REVISTA BRASILEIRA

DETOXICOLOGIA
BRAZILIAN JOURNAL
OF TOXICOLOGY.
@SOCIEDADE Revista Brasjleirade Toxicologia 20, n.1 e2 (2007) 21-28
BRASn..EIRA DE
TOXlCOLOGIA

Medicamentos veterinários na apicultura: metodologias

analiticas para determinação de resíduos no mel

Gustavo Tayar Peres, Flavia Pereira da Silva Airoldi, Felix Guillermo Reyes Reyes*

Laboratório de Toxicologia, Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade

Estadual de Campinas -UNICAMP

Abstract
,
Veterinary drugs on the apiculture: analytical methodologies for residues determination

There is an increasing demand for the determination of veterinary drug residues in honey. To determine these residues, many
analytical techniques are available, but the high performance liquid chromatography has an important position, since it can be
connected to different detectors in order to reach the requiredselectivity for the contaminant identification and quantification.
Nowadays, mass spectrometry has become one of the most appropriated techniques to determinate veterinary drug residues
in foods. However, the sample preparation is stilI a critical step in this kind of analysis. The present work is a review of the
analyticaI methods that use high performance liquid chromatography for the determination of veterinary drug residues in
honey, with emphasis on mass spectrometry and sample preparation.

Keywords: chromatography, residues, antimicrobial, veterinary drugs, honey, mass spectrometry.

