Bruno Dias Camargo Fiopr Mest 2023

INSTITUTO CARLOS CHAGAS
MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA
BRUNO DIAS CAMARGO
DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO DE BAIXO CUSTO PARA

REALIZAÇÃO DE DIAGNÓSTICOS MOLECULARES BASEADO EM
TECNOLOGIA LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION)
CURITIBA
2023
BRUNO DIAS CAMARGO
DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO DE BAIXO CUSTO PARA

REALIZAÇÃO DE DIAGNÓSTICOS MOLECULARES BASEADO EM
TECNOLOGIA LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biociências e Biotecnologia, do Instituto Carlos
Chagas, como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências em Biociências e Biotecnologia.
Orientador: Dr. Lucas Blanes

Coorientador: Dr. Rafael Eleodoro de Góes
CURITIBA
2023
ii
Termo de Aprovação
Autor: Bruno Dias Camargo
Título: DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO DE BAIXO CUSTO PARA

REALIZAÇÃO DE DIAGNÓSTICOS MOLECULARES BASEADO EM TECNOLOGIA
LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION)
Orientador: Dr. Lucas Blanes (ICC)

Coorientador: Dr. Rafael Eleodoro de Góes (UTFPR)
Instituição: Instituto Carlos Chagas
Examinadores:
Profª. Dra. Patricia Shigunov
Prof. Dr. Alexandre Dias Tavares da Costa
Prof. Dr. Amauri Amorin Assef
Suplentes:
Profª. Dra. Dalila Luciola Zanette
Profª. Dra. Sheila Cristina Nardelli
Data da aprovação: 14/02/2023
CURITIBA
2023
iii
AGRADECIMENTOS
Essencialmente, gostaria de agradecer as pessoas com as quais compartilho

minhas conquistas: aos meus pais, José e Maria, pelo apoio incondicional durante
toda minha vida, jornada profissional e jornada acadêmica. Minha namorada, Mainara
Ghilardi, por todo o suporte e apoio. Ainda, gostaria de agradecer a família e aos meus
amigos Amanda, Ken, Paola, Plinio e Raul por sempre me apoiarem e estarem
presentes.
Agradeço ao meu orientador Dr. Lucas Blanes pela oportunidade de ingressar
na vida acadêmica, e poder desenvolver este e mais projetos, sendo sempre um
mentor presente. Agradeço também a todos os professores do ICC pelos
ensinamentos compartilhados e ao Dr. Rafael Eleodoro de Góes, meu coorientador,
que me auxiliou nesta jornada com ensinamentos essenciais e complementares aos
do meu orientador.
Meus sinceros agradecimentos aos meus colegas do laboratório de
prototipagem, sem os quais eu não teria alcançado os resultados que obtive, em
especial para os codesenvolvedores deste projeto, o Mestre em Biociências e
Biotecnologia e Engenheiro Mecânico Mateus Cassaboni Stracke e a Engenheira de
Controle e Automação Viviane Klassen de Oliveira. Também aos meus colegas de
laboratório Victor Cunha, Pedro Mantovan, Geovani Mendonça, Emerson Nery, Hellen
Ancelmo e ao Dr. Vinicius Zoldan por contribuírem com seus respectivos
conhecimentos para minha formação, para o enriquecimento deste trabalho e para a
desenvolvimento de um laboratório de prototipagem.
Agradeço também ao pessoal do Laboratório de Ciências e Tecnologias
Aplicadas em Saúde do Instituto Carlos Chagas por toda a contribuição e
ensinamentos, em especial para a Bruna de Oliveira Coelho e para a Heloisa Bruna
Soligo Sanchuki.
Por fim, agradeço ao programa de pós-graduação do ICC pela oportunidade e
estrutura que me foi dada para desenvolver este projeto, e ao IBMP pela estrutura
oferecida para a realização deste projeto e pela confiança no trabalho.
iv
RESUMO
Equipamentos baseados no conceito Point-of-care (POC) (diagnóstico no ponto de

atendimento) vêm sendo desenvolvidos, nos últimos anos, visando o diagnóstico
molecular rápido de doenças. Atualmente, a tecnologia LAMP (Loop-mediated
isothermal amplification), considerada simples, robusta e de baixo custo, já está
disseminada e seu potencial para screening de diversas doenças já foi reportado na
literatura, como por exemplo para o diagnóstico de COVID-19, tuberculose, HIV,
malária, dengue e Zika vírus. Comparado com a técnica padrão-ouro PCR
(Polymerase Chain Reaction) a técnica LAMP é considerada mais simples devido ao
fato de não necessitar ciclagens constantes de temperatura e pelo fato de ocorrer a
mudança visual de cores no tubo de reação, o que facilita a interpretação de resultado
a olho nu. Neste trabalho são apresentados a construção e evolução da maturidade
tecnológica de dois protótipos de equipamentos (hardware e firmware) baseado na
tecnologia LAMP, com capacidade de amplificação e de detecção colorimétrica,
visando um incremento no indicador de maturidade tecnológica TRL no nível 4 para o
nível 5. Para que ocorra a construção de equipamentos LAMP é essencial o
desenvolvimento de um circuito eletrônico com a robustez necessária para permitir a
aquisição e controle dos sinais responsáveis pela amplificação e detecção das
amostras biológicas. O primeiro equipamento construído e apresentado (Apollo) é
uma prova de conceito de um equipamento LAMP com TRL 4, e o segundo
equipamento (Cardinal) é construído baseado em melhorias e amadurecimento da
tecnologia empregada na construção do primeiro equipamento, visando o TRL 5.
Ambos os equipamentos possuem a capacidade para analisar até oito amostras em
microtubos de 200µL, com detecção colorimétrica via sensores de cor. O primeiro
equipamento utiliza-se de um microcontrolador do tipo Arduino Nano, sensor de cor
analógico e sistema de aquecimento por resistor (efeito Joule) tanto das amostras
quanto da tampa do dispositivo. O segundo equipamento utiliza-se de um
microcontrolador do tipo ESP32, sensor de cor digital, sistema de aquecimento da
tampa por resistor e pastilhas termoelétricas (efeito Peltier) para aquecimento e
resfriamento das amostras. Os dois tiveram seu funcionamento comprovado através
da amplificação e detecção de amostras contendo SARS-CoV-2 e o segundo ainda
foi capaz de amplificar, mas sem a detecção, amostras de hanseníase. O grande
diferencial do segundo equipamento é um sistema eletrônico com melhorias baseadas
no desempenho do primeiro protótipo de equipamento, um sistema de aquecimento e
resfriamento da amostra com o uso de dispositivo termoelétrico, com maiores
velocidades de aquecimento e resfriamento (ganho de até 5 vezes), do uso de um
microcontrolador com maior capacidade de processamento (260 vezes mais rápido) e
armazenamento (125 vezes maior) e uma troca dos sensores de cor para dispositivos
com maior disponibilidade de mercado.
Palavras-chave: SARS-CoV-2; RT-LAMP; Detecção Colorimétrica; Controle PID;

Point-of-Care.
v
ABSTRACT
Equipment based on the Point-of-care (POC) concept (diagnosis at the point of care)
has been developed in recent years, aiming at the rapid molecular diagnosis of
diseases. Currently, LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) technology,
considered simple, robust, and low-cost, is already widespread and its potential for
screening several diseases has already been reported in the literature, such as for the
diagnosis of COVID-19, tuberculosis, HIV, malaria, dengue and Zika virus. Compared
to the gold-standard PCR (Polymerase Chain Reaction) technique, the LAMP
technique is considered simpler because it does not require constant temperature
cycling and because there is a visual change of colors in the reaction tube, which
facilitates interpretation through naked eye results. In this work, the construction and
evolution of the technological maturity of two devices (hardware and firmware) based
on LAMP technology, with amplification and colorimetric detection capacity, will be
presented, aiming to increase the TRL capacity of the project. For the construction of
the LAMP equipment to occur, it is essential to develop an electronic circuit with the
necessary robustness to allow the acquisition and control of the signals responsible for
the amplification and detection of biological samples. The first equipment built and
presented (Apollo) is a proof of concept of a LAMP equipment with TRL 4, and the
second equipment (Cardinal) is built based on improvements and maturation of the
technology used in the construction of the first equipment, aiming at TRL 5. Both
devices can analyze up to eight samples in 200uL microtubes, with colorimetric
detection via color sensors. The first equipment uses an Arduino Nano microcontroller,
an analog color sensor and a resistor heating system (Joule effect) for both the
samples and the device cover. The two had their operation proven through the
amplification and detection of samples containing SARS-CoV-2 and the second was
still capable of amplifying, but without detection, leprosy samples. The major difference
of the second equipment is more robust electronics, a heating and cooling system of
the sample through a thermoelectric device, with higher heating and cooling rates (gain
of up to 5 times), the use of a microcontroller with greater capacity (260 times faster)
and storage (125 times bigger) and an exchange to color sensors more widely
available.
Keywords: SARS-CoV-2; RT-LAMP; Color Detection; PID Control; Point-of-Care.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Linha do tempo da COVID-19 no Brasil .................................................... 16

