MECANISMO
FIXAÇÃO DO NITROGÊNIO
Nitrificação: O primeiro passo no ciclo é a fixação
(redução) do nitrogênio atmosférico, por bactérias
fixadoras de nitrogênio, produzindo amônia (NH3 ou
NH4+). Embora a amônia possa ser utilizada pela maior
parte dos organismos vivos, bactérias do solo, que
obtêm sua energia pela oxidação da amônia em nitrito
(NO2–) e, por fim, em nitrato (NO3–), são tão
abundantes e ativas que praticamente toda a amônia
que chega ao solo é oxidada a nitrato.
Desnitrificação: Plantas e muitas bactérias podem
captar e reduzir facilmente nitrato e nitrito a amônia,
pela ação de nitrato e nitrito-redutases.
A amônia assim produzida é incorporada nos
aminoácidos pelas plantas. Animais podem utilizar as
plantas como fonte de aminoácidos, tanto não
essenciais quanto essenciais, para construir suas
proteínas.
Quando os organismos morrem, a degradação
microbiana de suas proteínas retorna a amônia ao
solo, onde bactérias nitrificantes novamente a
convertem em nitrito e nitrato. Um equilíbrio entre o
nitrogênio fixado e o nitrogênio atmosférico é mantido
por bactérias que reduzem nitrato a N2 em condições
anaeróbias, processo denominado desnitrificação
–
Essas bactérias do solo utilizam NO , e não O2, como
3 exergônica
aceptor final de elétrons, em uma série de reações
que, da mesma forma que a fosforilação oxidativa,
gera um gradiente de prótons transmembrana, que é
utilizado para sintetizar ATP.
Inicialmente, o NO3 – é reduzido a NO2 – pela nitrato-
redutase, e então o NO2 – é reduzido a NH4 1 em uma
transferência de seis elétrons, catalisada pela nitrito-
redutase
A nitrato- -redutase é uma proteína grande e solúvel
Dentro da enzima, um par de elétrons, doados pelo
NADH, flui pelos grupos ¬SH da cisteína, FAD e de um
citocromo (cit b557), e daí para um novo cofator
contendo molibdênio, antes de reduzir o substrato
NO3 – a NO2
Seis elétrons, doados um por vez pela ferredoxina,
passam por um centro 4S-4Fe na enzima e, então, por
uma nova molécula do tipo heme (siro-heme) antes
de reduzir o NO2 – a NH4 1 (Figura 22-2). Em
microrganismos não fotossintéticos, o NADPH fornece
os elétrons para essa reação
A fixação do nitrogênio é realizada por enzimas do
complexo da nitrogenase
O primeiro produto importante da fixação do
nitrogênio é a amônia, que pode ser utilizada por
todos os organismos, seja diretamente ou após
conversão em outros compostos solúveis, como
nitritos, nitratos ou aminoácidos.
A redução do nitrogênio em amônia é uma reação
A ligação tripla N ‚ N, entretanto, é muito estável
Assim sendo, a fixação do nitrogênio tem uma energia
de ativação extremamente alta, e o nitrogênio
atmosférico é quase quimicamente inerte, em
condições normais
A fixação biológica do nitrogênio é realizada por um
complexo altamente conservado de proteínas,
denominado complexo da nitrogenase,
componentes centrais são a dinitrogenase-redutase e
a dinitrogenase
A dinitrogenase é reduzida pela transferência de
elétrons a partir da dinitrogenase-redutase (Figura 22-
4).
O tetrâmero da dinitrogenase apresenta dois sítios de
ligação para a redutase. Os oito elétrons necessários
são transferidos, um a um, da redutase para a
dinitrogenase: uma molécula de redutase reduzida
liga-se à dinitrogenase, transfere um único elétron e
então a redutase oxidada se dissocia da dinitrogenase,
em um ciclo que se repete.
Cada volta do ciclo requer a hidrólise de duas
moléculas de ATP pela redutase dimérica.
A fonte imediata de elétrons para a redução da
dinitrogenase-redutase varia, podendo ser
ferredoxina reduzida (ver Seção 19.8), a flavodoxina
reduzida, e talvez outras fontes que também tenham
um papel nessa redução. Em pelo menos uma espécie,
a fonte primária de elétrons para reduzir a ferredoxina
é o piruvato
cujos Na reação catalisada pela dinitrogenase-redutase,
tanto a ligação do ATP quanto sua hidrólise
determinam alterações conformacionais na proteína
que ajudam a superar a alta energia de ativação da
fixação do nitrogênio.
SIMBIOSE
A relação simbiótica entre plantas leguminosas e
bactérias fixadoras de nitrogênio nos nódulos de suas
raízes engloba os dois problemas do complexo da
nitrogenase: as necessidades de energia e a labilidade
frente ao oxigênio. É provável que a energia
necessária para a fixação do nitrogênio tenha sido a
força que evolutivamente levou a essa associação
entre planta e bactéria.
As bactérias nos nódulos das raízes têm acesso a um
grande reservatório de energia na forma de
abundantes carboidratos e intermediários do ciclo do
a
ácido cítrico, disponibilizados pela planta. Isso pode
permitir à bactéria fixar nitrogênio em quantidades
centenas de vezes maiores que o fazem suas primas
de vida livre, nas condições normalmente encontradas
no solo. Para resolver o problema da toxicidade pelo
oxigênio, as bactérias nos nódulos das raízes ficam
banhadas em uma solução contendo uma
hemeproteína ligadora de oxigênio, a leg-
hemoglobina, produzida pela planta
A fixação do nitrogênio é um processo
energeticamente dispendioso: 16 moléculas de ATP e
8 pares de elétrons produzem apenas 2 NH3
A amônia é incorporada em biomoléculas via O a-cetoglutarato, intermediário do ciclo do ácido
glutamato e glutamina cítrico, sofre aminação redutora, com a glutamina
como doador de nitrogênio
O glutamato é fonte de grupos amino para a maior
parte dos demais aminoácidos, por meio de reações O glutamato também pode ser formado por meio de
de transaminação outra via, embora de menor importância: a reação
entre a- -cetoglutarato e NH4 1, formando glutamato
O nitrogênio amídico da glutamina é fonte de grupos
em uma única etapa. Essa reação é catalisada pela L-
amino em uma ampla gama de processos
glutamato-desidrogenase, uma enzima presente em
biossintéticos.
todos os organismos. Os equivalentes redutores são
As vias biossintéticas para a produção de glutamato e fornecidos pelo NADPH
glutamina são simples, e todos os passos ou alguns
deles ocorrem na maioria dos organismos.