INTRODUÇÃO oxitetraciclina, a estreptomicina e o cloranfenicol (CLAY,

A apicultura no Brasil é uma atividade que tem se
desenvolvido pelo crescimento da demanda de seusprodu-
tos no mercado interno e, principalmente, no mercado exter-
no (BRASIL, 2006a). A produção e comercializaçãode mel é
uma fonte de renda alternativa para os produtores rurais e,
em algumas regiões do país, é a principal ati vidade remune-
radora. Como em outras atividades agropecuárias, as abe-
lhas utilizadas para a produção de mel podem ser afetadas
por doenças que prejudicam a produtividade do apiário.
Entre as doenças mais prejudiciais que ocorrem na apicultu-
ra destacam-se as de origem bacteriana, como a Cria Pútrida
Européia (EFB) e a Cria Pútrida Americana (AFB), as quais
estão amplamente disseminadas no mundo, ocorrendo de
forma crônica em alguns países(WILSON, 2000). Paracon-
trole destas doenças, a medicina veterinária utiliza as técni-
cas de manejo em conjunto com a aplicação de medicamen-
tos veterinários. As substâncias mais utilizadas para con-
trole da AFB e EFB, legal ou ilegalmente, são o sulfatiazol, a
*Autor correspondente: Felix Guil/enno Reyes Reyes, Laboratório de
Toxicologia, Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de
Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas -
UNICAMP. R. Monteiro Lobato, 80, Cidade UnivelSitária 'Zeferino Vaz".
Caixa Posta16121, 13083-B62 Campinas, SP. Tel: (19)3521-2168,
Fax: (19)3521-2153, e-mail: reyesfgr@fea.unicamp.br
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direitos reservados
2(XX);HORMAZÁBALe YNDESTAD,2001; MARTIN, 2003;
VERZEGNASSI etal.,2003; ORTELLIetal., 2004). Entre-
tanto, a utilização de medicamentos veterinários na apicul-
tura pode incorrer em resíduos dos antimicrobianos no mel
(MUTINELLI, 2003; MARTEL e ZEGGANE, 2003) .A pre-
sença destesresíduos no mel implica em riscos à saúde dos
consumidores quando da ingestão do produto devido à
toxicidade dos agentes antimicrobianos. Resíduos de
antimicrobianos em alimentos podem, também, contribuir
para que bactérias patogênicas ao homem e aos animais
adquiram resistência à ação dos medicamentos, tornando
os tratamentos tradicionais ineficazes.
Com o objetivo de definir níveis seguros para a
ingestão de resíduos de medicamentos veterinários em ali-
mentos, o comitê conjunto da Organização para Alimenta-
ção e Agricultura (FAO) e da Organização Mundial de SaÚ-
de (WHO) de peritos em aditivos de alimentos (JECFA) ava-
lia os dados toxicológicos disponíveis para determinados
medicamentos veterinários. Na Tabela I, estão os valores
de ingestão diária aceitáveis (IDA) estabelecido pelo JECFA
para os principais antimicrobianos utilizados na apicultura.
O JECFA também estabelecelimites máximos de resí-
duos (LMR) de medicamentos veterinários para alguns ali-
mentos como carnes, leite e ovos. Entretanto, não foram
estabelecidos, até o presente, LMR para estes agentes
antimicrobianos em mel.
No Brasil. o Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA) criou o Programa de Controle de
22 Re.yes F.GR./Revista Brasileira
Resíduos no Mel (BRASil." 2006b ). O programa estabelece
LMR somente para as tetraciclinas (oxitetraciclina,
tetraciclina e clortetraciclina) e sulfonamidas (sulfatiazol,
sulfametazina e sulfadimetoxina) de 100 e 200 !lg kg-l, res-
pectivamente. Os valores são referentes à soma dos resídu-
os de cada antimicrobiano.
Para realizar o monitoramento dos resíduos de medi-
camentos veterinários em mel, diversas técnicas analíticas
são utilizadas. Na etapa de triagem, onde se pretende seleci-
onar as amostras suspeitas de contaminação, os métodos
mais utilizados são os imunoensaios como o ElA ("Enzyme
immunoassay") e ELISA ("Enzyme-Iinked immunosorbent
assay") (BOGDANOV, 2003). Existem, também, os ensaios