Figura 2 - Ilustração esquemática da técnica LAMP ................................................. 18
Figura 3 – Fluxo de trabalho de diagnósticos baseados em LAMP, são realizadas as
seguintes etapas: 1 – Coleta da amostra: Podendo ser feita através de swab (nasal
ou oral), sangue, urina ou fezes. ............................................................................... 19
Figura 4 - Exemplos de equipamentos LAMP ........................................................... 21
Figura 5 - Controle no qual um processo tem seu valor monitorado e controlado com
o uso do PID.............................................................................................................. 23
Figura 6 – Influência do controle para diferentes ganhos proporcionais, integrais e
derivativos. ................................................................................................................ 25
Figura 7 - Gráfico de resposta transitória típica de sistemas de segunda ordem a um
sinal degrau. .............................................................................................................. 26
Figura 8 - Sistemas embarcados Arduino Nano e ESP32 DevKitC ........................... 27
Figura 9 – Especificações técnicas do sistema embarcado ESP32 .......................... 28
Figura 10 – Especificações técnicas do sistema embarcado Arduino Nano ............. 29
Figura 11 - Diagrama demonstrativo de uma conexão padrão do protocolo I²C ....... 31
Figura 12 - Uso do PWM em diferentes ciclos de trabalho. A linha tracejada
representa a saída do sistema e o sinal em pulsações representa o PWM. ............. 32
Figura 13 - Uso do sinal PWM (pulsações) para controlar o sinal de alimentação
(laranja) de outro componente. ................................................................................. 32
Figura 14 - Exemplo do uso do PWM para entregar diferentes valores de potência
para uma lâmpada. ................................................................................................... 33
Figura 15 - Pastilha termoelétrica de cerâmica, que funciona através do efeito Peltier.
.................................................................................................................................. 33
Figura 16 - Exemplo do uso de uma ponte H invertendo a polaridade de uma carga.
.................................................................................................................................. 34
Figura 17 - Exemplo de uso de um capacitor de desacoplamento para filtragem de
ruido. ......................................................................................................................... 35
Figura 18 - Exemplo de uso de um resistor Pull-Up. ................................................. 36
Figura 19 - Technology Readiness Level (TRL). ....................................................... 38
Figura 20 - Bloco térmico fresado com ferramenta de alta precisão. ........................ 45
Figura 21 - Impressora 3D modelo Ender 3 Pro e filamento preto do tipo PLA. ........ 46
Figura 22 - Visão sistemática do LAMP visando a construção do equipamento Apollo.
.................................................................................................................................. 47
Figura 23 - Diagrama de blocos da eletrônica do equipamento LAMP Apollo .......... 48
Figura 24 - Máquina de fresagem e furação de PCI LPKF S103 e placas PCI FR4. 48
Figura 25 - Componentes do bloco de aquecimento inferior do projeto Apollo. (a)
Placa de aquecimento; (b) Bloco de alumínio; (c) Sistema de aquecimento integrado.
.................................................................................................................................. 49
Figura 26 - Componentes do sistema de aquecimento superior do projeto Apollo. (a)
Placa de aquecimento; (b) Placa de alumínio; (c) Sensor de temperatura. .............. 49
Figura 27 – Sensor de cor analógico TCS3200 ......................................................... 49
vii
Figura 28 – MOSFET IRL3103, componente que controla o fluxo de potência
fornecida a placa de aquecimento. ............................................................................ 50
Figura 29 - Micro ventilador, para resfriamento das amostras. ................................. 51
Figura 30 - Arduino Nano, componente responsável pelo controle geral do
equipamento Apollo. .................................................................................................. 51
Figura 31 - Sensor de temperatura LM35 acoplado no alumínio da placa Inferior .... 52
Figura 32 - 74HC4051D, Multiplexador/Demultiplexador para escolha do par
LED/TCS3200 ........................................................................................................... 52
Figura 33 - Buzzer, para alarme sonoro. ................................................................... 53
Figura 34 - Exemplo do Display OLED utilizado no projeto Apollo. ........................... 53
Figura 35 - Diagrama esquemático eletrônico da placa contendo o botão e o display
do equipamento......................................................................................................... 54
Figura 36 - Diagrama esquemático da Placa mãe do Apollo. Contendo os itens
citados no texto da seção 3.3.3 ................................................................................. 55
Figura 37 - Diagrama esquemático eletrônico da de emissão do sistema de detecção
colorimétrica. ............................................................................................................. 56
Figura 38 - Diagrama esquemático eletrônico da placa de detecção do sistema de
detecção colorimétrica. ............................................................................................. 57
Figura 39 – Visão sistemática do LAMP visando a construção do Cardinal .............. 58
Figura 40 - Diagrama de blocos da eletrônica do Cardinal ....................................... 59
Figura 41- Pastilha termoelétrica ............................................................................... 59
Figura 42 - Driver Motor Ponte H L298n ................................................................... 60
Figura 43 – Sensor de cor VEML3328 ...................................................................... 60
Figura 44 – Foto do ESP32, componente responsável pelo controle geral do
equipamento Apollo. .................................................................................................. 61
Figura 45 - Exemplo do Display OLED utilizado no projeto Apollo. ........................... 62
Figura 46 - Rotary Encoder ....................................................................................... 62
Figura 47 - Conversor bidirecional de nível lógico 3,3V/5V ....................................... 63
Figura 48 - Fonte chaveada 12V 10A ........................................................................ 63
Figura 49 - Diagrama Esquemático do Cardinal........................................................ 64
Figura 50 - Dispositivos para monitoramento de temperatura em tempo real ........... 65
Figura 51 - Amostras de SARS-CoV-2. (a) Resultado positivo (+). (b) Resultado
indeterminado (IND). (c) Resultado negativo (-), ....................................................... 66
Figura 52 - Configuração Mux / Demux que permite uma seleção exclusiva de um
par LED / sensor de cor. Isso também reduz a quantidade de pinos usados do
sistema embarcado/microcontrolador (MCU). ........................................................... 67
Figura 53 - Demonstração do sistema de detecção de cor, em que uma placa emite
uma luz branca via LED; O LED ilumina o tubo com uma luza branca
transversalmente e a luz absorvida na solução (rosa (-), amarela (+) ou laranja
(Indeterminada)) é transmitida e capturada no sensor de cor. .................................. 68
Figura 54 - Caixa do instrumento que contém a placa principal da eletrônica, o bloco
de aquecimento/detecção da LAMP, o aquecedor da tampa, os ventiladores e o
display OLED. (a) Tampa fechada durante os testes (b) Tampa aberta para
inserir/remover os microtubos. .................................................................................. 69
viii
Figura 55 - Placas que compõe a parte eletrônica do equipamento Apollo. a) Placa
mãe do aparelho. b) Placa contendo uma matriz com 8 sensores de cor TCS3200. c)
Placa com o Display OLED, com um botão e um LED verde. d) Placa contendo 8
LEDs. e) Alumínio da tampa. f) Placa de aquecimento superior com o sensor de
temperatura LM35 para aquecimento da tampa. g) Alumínio inferior, para
aquecimento das amostras e suporte das placas de condução da luz de detecção. h)
Placa de aquecimento inferior ................................................................................... 70
Figura 56 - Placa de LEDs ........................................................................................ 70
Figura 57 - Placa de Sensores de Cor ...................................................................... 71
Figura 58 - Posicionamento dos componentes internos do projeto Apollo. ............... 71
Figura 59 - Estados de funcionamento do termociclador Apollo, implementados no
software do sistema embarcado. ............................................................................... 73
Figura 60 - Um exemplo do controle PID desajustado do instrumento Apollo no
controle da temperatura, tentando manter a temperatura do bloco das amostras na
temperatura de setpoint durante uma janela de tempo de 10 minutos. ..................... 74
Figura 61 - Um exemplo do controle PID do instrumento Apollo no controle da
temperatura, mantendo os aquecedores superior e inferior nas temperaturas de
setpoint durante uma janela de tempo de 30 minutos. O aquecimento superior tem a
finalidade de evitar a condensação do líquido nas paredes do tubo. ........................ 74
Figura 62 - Comparação de reações colorimétricas RT-LAMP no protótipo e em um
aparelho comercial. ................................................................................................... 75
Figura 63 – Housing do equipamento Cardinal ......................................................... 80
Figura 64 - Placa mãe do Cardinal ............................................................................ 81
Figura 65 - Placa de recepção com os sensores de cor VEM3328 e a placa de
emissão com os LEDs brancos. ................................................................................ 81
Figura 66 - Placa do display, contendo um LED indicador, display OLED e botão
seletor do tipo Rotary Encoder. ................................................................................. 82
Figura 67 - Posicionamento dos componentes internos do projeto Apollo. ............... 83
Figura 68 - Exemplo de seleção do Teardrop em um programa de confecção de
placas de circuito impresso ....................................................................................... 84
Figura 69 - Visão da parte inferior da PCI do projeto Cardinal .................................. 85
Figura 70 - Visão da parte superior da PCI do projeto Cardinal ................................ 85
Figura 71 - BOM interativo da placa mãe do Cardinal ............................................... 86
Figura 72 - Estados de funcionamento do equipamento Cardinal, implementados no
software do sistema embarcado. ............................................................................... 88
Figura 73 - Tela de boas-vindas do equipamento Cardinal ....................................... 89
Figura 74 - Menu inicial do equipamento Cardinal, com possibilidade de seleção do
tipo de ciclo a ser executado, configurações do equipamento e menu de
informações. .............................................................................................................. 89
Figura 75 - Menu de seleção de ciclos do Cardinal, com a opção da escolha de RT-
PCR (Não implementado), RT-LAMP e voltar para o menu principal. ....................... 90
Figura 76 - Tela de escolha de temperatura e tempo para o RT-LAMP. ................... 90
Figura 77 - Tela instruindo a inserção das amostras e depois apertar o botão para
dar prosseguimento ................................................................................................... 90
ix
Figura 78 – Telas que aparecem durante o LAMP. Começando pelo aquecimento da
tampa, seguindo pelo RT-LAMP e terminando com o resfriamento da amostra. ...... 91
Figura 79 - Processo de detecção e tela dos resultados ........................................... 91
Figura 80 - Menu de configurações, onde é possível ver os valores lidos pelos
sensores de cor e de temperatura. ............................................................................ 91
Figura 81 - Menu de cor em configurações, onde é possível ler os valores de cor de
maneira individual. .................................................................................................... 92
Figura 82 - Menu com as informações do projeto, informando a equipe que participou
do projeto, e as instituições patrocinadoras. ............................................................. 92
Figura 83 - Bloco de aquecimento do Cardinal, com o alumínio de posicionamento de
amostras, dispositivo Peltier, Ponte H e ventoinha. .................................................. 93
Figura 84 - Comparação de reações colorimétricas RT-LAMP no Cardinal e em um
aparelho comercial. ................................................................................................... 94
Figura 85 – Equipamentos do tipo POC RT-LAMP Cardinal e Apollo lado a lado..... 97
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Portas do Arduino Nano utilizadas no equipamento Apollo

Tabela 2 - Resultados do RT-LAMP testando 66 amostras clínicas
Tabela 3 - Intervalo de valores de interpretação Gf - Bf do sistema de detecção de
cores, no qual Gf é a frequência da cor verde e Bf é a frequência da luz azul lidas pelo
sensor TCS3200
Tabela 4 – Portas do ESP32 utilizadas no equipamento Cardinal
Tabela 5 - Resultados do RT-LAMP testando 22 amostras clínicas no Cardinal
Tabela 6 - Intervalo de valores de interpretação Gf - Bf do sistema de detecção de
cores, no qual Gf é a frequência da cor verde e Bf é a frequência da luz azul lidas pelo
sensor VEML3328
xi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADC Analog-to-digital converter (Conversor analógico para digital)

BOM Bill of materials (Estrutura de produtos)
CAD Computer Aided Design (Desenho auxiliado por computador)
CAE Computer Aided Engineering (Engenharia auxiliada por
computador)
CAM Computer Aided Manufacturing (Manufatura auxiliada por
computador)
COVID Corona Virus Disease (Doença do coronavírus)
EMC Electromagnetic compatibility (Compatibilidade eletromagnética)
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
GPIO General Purpose Input/Output
IBMP Instituto de Biologia Molecular do Paraná
ICC Instituto Carlos Chagas
LaCTAS Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde
LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification (Amplificação isotérmica
mediada por loop)
LED Light-emitting diode (Diodo emissor de luz)
MERS Middle East respiratory syndrome (Síndrome respiratória do
Oriente Médio)
NTC Negative Temperature Coefficient (Coeficiente negativo de
temperatura)
PID Proporcional-Integral-Derivativo
PCI Placa de circuito impresso
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
PLA Polylactic acid (Ácido Polilático)
POC Point-of-Care (Teste no ponto de atendimento)
PWM Pulse-width modulation (Modulação por largura de pulso)
qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR quantitativa em
tempo real)
RT Reverse-Transcription (Transcrição Reversa)
RPU Rigid polyurethane (Poliuretano Rígido)
SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome - Coronavirus 2 (Síndrome
respiratória aguda grave)
xii
SISO Single-input, single-output (Entrada única, saída única)
SMD Surface mounted device (Dispositivo montado na superfície)
SOIC Small outline integrated circuit (Circuito integrado de pequeno
contorno)
SUS Sistema Único de Saúde
TRL Technology Readiness Level (Nível de prontidão tecnológica)
xiii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16
1.1. A PANDEMIA DA COVID-19 ............................................................................... 16
1.2. TESTES DIAGNÓSTICO DO TIPO POINT-OF-CARE ......................................... 17
1.3. LAMP PARA AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS .................................. 18
1.4. DISPOSITIVOS LAMP ......................................................................................... 20
1.5. CONSTRUÇÃO DE DISPOSITIVOS POC LAMP ................................................ 22
1.5.1. CONTROLE DE TEMPERATURA .................................................................. 22
1.5.1.1. EFEITO DAS VÁRIAVEIS DO CONTROLE PID (PROPORCIONAL
– INTREGAL - DERIVATIVO) NO CONTROLE DA TEMPERATRA .............. 24
1.5.1.2. RESPOSTA TRANSITÓRIA DE UM SISTEMA .............................. 25
1.5.2. USO DE SISTEMAS EMBARCADOS ............................................................. 27
1.5.2.1. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS DO ESP32 ................................... 28
1.5.2.2. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS DO ARDUINO NANO................... 29
1.5.2.3. DEFINIÇÃO DE FIRMWARE .......................................................... 30
1.5.2.4. SINAL I²C ........................................................................................ 30
1.5.3. CONTROLE DE POTÊNCIA VIA PWM (Pulse-Width Modulation) .................. 31
1.5.4. SISTEMA ELETRÔNICO ................................................................................ 33
1.5.4.1. FORMAS DE AQUECIMENTO ....................................................... 33
1.5.4.2. PONTE H ........................................................................................ 34
1.5.4.3. FIDELIDADE DE SINAL NA ELETRÔNICA .................................... 35
1.5.4.3.1. CAPACITORES DE DESACOPLAMENTO .................................. 35
1.5.4.3.2. RESISTORES PULL-UP E PULL-DOWN .................................... 36
1.6. MATURIDADE TECNOLÓGICA .......................................................................... 37
1.6.1. TRL 1 – PRINCÍPIOS BÁSICOS OBSERVADOS ........................................... 38
1.6.2. TRL 2 – CONCEITO TECNOLÓGICO FORMULADO .................................... 39
1.6.3. TRL 3 – PROVA DE CONCEITO .................................................................... 39
1.6.4. TRL 4 – VALIDAÇÃO DA TECNOLOGIA EM LABORATÓRIO ....................... 40
1.6.5. TRL 5 – VALIDAÇÃO DO PROTÓTIPO EM AMBIENTE RELEVANTE .......... 40
1.6.6. TRL 6 – CONSOLIDAÇÃO DA TECNOLOGIA EM AMBIENTE RELEVANTE 41
1.6.7. TRL 7 – DEMONSTRAÇÃO DA TECNOLOGIA EM AMBIENTE
OPERACIONAL ............................................................................................................ 41
1.6.8. TRL 8 – SISTEMA COMPLETO E QUALIFICADO ......................................... 42
1.6.9. TRL 9 – INCORPORAÇÃO DA TECNOLOGIA............................................... 42
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 44
2.1. OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 44
xiv
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................................ 44
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 45
3.1. BLOCO TÉRMICO DE AQUECIMENTO .............................................................. 45
3.2. HOUSINGS DO EQUIPAMENTOS ...................................................................... 46
3.3. CONSTRUÇÃO DO EQUIPAMENTO 1 – APOLLO............................................. 47
3.3.1. SISTEMA DE AQUECIMENTO DO APOLLO ................................................. 48
3.3.2. DETECÇÃO COLORIMÉTRICA ..................................................................... 49
3.3.3. CIRCUITO ELETRÔNICO DE CONTROLE .................................................... 50
3.4. CONSTRUÇÃO DO EQUIPAMENTO 2 – CARDINAL ......................................... 58
3.4.1. SISTEMA DE AQUECIMENTO DO CARDINAL ............................................. 59
3.4.3. CIRCUITO ELETRÔNICO .............................................................................. 61
3.5. PROCESSO DE CALIBRAÇÃO .......................................................................... 65
3.6. REAÇÃO RT-LAMP COLORIMÉTRICO PARA DIAGNÓSTICO DE COVID-19 .. 65
3.7. PROCESSO DE DETECÇÃO COLORIMÉTRICA................................................ 66
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 69
4.1. APOLLO .............................................................................................................. 69
4.1.1. CARCAÇA DO APOLLO (HOUSING) ............................................................. 69
4.1.2. SISTEMA ELETRÔNICO DO APOLLO .......................................................... 70
4.1.3. FIRMWARE DO APOLLO............................................................................... 72
4.1.4. IMPLEMENTAÇÃO DO PID ........................................................................... 73
4.1.5. AMPLIFICAÇÃO DE AMOSTRAS CLÍNICAS COM O APOLLO ..................... 75
4.1.6. DETECÇÃO COLORIMÉTRICA COM O APOLLO ......................................... 77
4.1.7. CONCLUSÂO PARCIAL DO INSTRUMENTO APOLLO................................. 78
4.2. CARDINAL .......................................................................................................... 79
4.2.1. CARCAÇA DO CARDINAL (HOUSING) ......................................................... 79
4.2.2. SISTEMA ELETRÔNICO DO CARDINAL ....................................................... 80
4.2.2.1. MELHORIAS NO DESENVOLVIMENTO DAS PLACAS................. 83
4.2.3. FIRMWARE DO CARDINAL ........................................................................... 86
4.2.3.1. TELAS DO EQUIPAMENTO ........................................................... 89
4.2.4. IMPLEMENTAÇÃO DO PID NO CARDINAL E SEU SISTEMA DE
AQUECIMENTO ........................................................................................................... 92
4.2.5. AMPLIFICAÇÃO ............................................................................................. 93
4.2.7. CONCLUSÃO PARCIAL DO CARDINAL ........................................................ 95
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 97
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 101
xv
1. INTRODUÇÃO
Neste capítulo é apresentado uma revisão bibliográfica, contendo uma visão sobre
o uso de equipamentos Point-Of-Care (POC) e a tecnologia LAMP (Loop-Mediated
Isothermal Amplification (Amplificação isotérmica mediada por loop)) para testes
diagnóstico, conceitos da utilização de sistemas embarcados e confecção/produção
de circuitos eletrônicos para a criação destes equipamentos destinados à saúde,
utilizando o combate da pandemia de COVID-19 (Corona Virus Disease (Doença do
coronavírus)) como exemplo de aplicação.
1.1. A PANDEMIA DA COVID-19

