentes do LPS. O LPS da B ovis assim como o LPS das mutantes rugosas de
B. abortus e B. melitensis podem ser extraídas com o uso de solventes orgânicos.
A técnica de éter-de-petroleo-cloforformio-fenol (PCP), originalmente desenvolvida
para mutantes rugosas de enterobactérias é a técnica de escolha para obter LPS de B. ovis,
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uma vez que ela produz antígeno essencialmente livre de proteínas e ácidos nucléicos.
Entretanto a sua grande hidrofobicidade do LPS purificado representa um problema para o
seu uso em muitos testes sorológicos.
A estrutura do LPS da B. ovis não tem sido elucidada. Embora ela contenha açúcar
presente também no core-lipídio A do LPS de outras brucelas, o LPS purificado da B. ovis
dá somente uma reação de identidade parcial com o LPS dos mutantes rugosos de B.
abortus e B. melitensis ou com o LPS rugoso presente no antígeno extraído pelo calor da B.
canis.
Estas observações sugerem fortemente a presença de determinantes antigênicos
espécie-específicos no LPS da B. ovis
A reação cruzada com determinantes do core-Lipidio A de outras brucelas e
diferentes estágios de agregação dos LPS rugosas (moléculas dispersas) e dos LPS lisas
(moléculas em micelas)
ANTÍGENOS
O tratamento das brucelas rugosas pela técnica da salina aquecida (método da salina
quente) ela produz extratos antigênicos solúveis de cujo componente principal precipita
com o soro das brucelas rugosas. Por essa razão, o antigeno termorresistente tem sido
referido como o antigeno rugoso específico ou quando obtido da B ovis ele é chamado
antígeno específico de B. ovis. Entretanto a caracterização quimica do antigeno
termorresistente da B. ovis mostrou que são enriquecidos com LPS rugoso, proteínas da
membrana externa 3 e outros componentes externo da membrana. Assim os antígenos
termorresistente contem determinantes do LPS específicos para a B. ovis, mas tambem
componentes antigênicos adicionais, alguns deles compartilham com a B. melitensis
rugosas e lisas e outras espécies de Brucella spp. Tais componentes causam reações
cruzadas que em algumas vezes observadas com a técnica da salina aquecida e o soro de
ovelhas infectadas pela com a B. melitensis ou vacinadas com a amostra Rev.1. O antigeno
termorresistente devido a sua solubilidade em água e alta concentração em epitopos da
superfície celular é o melhor antigeno diagnóstico e tem sido amplamente utilizado para o
diagnóstico sorologico da infecção causada pela B. ovis.
A B. ovis cepa REO 198 a qual é CO2 independente é recomendada como fonte de
antigeno termorresistente para ser utilizado nos testes sorológicos. Esta cepa foi obtida do
Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) Laboratoire de Pathologie
Infectieuse et Immunologie, 37380 Nouzilly, France).
Meios sólidos são satisfatórios para o crescimento da B. ovis REO 198. O ideal seria
vários biotipos de B. ovis serem incluidos no antígeno O antigeno é preparado como segue:
1) Crescimento exponencial de uma cepa de preferencia aeróbia B. ovis REO 198 em uma
das seguintes maneiras: frascos de Trypticase soy em incubador orbital a 37°C e a 150 rpm;
ou em garrafas Roux de Trypticase Soy Agar ou outro meio util com 5% de soro ou em
fermentador de partida descrito para B abortus, mas com a adição de 5% de soro ao meio.
2) As células são lavadas 2 vezes e então suspensas em salina a 0,85% (12 g cél. Peso seco
ou 30 g (de cel centrif em 150 ml).
3) A suspensão celular é autoclavada a 120°C por 15-30 minutos.
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4) Após o resfriamento ela é centrifugada (15.000 X G, 4°C, 15 minutos) e o sobrenadante
é filtrado e dializado em água destilada (3 x 100 volumes) a 4°C por pelo menos 2 dias.
5) O fluido dializado é ultracentrifugado (100,000 X G, 4°C, 6-8 hours),
6) O sedimento é ressuspenso em uma pequena quantidade de água destilada e liofilizado.
7) O antigeno é reconstituido em água destilada (para uso em IDGA) em tampão salina-
veronal (para uso no teste de FC) ou em tampão carbonato-bicarbonado (para uso em
ELISA)
8) Titulação contra os soros-controle positivos e negativos.
O antígeno reconstituido é mantido a 4°C com 0,5% de fenol como preservativo
(somente para uso no teste de IDGA) ou liofilizado.
O congelamento de descongelamento deve ser evitado (9). O teste de FC deve ser
padronizado contra o padrão de soro internacional anti-B. ovis (obtido do laboratório de
referencia de Brucelose da OIE, VLA Weybridge, Addlestone, Surrey KT15 3NB, United
Kingdom).
ENSAIO IMUNOENZIMÀTICO (ELISA)