de diagnóstico rápido (kits comerciais), os quais ganharam
importância nos últimos anos frente à necessidadedos pro-
gramas de vigilância e das indústrias em analisar um grande
número de amostras a fim de garantir a segurança dos ali-
mentos. Porém, para a quantificação e confirmação da iden-
tidade do(s) contaminante(s), as técnicas citadas são insu-
ficientes. Atualmente, a cromatografia líquida de alta efici-
ência (HPLC) acoplada a diferentes tipos de detectores é a
técnica analítica mais utilizada para quantificação e confir-
mação de resíduos de medicamentos veterinários no mel.
Entre os detectores utilizados, o espectrômetro de massas
se destaca pela alta seletividade e capacidade de identifica-
ção dos compostos analisados. Independentemente da téc-
nica de análise utilizada, o preparo da amostra é, ainda, a
etapa mais crítica na análise de resíduos em matrizes com-
plexas como os alimentos.
Este trabalho visa revisar as metodologias analíticas
que utilizam a cromatografia liquida de alta eficiência na deter-
minação de resíduos de antimicrobianos em mel, com destaque
para a espectrometria de massase o preparo de amostra.
CROMATOGRAFIA LiQUIDA DE ALTA EFICltNCIA (HPLC)
A análise de resíduos de antimicrobianos em alimen-
tos envolve a determinação de concentrações na ordem de
microgramas (~g) ou nanogramas(ng) do(s) contaminante(s)
por quilograma (kg) de matriz. Esta baixa concentração difi-
culta os procedimentos analíticos, principalmente em amos-
de Toxicologia 20, n.J e 2 (2007)
trascomplexascomo os alimentos, onde a separaçãodo analito
de interessedos outros componentes da matriz é uma tarefa
bastantedifícil. A cromatografia líquida de alta eficiência é
uma técnica de separaçãode compostos atravésdas diferen-
çasde afinidade que estesapresentamem relação à fase esta-
cionária e a fasemóvel. A associaçãode HPLC com diferentes
técnicas de detecçãopossibilita a análise qualitativa e quan-
titativa de um grande número de substâncias, incluindo a
maioria dos antimicrobianos. As técnicas de detecção mais
utilizadas são espectrofotometria UV-visível (UV), a
fluorescência e a especb"ometriade massa.(MS).
Na Tabela 2 estão resumidas as condições de análi-
se de alguns métodos que utilizam HPLC associada a di-
versos detectores para determinação de resíduos de
antimicrobianos em mel.
Analisando-se a Tabela 2 é possível notar que a uti-
lização de colunas de fase reversa é predominante na deter-
minação de antimicrobianos no mel. O mesmo ocorre para a
utilização de solventes orgânicos de alta polaridade na cons-
tituição da fase móvel, sendo que a acetonitrila e/ou o
metanol são constituintes da fase móvel de todos os traba-
lhos revisados.
ISOHERRANEN eSOBACK (1999) revisaramdiver-
sos métodos de análise cromatográfica para determinação
de aminoglicosídeos, incluindo a estreptomicina e a
diidroestreptomicina. Os autores afirmam que, devido às
características dos aminoglicosídeos, HPLC é a técnica
mais apropriada para análise destes compostos. Entretan-
to, a alta polaridade das moléculas e a ausência de um
cromóforo dificultam a separação e detecção, respectiva-
mente. Para melhorar a separaçãoem coluna de fase reversa,
EDDER et ai. ( 1999) utilizaram a crornatografia de par iônico,
adicionando à fase móvel os alquilsulfonatos como con-
tra-íons. A mesma técnica foi utilizada por PANO et al.
(2004). Ambos os grupos fizeram a derivatização, pós-co-
Iuna analítica, com hidróxido de sódio para permitir a
detecção por fluorescência. Na determinação de
estreptomicina em méis por MS, os alquilsulfonatos po-
dem ser substituídos pelo ácido pentafluoropropiônico,
pois aqueles são incompatíveis com os sistemas de
ionização dos equipamentos de espectrometria de massas
(BRUIJNSVOORT et al. ,2004).
 Reyes F.GR./Revista Brasileira de Toxicologia 20, n. J e 2 (2007) 23