A pandemia COVID-19 causada pelo vírus SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory
syndrome - Coronavirus 2 (Síndrome respiratória aguda grave)) tem sido uma
preocupação global para os sistemas de saúde e sistemas econômicos (Tandon,
2020). No Brasil, o número de casos confirmados da doença é de aproximadamente
36 milhões, com um total de 695 mil mortes (Ministério da Saúde, 01/2023). A
cronologia da COVID-19 no Brasil pode ser vista na Figura 1.
Figura 1 - Linha do tempo da COVID-19 no Brasil
Fonte: Correio Braziliense1 (2021)
1 Disponível em: < https://tinyurl.com/488dtjja >
16
A pandemia começou em Wuhan (Wang et al., 2020), na China, e espalhou-se
pelo mundo, mas com as consequências mais graves principalmente em países não
desenvolvidos (Ciotti et al., 2020). O controle da pandemia depende de diversos
fatores, sendo os mais importantes o diagnóstico e monitoramento de casos e o uso
de vacinas (Studdert, D. M., & Hall, M. A.., 2020).
1.2. TESTES DIAGNÓSTICO DO TIPO POINT-OF-CARE

Testes de diagnóstico no ponto de atendimento, do Inglês, Point-Of-Care,
realizados por especialistas ou pelo próprio paciente, tem como finalidade facilitar o
acesso da população ao diagnóstico médico rápido, preciso e de baixo custo, seja em
grandes centros urbanos ou em regiões remotas. Dispositivos POC podem ser
fabricados utilizando-se inúmeras técnicas ou materiais, dependendo do objetivo
proposto. Podem-se citar os medidores de glicose para diabéticos e testes rápidos de
gravidez comprados em farmácias como exemplos de dispositivos POC de grande
sucesso.
O uso de dispositivos POC pode não apenas agregar qualidade de vida ao
paciente como também evitar o gasto de bilhões de reais, por exemplo, com
internações desnecessárias ou pela perda de força de trabalho. Por isso o esforço em
criar equipamentos de baixo custo potencialmente utilizáveis no SUS. Dentre os
dispositivos POC existem aqueles que se propõe a realizar diversas tarefas antes
realizadas em um laboratório, como por exemplo os dispositivos POC que realizam
de forma simples e automatizada à amplificação de ácidos nucleicos em uma amostra
de interesse possibilitando assim a realização de teste de alta resolução sem a
necessidade de grandes estruturas e equipe altamente treinada, diminuindo o custo
e tamanho de termocicladores convencionais e a necessidade de um laboratório
especializado.
O método padrão ouro usado para detectação da presença de material genético
de vírus é o quantitativo Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR), um
método altamente específico realizado por pessoal treinado. No entanto, é um método
caro, demorado e requer ambientes específicos (Afzal, 2020). Dispositivos POC são
sistemas excelentes para complementar os serviços de saúde tradicionais, provendo
diagnóstico nos pontos de atendimento a custos reduzidos, possibilitando um
aumento significativo no número de pessoas atendidas. Segundo Manmana et al.,
17
2021, os instrumentos e técnicas de POC precisam ser rápidos, baratos e com alta
sensibilidade e seletividade.
1.3. LAMP PARA AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

A técnica Reverse-Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-
LAMP) é uma técnica capaz de amplificar RNA com 6 primers específicos em 15-40
minutos, a uma única temperatura de geralmente 65° C (Curtis et al., 2008). É
considerado um método POC por seu menor custo, fácil execução e alta sensibilidade
(Chaouchi, 2021).
O funcionamento do LAMP ocorre através da ação de uma DNA polimerase com
atividade de deslocamento de fita denominada Bst em conjunto com dois primers
internos (FIP e BIP) e dois primers externos (F3 e B3), que são projetados para seis
regiões específicas contidas na sequência alvo (Figura 2). Na primeira etapa acontece
a formação de DNA com loops em cada extremidade, que serão utilizados como
estrutura iniciadora para amplificação que ocorre na sequência, ocasionando uma
amplificação exponencial das estruturas em forma de loop, resultando em estruturas
de diversos tamanhos que consistem em repetições da sequência alvo (Curtis et al.,
2008; Parida et al., 2008).
Figura 2 - Ilustração esquemática da técnica LAMP
Fonte: Isothermal Amplification (NEB)2 2022.
2 Disponível em: < https://www.neb-online.de/en/pcr-and-dna-amplification/isothermal-amplification/ >
18
O método LAMP também foi desenvolvido para realizar a detecção de diversos
patógenos, incluindo vírus de RNA, como o SARS-CoV-2, por exemplo, utilizando
uma amplificação em temperatura constante mediada por loop de transcrição reversa,
denominado RT-LAMP. Isto é possível através da adição de uma transcriptase
reversa estável ao calor (Hong et al., 2004; Kurosaki et al., 2007; Soliman e El-
Matbouli, 2006; Yoshida et al., 2007). Existe também a enzima Bst 2.0 que possui a
capacidade de transcrição reversa, simplificando a reação.
A técnica RT-LAMP é frequentemente combinada com métodos de detecção
colorimétricos, como indicadores de pH e corantes fluorescentes (Thi et al., 2020;
Njiru et al, 2008). Esta abordagem permite uma interpretação rápida dos resultados,
dispensando a necessidade de equipamentos sofisticados ou pessoal treinado. O
vermelho de fenol, por exemplo, é um indicador de pH que muda a cor da reação RT-
LAMP de rosa (pH ~ 8) para amarelo (pH ~ 6) quando ocorre a amplificação.
Esta combinação de visualização de mudança de cor de forma visual e uso de
um simples termo bloco para realizar a reação é uma grande vantagem no
desenvolvimento de instrumentos POC para essa e outras doenças (Thi et al., 2020).
Na Figura 3 é possível ver um resumo do fluxo de trabalho para se utilizar
técnica LAMP (Moehling et al., 2021). Um detalhe é que esse fluxo pode existir para
outras técnicas de amplificação.
Figura 3 – Fluxo de trabalho de diagnósticos baseados em LAMP, são realizadas as seguintes etapas:
1 – Coleta da amostra: Podendo ser feita através de swab (nasal ou oral), sangue, urina ou fezes.
2 - Preparação da amostra: Podendo incluir lise celular, extração, purificação e eluição.
3 – Amplificação da amostra: Através de termocicladores.
4 - Detecção da amostra: Pode se utilizar de métodos colorimétricos, fluorescentes e turbidimétricos.
Fonte: Moehling et al. (2021)
19
Os protocolos típicos de LAMP consistem em 4 etapas:
1. Coleta da Amostra: Amostras comuns incluem saliva, swab (nasal ou oral),
sangue, urina e fezes. Dependendo da complexidade da amostra (como fezes e
sangue) um processo de extração do ácido nucleico é necessário;
2. Preparação da amostra: A preparação típica da amostra inclui lise celular,
extração, purificação e eluição. O LAMP não requer necessariamente extração,
purificação e eluição de ácidos nucleicos porque a Bst DNA polimerase é tolerante
a inibidores comuns de matriz de amostra;
3. Amplificação da amostra: Alvos são amplificados via LAMP usando um
termociclador ou pequeno equipamento (banho-maria, por exemplo) em uma
única temperatura (60–70°C). A temperatura de 65 ºC é a sua temperatura ótima
de trabalho;
4. Detecção da amostra: Métodos colorimétricos, fluorescentes e turbidimétricos são
as leituras de sinal mais comuns usadas para detectar amplicons LAMP. Para
analisar os resultados (endpoint ou em tempo real), podem ser utilizadas por
exemplo: leitura a olho nu, imunoensaio de fluxo lateral, leitor de fluorescência,
sensor de cor ou turbidímetro.
1.4. DISPOSITIVOS LAMP

Devido à pandemia de COVID-19, vários instrumentos POC foram desenvolvidos
para detectar o vírus SARS-CoV-2. Esses equipamentos buscam métodos mais
rápidos, baratos e portáteis para aplicação em hospitais e áreas rurais. Ganguli et al.,
2020, desenvolveram um dispositivo RT-LAMP que foi fabricado com o uso de um
cartucho tridimensional, fabricado a partir de poliuretano rígido (RPU) em uma
impressora Carbon M2, e possui um leitor baseado em smartphone. Os autores
detectaram o vírus SARS-CoV-2 em dez amostras clínicas, indicando o potencial dos
instrumentos POC para o diagnóstico de COVID-19. Outros exemplos de dispositivos
LAMP podem ser vistos na Figura 4.
Com o objetivo de desenvolver um instrumento semelhante, este trabalho utilizou
sensores de cor parecidos com os já descritos com sucesso na literatura, usados para
resolver diversos desafios, tais como: na detecção de cores de algumas bactérias
(Kaur et al. 2019), quantificação de cianeto (Singh et al. 2020), teste de urina (Ragul
et al. 2020), detecção de fluorescência em um dispositivo Lab-on-a-Chip (Uddin et al.
2015) e em um leitor de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) (Borse et al. 2017),
20
incluindo outras aplicações POC (Mohammed et al. 2021, Aswathy e Anusree, 2018).
A Figura 4 apresenta exemplos de dispositivos LAMP POC.
Figura 4 - Exemplos de equipamentos LAMP

Fabricante K-DOD Korea
a) Capacidade de amostras 4
Tempo de duração do teste 30 minutos
Fabricante GENCURIX
b) Capacidade de amostras 16
Hibergene
Fabricante
Diagnostics
c) Capacidade de amostras 18
Tempo de duração do teste 15 – 25 minutos
Fabricante Hilab
d) Capacidade de amostras 4
Fabricante Visuri
e) Capacidade de amostras 12
Tempo de duração do teste 30-60 minutos
Fonte: Medical Expo3 (a), Gencurix4 (b), Hibergene Diagnostics5 (c), Hilab6 (d), Visuri7 (e) (2022)
3 Disponível em: < https://www.medicalexpo.com/prod/k-dod-korea/product-305202-1053174.html >

4 Disponível em: < https://www.gencurix.com/eng/sub_2_8.php?ckattempt=1 >
5 Disponível em: < https://hibergene.com/products/hg-swift/ >
6 Disponível em: < https://hilab.com.br/dispositivos/molecular/ >
7 Disponível em: < https://www.visuri.com.br/multilamp/ >
21
Uma vez que a utilização do RT-LAMP colorimétrico realiza o processo de
detecção de forma mais rápida e simples (sem o uso de lasers e filtros), é
imprescindível que os equipamentos POC desenvolvidos para este tipo de
diagnóstico sejam dotados de uma interpretação automática dos resultados.
1.5. CONSTRUÇÃO DE DISPOSITIVOS POC LAMP

Existem apenas alguns dispositivos termocicladores portáteis de baixo custo
descritos na literatura e esses de forma geral rodam até 12 amostras ao mesmo
tempo, enquanto os instrumentos profissionais podem custar até US$140.000
(Oliveira et al. 2021) rodando uma ou mais placas para 96 amostras.
Visando a construção de equipamentos POC LAMP é preciso um controle de
temperatura rápido, estável e preciso, uma detecção colorimétrica para a
interpretação dos resultados e uma eletrônica capaz de dar suporte aos requisitos do
projeto. Nos próximos subcapítulos são apresentados conceitos relacionados a estes
elementos.
1.5.1. CONTROLE DE TEMPERATURA

Considerando a necessidade de um controle preciso da temperatura em
equipamentos que se utilizem das técnicas RT-PCR e RT-LAMP (Miralles et al. 2013),
faz-se necessário o uso de técnicas para o controle da temperatura que possam ser
implementados em dispositivos POC. Algoritmos de controle do tipo PID (proporcional
– integral – derivado) (Kushwah e Patra, 2014), bastante utilizados na indústria
tradicional, podem ser utilizados. O PID consiste em um mecanismo com feedback
em loop usado em sistemas de controle industrial e uma variedade de outras
aplicações (Dinca et al. 2009), incluindo instrumentos PCR (Pogfai et al. 2008) e
instrumentos POC PCR (Oliveira et al. 2021). O PID tem um funcionamento como o
ilustrado na Figura 5.
22
Figura 5 - Controle no qual um processo tem seu valor monitorado e controlado com o uso do PID.
Fonte: Novus8, 2019
Nesses sistemas, o sensor de temperatura alimenta constantemente o

controle, que por sua vez calcula continuamente o valor do erro do sistema, aplicando
uma correção com base na equação PID (Johnson e Moradi, 2006), controle esse que
é calibrado através da modificação das variáveis de controle (P, I e D). Em que temos
que:
• SP (Setpoint) representa o valor ideal desejado a ser alcançado pelo processo e
é fornecido ao sistema pelo usuário. No LAMP este valor é representado pela
temperatura de 65 ºC ajustada pelo usuário no termociclador;
• PV (Process Variable ou variável de processo) é a variável que representa o valor
real do processo e é interpretado e fornecido ao controlador PID através de um
sistema de sensoriamento. No caso de um termociclador, este valor seria o da
temperatura do bloco de aquecimento das amostras (ou do aquecimento da tampa
do termociclador) que é monitorado por um sensor de temperatura;
• O erro é representado pela diferença entre o SP e o PV e é o principal indicador
do desempenho do controle no processo. Na prática de um termociclador, o erro
representa o quão distante a temperatura real está da temperatura desejada, o
que fornece ao controlador PID informação necessária para aplicar correções no
processo;
• MV (Manipulated Variable ou variável manipulada) é a resposta do controlador ao
erro apresentado pelo processo. Em outras palavras, o controlador PID ao receber
o valor do erro responde para o processo com uma ação através de uma variável,
com a finalidade de correção. Em um termociclador isso pode ser representado
8 Disponível em: < https://tinyurl.com/ms6b36ur >
23
pelo aumento ou a diminuição da energia fornecida ao bloco de aquecimento com
a finalidade de aquecer ou resfriar a amostra, respectivamente.
Portanto, os equipamentos desenvolvidos neste estudo possuem um controle
de temperatura através do sistema de controle PID.
1.5.1.1. EFEITO DAS VÁRIAVEIS DO CONTROLE PID