Muitas variações deste teste têm sido propostos. O teste descrito aqui é um teste de
ELISA indireto utilizando o ABTS (2,2’-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic
acid]) como cromógeno. Os testes são realizados em placas de ELISA com fundo chato
com 96 orificios. Os reagentes e as diluições são feitos em PBS pH 7,2 com a adição de
0.05% de Tween 20 (PBST). As diluições do antígeno são realizadas com tampão
carbonato-bicarbonato, pH 9,6.
As placas são lavadas apos o antogeno fixado e entre as incubações geralmente com
PBST O antígeno (HS) e o conjugado são titulados e as diluições são selecionadas para dar
a melhor relação entre o soropadrão positivo e negativo. Secundariamente os anticorpos
(anti-ovino IgG [H+L cadeias]) são geralmente conjugadas a peroxidase, embora outras
enzimas possam ser utilizadas. Se o conjugado com peroxidase é utilizado, o cromogeno
geralmente ABTS é diluído em tampão substrato pH 4 (composto de ácido cítrico trisódico
e ácido cítrico). A isso é adicionado a agua oxigenada (H2O2), e as placas incubadas por 15-
60 minutos a temperatura ambiente. A reação pode é suspensa com 1 mM de azida sódica e
mudança de cor é lida pelo filtro de 405-414 nm.
O antígeno utilizado no ELISA é o HS estoque (1 mg/ml em tampão de
sensibilização) titulado com diferentes diluições do antígeno, conjugado e substrato, contra
um soro padrão ou contra diluições seriais de um painel de soros que são psotivos e
negativos para B. ovis na determinação da diluição mais adequada (geralmente 5-10 µg/ml).
As Placas de ELISA são sensibilizadas com 100 µl de uma predeterminada diluição
de antígeno em tampão carbonato, pH 9.6, para cada orifício. As placas são incubadas por 2
horas a 37°C ou overnight a 4°C. Posteriormentre elas são lavadas 4 vezes para remover o
antígeno não ligado; as placas são secas com batidas firmes com elas viradas ou com
toalhas absorventes. As placas sensibilizadas podem ser utilizadas imediatamente ou
secadas e estocadas a a 4°C (a estabilidade nessas condições é adequada por pelo menos 1
mes).
Os Soros: Dilua os soros controles positivos e negativos a 1/200 pela adição de 10
µl do soro a 2 ml PBST. Adicione um volume de 100 µl da amostra em duplicata na
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microplaca. As placas são cobertas, incubadas a 37°C por 1 hora, lavadas 3 vezes com
tampão de lavagem.
O Conjugado: O conjugado titulado e diluido em PBST são adicionados (100 µl) a
cada orifício e as placas cobertas e incubadas por 1 hora a 37°C. Após a incubação, as
placas são lavadas novamente 3 vezes com PBST.
O Substrato: Solução de ABTS em tampão é adicionado (100 µl/orifício); as placas
são incubadas por 15-60 minutos em temperatura ambiente com continua agitação.
A Leitura e interpretação dos resultados: A absorbancia é lida automaticamente em
espectrofotometro a 405-414 nm. Os valores de absorvância podem ser expressos em
percentagens de absorvância media dos controles positivos. Os valores de absorvância
podem ser expresso como percentagens de absorvancia da média do controle positivo ou
preferencialmente transformada em unidades ELISA calculadas tanto manualmente ou pelo
so de computador num programa que calcula a curva de uma curva-padrão construída com
uma série de resultados de diluições do controle positivo. O limiar deve ser calculado
testando uma quantidade suficientemente grande da população ovina livre da infecção pela
B. ovis e a sensibilidade do teste sendo controlada na população de animais infectados pela
B. ovis.