Tabela 2: Métodos de HPLC para determinação de resíduos de antimicrobianos em mel

OKAe(al..1994

50 ~g k~- HORIE et aI.. 1992

Acetonitrila
I Água! 900 II 3000
uv Pecospherc CR C 18 DlAZt'tal., 1990
, ' SOA '-- J!g kg-1
do para melhorar
, a simetria
' dos picos é .o sal dissódico do

As tetraciclinas possuem a característica de interagir

fortemente com os grupos silanóis e traços de metais pre-
sentes nas colunas cromatográficas com suporte de sílica.
Este fato favorece a formação de caudas nos picos detecta-
dos~Para superar este problema, são apresentadasdiversas
soluções como a utilização de colunas com recheio à base
de polímeros e colunas com substituintes que formam uma
proteção do esqueleto de sílica (end-capping). Outra forma
de diminuir as interações das tetraciclinas com os silanóis é
a utilização de ácidos na fase móvel como o fosfórico, o
cítrico, O tartárico e OoxáJico, sendo que com este último os
picos apresentam melhor simetria. Outro composto utiliza-
ácido etilenodiaminotetracético (NalEDTA). As tetraciclinas
apresentam tluorescência quando complexadas com íons
metálicos como, por exemplo, Cal+, Mgl+ e A13+ ou quando
em meio básico. Elas apresentam, também, absorção no UV
entre 270 e 36Onm. Portanto, além do espectrômetro de mas-
sas, os detectores de UV e tlorescência, também são utiliza-
dos na determinação de tetraciclinas em mel (OKA et al. ,
2000; ANDERSON et al. ,2005).
Os métodos existentes na literatura para determina-
ção de sulfonamidas em mel descrevem a utilização de colu-
nas de fase reversa tipO octadecil (C 18). HORIE et al. ( 199? )
24 Reyes F.GR./Revista Brasi[eira
relataram a determinação de 10 sulfonamidas em mel com
um tempo de análise cromatográfica de 20 minutos.
CABALLERO e1 al. (2001) realizaram a separação
cromatográfica de 15 sulfonamidas, sendo que II delas pu-
deram ser determinadas como resíduos no mel com limites
de detecção entre I 00 e 2000 ~g L .1 Os autores destacaram
a dependência dos fatores de retenção (k') com relação ao
pH da fase móvel e a utilização deste parâmetro,juntamente
com a adição de compostos surfactantes, como ferramentas
para incrementar a separação e resolução dos picos. De
maneira semelhante, VINAS et al. ( 1995) estudaramo com-
portamento dos k' de cinco sulfonamidas em relação à com-
posição da fase móvel contendo acetonitrila e água. Os va-
lores de k' declinaram rapidamente com o acréscimo de
acetonitrila na fase móvel de 0 a 20% (relação entre volu-
mes-v/v). A espectrofotometria UV com comprimentos de
onda entre 260 e 285nm é utilizada por diversos autores na
determinação de resíduos de sulfonamidas em mel (DIAZ et
al., 1990; HORIE et al., 1992; viNAS et al~, 1995;
CABALLERO et al., 2001). Outros pesquisadoresrealiza-
ram a detenninação de sulfonamidas em mel com detectores
de fluorescência após derivatização dos antimicrobianos
com fluoroescamina (MARTEL e ZEGGANE, 2003; PANO et
al., 2003; POSYNIAK et ai., 2003; MAUDENS etal., 2004).
Os métodos de cromatografia líquida (LC) para de-
terminação de cloranfenicol em méis desenvolvidos nos úl-
timos anos utilizam as colunas de fase reversa C18 e o
espectrômetro de massas como detector. As principais dife-
renças entre as etapas cromatográficas dos métodos revi-
sados são em relação à fase móvel utilizada. Foram utiliza-
das misturas de metanol e ácido fórmico, metanol e acetato
de amônio, água e acetonitrila, ácido fórmico e acetonitrila,
formitato de amônio e acetonitrila (HORMAZÁBAL e para o sistemaMS/MS, somentedurante o período de eluição
YNDESTAD, 2001; TURNIPSEED et al., 2002;
VERZEGNASSI et ai., 2003; BOGUSZ et ai. ,2004; OR1ELLI
e1al. , 2004; FORTI et al. ,2005).
FSPEC1ROMETRIA DE MASSAS (MS)
A utilização do espectrômetro de massas como
detector para o sistema cromatográfico possibilita a confir-
mação de identidade do composto de interesse através dos
dados sobre a sua massa e estrutura molecular. As informa-
çÕessão obtidas da relação massa (m)/carga (z) do íon pre-
cursor gerado no processo de ionização e seus produtos de
fragmentação gerados nas etapas seguintes de equipamen-
tos de espectrometria de massasseqliencial (MS/MS). Além
da possibilidade de confirmação da substância analisada, a
espectrometria de massas pode solucionar problemas na
