FACULDADE MARECHAL RONDON – FARON

ANYTA RINALDI

MICROBIOLOGIA GERAL

VILHENA – RO

2020
 ANYTA RINALDI

MICROBIOLOGIA GERAL

Trabalho apresentado ao Prof. Mayara Lima

Kavasaki da Faculdade Marechal Rondon –
FARON como requisito avaliativo da disciplina
de Microbiologia Geral do curso de Medicina
Veterinária.

Orientador: Prof. Mayara Lima Kavasaki

Vilhena-RO

2020
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 4
2. Bacilos álcool-ácidos resistentes.................................................................................................. 5
2.1 Coloração de Gram ........................................................................................................................ 6
2.2 Coloração de Ziehl-Neelsen........................................................................................................... 8
2.3 utilização de plasmídeos para clonagem de DNA ......................................................................... 9
3. CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 10
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 11
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1. INTRODUÇÃO

Bacilos álcool-ácidos, são micobactéria que geralmente tem crescimento lento como
também é um organismo aeróbio, são descritas como acidorresistente por conta da camada
lipídica de sua parede celular, não permitindo que a mesma seja bem corada em gram, portanto
cora-se em ziehl-neelse. Apresenta-se geralmente, como bastonetes finos, retos, ligeiramente
encurvados, ou em forma clava (MARIANA,2015, p.3). Tem uma disseminação mundial tendo
em vista que sua transmissão se dá por aerossóis ou contato direto, a Mycobacterium
tuberculosis por exemplo é uma das mais conhecidas pois é quase exclusiva do humano, já
Mycobacterium bovis, atinge os bovinos, ovinos e caprinos, tendo como forma de contagio de
animais para animais por secreções e via oronasal. Em cães e gatos, a infecção resulta da
ingestão de carne ou do contato com solo ou fômites contaminados. As manifestações clínicas
de cães infectados por Mycobacterium avium tendem a ser vagas ou ausentes, logo o
diagnóstico in vivo torna-se difícil (GONSALVES, Et al., 2013).

Os métodos de coloração comuns para bactérias são coloração de Gram e coloração de

Ziehl-Neelsen, a técnica de coloração de Gram consiste na capacidade das paredes celulares
das bactérias em serem coradas e o método Ziehl-Neelsen, baseia-se na capacidade de algumas
bactérias resistirem aos a métodos mais simples de coloração.
O plasmídeo representa pequenos fragmentos circulares de DNA bacteriano de
replicação independente, os plasmídeos podem se ligar ao DNA passando a característica de
resistência bacteriana, dando origem a uma colônia bacteriana resistentes.
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2. Bacilos álcool-ácidos resistentes

