Coleção de Culturas Tropical – Fundação André Tosello

AC–IOP–008
ORIENTAÇÕES PARA ABERTURA DE AMPOLA Revisão: Inicial
E REATIVAÇÃO DE LINHAGENS LIOFILIZADAS Emissão: 04/08/2020

Verificar cada linhagem cuidadosamente após seu recebimento. Se a mesma se apresentar insatisfatória, notificar a FAT-CCT para que sejam
tomadas as devidas ações.
Seguir as recomendações da Carta de Envio que acompanha a linhagem para cultivo da mesma (meio de cultura, temperatura de incubação, e
demais instruções específicas), de forma a garantir condições ideais de recuperação.

Microrganismos distribuídos na forma liofilizada, em ampola de vidro selada, apresentam validade indeterminada desde que seu armazenamento
seja por refrigeração (02 a 10°C) e livre de injúrias (sem rompimento do vidro).

A preservação por liofilização é eficiente por manter a linhagem desidratada e sob vácuo. Uma vez rompida a ampola, a linhagem entra em contato
com oxigênio e umidade atmosféricos, reiniciando suas atividades metabólicas. Portanto, o conteúdo da ampola deve ser reativado por completo; não
podendo ser armazenada uma parte do mesmo para reativação posterior.
É necessário ter cuidado ao abrir ampolas com conteúdo liofilizado, pois estas estão a uma pressão inferior, de modo que a entrada súbita de ar é
capaz de provocar a dispersão de parte do conteúdo para o ar ambiente.

A abertura da ampola deve ser realizada em ambiente estéril, por pessoal treinado em técnicas microbiológicas e seu manuseio deve ser feito em
instalações que atendam aos requisitos de contenção apropriados respeitando o nível de biossegurança exigido para a linhagem a ser manipulada (ampolas
contendo microrganismos de classe de risco 2 devem ser abertas em cabines de biossegurança), tomando os seguintes cuidados:
• Todo o material empregado deve ser estéril ou previamente flambado.
• Se não for possível trabalhar em cabine de biossegurança (fluxo laminar), usar proteção adequada para os olhos. Manter a ampola afastada do rosto e
sobre uma ou bandeja.
• Usar luvas.
• Esterilizar a ampola vazia e seus fragmentos antes do descarte, obedecendo as legislações vigentes para descarte de resíduos biológicos.

Rompimento da ampola com auxílio de lima ou caneta ponta de diamante

Rompimento da ampola através de choque
Desinfetar a superfície externa da ampola com uma gaze embebida em álcool etílico 70%.
térmico
Riscar a ampola na altura do ponto médio do tampão de algodão, utilizando lima ou caneta
com ponta de diamante.
A ampola pode ser aberta através do
1 2 rompimento do vidro por choque térmico:
alternam-se passagens rápidas da ampola no
fogo do bico de Bunsen com gotejamento de
água destilada estéril (ou solução salina estéril)
gelada (mantida em banho de gelo).

Envolver a ampola em um chumaço de algodão ou gaze embebido em

álcool etílico 70%. Segurando firmemente com ambas as mãos, quebrar a
4 Retirar a porção superior da ampola próximo ao bico de Bunsen
e remover o tampão de algodão com uma pinça.
ampola na altura do risco pressionando com os dedos polegares.
Adicionar lentamente 0,2 mL de água destilada com o auxílio de
NOTA: Tomar cuidado para não deixar a gaze muito molhada, pois o uma pipeta para voltar a formar a suspensão, evitando a
álcool pode ser sugado para o liófilo quando o vácuo é quebrado. formação de espuma.
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Seguir procedimentos abaixo conforme o microrganismo (bactérias / leveduras ou fungos filamentosos).

6 NOTA: Alguns microrganismos podem necessitar de repiques regulares para sua manutenção.

REATIVAÇÃO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS

1. Fazer a suspensão das células, deixando reidratar por 10 a 15 minutos; e transferir todo o conteúdo da ampola para um tubo de ensaio contendo 5,0 mL
de meio de cultura líquido (caldo) indicado para o microrganismo e incubar conforme orientação para cada linhagem (conforme Carta de Envio que
acompanha as linhagens).
2. A partir da cultura crescida no caldo (observação de turvação), fazer uma estria de esgotamento em placa contendo meio de cultura sólido recomendado.
3. Incubar a linhagem nas condições de luz, temperatura e tempo de crescimento recomendadas.

NOTAS:
• Culturas bacterianas anaeróbicas devem ser reidratadas evitando a aeração do meio de cultura, assim como do liófilo; proceder com a sucção e
homogeneização com maior delicadeza.
• Com tratamento e condições adequadas, a maioria das culturas liofilizadas crescerá em poucos dias. No entanto, algumas podem necessitar de maior
tempo de incubação; assim manter o material incubado pelo dobro do tempo normal, antes de ser descartado como inviável.

REATIVAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

1. Reidratar o liofilizado por 30 minutos a uma hora; e transferir todo o conteúdo da ampola para um tubo de ensaio contendo 5,0 mL de meio de cultura
líquido (caldo) indicado para o microrganismo e incubar conforme orientação para cada linhagem (conforme Carta de Envio que acompanha as
linhagens).
2. A partir da cultura crescida no caldo (observação de turvação), fazer repique em placa contendo meio de cultura sólido recomendado, com a superfície
seca.
3. Incubar a linhagem nas condições de luz, temperatura e tempo de crescimento recomendadas.

NOTA:
• Algumas linhagens podem necessitar de maior tempo de incubação, assim manter o material incubado pelo dobro do tempo normal, antes de ser
descartado como inviável.
• Armazenar a mistura de material liofilizado hidratado até obter crescimento.

Em caso de dúvidas ou para maiores informações, entrar em contato através do email cct@fat.org.br ou pelo telefone (19) 3242-7022. 1 de 1