separação dos componentes da amostra que não apresen-
tem boa resolução na separação cromatográfica devido a
semelhanças estruturais, melhorando a determinação quan-
titativa de contaminantes (GENTIIJI e! al., 2005). Na deter-
minação de resíduos de medicamentos veterinários em mel,
a espectrometria de massastornou-se uma importante ferra-
menta analítica e seu uso difunde-se entre os pesquisado-
res (vide Tabela 2). Entretanto. os equipamentos disponí-
de Toxicologia 20, n.l e 2 (2007)
veis atualmente apresentamum custo elevado em compara-
ção aos detectores de fluorescência e UV.
KAUFMANN et al. (2002) desenvolveram um méto-
do para determinação de sulfonamidas e tetraciclinas em
mel utilizando LC-MS/MS. Os autores utilizaram um equipa-
mento do tipo triplo-quadrupolo com sistema de ionização
por eletronspray no modo positivo (ESI+). Os resultados
mostraram que as sulfonamidas que eluíram primeiro da co-
luna analítica apresentarambaixa recuperação devido a per-
das no processo de limpeza da amostra e a ocorrência de
supressãodo sinal do detector pela matriz. O inverso ocor-
reu com a oxitetraciclina e a tetraciclina, as quais apresenta-
ram um incremento 80 sinal quando oriundas da matriz
fortificada em comparação aos padrões puros.
VERZEGNASSI e! al. (2002) também detectarama ocorrên-
cia de supressãono sinal obtido na análise de sulfonamidas
em mel por LC-MS/MS com ionização por ESI+, mas não
conseguiram estabelecer uma correlação entre a supressão
do sinal e as quantidades de açúcarese hidroximetilfurfural
contidos no mel analisado. Segundo os autores, a supres-
sãodo sinal impediu a análise quantitativa das sulfonamidas,
pois inferiu uma grande variação nas curvas de calibração.
Recentemente, outro método de determinação por LC-MS/
MS foi descritopor THOrv:lPSONeNOOT (2005) paradeter-
minação de sulfonamidas em mel. Os autores utilizaram uma
coluna de extração em fase sólida diretamente acoplada ao
sistema LC-MS/MS. As sulfonamidas foram extraídas on-
line e analisadas no modo ESI+. Através da variação na
composição da fase móvel, foi possível fazer a limpeza da
amostra e a eluição das sulfonamidas. Durante a limpeza, o
fluxo de fase móvel foi desviado da fonte de ionização por
uma válvula acoplada ao sistema. O fluxo foi redirecionado
das sulfonamidas, as quais foram analisadas por
monitoramento das reações múltiplas (MRM).
Conforme já mencionado, a estreptomicina e a
diidroestreptomicina são compostos que não fluorescem e
não apresentam forte absorção no UV, dificultando a
detecção em sistemas de HPLC com detectores de
fluorescência e UV. A espectrometria de massassurge como
alternativa aos processos de derivatização normalmente
utilizados para determinaçãodestesantimicrobianos em mel.
HORIE et al. (2004) desenvolveram um método para análise
de estreptomicina e diidroestreptomicina em mel por LC-
MS. A ionização dos analitos foi feita por ESI+, enquanto
que a determinação das espécies iônicas relativas a cada
antimicrobiano foi realizada pelo sistema de monitoramento
do íon selecionado-SIM (selected ion monitoring).
BRUlJNSVOORT et al. (2004) também utilizaram o modo de
ionização por ESI+ para determinação de estreptomicina e
diidroestreptomicina em mel, com limites de quantificação
de 1 e 2 /lg kg .1,respectivamente. Diferentemente do ante-
rior, este método utilizou a fragmentação dos íons (MS/MS)
para confirmação dos compostos.
A determinação de tetraciclinas em mel por LC -MS
foi, primeiramente,relatadapor OKA et al. ( 1994). O mét<.>do
desenvolvido utilizava como fonte de ionização a técnica
denominada Fast Atam Bombardment (FAB), a qual neces-
 Reyes F.G.R./Re\'i.\'ta Bra.\'ileira de To.ricologia 20. /1.1 e 2 (2007)
sita de uma fase móvel volátil para evitar obstrução na
interface com o espectrômetro de massas e depósitos de
materiais na fonte de ionização. O limite de detecção foi
100 jlg kg-1e o tempo de análise cromatográfica foi supe-
rior a 50 minutos. Uma outra técnica de ionização utiliza-
da para determinação de resíduos de tetraciclinas em mel
é a APCI (Atmosferic Pressure Chemical Ionization).
NAKAZAWAetal. (1999) utilizaram aAPCI mantendo a
temperatura da interface a 400 °C, o que gera a decompo-
sição do ácidooxálico utilizado na fase móvel com o in-
tuito de melhorar a resolução cromatográfica dos picos.