(PROPORCIONAL – INTREGAL - DERIVATIVO) NO CONTROLE
DA TEMPERATRA
O termo P age de maneira proporcional ao valor atual do erro SP−PV. Por
exemplo, se o erro for grande, a saída de controle será proporcionalmente grande.
Usar o controle proporcional sozinho (sem o uso dos parâmetros integral e derivativo)
resultará em um processo em estado estacionário (estado em que o processo adquire
estabilidade) com uma diferença, ou offset, SP-PV estável (M Araki, 2009). Em um
termociclador LAMP isso pode significar que o controle estabilize o processo em uma
temperatura outra que não a desejada. O efeito do termo P (sem efeito dos termos
integral e derivativo) pode ser visto nos gráficos da primeira coluna da Figura 6.
O termo I (integral) considera os valores passados já apresentados pelo erro
SP−PV e os integra ao longo do tempo para produzir o termo I. Por exemplo, se
houver um erro residual SP−PV após a aplicação do controle proporcional, o termo
integral busca eliminar o erro residual adicionando um efeito de controle ao valor
cumulativo histórico do erro. Quando o erro for eliminado, o termo integral deixará de
crescer. Isso resultará na diminuição do efeito proporcional à medida que o erro
diminui (M Araki, 2009). O efeito do termo I pode ser visto nos gráficos da segunda
coluna da Figura 6.
O termo D (derivativo) é a estimativa da tendência futura do erro SP−PV, com
base em sua taxa de variação atual. Às vezes é chamado de "controle antecipatório",
pois está efetivamente buscando reduzir o efeito do erro SP−PV através da taxa de
mudança de erro. Quanto mais rápida a mudança, maior o efeito de controle (M Araki,
2009). O efeito do termo D pode ser visto nos gráficos da terceira coluna da Figura 6.
24
Figura 6 – Influência do controle para diferentes ganhos proporcionais, integrais e derivativos.
Fonte: Adaptado de TLK Energy9 (2022)
Esse entendimento do comportamento das variáveis auxilia no processo

prático de calibração do controle da temperatura.
1.5.1.2. RESPOSTA TRANSITÓRIA DE UM SISTEMA

Respostas transitórias (como um sistema reage, em um primeiro momento, a
uma mudança no seu estado de equilíbrio - Figura 7) auxiliam na verificação se as
características do processo estão agindo de acordo com o comportamento desejado.
Em uma resposta transitória os seguintes parâmetros são analisados:
• O tempo de subida (Rise Time) significa o tempo necessário para um sinal passar
de um valor baixo especificado para um valor alto especificado. Esses valores
costumam ser 10% e 90% do setpoint (Bayram et al. 2013). Em um dispositivo
POC LAMP essa métrica pode ser calculada pelo tempo que a temperatura leva
de seu valor ambiente até 62 ºC (95% dos 65 ºC) no aquecimento e do valor de
65 ºC até a temperatura ambiente, no momento do resfriamento;
• O tempo de estabilização é o tempo decorrido desde a aplicação de uma entrada
desejada até o momento em que a saída entrou e permaneceu dentro de uma
faixa de erro especificada (região de estabilização). Essa região de acomodação
é definida como %Settling. No POC LAMP é o tempo para que o valor de
9 Disponível em: < https://tlk-energy.de/blog-en/practical-pid-tuning-guide >
25
temperatura apresentado pelo sistema se estabilize dentro de uma faixa de
temperatura definida como ideal, variando o mínimo possível em torno de 65 ºC;
• %Overshoot é a quantidade pela qual o sinal de resposta pode exceder o valor
final. %Undershoot é a quantidade pela qual o sinal de resposta pode superar,
negativamente, o valor inicial (MB Bayram et al. 2013). Em um POC LAMP é o
quanto a temperatura do sistema possa ter superado o setpoint, como por exemplo
chegar a 67 ºC, apresentando então um Overshoot de 2 ºC (3%).
Figura 7 - Gráfico de resposta transitória típica de sistemas de segunda ordem a um sinal degrau.
Fonte: Bayram et al. 2013
Entender esses parâmetros da resposta transitória é essencial para que o

controle final do processo faça com que a variável controlada dentro de características
de desempenho esperadas, dentro das tolerâncias aceitáveis, resultando em um
ótimo desempenho do sistema, como um rápido aquecimento (baixo Rise Time),
estabilização rápida da temperatura (baixo Settling Time) e dentro de uma faixa
estreita de variação (baixo %Settling) e o mínimo de sobressinal possível (baixo
%Overshoot).
26
1.5.2. USO DE SISTEMAS EMBARCADOS
Para monitorar e controlar todos os periféricos e funcionalidades do
instrumento, um sistema embarcado, como uma placa Arduino ou o ESP32 (Figura
8), pode ser usado.
Figura 8 - Sistemas embarcados Arduino Nano e ESP32 DevKitC
Fonte: Adaptado de Arduino Store10 e Espressif11 (2023)
Arduino é uma plataforma eletrônica de código aberto usada para controlar

circuitos eletrônicos enviando dados e instruções a um microcontrolador (Banzi e
Shiloh, 2014). O sistema embarcado consiste em uma placa de circuito impresso, que
inclui um microcontrolador, sistema de alimentação, circuito de clock e
interfaceamento, podendo ser programável em conjunto com um firmware gravado na
memória da placa física (D’, 2012). Suas placas podem ler e atuar sobre entradas,
manipulando também as saídas, sendo amplamente utilizadas no processo de
desenvolvimento de alguns instrumentos, incluindo projetos envolvendo controle de
temperatura com o uso de bibliotecas PID (Asraf et al. 2017; Mathew et al. 2015;
Wang e Chi 2016; Zermani et al. 2014) e detecção de cores usando sensores de cor,
conforme mencionado anteriormente. A escolha do sistema embarcado depende dos
requisitos do projeto, sendo o Arduino e o ESP32 dentre os sistemas mais presentes
dentro de prototipagem rápida.
Nos subitens a seguir do subcapitulo 1.5.2 são apresentadas algumas
especificações dos sistemas embarcados utilizados na construção dos dispositivos
POC LAMP deste trabalho.
10 Disponível em: < https://store.arduino.cc/products/arduino-nano >

11 Disponível em: < https://www.espressif.com/en/products/devkits/esp32-devkitc/overview >
27
1.5.2.1. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS DO ESP32
A placa ESP32 possui, como principais características para esse projeto,
as apresentadas na Figura 9.
Figura 9 – Especificações técnicas do sistema embarcado ESP32
Processador tensa Dual ore 2 bit

re uência do loc de até 2 0 z
emória interna de 20 S
emória flash de
02.11b g n i i
luetooth .2
ensão de operação 2.2V a . V

Saída regulada de tensão de . V 00m
onsumo de uando em estado de
hibernação
onsumo de 2 0 m uando usando
luetooth ou i i
1 pinos com conversão D

2 saídas P
2 interfaces I2
Fonte: Adaptado de Last Minute Engineers (2023)
A energia ao ESP32 é fornecida ou por sua entrada Micro USB (quando

conectado ao computador, por exemplo) ou através do seu pino Vin por uma fonte
externa regulada em 5V (quando o ESP32 é utilizado internamente em equipamentos,
por exemplo). Além disso, possui uma saída regulada de 3,3V (ou 3v3) que pode ser
utilizada para fornecer energia a outros componentes do circuito no qual ele é
utilizado. A conexão pela entrada do Micro USB também permite a transferência do
firmware para o sistema embarcado.
Os 25 pinos do tipo GPIO (General-purpose input/output) podem ser
modificados, via programação, para exercerem diversas funções. Podem ser
28
configurados como entradas (podendo ler algum sensor ou botão, por exemplo) ou
saídas (podendo acionar um motor, um LED (Light Emitter Diode (diodo emissor de
luz) etc.). Os pinos do tipo ADC (Analog to Digital Converter) são entradas para o
conversore analógico digital que são utilizados para ler sinais analógicos, como de
um sensor de temperatura, e transformar em sinal digital para ser interpretado pelo
sistema embarcado.
O ESP32 conta também com Wi-Fi e Bluetooth integrados, 25 pinos PWM e 2
pinos para comunicação I2C e possui dimensões de 28 x 55 mm. Além do que foi
apresentado, o ESP32 contém algumas outras funcionalidades, configurações,
protocolos de comunicação e modos de funcionamento que não agregam a ser
mencionados no escopo deste trabalho.
1.5.2.2. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS DO ARDUINO NANO

A placa Arduino Nano possui, como principais características para esse
projeto, as apresentadas na Figura 10.
Figura 10 – Especificações técnicas do sistema embarcado Arduino Nano
Fonte: Autoria própria
A energia ao Arduino Nano é fornecida ou por sua entrada Micro USB ou

através do seu pino Vin por uma fonte externa regulada entre 7 e 12V. Além disso,
possui uma saída regulada de 5V que pode ser utilizada para fornecer energia a
outros componentes do circuito no qual ele é utilizado. A conexão pela entrada do
Micro USB também permite a transferência do firmware para o sistema embarcado.
Seus pinos digitais e ADC têm a mesma funcionalidade GPIO explicada para
o ESP32. O Arduino Nano possui frequência de Clock de 16MHz e opera em tensão
29
de 5V. Possui 8 pinos digitais, 6 ADC, 6 PWM e 2 pinos para conexão I2C. Possui
memória flash de 32kB, memória interna SRAM de 2kB.
O Arduino Nano não possui Wi-Fi e Bluetooth integrados e possui dimensões
de 18 x 45 mm. Além do que foi apresentado, o Arduino Nano contém algumas outras
funcionalidades, configurações, protocolos de comunicação e modos de
funcionamento que não agregam a ser mencionados no escopo deste trabalho.
1.5.2.3. DEFINIÇÃO DE FIRMWARE

Na computação, firmware é uma classe específica de software que fornece o
controle para o hardware específico de um dispositivo. Para dispositivos menos
complexos, como sistemas embarcados, o firmware pode atuar como o sistema
operacional completo do dispositivo, realizando todas as funções de controle,
monitoramento e manipulação de dados. Nos dispositivos POC LAMP fornecem
instruções ao sistema embarcado de como ler e interpretar sinais dos sensores de
cor e de temperatura, como controlar o aquecimento, como lidar com as instruções
recebidas do usuário e quais informações apresentar ao usuário.
1.5.2.4. SINAL I²C

I²C (Inter-Integrated Circuit), ou I2C, é um protocolo de comunicação que se
utiliza de dois fios para comunicação de dados, e permite a conexão de diversos
componentes (comumente chamados de escravos) a um mesmo barramento que é
gerenciado, geralmente, por um sistema embarcado (comumente chamado de
mestre) (Arduino, 2022). A Figura 11 apresenta um diagrama demonstrativo de uma
conexão padrão que utiliza o protocolo I²C.
30
Figura 11 - Diagrama demonstrativo de uma conexão padrão do protocolo I²C
Fonte: Vida de silício12
No I2C o SDA (Serial Data ou dados seriais) é o barramento pelos quais são
recebidos e enviados os dados e o SCL (Serial Clock ou Clock serial) é o barramento
que sincroniza o tempo transmissão e recepção de todos os componentes presentes
na rede.
O mestre reconhece cada dispositivo de maneira distinta, pois cada um possui
um endereço único no barramento e existe uma hierarquia de transmissão de dados
que garante que cada dispositivo se comunique respeitando a transmissão dos outros
e o tempo de leitura do dispositivo mestre.
Em dispositivos POC LAMP que trabalham com a detecção de múltiplas
amostras é importante a implementação de uma metodologia que permita que o
sistema embarcado possa lidar com diversos sensores, dado a sua limitação física de
entradas que, além dos múltiplos sensores, também são responsáveis pela
monitoração de outros periféricos conectados, problemática que pode ser resolvida
com o emprego do sinal I2C.
1.5.3. CONTROLE DE POTÊNCIA VIA PWM (Pulse-Width Modulation)

A modulação PWM (Pulse-Width Modulation ou Modulação por largura de
pulso) é um método que pode ser utilizado para controle da potência média entregue
por um sinal elétrico analógico através da modulação da razão cíclica de um sinal
digital, no qual a razão cíclica dita o ciclo de trabalho da saída, indo de 0 a 100% de
um valor de Tensão elétrica (representado por V), como pode ser visualizado na
Figura 12.
12 Disponível em: < https://portal.vidadesilicio.com.br/i2c-comunicacao-entre-arduinos/ >
31
Figura 12 - Uso do PWM em diferentes ciclos de trabalho. A linha tracejada representa a saída do sistema e o
sinal em pulsações representa o PWM.
Fonte – Portescap13
O PWM é comumente utilizado por sistemas embarcados (como o Arduino e o

ESP32, em algumas das suas saídas) para o controle de dispositivos que podem
operar em diferentes intensidades, como por exemplo a quantidade de luz emitida por
um LED, a rotação de um motor, sistemas de aquecimento etc. Um exemplo do PWM
com uso para controlar o sinal que alimenta outro sistema e, consequentemente, a
potência média entregue, pode ser visto na Figura 13.
Figura 13 - Uso do sinal PWM (pulsações) para controlar o sinal de alimentação (laranja) de outro componente.
Fonte – Circuits DIY14
Um exemplo visual do resultado do uso de um PWM em diferentes ciclos de

trabalho para controle de potência entregue a um dispositivo pode ser visto na Figura
14, na qual a potência é entregue a uma lâmpada regulando o PWM em 25%, 50%,
75% e 100% do seu ciclo de trabalho.
13 Disponível em: < https://tinyurl.com/mchptsr9 >

14 Disponível em: < https://www.circuits-diy.com/pulse-width-modulation-circuit/ >
32
Figura 14 - Exemplo do uso do PWM para entregar diferentes valores de potência para uma lâmpada.
Fonte: Adaptado de Pereira, R. et al. 2015
No aquecimento, essa variação de entrega de potência média a um dispositivo

representa o quanto de aquecimento vai ser fornecido ao processo, o que possibilita
o controle da temperatura através do uso do PWM em conjunto com o PID,
implementados no firmware de um sistema embarcado.
1.5.4. SISTEMA ELETRÔNICO
1.5.4.1. FORMAS DE AQUECIMENTO