Foi descrito em 1882 por Robert Koch, bacilos álcool-ácidos resistentes representam as
microbactérias, que tem aproximadamente 60% da sua parede celular e de característica lipídica
o que as torna acidorresistentes. Esse organismo não se assemelha as gram em sua totalidade
por isso não é denominada gram positiva ou negativa, entretanto muitos autores a descrevem
como semelhante a gram positiva, são fracamente corados pelos corantes utilizados na
coloração de Gram, deste modo são coradas pelo método de Ziehl-Neelsen. São as únicas
bactérias acidorresistentes com exceção de (Nocardia asteroides, a principal causa de
nocardiose), são bacilos aeróbios, imóveis, não formam esporos, de crescimento lento,
resistência a detergentes, a ácido, a antibióticos e antibacterianos comuns, o parasitismo é
intracelular, ocasionando lesões que levam á cronicidade, com hipersensibilidade do tipo tardio
e seu tempo de vida pode ser longo(semanas) em escarros secos ou em ambientes, o que facilita
sua disseminação.
Os principais patógenos são Mycobacterium tuberculosis, que causa a tuberculose e
Mycobacterium leprae causador da lepra, Mycobacterium avium que causa doenças
respiratórias e Mycobacterium bovis causador da tuberculose bovina. A família
Micobacteriaceae antecede a evolução da vida animal e compreende diversas bactérias
saprófitas do solo que desempenham função de decompor material vegetal morto, enriquecendo
o solo, como parte do ciclo vital de plantas e árvores. Da mesma forma que outros gêneros do
reino animal, na medida em que evoluíram, mutações ao acaso produziram espécies capazes de
parasitar animais (répteis, anfíbios, peixes e pássaros). Muito mais tarde, quando os mamíferos
evoluíram, um mutante chamado Mycobacterium bovis, desenvolveu a capacidade de parasitar
um amplo espectro de animais de sangue quente: bovinos, roedores, marsupiais, cervos.
Permaneceu endêmico em muitas espécies, distribuindo-se entre presas e predadores. Sem
disseminação aérea em espaços fechados, não se tornou epidêmico. Os primeiros contatos da
microbactéria com a raça humana provavelmente foram esporádicos e causados pelo ato de
comer carne crua ou inadequadamente cozida (CAMPOS, 1999).
Segundo Campos (1999, p.52) “Mycobacterium tuberculosis resistente é um sério
problema por dois motivos principais: 1) como há apenas poucos fármacos efetivos disponíveis,
uma infecção pelo bacilo resistente pode levar a uma doença potencialmente intratável; 2)
embora apenas parte menor dos infectados venha a adoecer (5-10%), a doença é altamente
contagiosa. Portanto, se houver um número elevado de doentes tuberculosos portadores de
germes resistentes a duas ou mais drogas potentes do arsenal terapêutico contra a doença, a
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probabilidade desse número aumentar exponencialmente é grande, e estaremos de frente a um

sério problema com poucas possibilidades de solução”.
Após a entrada da M. avium no organismo pela via respiratória ou pelo trato alimentar,
ela é englobada por células fagocitárias e continua crescendo e se multiplicando. A micobactéria
se dissemina pelos tecidos adjacentes por via linfática ou hematógena. Os granulomas
frequentemente se formam como tentativa de conter o microrganismo. Tal infecção pode se
caracterizar por lesões cutâneas primárias ou progredir para infecção disseminada iniciando-se
pelo trato respiratório ou pelo trato gastroentérico (Shackelford e Reed, 1989, Apud,
Gonsalves, Et, al 2013, p.1112). Hanseníase é
infecção granulomatosa crônica, causada pelo bacilo Mycobacterium leprae. Apresenta alta
contagiosidade e baixa morbidade. Na medicina veterinária o bacilo do Mycobacterium bovis
está relacionado diretamente pois levará a morte de muitos animais, diminuição da produção de
leite, descarte precoce, eliminação de animais de alto valor, condenação de lotes e carcaças no
abate e consequentemente perca da credibilidade da unidade de criação. Recentemente, foram
incluídas nesse complexo M. caprae, que causa infecção em caprinos, e M. pinnipedii, que
causa infecções em leões marinhos e no homem, Mycobacterium avium em cães e gatos(ovinos,
equinos, suínos) que são contaminados através da ingestão de carne, de contato com solo ou
fômites infectados, em alguns casos como de cães o agente patológico Erhlichia canis pode
colaborar para essa contaminação por deixar os pacientes imunossuprimidos facilitando a
entrada do Mycobacterium avium.