Os limites de detecção estabelecidos para OTC, TC e CITC
ficaram entre I e 4 jlg kg-1 e o tempo corrida foi de 18
minutos. O artifício de manter a fonte de ionização a alta
temperatura para decomposição do ácido oxálico conti-
do na fase móvel foi utilizado para a técnica de ESI+ na
determinação de oxitetraciclina em mel em outro método
estabelecido por ALFREDSSON et al. (2005).
Na determinação de resíduos de cloranfenicol no mel,
a técnica de LC-MS tem sido a mais utilizada. Este fato é,
provavelmente, conseqiiência da proibição do uso deste
antimicrobiano na criação de animais para produção de ali-
mentos, em di versos países.A "tolerância zero" estabelecida
implica na necessidadede se utilizar métodos que permitam
a determinação e confirmação do antimicrobiano em níveis
muito baixos como, por exemplo, o nível mínimo de desem-
penho do método requerido pela União Européia (UE) -0,3
jlg kg-l (CEC,2002). HORMAZÁBALe YNDESTAD (2001)
utilizaram um LC-MS do tipo quadrupolo simples com APCI
e obtiveram um limite de detecção de I ~g kg-l e um tempo
de corrida de 12 minutos. 11JRNIPSEED et al. (2002) desen-
volveram um método para determinação qualitativa de CAP
em mel utilizando um equipamento do tipo Ion Trap com
ionização por ESI nos modo negativo e espectrometria de
massasseqtiencial (MS/MS). O limite de detecçãoestabele-
cidofoi I ~gkg-l. VERZEGNASSIetal. (2003)desenvolve-
ram um método quantitativo com limite de detecção inferior
a 0,1 jlg kg-l utilizando o modo negativo de ESI e o
monitoramento das transições entre os íons pelo sistema
SRM (selected reaction monitoring) em equipamento do tipo
triplo quadrupolo. Com equipamentos de LC-MS/MS equi-
valentes ao anterior e utilizando o mesmo modo de opera-
ção (ESr, SRM) outros três métodos relatados na literatu-
ra estabeleceram, para a determinação de cloranfenicol em
mel, limites de detecção igual a 0,05 jlg kg-l, 0,02 jlg kg-1e
0,07 jlg kg-1(~OGUSZ etal., 2004; ORTELLletal., 2004;
FORTI etal_, 2005).
PREPARO DEAMOSTRAS
As etapas mais impot1antes e difíceis de um método
para análise de antimicrobianos em mel são: a extração da(s)
substãncia(s) de interesse e a limpeza da amostra. Adificul-
dade aumenta quando o método visa determinar os resídu-
os de diversos compostos simultaneamente. Mesmo per-
tencendo a uma mesma classe, os antimicrobianos apresen-
tam propriedades físicas e Químicas diferentes.
25
Duas técnicas são mais utilizadas para a extração de
antimicrobianos de matrizes biológicas: a extração líquido-
líquido (LLE) e a extração em fase sólida (SPE). Esta última
tem substituído a LLE por apresentar diversas vantagens,
tais como: major rapidez, melhor precisão, extratos mais lim-
pos, menor quantidade de amostra, menor quantidade de
sol ventes orgânicos, possibilidade de automação e menor
quantidade de resíduos.
A extração de resíduos de tetraciclinas em alimentos,
inclusive o mel, é dificultada pelo fato destas substâncias
formarem quelatos com íons metálicos e de ligarem-se com
proteínaspresentesna matriz, além de interagirem fortemente
com grupos silanóis presentes em cartuchos de extração em
fase sólida a base dt1sí1ica, assim como ocorre em colunas
analíticas de separaçãocromatográfica (OKA et al., 2000).
Porém, essas dificuldades têm sido superadas através do
controle de pH da solução de extração e pelo uso de subs-
tâncias que minimizam as interações com os grupos silanóis,
como o EDTA e o ácido oxálico, além do desenvolvimento
de polímeros para substituírem a sí1ica nos cartuchos de
extração e colunas analíticas. Em decorrência das constan-
tes de dissociação (pka) das tertraciclinas, e devido à pre-
sença de grupos substituintes com nitrogênio, estas subs-
tâncias apresentam cargas em toda a faixa de pH. Mesmo
havendo um valor de pH no qual as moléculas apresentam-
se na forma de zwitterions com uma carga total neutra, a
presença de cargas pontuais diminui a solubilidade das
tetraciclinas em solventes imiscíveis em água, dificultando
a extração por LLE. Na análise de resíduos de oxitetraciclina
em mel, DIAZ et al. ( 1990) apresentam um preparo de amos-
tra bastante simples, somente com uma etapa de diluição.
Porém, o método apresenta baixa sensibilidade e a introdu-
ção de todos os compostos da amostra na coluna analítica,