Termocicladores comerciais utilizam pastilhas termoelétricas, que são
elementos de cerâmica que utilizam o efeito Peltier (Figura 15), nos quais quando
aplicada uma diferença de potencial nos polos do material é criada uma diferença de
temperatura.
Figura 15 - Pastilha termoelétrica de cerâmica, que funciona através do efeito Peltier.
Fonte: Easy Trom Labs15
15 Disponível em: < http://www.easytromlabs.com/ >
33
pastilha tem uma “face fria” e uma “face uente” ue podem se inverter caso
a polaridade da diferença de potencial aplicada nos seus polos inverta. Em outras
palavras é um dispositivo feito para aquecer e resfriar em proporcionalidade à
potência que lhe é fornecida. A inversão da polaridade aplicada na pastilha pode ser
feita através do uso de uma ponte H, explicada com maiores detalhes no item 1.5.4.2.
Outra técnica possível de aquecimento pode ser através do efeito Joule (se
utilizando de um elemento resistivo, como acontece em chuveiros elétricos), que é
menos convencional em termocicladores pela dificuldade de alternar rapidamente
entre diferentes faixas de temperatura, o que compromete algumas técnicas utilizadas
no termociclador como o RT-PCR. Assim sendo, o efeito Joule pode ser utilizado em
instrumentos que trabalham somente com LAMP por se manter somente a uma
temperatura, o que diminui o custo de construção do aparelho por precisar de menos
elementos em sua construção. A construção de termocicladores usando o efeito Joule
para aquecimento já foi demonstrado por Oliveira et al. (2021).
1.5.4.2. PONTE H
A ponte H é um tipo de circuito eletrônico que inverte a polaridade aplicada a um
dispositivo. Um exemplo do uso de uma ponte H invertendo a polaridade de uma
carga pode ser visto na Figura 16.
Figura 16 - Exemplo do uso de uma ponte H invertendo a polaridade de uma carga.
haves , , e
ão permitem a passagem de corrente
haves e
Permitem passagem de corrente
haves e
ão permitem passagem de corrente
haves e
ão permitem passagem de corrente
haves e
Permitem passagem de corrente
Fonte: Adaptado de Hernández, et al. 2015
Esse tipo de circuito é frequentemente utilizado em aplicações nas quais é

preciso inverter a polaridade de uma carga durante seu processo de operação, como
34
por exemplo um trocar a direção que um motor está girando ou, no caso de um
termociclador, inverter a polaridade aplicada a pastilha termoelétrica para trocar seu
estado de aquecimento para resfriamento.
1.5.4.3. FIDELIDADE DE SINAL NA ELETRÔNICA

Pensando em melhorar a qualidade do sinal transmitido através da placa
eletrônica, foram adicionados alguns elementos e aplicados alguns conceitos na
confecção da placa mãe do circuito do equipamento POC LAMP, como capacitores
de filtro, de desacoplamento e resistores Pull-up e Pull-Down, descritos nos próximos
itens.
1.5.4.3.1. CAPACITORES DE DESACOPLAMENTO

Um capacitor de desacoplamento é utilizado com a finalidade de filtrar um
eventual sinal ruidoso, gerado pelo próprio sistema eletrônico ou fatores externos
(como descarga eletrostática), que possa chegar até os diversos elementos de um
circuito eletrônico. Isso é importante pois o sistema embarcado constantemente lê
sinais em algumas das suas portas e executa alguma ação ao sistema a partir dessa
leitura, trazendo a necessidade de garantir que os sinais gerados e lidos foram
propositais e não um acidente por fatores externos. A Figura 17 mostra o exemplo de
uso de um capacitor de desacoplamento para filtrar eventuais ruídos de sinal.
Figura 17 - Exemplo de uso de um capacitor de desacoplamento para filtragem de ruido.
Fonte: Adaptado de Components 10116
16 Disponível em: < https://tinyurl.com/yeyk3eyp >
35
Isso é frequentemente necessário pois em alguns circuitos o funcionamento
de um dispositivo pode criar ruídos que interfiram no funcionamento adequado de
outros componentes.
1.5.4.3.2. RESISTORES PULL-UP E PULL-DOWN

Os resistores pull-up e pull-down são resistores utilizados para garantir um
estado de sinal, impedindo que um sinal flutue aleatoriamente quando não existe um
sinal sendo aplicado naquele momento.
Figura 18 - Exemplo de uso de um resistor Pull-Up.
uando o botão for pressionado, o sinal aparece no

uando o botão for pressionado, o sinal aparece no
Fonte: Adaptado de Sparkfun17
Na Figura 18 o resistor R1 funciona como resistor Pull-Up. Quando o botão é

pressionado, o sistema embarcado (podendo ser o Arduino ou ESP32) recebe o valor
de GND, e quando ele está aberto (não pressionado) recebe o valor de VCC. Se não
existisse o resistor pull-up R1, o valor recebido pelo sistema embarcado, quando o
botão estivesse não pressionado, seria um valor flutuante aleatório, pois não teria
nada em sua entrada que garantisse efetivamente um valor. Neste caso o sistema
embarcado faria uma leitura incorreta, fazendo com que em algum momento que o
botão foi pressionado mesmo sem nenhum comando ter sido dado.
17 Disponível em: < https://learn.sparkfun.com/tutorials/pull-up-resistors/all >
36
1.6. MATURIDADE TECNOLÓGICA
O desenvolvimento de um equipamento eletrônico se dá sob a forma de
protótipos, testes e entregas. Internacionalmente existe uma classificação de
tecnologias por meio de avaliações de seus níveis de maturidade conhecido como
Technology Readiness Level (TRL) e no Brasil essa avaliação segue a norma NBR
ISO 16290:2015.
Na Figura 19 são apresentados os 9 níveis de maturidade do TRL divididos em
3 grandes categorias:
• Pesquisa:
1. Princípios básicos observados;
2. Conceito da tecnologia formulado;
3. Prova de conceito experimental.
• Desenvolvimento:
4. Tecnologia validada em laboratório;
5. Tecnologia validade em ambiente relevante;
6. Tecnologia demonstrada, com consistência de funcionamento, em ambiente
relevante.
• Entrega:
7. Protótipo do sistema demonstrado em ambiente operacional;
8. Sistema completo e qualificado;
9. Sistema final consolidado em ambiente operacional.
37
Figura 19 - Technology Readiness Level (TRL).
Fonte: Senai (2022)18
A seguir será apresentado a descrição dos 9 níveis, tomando como referência

a descrição da NBR ISO 16290:2015 e visando o desenvolvimento de equipamentos,
sendo os TRL 1 e 2 referentes a pesquisa fundamental, o 3, 4 e 5 referentes a
pesquisa e desenvolvimento, o 6, 7 e 8 referentes ao projeto piloto e demonstração
do equipamento em diferentes ambientes, e o 9 ao início da vida do equipamento em
âmbito comercial.
1.6.1. TRL 1 – PRINCÍPIOS BÁSICOS OBSERVADOS

Primeira concepção do equipamento ou sistema, com embasamento científico
e aplicação definida e a primeira ideia de firmware/software e hardware a ser utilizado,
levando em conta conceitos que sustentam a aplicação da tecnologia no problema a
ser resolvido. Nesse momento são levados em contas propriedades básicas da
18Disponível em: < https://institutos.sc.senai.br/2022/09/13/technology-readiness-level-trl-como-

determinar-a-maturidade-de-uma-tecnologia/ >
38
tecnologia. Não são necessariamente definidos os componentes, mas sim o que se
espera que os componentes sejam capazes de resolver.
Seguem alguns indicadores desta etapa:
• As atividades básicas de pesquisa foram realizadas e os princípios básicos foram
definidos;
• Princípios e descobertas foram publicados na literatura (por exemplo, artigos de
pesquisa, artigos revisados por pares etc.).
1.6.2. TRL 2 – CONCEITO TECNOLÓGICO FORMULADO

Nessa fase são realizados os primeiros esboços do projeto, desenhos
preliminares da eletrônica que deem uma ideia geral do seu funcionamento,
apresentação de um software de desempenho genérica através de algoritmos e
fluxogramas, esboços e desenhos conceituais do housing do equipamento. Nenhuma
demonstração real e experimental ou análise detalhada está disponível para apoiar a
conjectura do projeto, além de um projeto conceitual. As ideias são especulativas.
• As aplicações dos princípios básicos foram identificadas;
• Aplicações e análises de suporte foram publicadas na literatura (por exemplo,
estudos analíticos, pequenas unidades de código para software, artigos
comparando tecnologias).
1.6.3. TRL 3 – PROVA DE CONCEITO

Os primeiros módulos para testes dos conceitos teóricos são construídos.
Pequenos circuitos eletrônicos são desenhados em software CAD (Computer Aided
Design) e desenvolvidos em placas do tipo protoboard, que servem para
desenvolvimento rápido de protótipos de eletrônica. Segmentos de códigos são
construídos para testes pontuais e validação de funcionalidades. Primeiros housings
construídos em 3D. As demonstrações, modelagens e simulações de laboratório
validam a previsão analítica e, quando não, os modelos são refeitos e adequados
para corrigir os problemas encontrados. Os componentes ainda não são integrados,
só são usados para testar e avaliar conceitos básicos em problemas de modelo
simples que representam a necessidade final.
• Prova de conceito e/ou função crítica analítica e experimental foi desenvolvida;
39
• Componentes separados foram validados em um ambiente de laboratório.
1.6.4. TRL 4 – VALIDAÇÃO DA TECNOLOGIA EM LABORATÓRIO

Um sistema único de baixa fidelidade é construído e operado para demonstrar
a funcionalidade básica em ambiente de teste e as previsões de desempenho
associadas são definidas em relação ao ambiente operacional final. Os módulos são
integrados em um único sistema: hardware, housing e firmware/software. São
validados os principais componentes críticos do sistema, estabelecendo a sua
interoperabilidade. O primeiro protótipo é construído de acordo com a formulação
básica, possibilitando o aprimoramento do modelo para uma representação mais
realista do sistema industrial, e a capacidade de produzir a tecnologia em ambiente
controlado.
• Componentes, subsistemas e/ou processos integrados foram validados em um
ambiente de laboratório;
• É entendido como a integração e os resultados do teste diferem dos objetivos
esperados do sistema.
1.6.5. TRL 5 – VALIDAÇÃO DO PROTÓTIPO EM AMBIENTE RELEVANTE

Um sistema de fidelidade média do componente é construído e operado para
demonstrar o desempenho geral em um ambiente operacional simulado/controlado,
com elementos de suporte realistas que demonstram o desempenho geral em áreas
críticas. As previsões de desempenho são feitas para as fases de desenvolvimento
subsequentes. O primeiro protótipo é aprimorado a partir dos resultados observados
e das perspectivas futuras para o projeto se tornando em um segundo protótipo que
contém todos os principais elementos da necessidade final de sua aplicação. Neste
momento as documentações de performance são iniciadas. A complexidade dos
desenhos técnicos aumenta, são adicionados à eletrônica elementos para melhorar
seu controle e desempenho, são realizadas melhorias no desenho do housing e os
defeitos observados são corrigidos. São integradas mais funcionalidades no software
e firmware, e a sua escrita é feita de maneira mais otimizada e voltada para a
aplicação final.
40
• Componentes/subsistemas ou processos semi-integrados foram validados em um
ambiente simulado;
• Como o ambiente simulado difere do ambiente operacional esperado e como os
resultados do teste se comparam com as expectativas são compreendidos.
1.6.6. TRL 6 – CONSOLIDAÇÃO DA TECNOLOGIA EM AMBIENTE

RELEVANTE
Um sistema de alta fidelidade que aborda adequadamente todos os problemas
críticos é construído e operado em ambiente relevante para demonstrar sua
funcionalidade sob condições finais de operação. É demonstrada a funcionalidade do
protótipo para resolver problemas realistas em grande escala. Neste ponto o sistema
deve ter a capacidade de se integrar parcialmente a sistemas de hardware e software
já existentes no mercado. Sua documentação, mesmo que limitada, já existe. A
viabilidade da engenharia é totalmente demonstrada e o protótipo não necessita de
nenhuma intervenção especializada no seu desenvolvimento (por exemplo refazer
partes do hardware). O protótipo começa a entrar em conformidade com as
legislações envolvidas na sua aplicação e no seu desenvolvimento, como os padrões
ISO. Nesta etapa é esperada a capacidade de produzir o produto ou seus
subconjuntos. O sistema deve passar por testes de campo.
• Modelo em escala piloto ou protótipo desenvolvido;
• Modelo em escala piloto ou sistema de protótipo está próximo da configuração
desejada em desempenho e volume, mas geralmente menor que em escala real;
• Protótipo em escala piloto ou sistema modelo foi demonstrado em um ambiente
simulado;
• São compreendidos como o ambiente simulado difere do ambiente operacional e
como os resultados diferiram das expectativas.
1.6.7. TRL 7 – DEMONSTRAÇÃO DA TECNOLOGIA EM AMBIENTE

OPERACIONAL
Uma unidade de engenharia de alta fidelidade que trata adequadamente de
todos os problemas críticos é construída e operada em um ambiente relevante para
demonstrar o desempenho no ambiente operacional real. O software do protótipo
apresenta todas as principais funcionalidades disponíveis para demonstração e teste,
41
e integrado com sistemas operacionais de hardware, demonstrando viabilidade
operacional. A maioria dos bugs de software foi removida. Documentação limitada
disponível. Instalação, execução e avaliação do software no ambiente de objetivo real,
com demonstração do uso pelos clientes. Nesta etapa é esperada a capacidade de
produzir o produto e/ou seus subconjuntos em ambiente representativo de produção.
• Protótipo em escala real com forma pronta, ajuste e função desenvolvidos;
• Protótipo em escala real demonstrado em um ambiente operacional, mas sob
condições limitadas.
1.6.8. TRL 8 – SISTEMA COMPLETO E QUALIFICADO

O produto em sua configuração final é demonstrado com sucesso por meio de
teste e análise para o ambiente operacional pretendido. Todo o software foi
completamente depurado e totalmente integrado com todos os sistemas operacionais
de hardware. Toda a documentação do usuário, documentação de treinamento e
documentação de manutenção concluída. Todas as funcionalidades demonstradas
com sucesso em cenários operacionais. elaboração do dossiê técnico, utilizado no
registro do produto. Nesta etapa é esperada a capacidade de implementação da
produção e minimização dos custos.
• Configuração final da tecnologia desenvolvida;
• Configuração final testada com sucesso em um ambiente operacional;
• A capacidade da tecnologia de atender aos seus requisitos operacionais foi
avaliada e os problemas documentados; planos, opções ou ações para resolver
problemas foram determinados.
1.6.9. TRL 9 – INCORPORAÇÃO DA TECNOLOGIA