2.1 Coloração de Gram

É uma técnica criada pelo médico dinamarquês, Hans Christian Gram que auxilia no
diagnóstico de doenças bacterianas, seu principal objetivo é classificar as bactérias em gram
positivas e gram negativas, a capacidade do organismo de se pigmentar se faz através de sua
parede celular, no caso da gram positiva é composta de uma espessa camada de peptideoglicano
o que retém o cristal violeta conferindo a ela uma coloração roxa, já as gram negativas essa
camada de peptideoglicano é muito delgada, entretanto, a estrutura da parede é bem mais
complexa do ponto de vista químico pois possuem membrana externa e peptideoglicano,
consequentemente não virá a reter o cristal violeta como na anterior após o tratamento com
álcool, desse modo no seu processo de descoloração e coloração final visualiza-se uma
coloração avermelhada. Nesse método são usados alguns reagentes como; cristal violeta, lugol,
álcool, fucsina e água (para lavagem). Boa parte das gram positivas são cocos, já as gram
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negativas são bacilos, mas nem todas como os lacto bacilos, existem bactérias gram variáveis
que as vezes podem ser coradas como se fossem positivas ou negativas e existem também as
micobacterias que não se coram por esse método. A identificação de bactérias como gram-
negativas ou gram-positivas é essencial para a microbiologia, uma vez que este é um dos
primeiros passos para determinar o melhor tratamento contra infecções causadas por tais
microrganismos. Técnicas como a coloração de gram, altamente empregada na área de análise
clínica, distinguem estes seres de forma simples, porém com certas limitações, enquanto as
bactérias gram-positivas possuem uma parede celular mais espessa, porém mais simples, as
gram-negativas contém uma estrutura muito mais complexa já que sua parede é envolta por
uma membrana externa com proteínas específicas que realizam a difusão seletiva com o
ambiente, impedindo a permeabilidade de alguns antibióticos(Maranni;Cena,2019,p.1). A
bacterioscopia corada, por sua vez, é realizada em esfregaços de amostras, que uma vez secos
e fixados, são submetidos a um método de coloração. Neste caso bactérias mortas são
examinadas. A técnica de Gram compreende as seguintes etapas:
1) Preparar o esfregaço delgado em lâmina de vidro e deixar secar ao ar.
2) Fixar pelo calor ou por método químico.
2) Colocar a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com solução
de cristal violeta por 1 minuto.
3) Derramar o corante e lavar com água corrente.
4) Cobrir o esfregaço com solução de iodo de Gram durante 1 minuto.
Lavar novamente com água.
5) Cobrir a superfície do esfregaço com algumas gotas do descorante
álcool-acetona até que não haja mais desprendimento de cor violeta.
Usualmente esse processo demora dez segundos ou menos. Lavar com
água corrente.
6) Cobrir a superfície com o contra corante safranina durante 1 minuto.
Lavar com água corrente.
7) Colocar a lâmina na posição vertical deixando que o excesso de água
escorra e o esfregaço seque.
8) Examinar o esfregaço com óleo de imersão empregando objetiva de
100x do microscópio.
As bactérias Gram-positivas coram-se em violeta e as bactérias
Gram-negativas, em vermelho.
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Alguns cientistas tentaram justificar as colorações diferentes para gram positivas e

gram negativas e chegaram a conclusão de que o álcool desidrata a espessa camada de
peptideoglicano nas gram positivas o que cria poros que iram reter o cristal violeta dentro da
célula (ao mesmo tempo em que se desidratam fecham a malha de peptideoglicano já que por
sua vez o álcool não irá solubilizar lipídeos ficando assim retidos os corantes), enquanto o
tratamento com álcool na Gram-negativa leva a um aumento da permeabilidade devido à
extração de lipídios da membrana externa abrindo portas desta forma para o corante (o que
explica elas não serem coradas facilmente já que inicialmente reteriam o cristal violeta porém
com o tratamento do álcool sua membrana externa seria dissolvida o que levaria a liberação do
corante).

2.2 Coloração de Ziehl-Neelsen

O bacteriologista Franz Ziehl e o patologista alemão Friedrich Neelsen foram

quem desenvolveram em 1882 a técnica de Ziehl-Neelsen, onde por meio desta técnica pode-
se visualizar o bacilo álcool-ácido resistente, o que auxilia no diagnóstico da tuberculose. Esse
exame é chamado de Baciloscopia e oferece um diagnóstico presuntivo, sendo a cultura o
padrão ouro e que fornece o diagnóstico de certeza. O número de micobactérias na amostra é
importante para a análise da evolução da doença. Além dessas características, os bacilos
também podem formar agrupamento em corda (MOREIRA et al.,2015, p.59). Empregada em
bactérias que resistem a métodos comuns como de gram pois reagentes em sua maioria são
aquosos, por conta de sua parede celular na qual existe um alto teor de ácido micólico o que a
torna hidrofóbica, nesse caso necessita-se uma coloração mais elaborada com vários processos
distintos.
A técnica pode ser realizada como descrita abaixo:
1) Cobrir o esfregaço (homogêneo, delgado e fixado) com solução de
fucsina de Ziehl.
2) Deixar agir por 5 a 10 minutos, aquecendo em chama branda até o
desprendimento de vapores.
3) Lavar com água corrente e descorar com solução de álcool-ácido
clorídrico a 1%. Lavar com água corrente.
4) Cobrir o esfregaço com azul de metileno e deixar por um minuto.
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5) Lavar com água corrente e deixar secar.