aumentandoa interferência no resultado e diminuindo a vida
da coluna. A dissolução da amostra em tampão Mcl1vaine
(pH=4) contento Na2EDTA e, em seguida, aplicação desta
em cartucho de extração em fase sólida é o procedimento
mais citado na literatura para análise de oxitetraciclina em
mel (ANDERSON et al. ,2005). As diferenças entre os méto-
dos são, principalmente, os volumes de diluição do mel e o
tipo de cartucho utilizado. Em uma revisão de metodologias
para análisede tetraciclinas feita por OKA et al. (2000), pode-
se observar que a maioria dos cartuchos utilizados para
extração das tetraciclinas é de sí1icamodificada com grupt)s
octadecil (C 18). Porém. mais recentemente, os autores têm
relatado que o uso de cartuchos à base de polímeros melho-
rao nível de recuperação dos analitos (K.:\UFMANN etal.,
2002; PAGLIUCA et al., 2002; CINQUINA et al.. 2003;
VINAS etal., 2004).
A extração do cloranfenicol de matrizes biológicas
pode ser feita através de LLE com sol ventes como metanol,
acetonitrila, acetato de etila ou diclorometano. Para a lim-
peza da amostra com SPE, tanto cartuchos de fase normal
quanto reversa têm sido utilizados, sendo que para C 18
foram obtidos melhores níveis de recuperação do analito
em comparação com fase normal (FEDENIUK e SHAND.
1998). Parao mel, uma combinação de LLEcom SPEé rela-
tada por diferentes autores. HORMAZÁBAL e YNDRST A n
26 Re)'e.~ FG.R./Re,..ista Brasileira
(2001) iniciam a extração Ll~E utilizando uma mistura de
solventes. Posteriormente. a tração orgânica é evaporada
e reconstituída em solução aquosa. a qual é aplicada ao
cartucho de extração em fase smida. Procedimento seme-
lhante em relação à seqliência de extrações, é relatado em
boletim do FDA-Food and Drug Administration
(TURNIPSEED et al.. 2002). Porém. a primeira etapa da
LLE é feita com acetato de etila e. após evaporação do
sol vente orgânico e dissolução em meio aquoso. uma se-
gunda extração é feita com hexano para retirar interferen-
tes apoIares. Para limpeza do extrato utiliza-se uma seqliên-
cia de dois cartuchos de SPE. VERZEONASSI et al. (2003)
inverte a seqliência de extrações. iniciando com SPE em
cartucho a base de polímero. O cloranfenicol é, então, ex-
traído da fração obtida na etapa anterior com uma mistura
de acetonitrila e diclorometano. A fração orgânica é eva-
porada e a amostra restante é dissolvida em água.
Para a determinação de estreptomicina em mel,
EDDER et al. (1999) utiliza SPE combinando cartuchos de
troca iônica e C 18 para extração e limpeza da amostra, res-
pectivamente. BRUIJNSVOORT et al. (2004) descreve a
análise da estreptomicina em mel através de LC-MS utili-
zando uma única etapa de extração e limpeza por SPE com
cartuchos C18. Para aumentar a retenção do agente
antimicrobiano no cartucho de fase reversa. os autores
adicionaram ao tampão de extração um contra-íon, o ácido
heptanosulfônico. O mesmo contra-íon foi utilizado por
HORIE et (Li. (2004), porém eles fizeram uma primeira pas-
sagem da amostra diluída em água pelo cartucho de
polímero, sem retenção da estreptomicina e te, a técnica mais adequada para esta função. Entretanto, a
diidroestreptomicina. O cartucho foi condicionado nova-
mente e a amostra, agora com o contra-íon, foi aplicada
uma segunda vez, possibilitando a retenção dos analitos.
Em outro método desenvolvido por PANO et al. (2004), a
utilização do contra-íon para retenção no cartucho C18 foi
precedida de uma etapa de extração dos antimicrobianos
da matriz com SPE de troca catiônica.
HORIE et al. (1992) utilizaram para a extração de
sulfonamidas do mel a LLE com clorofórmio após dissol-
ver a amostra em uma solução de cloreto de sódio 30%. A
limpeza do extrato foi feita cartucho de SPE com florisil.
VINAS ef al. (1995) fizeram somente a diluição da amostra
com água e injeção direta desta solução no cromatógrafo.
De maneira semelhante. CABALLERO ef al. (2001) não
utilizaram etapa de extração para análise de sulfonamidas
em mel. Os autores fizeram a diluição da amostra em solu-
ção de dodecilsulfato de sódio. sonificação e filtragem
antes da injeção. KAUFMANN ef al. (2002) estabelece-
ram como necessária uma etapa de hidrólise com ácido
clorídrico (HCI 2 mol L-' ). anterior a SPE, para liberar as