O produto é operado com sucesso. Toda a documentação foi concluída.
Suporte de engenharia está em vigor. O sistema foi operado com sucesso no
ambiente operacional. Produto comprovadamente pronto por meio de operações
bem-sucedidas no ambiente operacional. Nesta etapa é esperada a capacidade de
uso do produto em todo seu alcance e quantidade.
42
• A tecnologia foi implantada com sucesso e comprovada em uma ampla gama de
condições operacionais;
• Relatórios operacionais, de teste e avaliação foram concluídos;
• A tecnologia está disponível abertamente no mercado e/ou foi vendida em seu
estado atual de oferta de serviço para fins de teste ou desenvolvimento.
43
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral deste trabalho foi construir dois protótipos de equipamentos POC
LAMP (hardware e software) que tenham a finalidade de amplificar e detectar
amostras biológicas, visando a maturidade tecnológica em nível TRL 4 do primeiro
equipamento e, baseado em melhorias do primeiro, alcançar o TRL 5 no segundo
equipamento, com hardware e firmware robustos o suficiente para um preciso controle
de temperatura e a possibilidade da detecção colorimétrica dos resultados.
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Avaliar o melhor sistema embarcado para a construção dos protótipos de
equipamentos dentre os com maior uso no mercado e que melhor se encaixem
em cada projeto de equipamento;
• Implementar sensores de cor distintos em cada um dos equipamentos, que
tenham a capacidade de detectar as mudanças de cor e avaliar seu
desempenho para determinar qual a melhor opção para um equipamento de
alto nível de maturidade;
• Adaptar o sistema do primeiro equipamento construído, com base nas suas
principais falhas, visando a construção de um segundo protótipo mais robusto,
mitigando as falhas encontradas.
44
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Neste capítulo serão apresentados os materiais e métodos utilizados durante

as etapas de desenvolvimento realizadas nos dois protótipos de equipamentos. São
descritos dois protótipos que representam duas maturidades tecnológicas diferentes,
o Apollo (visando TRL 4) e o Cardinal (Visando TRL 5).
Os níveis TRL 1, 2 e 3 para desses dois equipamentos tomou como base um
protótipo construído e publicado em forma de artigo intitulado “A low‑cost PCR
instrument for molecular disease diagnostics based on customized printed circuit
board heaters” (Oliveira et al. 2021) que descreve a construção e demonstração da
funcionalidade um termociclador para PCR, da qual o autor deste trabalho fez parte
da equipe de desenvolvimento enquanto aluno de Iniciação Científica. A partir dos
resultados e entendimento das tecnologias e metodologias empregadas, os seguintes
equipamentos surgem como uma evolução e amadurecimento tecnológico sendo o
primeiro protótipo um equipamento e não somente uma demonstração da técnica.
Toda estrutura mecânica dos equipamentos, inclusive o projeto do housing em
3D, foram desenvolvidas em parceria com o mestre em biociências e biotecnologia
pelo ICC (Instituto Carlos Chagas) e engenheiro mecânico, Mateus Cassaboni
Stracke, devido à alta complexidade e interligação entre os sistemas eletrônicos e a
estrutura mecânica do projeto.
3.1. BLOCO TÉRMICO DE AQUECIMENTO

O aquecimento de ambos os equipamentos RT-LAMP se dá em um bloco
térmico (Figura 20), em que até 8 amostras são dispostas e foi confeccionado
utilizando-se de um bloco alumínio fresado, projetado utilizando o software para
desenhos de sistemas mecânicos CAD (Computer Aided Design ou desenho assistido
por computador) SolidWorks. O bloco é acoplado a uma placa de circuito impresso
(PCI) e possui dimensões de 114,0 x 18,0 x 10,5 mm (Comprimento x Largura x
Altura).
Figura 20 - Bloco térmico fresado com ferramenta de alta precisão.
Fonte: Adaptado de Mateus Stracke (2021)
45
O bloco de alumínio é utilizado como condutor de calor, o que garante uma
distribuição uniforme de calor ao longo do bloco e, consequentemente, nas amostras.
O aquecedor superior possui uma placa fina de alumínio acoplada a uma outra PCI
com a mesma finalidade de distribuição uniforme de calor.
O bloco de alumínio inferior foi feito com oito estruturas cônicas verticais
distribuídas uniformemente na região mais centralizada de seu corpo. As estruturas
são utilizadas para garantir o correto posicionamento dos microtubos do equipamento
e aumentar a área de contato para transferência de calor. Alinhado com as estruturas
cônicas, o bloco possui oito caminhos horizontais para que a luz do LED percorra os
microtubos, chegando ao sensor de cores. Um sensor de temperatura LM35 com
encapsulamento TO220 foi fixado em uma extremidade do bloco para adquirir a
temperatura. Em ambas as extremidades da peça, há furos para fixar o bloco de
aquecimento à carcaça do instrumento e ao sensor de temperatura, e furos
horizontais para fixar as placas emissora e receptora utilizadas no processo de
detecção colorimétrica.
3.2. HOUSINGS DO EQUIPAMENTOS

O housing dos equipamentos é feito através do uso de uma impressora 3D da
marca Ender com filamento do tipo PLA (Ácido Polilático), modelo Ender 3 Pro (Figura
21).
Figura 21 - Impressora 3D modelo Ender 3 Pro e filamento preto do tipo PLA.
Fonte: 3DLab19.
A escolha pela impressão 3D é explicada por ser um método rápido, barato e

bem difundido na área de prototipagem rápida de dispositivos.
19 Disponível em: < https://3dlab.com.br/produto/ender-3-pro-kit/ >.
46
3.3. CONSTRUÇÃO DO EQUIPAMENTO 1 – APOLLO
De um ponto de vista sistemático, o equipamento para a técnica LAMP para
detecção de Covid-19, necessita de um aquecimento até 65 ºC da amostra, mantida
por 30 minutos sem que ocorra a evaporação do líquido. Após os 30 minutos resfriar
as amostras e fazer a leitura e interpretação da cor presente no tubo, provendo o
diagnóstico. Essa característica pode ser vista na Figura 22. A ideia desse
equipamento era ser o mais simples possível, sendo que este apenas necessita
apertar um botão para funcionar. Para tal, todas as características de aquecimento e
tempo foram diretamente inseridas no firmware do instrumento, não havendo
possibilidade de ajustes e variações nesses parâmetros de forma externa pelo
usuário, apenas através de programação.
Figura 22 - Visão sistemática do LAMP visando a construção do equipamento Apollo.
Fonte: Autoria Própria
Tendo a visão sistemática do funcionamento do equipamento, é possível

transformar ele em um esboço de um projeto de engenharia, através dos primeiros
esboços do projeto. O diagrama de blocos, resultado do primeiro esboço do projeto
do Apollo, da eletrônica do instrumento pode ser visto na Figura 23. A seta aponta na
direção em que o sinal flui.
47
Figura 23 - Diagrama de blocos da eletrônica do equipamento LAMP Apollo
Com o diagrama em mãos é possível a escolha dos componentes e a

construção do equipamento do ponto de vista da engenharia.
3.3.1. SISTEMA DE AQUECIMENTO DO APOLLO

O aquecimento é feito através do efeito Joule (aquecimento através do efeito
resistivo) utilizando-se de duas placas P I dupla face ( de μm de cobre) ue
foram fabricadas utilizando uma máquina de fresagem e furação de PCI, a LPKF S103
(LPKF Laser & Electronics, Alemanha). A máquina de fresa e as placas FR4 podem
ser vistas na Figura 24. Todas as placas eletrônicas confeccionadas para este projeto
foram manufaturadas com o auxílio da LPFK S103.
Figura 24 - Máquina de fresagem e furação de PCI LPKF S103 e placas PCI FR4.
Fonte: Adaptado de UseScience20
O resistor de cobre projetado na PCI inferior (Figura 25) tem uma resistência
total de aproximadamente 2, Ω e a placa P I superior 2, Ω. O resistor foi projetado
em configuração “zig-zag” para melhor distribuição de calor.
20 Disponível em: < https://scientificservices.eu/item/milling-and-drilling-equipment/1865 >
48
Figura 25 - Componentes do bloco de aquecimento inferior do projeto Apollo. (a) Placa de aquecimento; (b)
Bloco de alumínio; (c) Sistema de aquecimento integrado.
Fonte: Mateus Stracke (2021)
Na placa PCI superior (Figura 26), há um LM35 com encapsulamento do tipo

SOIC8 usado como sensor de temperatura soldado próximo ao resistor de
aquecimento para melhor aquisição de temperatura.
Figura 26 - Componentes do sistema de aquecimento superior do projeto Apollo. (a) Placa de aquecimento; (b)
Placa de alumínio; (c) Sensor de temperatura.
3.3.2. DETECÇÃO COLORIMÉTRICA

Sensores de cor TCS3200 da AMS (Figura 27), que convertem luz para
frequência, foram usados para detecção de cores, usando seu modo de detecção das
frequências Azul e Verde.
Figura 27 – Sensor de cor analógico TCS3200
Fonte: Components10121 (2021)
21 Disponível em: < https://components101.com/sensors/tcs3200-color-sensor-module >
49
Uma placa PCI foi fabricada também se utilizando da LPKF S103, como
descrito no item 3.3.1, mas com um projeto diferente para suportar os terminais dos
sensores de cor. A placa PCI de detecção contém oito sensores de cor TCS3200
distribuídos uniformemente ao lado de capacitores de filtro e resistores limitadores de
corrente.
A placa com os TCS3200 funciona em conjunto a uma placa de LEDs fabricada
da mesma forma que a placa contendo os sensores de cor TCS3200, possuindo um
projeto diferente utilizado para comportar oito LEDs SMD (Surface-mount Device ou
Tecnologia de montagem superficial) e resistores limitadores de corrente.
3.3.3. CIRCUITO ELETRÔNICO DE CONTROLE

O projeto eletrônico foi desenhado nos softwares Eagle (versão 9.6.2
educacional), AutoCAD (versão estudante), ambos da Autodesk (Autodesk, Inc. USA)
e o software DipTrace (versão 4.2.0.1 standard). A seguir são listados os principais
componentes do projeto:
• A Placa Mãe é responsável pelo controle de todo equipamento, contendo diversos
componentes eletrônicos, entre eles dois MOSFETs (IRL3103 da Infineon) para o
acionamento dos aquecimentos superior e inferior. O MOSFET (Figura 28), neste
projeto, funciona como uma chave que permite ou não a passagem de corrente
pelas placas de aquecimento superior e inferior, que fornece a potência necessária
para o aquecimento.
Figura 28 – MOSFET IRL3103, componente que controla o fluxo de potência fornecida a placa de aquecimento.
Fonte: WestFlorida Components22 (2021)
• As placas de aquecimento superior e inferior são acionadas pelos MOSFETs

através de um comando do tipo PWM do sistema embarcado Arduino, através do
controle PID implementado no firmware do sistema embarcado, com base nos
valores mensurados pelo sensor de temperatura.
22 Disponível em: < https://tinyurl.com/32yrw5xh >
50
• Dois transistores BC817 da Rectron utilizados para o acionamento das duas
ventoinhas 12V, 0,13 A de 40x40x10mm da Botto Brazil (Figura 29), um para cada.
O transistor, assim como o MOSFET, funciona como uma chave para o
acionamento de um componente. A diferença é a potência que eles fornecem, em
que o MOSFET é um componente mais robusto para correntes maiores. As
ventoinhas são responsáveis pelo resfriamento do bloco de aquecimento ao final
da reação LAMP.
Figura 29 - Micro ventilador, para resfriamento das amostras.
Fonte: Botto Brazil23 (2021)
• Foi escolhido o sistema embarcado Arduino Nano, da Arduino, (Figura 30), que
contém o firmware com todas as instruções para o funcionamento do dispositivo,
o controle PID para o aquecimento, o controle do resfriamento, o processo para
detecção colorimétrica e o controle de todos os outros periféricos do dispositivo
através do gerenciamento de entradas e saídas.
Figura 30 - Arduino Nano, componente responsável pelo controle geral do equipamento Apollo.
Fonte: Arduino Store24 (2021)
• Foram usados dois sensores de temperatura LM35 (da Texas Instruments), um

para cada placa de aquecimento. O sensor LM35 utilizado na placa inferior tem
um encapsulamento do tipo TO-220 por facilitar a fixação com a placa de alumínio
23 Disponível em: < https://www.bottobrazil.com.br/micro-ventilador-dc-fan-40x40x10mm-12v-alta-

rotacao-sleeve-bucha-botto-brazil >
24 Disponível em: < https://store-usa.arduino.cc/products/arduino-nano >
51
(Figura 31) e ter uma grande área de contato, o que ocasiona uma melhoria no
processo de aquisição da temperatura, enquanto o utilizado na placa superior tem
um encapsulamento do tipo SOIC8. O sensor é, de acordo com a fabricante Texas
Instruments, calibrado em graus Celsius, tem escala linear, tem 0,5º C de precisão
(a 25 ºC), trabalha entre -55 ºC e 150 ºC e tem baixo consumo de potência.
Figura 31 - Sensor de temperatura LM35 acoplado no alumínio da placa Inferior
• Dois multiplexadores/demultiplexadores (Mux/Demux) (Figura 32) da RS