Estudos comparativos mostraram que o ELISA possui melhor sensibilidade do que a
IDGA ou o teste de FC. A existencia de alguns soros ELISA-negativos e IDGA positivos a
combinação de IDGA com ELISA dá ótima sensibilidade. Entretanto a combinação do teste
de FC e ELISA ou CF e IDGA não melhoram a sensibilidade do ELISA sozinho (14).
Alem do mais, o teste de FC possui outras importantes disvantagens – tais como a
complexidade, obrigatoriedade na inativação do soro, atividade anticomplementária de
alguns soros, a dificuldade de realização com soro hemolisado e o fenômeno de pro-zona.
Por sua sensibilidade, simplicidade e fácil interpretação a IDGA é o teste mais práctico no
diagnóstico de rotina em laboratórios menos especializados.
REFERÊNCIAS RECOMENDADAS
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BACTERIOLOGIA
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BACTERIOLOGIA
Brucella canis
Prof. Marcos J P Gomes
BRUCELOSE CANINA
INTRODUÇÃO
A brucelose canina foi uma enfermidade conhecida como vetores mecânicos e
biológicos da Brucella abortus, B. suis e B. melitensis. A fonte de infecção em quase todos
os casos era o consumo de animais domésticos ou silvestres infectados ou pelo contato de
cães com estes (Morse, 1951; Batista & Hipólito, 1960-1; Correa et al., 1981). Em contraste
com a forma esporádica de brucelose canina, há uma outra, extremamente infecciosa
causada por uma nova espécie de brucela.
Em 1966, Carmichael, nos EUA, durante uma investigação sobre a causa de abortos
em cães da raça Beagle, isolou um cocobacilo Gram negativo de vários fetos abortados.
Mais tarde, várias outras observações deram suporte a inclusão deste organismo no gênero
Brucella, sendo denominada como Brucella canis.
AGENTE-INFECÇÃO
A B. canis é o agente etiológico da brucelose canina; enfermidade caracterizada por
manifestações clínicas variadas. A maioria dos cães infectados não apresenta sinais clínicos
perceptíveis ou mesmo considerado clinicamente normal. As manifestações clínicas
indicativas da enfermidade são, especialmente àquelas, associadas com o trato reprodutor.
O sinal clínico primário na fêmea infectada é o aborto, podendo ser acompanhado
ou não de mortes embrionárias ou natimortos.
Nos machos, os sinais clínicos mais comuns são: epididimite, orquite e/ou atrofia
testicular e dermatite de escroto. Outras manifestações podem incluir: linfadenites e
esplenites, lesões oculares, discoespondilites e osteomielites.
A presença e o diagnóstico da brucelose canina nos grandes centros urbanos
reveste-se de importância pelo risco que ela representa para a população domiciliada de
animais, para seus criadores e pelo estreito convívio ou contato com os seus "familiares".
Os estudos epidemiológicos dirigidos à brucelose canina nestes centros urbanos podem
fornecer dados relevantes quanto a sua apresentação, distribuição, comportamento desta
enfermidade venérea para os caninos, mas também como uma zoonose potencial,
especialmente para criadores, proprietários, tratadores e profissionais veterinários.
IMPACTO ECONÔMICO
Os prejuízos econômicos são muito importantes para os criadores, pois a infecção
causada pela B. canis, acomete um grande número de animais (canis), onde ela ocorre sob a
forma de surtos, envolvendo animais com alto valor zootécnico.
EPIDEMIOLOGIA
A enfermidade foi registrada nos Estados Unidos; em países da Europa; no Japão,
Madagascar e México. Na América do Sul, especialmente no Peru, Argentina e Brasil.
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Estudos epidemiológicos mostraram que a prevalência da infecção causada pela B.