sulfonamidas ligadas com os açúcares da matriz. Após a
hidrólise, a extração foi feita utilizando cartuchos com fase
reversa a base de polímeros. Segundo os autores. sem a
etapa de hidrólise, a determinação de sulfonamidas em mel
ficaria subestimada. Este fato foi relatado. também, por
VERZEONASSI ef al. (2002). porém estes autores utiliza-
ram O ácido tricloroacético para a hidrólise. Após a
hidrólise. o oH da solucão foi corri2ido para 6.5 e, então,
de To.tico{ogia 20, 11.J e 2 ( 2VV7)
t(>irealizada a extração das sulfonamidas com uma mistura
de acetonitrila e diclorometano. MARTEL e ZEGGANE
(2003) fizeram a etapade hidrólise com HCI e utilizaram um
alíquota desta solução para a derivatização do sulfatiazol
com fluoroescamina e análise direta por HPLC. A combina-
ção seqtiencial de cartuchos de troca iônica e fase reversa
foi utilizada por PANG et a(. (2003) para extração e limpeza.
respectivamente. na analise de sulfonamidas em mel. A
etapa de hidrólise, anterior à extração. foi realizada com
ácido fosfórico. POSYNIAK et al. (2003 ). util izaram tam-
pão acetato (pH 5) para dissolver a amostra e aplicaram
esta solução ao cartucho de SPE do tipo C18. MAUDENS
et a(. (2004) fizeram hjdrólise com HCI seguida de extração
com acetonitrila e limpeza do extrato com SPE de troca
catiônica. THOMPSON e NOOT (2005) utilizaram um car-
tucho de SPE on line ao sistema LC-MS/MS e fizeram a
extração e limpeza com o gradiente da fase móvel.
CONSmERAçÕE5 F1NAIS
A determinação de resíduos de medicamentos vete-
rinários em mel é uma necessidadecrescente devido ao au-
mento das exigências dos mercados importadores e da cria-
ção de programas de vigilância governamentais. Para tanto,
são necessáriastécnicas analíticas que possibilitem a iden-
tificação e quantificação dos resíduos que possam estar
presentesno mel. A cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada a espectrometria de massasparece ser, atualmen-
disponibilidade destesequipamentosé, ainda, limitada, prin-
cipalmente devido ao elevado custo de aquisição e a neces-
sidade de pessoal especializado para sua operação. Inde-
pendentemente da técnica de análise, a preparação, prévia
ou contínua, da amostra é a etapa mais crítica na determina-
ção de resíduos de agentes antimicrobianos em alimentos,
como o mel. Há, todavia, espaço para o aprimoramento dos
procedimentos utilizados atualmente e para o desenvolvi-
mento de novas metodologias que tenham o objetivo de
obter os resultados exigidos. reduzindo-se o tempo de aná-
lise e seu custo, seja este financeiro ou ambiental. Este fato
poderá contribuir para a ampliação dos programas de vigi-
lância de resíduos de medicamentos veterinários em alimen-
tos e, conseqilentemente, desestimular o uso destas subs-
tâncias sem orientação profissional, aumentando a segu-
rança do mel oferecido aos consumidores e estimulando a
atividade apícola no país.
RESUMO
Há uma demanda crescente para a determinação dos
resíduos de medicamentos veterinários em mel. Para reali-
zar essa determinação, diversas técnicas analíticas estão
descritas. Acromatografia líquida de alta eficiência desta-
ca-se entre as técnicas atualmente utilizadas devido a sua
capacidade de separação e à possibilidade de acoplamento
do cromatógrafo com diversos tipos de detectores afim de
 Reves FGR./Re\'i~.ta Brasileira
obter a seletividade nel:essária para identificação e
quantifil:ação do(s) resíduo(s). Atualmente. a Alvarez-ClJqueMC. MicelJar chromatographic pr<.)(;edure
espectrometria de massas tem se mostrado a técnica de
análise mais adequada para a identificação e quantificação
de resíduos de medicamentos veterinários em alimentos.
Entretanto. o preparo da amostra para análise é. ainda. a
etapa crítica neste tipo de determinação. O presente traba-
lho faz uma revisão dos métodos analíticos que utilizam a
cromatografia líquida de alta eficiência na determinação
de resíduos de medicamentos veterinários em mel, com
ênfase na utilização da espectrometria de massase no pre-
paro de amostra.
Unitermos: cromatografia, resíduos, antimicrobianos, me-
dicamentos veterinários. mel, espectroscopia de massas.
AGRADECIMENT~
Os autores agradecem o apoio concedido pelas agên-
cias financiadoras CAPES e CNPq.
~CIAS BmUOGRÁF1CAS
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