Components foram usados para o sistema de detecção colorimétrica, sendo um
responsável pela iluminação dos LEDs e um responsável pela leitura dos sensores
de cor. O Mux/Demux é um elemento que permite que em um único canal de
comunicação sejam transmitidos mais de uma fonte de dados. No projeto é
utilizado uma única porta do Arduino Nano para ligar 8 LEDs diferentes, de
maneira alternada e uma outra única porta para leitura de 8 sensores de cor,
também de maneira alternada. E isso só é possível através do uso do Mux/Demux.
Explicações mais detalhadas sobre o funcionamento do Mux/Demux no projeto
são apresentadas na Figura 52.
Figura 32 - 74HC4051D, Multiplexador/Demultiplexador para escolha do par LED/TCS3200
Fonte: RS Components25 (2021)
• Um buzzer (adquirido via Baú da Eletrônica) (Figura 33) para sinalização sonora.
O Buzzer é um elemento que emite som quando acionado, e é utilizado para
25 Disponível em: < https://pt.rs-online.com/web/p/ci-multiplexores-y-demultiplexores/1697756 >
52
sinalizar ao usuário do aparelho sobre algumas das etapas de seu funcionamento,
como inicialização, finalização do LAMP e resultados prontos para leitura.
Figura 33 - Buzzer, para alarme sonoro.
Fonte: Baú da Eletrônica26 (2021)
• Para comunicação visual, foi utilizado um display OLED da Adafruit (Figura 34) de
0,96 polegadas, para indicar ao usuário as informações relevantes do
funcionamento do aparelho para o usuário, como o tempo do LAMP, a temperatura
e os resultados da detecção. No display também são mostradas informações
sobre o estado atual do aparelho e eventuais instruções ao usuário.
Figura 34 - Exemplo do Display OLED utilizado no projeto Apollo.
Fonte: Adafruit27 (2021)
• Além de todos esses circuitos, mais alguns componentes são usados para limpar
e estabilizar os sinais do circuito, como capacitores de filtragem. Um fusível é
usado para segurança do circuito. O instrumento é alimentado por um adaptador
AC/DC (entrada 100-240V—50/60 Hz — saída 12V, 5A (FY, W-T5000 – Hechoen-
China).
As seguintes figuras mostram os diagramas esquemáticos eletrônicos das placas
de circuito impresso desenhadas para construção do equipamento. As placas serão
descritas com mais detalhes no item 4.2.2:
26 Disponível em: < https://www.baudaeletronica.com.br/buzzer-5v.html >

27 Disponível em: < https://www.adafruit.com/product/326 >
53
Figura 35 - Diagrama esquemático eletrônico da placa contendo o botão e o display do equipamento.
54
Figura 36 - Diagrama esquemático da Placa mãe do Apollo. Contendo os itens citados no texto da seção 3.3.3
55
Figura 37 - Diagrama esquemático eletrônico da de emissão do sistema de detecção colorimétrica.
56
Figura 38 - Diagrama esquemático eletrônico da placa de detecção do sistema de detecção colorimétrica.
57
3.4. CONSTRUÇÃO DO EQUIPAMENTO 2 – CARDINAL
Visando um aprimoramento das metodologias empregadas no Apollo em

questão de funcionalidade, o segundo equipamento (codinome Cardinal) deve ter um
sistema que permita uma aplicação mais flexível para poder ser também utilizado
como um termociclador (sem detecção LIF - fluorescência induzida por laser), e com
funcionalidades mais otimizadas em relação ao Apollo. Pensando nisso e no projeto
do Apollo, o equipamento necessita de um aquecimento com maior taxa de
aquecimento e resfriamento da amostra, que ela seja mantida na temperatura pelo
tempo da reação escolhidos pelo usuário, que não ocorra a evaporação do líquido, e
que ao finalizar o resfriamento seu resultado seja interpretado. Este também deve
permitir uma a calibração da forma de detectar as cores de acordo com a escolha do
usuário. Essas características podem ser vistas na Figura 39.
Figura 39 – Visão sistemática do LAMP visando a construção do Cardinal
O diagrama de blocos da eletrônica do instrumento pode ser visto na Figura 40

- Diagrama de blocos da eletrônica do Cardinal. A seta aponta na direção em que o
sinal flui.
58
Figura 40 - Diagrama de blocos da eletrônica do Cardinal
Com o diagrama em mãos é possível a escolha dos componentes e a

construção do equipamento do ponto de vista da engenharia.
3.4.1. SISTEMA DE AQUECIMENTO DO CARDINAL

O sistema de aquecimento se utiliza de pastilhas termoelétricas (da Laird
Thermal Systems) (Figura 41), que funcionam através do efeito Peltier, para o
aquecimento e resfriamento do bloco de alumínio inferior.
Figura 41- Pastilha termoelétrica
Fonte: Mouser Ellectronics28
Para fazer alternar a pastilha termoelétrica entre seus modos de aquecimento

e resfriamento foi utilizada uma ponte H da DFRobot (Figura 42).
28 Disponível em: < https://tinyurl.com/4678ey32 >
59
Figura 42 - Driver Motor Ponte H L298n
Fonte: FilipeFlop29
Os demais componentes do sistema de aquecimento e sua construção são

iguais aos apresentados para o Apollo.

Sensores de cor VEML3328 da Vishay (Figura 43) foram usados para detecção
de cores. O sensor de cor VEML3328 é um sensor digital que funciona através da
comunicação I2C. Uma PCI foi fabricada também se utilizando da LPKF S103, como
descrito no item 3.3.1, mas com um projeto diferente para suportar os terminais dos
sensores de cor. A placa PCI de detecção contém oito sensores de cor VEML3328
distribuídos uniformemente ao lado de capacitores de filtro e resistores limitadores de
corrente. A placa também contém um dispositivo Mux/Demux, utilizado para a seleção
do sensor a ser lido.
Figura 43 – Sensor de cor VEML3328
Fonte: Mouser Electronics30 (2022)
A placa com os sensores VEML3328 funciona em conjunto a uma placa de

LEDs fabricada da mesma forma que a placa VEML3328 (também com um
Mux/Demux), possuindo um projeto diferente utilizado para comportar os terminais
dos oito LEDs SMD, um capacitor de filtro para o Mux/Demux e resistores limitadores
de corrente.
29 Disponível em: < https://www.filipeflop.com/produto/driver-motor-ponte-h-l298n/ >

30 Disponível em: < https://br.mouser.com/new/vishay/vishay-veml3328-veml3328sl-color-sensors/ >
60
No Apollo, o Mux/Demux se encontra na placa mãe, enquanto no Cardinal
existe um na placa de detecção e um na placa de emissão e isso foi feito com a
finalidade de diminuir o cabeamento existente conectando as placas.
3.4.3. CIRCUITO ELETRÔNICO

Existem 5 placas eletrônicas no projeto: Placa Mãe, Placa de Sensores de Cor,
Placa do Display, Placa de LEDs, e uma placa de aquecimento superior que são
elementos resistivos. Os dois elementos de aquecimento têm placas de alumínio que
são associadas a elas para melhor distribuição e aproveitamento do calor gerado no
aquecimento. A seguir são listados os principais componentes do projeto:
• A Placa Mãe é responsável pelo controle de todo o dispositivo, contendo um
MOSFETs (IRL3103) igual ao do Apollo para o acionamento do aquecimento
superior. A placa de aquecimento superior é acionada pelo MOSFET através de
um comando do sistema embarcado ESP32.
• Um transístor BC817 para o acionamento da ventoinha, que é igual a usada no
projeto Apollo. O transistor, assim como o MOSFET, funciona como uma chave
para o acionamento de um componente. A ventoinha (da Botto Brazil, 12V,
70x70x15mm) é responsável pela dissipação de energia que se acumula no bloco
de alumínio enquanto as pastilhas termoelétricas esquentem e resfriam o bloco da
reação.
• O sistema embarcado é o ESP32 da Espressif Systems (Figura 44), que contém
o firmware com todas as instruções para o funcionamento do dispositivo, o
controle PID para o aquecimento, o controle do resfriamento, o processo para
detecção colorimétrica e o controle de todos os outros periféricos do dispositivo
através do gerenciamento de entradas e saídas.
Figura 44 – Foto do ESP32, componente responsável pelo controle geral do equipamento Apollo.
Fonte: Components10131 (2022)
31 Disponível em: < https://components101.com/microcontrollers/esp32-devkitc >
61
• Foram usados dois sensores de temperatura LM35, um para cada placa de
aquecimento da mesma forma descrita no projeto Apollo.
• Dois multiplexadores/demultiplexadores (Mux/Demux) foram usados para o
sistema de detecção colorimétrica, sendo um responsável pela iluminação dos
LEDs e um responsável pela leitura dos sensores de cor, utilizados da mesma
forma como descrito no Apollo.
• A Placa do Display contém um Display OLED da Adafruit (Figura 34) de 1,5
polegadas (1,5 vezes maior que a do Apollo) para indicar ao usuário as
informações relevantes do funcionamento do aparelho para o usuário, como o
tempo do LAMP, a temperatura e os resultados da detecção. No display também
são mostrados menus com informações sobre o estado atual do aparelho e
eventuais instruções ao usuário que possam ser selecionadas.
Figura 45 - Exemplo do Display OLED utilizado no projeto Apollo.
Fonte: Adafruit32 (2022)
• Na placa do display também foram adicionamos um LED vermelho, que indica

quando o aparelho está fazendo a ciclagem LAMP, e o Rotary Encoder que
permite que o Cardinal tenha a função de seleção de opções como tempo e
temperatura em menus.
Figura 46 - Rotary Encoder
Fonte: Components 10133 (2022)
32Disponível em: < https://www.adafruit.com/product/4741 >

33Disponível em: < https://components101.com/modules/KY-04-rotary-encoder-pinout-features-
datasheet-working-application-alternative >
62
• As placas de LED e dos sensores de cor são parecidas com as apresentadas no
projeto Apollo, com a única diferença do sensor de cor que é utilizado.
• Um conversor bidirecional de nível lógico 3,3V/5V foi utilizado para alimentar
diferentes componentes com diferentes tensões de entrada.
Figura 47 - Conversor bidirecional de nível lógico 3,3V/5V
Fonte: Baú da Eletrônica34 (2023)
• A placa mãe ainda contém um fusível (250V – 10A) na entrada da alimentação

externa (Fonte de 12V/10A) visando a proteção do equipamento. A alimentação
do Cardinal conta com uma fonte chaveada 12V/10A (Figura 48) para conversão
da alimentação da rede de 110/220V para 12V.
Figura 48 - Fonte chaveada 12V 10A
Fonte: Baú da eletrônica35 (2023)
A Figura 49 represeta o diagrama esquemático eletrônico do Cardinal. O

diagrama difere do apresentado para o projeto Apollo, pois o software utilizado e a
metodologia empregada no desenho do diagrama foram diferentes, visando a
melhoria do projeto,
34 Disponível em: < https://www.baudaeletronica.com.br/conversor-de-nivel-logico-3-3-5v-

bidirecional.html >
35 Disponível em: < https://www.baudaeletronica.com.br/fonte-chaveada-120w-12v-10a.html >
63
Figura 49 - Diagrama Esquemático do Cardinal
64
3.5. PROCESSO DE CALIBRAÇÃO
Para o processo de calibração, a temperatura na placa foi medida com um
LM35 acoplado ao bloco de alumínio, e a temperatura do líquido foi medida com um
termopar tipo K conectado a um medidor externo (controlador de temperatura Novus
1200), os elementos de calibração são apresentados na Figura 50.
Figura 50 - Dispositivos para monitoramento de temperatura em tempo real

(a) Controlador Novus N1200; (b) Termopar tipo K da Eletrogate.
Fonte: (a) Novus36; (b) Eletrogate37.
ste sensor externo foi inserido em um tubo ppendorf de P de 200 μ

contendo 2 μ de água e selado, a fim de simular um cenário real.
3.6. REAÇÃO RT-LAMP COLORIMÉTRICO PARA DIAGNÓSTICO DE COVID-

19
O conjunto de primers usado para detecção de SARS-CoV-2 e as condições
de reação RT-LAMP foram previamente padronizados pelo grupo de pesquisa do
Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS) (Aoki et al.
2020, Oliveira et al., 2020). O conjunto de primers foi relatado pela primeira vez por
Rabe e Cepko (2020) e foi projetado para o gene ORF1a.
As reações colorimétricas de RT-LAMP foram realizadas com o kit Colorimetric
WarmStart® 2X Master Mix (NEB, Inglaterra). Os primers FIP (forward inner primer)
e BIP (backward inner primer) foram usados em uma concentração final de 1,6 μM
cada, FOP (forward outer primer) e BOP (backward outer primer) em 0,2 μM cada, e
FL (loop primer F-Loop) e BL (loop primer B-Loop) em 0,4 μM cada, com 5 μL de
amostra de RNA em um volume final de 25 μL. As reações foram incubadas por 30
36 Disponível em: <

https://www.novus.com.br/site/default.asp?Idioma=55&TroncoID=508083&SecaoID=547383&Subsec
aoID=727292&Template=../catalogos/layout_produto.asp&ProdutoID=907280 >
37 Disponível em: < https://www.eletrogate.com/termopar-tipo-k-50-a-400c-eza-tp-01 >
65
minutos a 65 ºC nos instrumentos RT-LAMP (Apollo e Cardinal) e em um
termociclador convencional para comparação de resultado. Após o período de reação,
as amostras foram resfriadas até a temperatura de 25 ºC no termociclador Apollo, e
até 10 ºC no termociclador cardinal, pela diferença de tecnologia empregada. Como
controle positivo foram utilizadas amostras positivas para RT-qPCR, e como controle
negativo foi utilizado um controle sem molde (NTC) com água livre de nuclease. O
RNA clínico foi extraído com o Mini Kit viral QIAamp® RNA (Qiagen, Alemanha),
seguindo as instruções do fabricante.
Amostras clínicas de swab de rayon nasal e oral foram coletadas em 3 mL de
solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS 1x) de pacientes sintomáticos do
Hospital Erasto Gaertner (Curitiba - Brasil) com aprovação do Comitê de Ética Local
(CAAE 31592620.4.3001.5248 e 31592620.4. 1001.0098).
Figura 51 - Amostras de SARS-CoV-2. (a) Resultado positivo (+). (b) Resultado indeterminado (IND). (c)
Resultado negativo (-),
Fonte – Oliveira et al. (2021)
As possíveis colorações das amostras de SARS-CoV-2 antes e após ocorrer a

reação de RT-LAMP são representadas na Figura 51.
3.7. PROCESSO DE DETECÇÃO COLORIMÉTRICA