canis é variável, dependendo da área geográfica e do tipo de teste aplicado. Estudos
sorológicos obtidos têm permitido valiosa informação sobre a enfermidade na população
canina bem como na população humana, representando, deste modo, mais um risco à saúde
pública.
No Brasil, a primeira observação sobre a infecção causada pela B. canis foi de
Sandoval et al., (1976), que detectaram 3,61%, dentre as 221 amostras de cães apreendidos
pelo centro de zoonoses da prefeitura municipal de São Paulo.
Wald & Fernandes (1976-7), no Rio Grande do Sul, estimaram a prevalência da
brucelose canina em 12,0 % das 192 amostras testadas de cães atendidos pelo ambulatório
do Hospital de Clínicas Veterinárias, em Porto Alegre.
Pereira Filho et al., (1978), na Bahia, quantificaram a enfermidade em 1,43%, das
1393 amostras de soro canino colhidas em Salvador.
Larsson (1979), obteve um percentual de 7,0% em levantamento realizado na
população canina da cidade de S. Paulo.
Germano et al., (1987), em Campinas, obtiveram um percentual de 5,4 % de
reagentes.
Schlemper & Vaz (1990), em Santa Catarina, detectaram 6,0 % de amostras
reagentes entre 334 amostras examinadas nos soros de cães na região do Planalto
Catarinense.
Magalhães Neto et al., (1992), em Pelotas, obtiveram uma prevalência de 22,7%
entre 304 amostras de soro canino.
Poester et al., (1994) estimaram a infecção em 7,4 % das 95 amostras da zona
urbana de Uruguaiana.
O isolamento da B. canis é considerado como o "padrão-ouro" no diagnóstico da
brucelose canina. Ela é chave importante para a aplicação de medidas no diagnóstico,
controle e prevenção da doença ou infecção.
O isolamento da B. canis pode ser obtido do sangue periférico de animais com
títulos altos de anticorpos. Moore & Kakuk (1969). Serikawa et al., (1978) isolaram B.
canis da urina e da próstata de cães infectados. Ueda et al., (1974) obtiveram isolamento de
B. canis do baço, epidídimo, próstata e linfonodos poplíteos e ilíacos. Harris et al., (1974)
isolaram B. canis do sangue, fluido cerebrospinal e de vários órgãos de fêmeas com sinais
neurológicos. Henderson et al., (1974), nos Estados Unidos, isolaram a B. canis de 3 cães
com lesões osteomielite vertebral na região tóraco-lombar (discoespondilites). Riecke &
Rhoades (1974) e Seagusa et al., (1977) isolaram B. canis de lesões oculares. Schoeb &
Morton (1978) isolaram o agente da brucelose canina de úlcera exsudativa escrotal.
No Brasil, a B. canis foi isolada por Fernandes & Wald (1976-7) do humor aquoso
de cão da raça Boxer, com lesões oculares. Neste mesmo ano, Godoy et al., (1977), em
Minas Gerais, isolaram a B. canis em hemocultura de uma cadela que havia abortado
recentemente. Larsson & Costa (1980), em São Paulo, isolaram 3 amostras de B. canis,
sendo 1 amostra de fêmea com histórico de infertilidade, e as outras duas de uma fêmea e
de um macho sem sinais clínicos. Vargas et al., (1996), em Santa Maria, isolaram B. canis
da placenta, de fetos abortados e neonatos de um canil com reprodutores caninos de várias
origens. Gomes et al., (1999), em Porto Alegre, isolaram B. canis do epidídimo e testículo
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de um cão com epididimite e orquite clínica. No Rio de Janeiro, Ferreira (2003) isolaram e
identificaram B. canis de 2 cães com sinais clínicos de brucelose canina de um canil
comercial.
DIAGNÓSTICO
O diagnóstico sorológico da brucelose canina é uma tarefa difícil e complexa,
incluindo as técnicas de fixação do complemento, soroaglutinação lenta, soroaglutinação