6) Visualizar com objetiva de imersão (100x).

nesse modo a fucsina será a primeira a ser utilizada sendo um passo muito importante
pois esse reagente tem a capacidade por meio do aquecimento da lâmina de adentrar nas paredes
celulares, descoradas em solução álcool-ácido e coradas com um contra corante como exemplo
o azul de metileno, deste modo as bactérias acidorresistentes se coram em vermelho por conta
da fucsina, já o processo de descoramento serve para desbotar qualquer outra bactéria, e o azul
de metileno para que crie um fundo em contraste de azul, visualizando assim de forma mais
fácil esses organismos. Na coloração pelo método de Ziehl-Neelsen, o resultado é quantitativo,
o que permite a avaliação da infectividade/potencial de transmissão do paciente bem como
acompanhar a redução da do grau de propagação após o início do tratamento, se torna
importante pois todo esse método auxilia no diagnóstico, no desenvolvimento de tratamentos,
vacinas ou medicamentos como também na catalogação e identifição para estudo desse
organismos.

2.3 utilização de plasmídeos para clonagem de DNA

A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia
de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria
inicial. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual
consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular
compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do 2 DNA de
interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para
formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo a molécula do DNA recombinante é
introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A
célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de
transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre
muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do
DNA recombinante (NASCIMENTO, Et, al 2003). É um processo pelo qual se faz copias de
pedaços de DNA que codificam ou expressam proteínas das quais tenham interesse, retira-se
da fita o genes escolhidos utilizando enzimas de restrição que cortam sítios específicos do gene,
após esse processo esse gene será inserido em um plasmídeo ( material genético circular de
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bactéria) que serão ligadas pela ligase, posteriormente recebe o nome de plasmídeo
recombinante, será inserido em um organismo que geralmente é a Escherichia coli contudo
esses organismos variam podendo ser: bactérias, células animais e vegetais ou fungos, através
de um choque térmico (transformação com cloreto de cálcio, é um método fácil e relativamente
barato de transformação)ou um pulso elétrico(As células são submetidas a alta voltagem que
provoca uma desestabilização da membrana externa e a formação de poros, possibilitando a
entrada do DNA para o interior da célula),essa bactérias iram se replicar de forma idêntica o
que replicará também o gene selecionado obtendo assim sucesso na clonagem, esse processo é
feito in vitro e alguns estudiosos afirmam que plasmídeos menores se incorporam melhor a
célula bacteriana competente.
Tem importância no sequenciamento do DNA, separar fragmentos de DNA em clones
independentes, estudar a transcrição e tradução de genes, visualizar a expressão funcional de
genes, sintetizar proteínas para produção de anticorpos, para a produção de vacinas
recombinantes e clonagem de genes de interesse, para expressão e produção de proteínas
recombinantes: insulina e hormônio de crescimento.

3. CONCLUSÃO

Em virtude dos fatos mencionados nota-se que as bactérias em geral contribuem para o
aprimoramento de técnicas, vacinas e conhecimentos, por mais que sejam estudadas desde a
antiguidade, com as tecnologias do presente esses estudos tomam formas mais abrangentes,
principalmente na medicina veterinária onde temos uma variedade de espécies,
consequentemente uma vasta lista de doenças, como citado Mycobacterium bovis, M. avium e
M. caprae, que contaminam animais o que irá auxiliar o diagnóstico são as formas de coloração
de Gram ou de Ziehl-Neelsen, já para o tratamento ou formulação de vacinas a técnica de
clonagem de DNA em que utiliza-se plasmídeos.
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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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