A via mais importante para a incorporação de NH4+ em

glutamato é constituída por duas reações.
Inicialmente, a glutamina-sintetase catalisa a reação
entre glutamato e NH4+, produzindo glutamina. Essa
reação ocorre em duas etapas, com o g-glutamil-
fosfato ligado à enzima como intermediário

Em células eucarióticas, a L-glutamato- -desidrogenase

localiza-se na matriz mitocôndria

A reação da glutamina-sintetase é um ponto

importante de regulação no metabolismo do
nitrogênio

(A enzima do tipo II, de eucariotos e de algumas

bactérias, tem 10 subunidades idênticas.)

A alanina, a glicina e pelo menos seis produtos finais

do metabolismo da glutamina são inibidores
alostéricos da enzima (Figura 22-8).
Cada inibidor por si só produz apenas uma inibição
parcial, mas os efeitos de múltiplos inibidores são
mais que aditivos e todos os oito em conjunto
praticamente “desligam” a enzima.
Esse é um exemplo de inibição por retroalimentação
cumulativa. Esse mecanismo de controle fornece um
ajuste constante dos níveis de glutamina, de forma a
satisfazer as necessidades metabólicas imediatas da
célula.
A regulação alostérica de uma enzima individual pode
ser consideravelmente mais complexa.
Seis produtos derivados da glutamina atuam como
moduladores na retroalimentação negativa da enzima,
e os efeitos gerais desses e de outros moduladores
são mais que aditivos. Tal regulação é denominada
inibição orquestrada
Sobreposta à regulação alostérica, está a inibição por
adenililação (adição de AMP) da Tyr397, localizada
próxima ao sítio ativo da enzima (Figura 22-9).
Essa modificação covalente aumenta a sensibilidade
aos inibidores alostéricos, e a atividade diminui à
medida que mais subunidades vão sendo adenililadas.
Tanto a adenililação quanto a desadenililação são
realizadas pela adenilil-transferase parte de uma
cascata enzimática complexa que responde aos níveis
de glutamina, a-cetoglutarato, ATP e Pi .
A atividade da adenilil-transferase é modulada pela
ligação a uma proteína reguladora denominada PII, e a
atividade da PII, por sua vez, é regulada por
modificação covalente (uridililação), novamente em
um resíduo de Tyr.
Ativação: O complexo entre adenilil-transferase e PII
uridililada (PII-UMP) estimula a desadenililação,
enquanto o mesmo complexo, com a PII desuridililada,
estimula a adenililação da glutamina-sintetase. Tanto a
uridililação quanto a desuridililação da PII são
catalisadas por uma única enzima, a uridilil-
transferase.
Inibição: A uridililação é inibida pela ligação de
glutamina e Pi à uridililtransferase e é estimulada pela
ligação de α-cetoglutarato e ATP à PII.

A regulação não cessa nesse ponto. A PII uridililada

também controla a ativação da transcrição do gene
que codifica a glutamina-sintetase, aumentando a
concentração celular da enzima; a PII desuridililada,
por sua vez, determina uma diminuição na transcrição
do mesmo gene.

O resultado final desse elaborado sistema de controle

é uma diminuição na atividade da glutamina-sintetase
quando os níveis de glutamina estão altos e um
aumento nessa atividade enzimática quando os níveis
de glutamina estão baixos e houver disponibilidade de
a-cetoglutarato e ATP (substratos da reação da
sintetase). O

Mais de doze reações biossintéticas conhecidas

utilizam a glutamina como a principal fonte
fisiológica de grupos amino 1) O nitrogênio g-amídico da glutamina (em vermelho)
é liberado como NH3 , em uma reação que
Como classe, as enzimas que catalisam essas reações
provavelmente envolve um intermediário covalente
são denominadas glutamina-amidotransferases.
glutamil-enzima. A NH3 viaja através de um canal até
Todas elas apresentam dois domínios estruturais: o segundo sítio ativo.
um deles liga a glutamina e o outro liga o segundo
2) A NH3 reage com qualquer de diversos aceptores.
substrato, um serve como aceptor do grupo amino

Um resíduo de Cys conservado no domínio onde

ocorre a ligação da glutamina atue como nucleófilo,
clivando a ligação amida da glutamina e formando
um intermediário glutamil-enzima covalentemente
ligado.

A NH3 produzida nessa reação não é liberada e sim

transferida por meio de um “canal de amônia” a um
segundo sítio ativo, onde reage com o segundo
substrato, formando um produto aminado.