rápida, imunofluorescência, ELISA e imunodifusão. A imunodifusão em gelose de agar
(IDGA) é a técnica mais utilizada no diagnóstico laboratorial da infecção por ser de fácil
realização, rápida e barata. Alem disso, esta técnica pode utilizar, tanto o antígeno
superficial rugoso da B. ovis quanto da B. canis.
PREVENÇÃO E CONTROLE
A prevenção é particularmente importante, especialmente nos grandes canis. Ao
contrário da brucelose nos outros animais domésticos, a brucelose canina não é uma doença
de notificação obrigatória e sua prevalência está baseada em limitados estudos sorológicos.
A incidência atual da enfermidade nos cães é provavelmente pouco diferente de
quando ela foi reconhecida nos anos sessenta; com exceção de alguns canis comerciais e
organizações de criadores de cães ou clubes de caça que instituíram medidas preventivas de
maneira privada.
Quando a brucelose já foi diagnosticada num criatório, o controle torna-se um
dilema. A eliminação da infecção demanda tempo e custos, mas a doença pode apresentar
uma crise emocional, especialmente quando cães de valor genético são acometidos.
A prevenção da reprodução em canis envolve um plano bem monitorado de
cuidados e de higiene. Os testes sorológicos devem ser realizados 2 vezes com intervalos de
1 mês em todos os cães a serem introduzidos em um canil de reprodução. As cadelas de um
canil devem ser testadas várias semanas antes do cio esperado. Se outros testes alem do
SAT-2ME são requeridos para certificar que estão livres de brucelose, haveria tempo para
aplicar aqueles procedimentos antes do período do cio. Nenhum animal novo deve ser
introduzido dentro da colônia de reprodução até que tenham sido considerados negativos a
2 testes com um mês de intervalo. Os testes em todos os animais num canil deve ser
realizado ao menos 1 vez ao ano ou se forem observadas alterações reprodutivas ou
abortos.
Há fortes suspeitas de brucelose canina nos casos de aborto até que seja provado o
contrário. Cães com testes de screening (SAT-ME ou TAT-ME) positivos ou suspeitos
devem ser isolados e avaliados por hemocultura e sorologia, utilizando testes mais
específicos como AGIDT, utilizando antígeno de proteínas citoplasmáticas. Qualquer
canino infectado deve ser removido do canil e eliminado. Em alguns casos, os proprietários
recusam a eliminação dos animais e, nesses casos há a indicação da castração
concomitantemente à terapia com antimicrobianos e acompanhamento dos casos em pelo
menos 3 meses.
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BACTERIOLOGIA
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PERSPECTIVAS
A necessidade de se conhecer dados sobre brucelose canina nas diferentes Escolas
Ensino Veterinário do país tem como base: 1) Obter dados quanto a prevalência de
brucelose canina em cães atendidos pelo serviço de atendimento policlínico em Instituições
de Ensino, Pesquisa e Extensão, especialmente por não muitos registros. 2) Isolar a B. canis
em amostras clínicas bem como aplicar testes sorológicos no monitoramento e controle da
infecção e, finalmente como prestação de serviço especializado à Comunidade Acadêmica
pelo treinamento de técnicos, estudantes e outros profissionais.
Tabela 1. Percentual de reagentes para a B. canis, através da IDGA, no LABACVET-
UFRGS
Ano Nº Amostras Reagentes %
1994 47 5 10,63
1995 29 2 6,89
1996 130 7 5,38
1997 72 4 5,55
1998 108 15 13,88
1999 34 8 23,52
2000 ? ? ?
2001 76 02 2,63
2002 35 0 00
2003 27 5 19,23
2004 145 29 20,00
2005
2006
Total 570 76 13,3
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Brucelose em Mamíferos Marinhos

Prof. Marcos J. P. Gomes
INTRODUÇÃO
O gênero Brucella spp é um grupo homogêneo, tendo como base, os estudos de
hibridização de ADN-ADN, o espectro de hospedeiros do gênero Brucella foi,
recentemente expandido com a adição de linhagens com características desse gênero nos
mamíferos marinhos. As características microbiológicas das amostras de Brucella dos
mamíferos marinhos do Atlântico, incluindo a baleia minque (Blaenoptera acutorostrata)
do Atlântico Norte são diferentes daquelas 6 espécies terrestres, parecendo que representam
um grupo separado.
SINAIS CLÍNICOS
As alterações reprodutivas como aborto, em fêmeas; orquite/epididimite, lesões
granulares, em machos, são sinais primários da brucelose nos animais terrestres.
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A avaliação da fertilidade em animais marinhos de vida livre é difícil, entretanto nos
EUA, em 1999, Miller e colaboradores relataram casos de aborto em dois golfinhos
(Tursiops truncatus) capturados.
LESÕES
Pequenas alterações patológicas tem sido relatadas nos primeiros estudos nos
animais marinhos encalhados no leste do Atlântico Norte apesar do sucesso no isolamento
de agentes cepas pertencentes ao gênero Brucella. Contrariamente com as lesões
granulomatosas e caseosas observadas e relatadas nos gônadas da baleia minque (B.
acutorostrata) no Oeste do Pacífico. Lesões granulomatosas caseosas testiculares foram
constatadas em 31% (11/35) e 38% (35/93) em machos da baleia minque do Pacífico Norte
capturados em 2000 e 2001 respectivamente.
ESTUDOS MOLECULARES
Os estudos moleculares evidenciaram que as cepas dos mamíferos marinhos diferem
das dos mamíferos terrestres e mesmo entre as linhagens que acometem os cetáceos e os
pinípedes. Algum tempo atrás, pesquisadores sugeriram a criação de uma nova espécie
denominada B. maris, entretanto ela não foi aceita. Mais recentemente mais 2 espécies
foram sugeridas; a B. cetaceae e a B pinnipediae, as quais ainda não foram oficialmente
aceitas nem rejeitadas.
Em 2007, Foster e colaboradores sugeriram os nomes de Brucella ceti e Brucella
pennipedialis para as brucelas de cetáceos e de focas, respectivamente (Foster et al 2007).
Em breve, é bem possível que sejam incluídas novas espécies ao gênero Brucella spp.
ZOONOSE
A brucelose é uma importante zoonose para o homem causando a grande variedade
de sinais e sintomas clínicos incluindo febre ondulante, fadiga, prostração dor articular,
mialgia, depressão e anorexia. Freqüentemente ocorrem seqüelas e períodos de
recrudescência, após o episódio inicial de infecção. A brucela pode ser transmitida de
animais para o homem pelo contato direto com animais infectados; pela ingestão de
produtos infectados e pela inalação de aerossóis.
Quatro espécies do gênero Brucella (classif. atual) são causas primárias de infecção
no homem. A Brucella melitensis é muito infecciosa, sendo transmitida por caprinos e
ovinos. A B. abortus é transmitida por bovinos. A B. suis transmitida por suínos e a B.
canis transmitida por cães. Outras espécies de Brucella são raras ou não infectam ao
homem.
Há alguns poucos relatos na literatura relativos a infecção humana causada por
linhagens de Brucella de mamíferos marinhos. Um deles está ligado à infecção de um
laboratorista que adquiriu os sinais clínicos compatíveis com brucelose. A infecção foi
confirmada pelo isolamento, testes diagnósticos sorológicos, PCR, RFLP de brucella de
origem marinha (Brew et al., 1999). O segundo caso atingiu dois pacientes peruanos em
que foram diagnosticados como portadores de neurobrucelose. O quadro clínico foi
confirmado pelos testes diagnósticos (isolamento, PCR, seqüenciamento de DNA) como
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infectados naturalmente por linhagens de Brucella de mamíferos marinhos (Sohn et al.,
2003).
Na Nova Zelândia, McDonald e colaboradores, em 2006, relataram um caso em um
homem de 43 anos, morando em Auckland apresentou sinais de osteomielite espinal por 2
semanas com sinais de febre, rigor e fraqueza lombar. Os testes aplicados reagiram tanto
para a B. suis quanto B. melitensis. As amostras foram então enviadas ao laboratório de
Referencia internacional que o identificou como relacionado a Brucella originária dos EU
de golfinhos (Tursiops truncatus) e da foca comum (Phoca vitulina).
Há na literatura relatos em muitos lugares e em diversas ocasiões de isolamento de
Brucella e comprovação sorológica em muitos mamíferos marinhos, especialmente no
Hemisfério Norte.
A prevalência da detecção de anticorpos contra Brucella nos animais marinhos
variou, segundo diversos autores entre 0 a 38% dos cetáceos, dos penípedes e mustelídeos
(Jepson et al. 1997; Tryland et al. 1999; Calle at al. 2002; Hanni et al. 2003; Maratea et al.
2003; Ohishi et al 2003; Nielsen et al 2005).
Um grande estudo, envolvendo 1.855 penípedes dos EU e 1.386 penípedes e
cetáceos do Atlântico Norte revelou que 3,1 e 8, 2%, tinham sorologia positiva para
brucelas marinhas, respectivamente (Tryland et al 1999; Nielsen et al 2001).
Amostras de Brucella foram isoladas em 31% (54/175) dos mamíferos marinhos
provindos de muitas origens (Forbes et al 1993; Ewalt et al 1994; Ross et al 1994; Foster et
al 1996; Clavareau et al 1998; Miller et al 1999; Tryland et al 1999; Gonzalez et al 2002;
Maratea et al 2003; Tryland et al 2005).
Há poucos relatos de sorologia positiva em penípedes e cetáceos no Hemisfério Sul.
Retamal e colaboradores, na Antártica, em 2000, estimaram em 3,5% (6/17) das
amostras de penípedes positivas para brucelose.
Van Bressem e colaboradores, em 2001 quantificaram em 55, 2% (32/58) das
amostras reagentes a prova de brucelose nos cetáceos examinados, nas costas peruanas do
Pacífico Sul.
Na Austrália, Dawson (2005) detectou reações sorológicas positivas em 3 espécies
incluindo 75% (9/12) dos leões marinhos (Neophoca cinerea).
Na Nova Zelândia, Mackereth e colaboradores, em 2005 não detectaram reagentes
positivos em 1001 leões marinhos da Nova Zelândia (Arctocephalus hookeri).
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MORFOLOGIA & COLORAÇÃO

Hospedeiros Espécie Principal Outras espécies

Caprinos B. melitensis** B. abortus

**Não Há registro de infecção pela B. melitensis no Brasil, até o presente momento.

Quadro 2. Sobrevivência da B. abortus, segundo as Condições Ambientais e o Tempo.

Feto à sombra 180 dias

A resistência fora do corpo do hospedeiro é de aproximadamente: 5 dias em estopa

Outras fontes de Infecção

CARACTERISTICAS CULTURAIS & BIOQUÍMICAS

No Rio Grande do Sul, poucos levantamentos regionais revelaram que a situação

Teste do Rosa de Bengala

Soroaglutinação lenta (tubo)

ELISA indireto (ELISAi)

ELISA competitivo (ELISAc)

Fluorescence Polarization Assay (FPA) ou Ensaio da Polarização Fluorescente (EPF)

Milk Ring Test (MRT) ou Teste do Anel em Leite (TAL)

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

CONTROLE & PREVENÇÃO

Quadro 3 Amostras de soro trabalhadas no lABACVET-UFRGS entre 2001-2007.

BRUCELOSE OVINA ou EPIDIDIMITE OVINA

INFECÇÃO EM OUTRAS ESPÉCIES

ENSAIO IMUNOENZIMÀTICO (ELISA)

Brucelose em Mamíferos Marinhos

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