O papel da eletrônica no processo de detecção colorimétrica é garantir que
apenas um par de LED e um sensor de cor funcionem por vez e estabilizar o sinal por
meio de filtros capacitivos. É importante que apenas um sensor seja lido por vez, pois
se acendêssemos mais de um LED no processo de leitura de um sensor, a luz das
amostras adjacentes influenciaria a leitura da amostra alvo, criando fontes de ruído
de sinal. O Mux / Demux permite, além de salvar o processamento do Arduino e os
pinos, que haja uma seleção única de um par LED / sensor de cor funcionando por
amostra-alvo lida (Figura 52). Apesar dessa hierarquia de leitura, o processo de leitura
66
leva apenas alguns segundos. Além disso, a intensidade do LED é regulada através
de resistores, de forma que não seja tão alta que sature o sensor de cor com sua luz
branca, uma baixa intensidade do LED é desejável para criar um ambiente favorável
para detecção de cor.
Figura 52 - Configuração Mux / Demux que permite uma seleção exclusiva de um par LED / sensor de cor. Isso
também reduz a quantidade de pinos usados do sistema embarcado/microcontrolador (MCU).
O sensor de cor tem a capacidade de ler três informações básicas contidas na

cor: sua quantidade de vermelho (R), verde (G) e azul (B). Para descobrir quais
informações seriam cruciais para obter o resultado do RT-LAMP, foi utilizada uma
ferramenta adobe capaz de extrair a quantidade de R, G e B presentes em uma
imagem (https://color.adobe.com/) com a utilização de uma foto capturada de
amostras reais positivas e negativas, para se entender como informação de amostras
positivas e negativas é interpretada em uma escala RGB (0-255). Este processo e o
sistema de detecção colorimétrica do instrumento podem ser vistos na Figura 53 -
Demonstração do sistema de detecção de cor, em que uma placa emite uma luz
branca via LED; O LED ilumina o tubo com uma luza branca transversalmente e a luz
absorvida na solução (rosa (-), amarela (+) ou laranja (Indeterminada)) é transmitida
e capturada no sensor de cor.
67
Figura 53 - Demonstração do sistema de detecção de cor, em que uma placa emite uma luz branca via LED; O
LED ilumina o tubo com uma luza branca transversalmente e a luz absorvida na solução (rosa (-), amarela (+) ou
laranja (Indeterminada)) é transmitida e capturada no sensor de cor.
Fonte: Autoria Própria.
Conforme demonstrado acima, a quantidade de vermelho presente nas

amostras negativas (rosa) e positivas (amarelas) é praticamente igual, portanto, não
é uma informação que precisa ser lida pelo sensor. A roda de cores nos dá uma
perspectiva espacial do arranjo de cores e da distância existente entre o rosa e o
amarelo. Saber disso é importante para a implementação do firmware de detecção
colorimétrica. A quantidade de verde e azul são os únicos que apresentam uma
variação significativa. Apesar de a cor azul ser a que mais varia, suas informações
por si só não seriam suficientes para garantir a estabilidade e qualidade da leitura. O
uso de azul e verde no processo de interpretação de cores do instrumento garante
que o possível ruído de leitura, como a influência da luz externa, seja minimizado.
Este sistema de detecção de cores de instrumento POC lê apenas a frequência verde
e azul das amostras. A interpretação da cor ocorre apenas no final do processo de
amplificação RT-LAMP, após as amostras serem resfriadas.
68
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. APOLLO
O primeiro equipamento (codinome Apollo) diz respeito a sua construção e
avaliação da tecnologia no LaCTAS. Esse equipamento foi desenvolvido visando-se
alcançar o TRL 4.
4.1.1. CARCAÇA DO APOLLO (HOUSING)

A carcaça do instrumento (Figura 54) foi projetada para ser de fácil utilização
e comportar todas as peças descritas anteriormente. A placa mãe está disposta na
parte traseira do instrumento, facilitando a conexão dos demais periféricos e a parte
frontal do bloco de aquecimento e detecção RT-LAMP com as ventoinhas
posicionadas logo abaixo.
Figura 54 - Caixa do instrumento que contém a placa principal da eletrônica, o bloco de aquecimento/detecção
da LAMP, o aquecedor da tampa, os ventiladores e o display OLED. (a) Tampa fechada durante os testes (b)
Tampa aberta para inserir/remover os microtubos.
Há aberturas em diversos pontos do housing e uma estrutura elevada para

permitir o fluxo de ar adequado no processo de resfriamento dos ventiladores e evitar
o superaquecimento dos componentes eletrônicos. A parte superior do instrumento
que contém o display OLED, um LED indicativo e o botão de controle foi projetada
com um ângulo de 30º para melhor experiência do usuário. Além disso, na parte
superior, há uma tampa com uma espessa camada plástica de material impresso para
evitar que o usuário se queime com a alta temperatura. A tampa também possui dois
pares de ímãs de neodímio para prendê-la quando fechada com firmeza.
69
4.1.2. SISTEMA ELETRÔNICO DO APOLLO
Existem 6 placas eletrônicas no projeto, como pode ser visto na Figura 55:
Placa Mãe (a), Placa de Sensores de Cor (b). Placa do Display (c), Placa de LEDs
(d), e duas placas de aquecimento, superior (f) e inferior (h), que são elementos
resistivos. As duas placas de aquecimento têm placas de alumínio (superior – e;
inferior – g) que são associadas a elas para melhor distribuição e aproveitamento do
calor gerado no aquecimento.
Figura 55 - Placas que compõe a parte eletrônica do equipamento Apollo. a) Placa mãe do aparelho. b) Placa
contendo uma matriz com 8 sensores de cor TCS3200. c) Placa com o Display OLED, com um botão e um LED
verde. d) Placa contendo 8 LEDs. e) Alumínio da tampa. f) Placa de aquecimento superior com o sensor de
temperatura LM35 para aquecimento da tampa. g) Alumínio inferior, para aquecimento das amostras e suporte
das placas de condução da luz de detecção. h) Placa de aquecimento inferior
Fonte: Autoria própria.
Na placa do display também adicionou-se um LED branco, que indica o estado

atual do aparelho, e um botão para controle das etapas de funcionamento do
dispositivo como pode ser visto na Figura 55 c.
A Placa de LEDs (Figura 56) contém 8 LEDs brancos para emissão de luz nos
microtubos, o que habilita o processo de detecção colorimétrica. O LED ilumina o tubo
com uma luza branca transversalmente e a luz absorvida na solução (rosa (-), amarela
(+) ou laranja (Indeterminada)) é transmitida e capturada no sensor de cor.
Figura 56 - Placa de LEDs
Fonte: Autoria Própria (2021)
70
A Placa de Sensores de Cor (Figura 57) contém 8 sensores de cor
responsáveis pela leitura das cores nos microtubos, permitindo o processo de
detecção colorimétrica. O arranjo das duas placas é explicado na seção Housing
deste documento.
Figura 57 - Placa de Sensores de Cor
O sensor de cor utilizado no equipamento Apollo é o sensor TCS3200 (Figura

27).
O posicionamento de todos os componentes dentro do equipamento Apollo
pode ser visto na Figura 58.
Figura 58 - Posicionamento dos componentes internos do projeto Apollo.
Com a eletrônica posicionada no equipamento e funcional, é possível seguir

para a programação, calibração e teste do firmware do equipamento. A alimentação
é feita através de uma fonte externa de 12 V, 5A.
71
4.1.3. FIRMWARE DO APOLLO
O firmware é responsável por toda a lógica de funcionamento do equipamento.
O Arduino Nano recebe todas as informações do que acontece no equipamento
através dos sensores, e o firmware interpreta e executa ações baseado nessas
informações. O código é escrito na linguagem do Arduino, que é C++ com algumas
modificações.
No início do programa são declaradas as bibliotecas utilizadas, sendo a
biblioteca PID_v1 para o controle PID e as bibliotecas Adafruit_GFX e
Adafruit_SSD1306 para o funcionamento do display. Essas bibliotecas estão
disponíveis gratuitamente pelo programa de edição de códigos do Arduino e no site
do Arduino. Também são declarados os pinos do Arduino Nano a serem utilizados
(Tabela 1), seus estados iniciais (ligado/desligado) e as variáveis que irão armazenar
os dados e informações processadas pelo firmware. As imagens que aparecem no
display também são declaradas no início do programa.
Tabela 1 - Portas do Arduino Nano utilizadas no equipamento Apollo
Pino Função Pino Função
D2 Mux C D11 Mux B
D3 Ventoinha D12 TCS3200 S2
D4 Mux Enable D13 TCS3200 S3
D5 Aquecimento Inferior A0 Leitura do TCS3200
D6 Aquecimento Superior A1 Aciona placa de LEDs
D7 Botão A3 Sensor de Temp. Superior
D8 Buzzer A6 -
D9 LED face A7 Sensor de Temp. Inferior
A lógica do firmware do projeto funciona conforme apresentado na Figura 59,

sempre estando em alguns dos estados apresentados.
72
Figura 59 - Estados de funcionamento do termociclador Apollo, implementados no software do sistema
embarcado.
Inserção das
amostras pelo usuário
uecimento das
ela de esultados
amostras
Detecção
esfriamento
colorimétrica
Fonte – Autoria Própria
O firmware faz constantemente a leitura do estado do botão, que pode ser

utilizado em caso de emergência para interromper o funcionamento do dispositivo no
Estado 3 – Aquecimento das amostras e forçar o seu resfriamento.
4.1.4. IMPLEMENTAÇÃO DO PID

O controle PID foi implementado através da biblioteca PID_v1 no firmware do
Arduino. A implementação deste PID foi essencial para o controle preciso da
temperatura, conforme discutido anteriormente por Oliveira et al. (2021), mostrando
diferentes dispositivos de PCR de baixo custo que utilizam o PID como ferramenta
para se obter o controle preciso da temperatura. A Figura 60 é um exemplo do efeito
de um PID desajustado no controle da temperatura no bloco de aquecimento das
amostras, com o efeito de a temperatura passar do alvo de 65 ºC e não apresentar
estabilidade ao longo do tempo.
73
Figura 60 - Um exemplo do controle PID desajustado do instrumento Apollo no controle da temperatura,
tentando manter a temperatura do bloco das amostras na temperatura de setpoint durante uma janela de tempo
de 10 minutos.
A Figura 61 mostra um exemplo de um ciclo de 30 minutos (controle inferior a

65 ºC e superior a 105 ºC) com o controle PID propriamente ajustado. Este gráfico é
muito semelhante aos observados em instrumentos comerciais, como pode ser visto
na pesquisa desenvolvida por Span et al., 2019.
Figura 61 - Um exemplo do controle PID do instrumento Apollo no controle da temperatura, mantendo os

aquecedores superior e inferior nas temperaturas de setpoint durante uma janela de tempo de 30 minutos. O
aquecimento superior tem a finalidade de evitar a condensação do líquido nas paredes do tubo.
Fonte: Stracke (2021)
74
Os parâmetros PID foram escolhidos com base na resposta do sistema via
sintonia manual, escolhendo primeiro o parâmetro proporcional, depois o parâmetro
integral e por último o parâmetro derivativo. Esta metodologia é testada e
implementada com sucesso por Oliveira et al., 2021, em um sistema de PCR de baixo
custo que também utiliza PCB como aquecedores. Inicialmente, os parâmetros I e D
são ajustados para 0, e o parâmetro P é escolhido para aproximar a saída do sistema
de um determinado setpoint. Uma vez definido o parâmetro P, o parâmetro I é
ajustado para corrigir qualquer offset que a saída possa ter em relação ao setpoint; e
finalmente, o parâmetro D é ajustado para aumentar a estabilidade geral na saída. Os
valores de PID para o Apollo são P = 15; I = 0,21 e D = 1,00.
A precisão da temperatura no instrumento é de ±0,5 °C. Essa diferença de
acurácia quando comparada com instrumentos comerciais é esperada uma vez que
o sistema eletrônico e a estrutura mecânica apresentadas são mais simples.
4.1.5. AMPLIFICAÇÃO DE AMOSTRAS CLÍNICAS COM O APOLLO

Os ensaios de validação do instrumento para detecção de SARS-CoV-2 foram
implementados conforme descrito anteriormente na seção 3.6. O instrumento pode
realizar oito amostras por ciclo, sendo duas para o controle positivo e negativo e as
outras seis para amostras clínicas. As mesmas condições e reações também foram
realizadas em um termociclador ProFlex PCR System (Applied Biosystems™) para
comparar os resultados (Figura 62).
Figura 62 - Comparação de reações colorimétricas RT-LAMP no protótipo e em um aparelho comercial.
75
Para essas reações RT-LAMP convencionais, a interpretação dos resultados
foi realizada tanto a olho nu quanto pelos sensores do aparelho no Apollo. O indicador
de pH Phenol Red muda a cor da reação de rosa (negativo) para amarelo (positivo).
Para estabelecer uma relação significativa entre esses dois métodos, 66 amostras
clínicas foram analisadas; 29 foram positivos e 37 foram negativos, de acordo com o
método padrão-ouro RT-qPCR (Tabela 2).
Tabela 2 - Resultados do RT-LAMP testando 66 amostras clínicas
Termociclador Equipamento POC

ProFlex Apollo
45,5% (n = 30)
Positivo 43,9% (n = 29)
(1 falso positivo)
Negativo 56,1% (n = 37) 47% (n = 31)
Indeterminado - 7,6% (n = 5)
Total n = 66 n = 66
Conforme mostrado na Tabela 2, o equipamento Apollo reproduziu com

sucesso as condições necessárias para realizar as reações colorimétricas em 30
minutos. Os resultados indicam uma precisão do instrumento de 90,9% quando
comparado ao termociclador. Esses dados também estão de acordo com outros
instrumentos relatados na literatura. Rodriguez-Manzano et al. (2021), por exemplo,
desenvolveram um dispositivo POC portátil capaz de detectar SARS-CoV-2 em
menos de 20 minutos. O sistema, no entanto, requer uma conexão Bluetooth com um
smartphone para leitura dos resultados. Ganguli et al., 2020, desenvolveram um
sistema de detecção portátil para SARS-CoV-2, distinguindo amostras positivas de
amostras negativas após 30 min, mas possui um leitor baseado em smartphone.
Para as reações RT-LAMP convencionais, a interpretação dos resultados foi
realizada a olho nu, no entanto, para o instrumento desenvolvido ocorreu
automaticamente pelo display do instrumento, devido ao software de interpretação de
cores. O indicador de pH Phenol Red muda a cor da reação de rosa (negativo) para
amarelo (positivo), como pode ser observado na Figura 62. Depois que todas as 66
76
amostras clínicas foram testadas, o instrumento atingiu uma sensibilidade de 100%
(capacidade do equipamento de indicar resultado positivo para amostras que são
realmente positivas) e especificidade de 97,3% (capacidade do equipamento de
indicar resultado negativo para amostras que são realmente negativas, o valor abaixo
de 100% indica que o equipamento emitiu resultado falso positivo) quando amostras
indeterminadas são excluídas. Amostras indeterminadas devem ser analisadas por
outras técnicas como RT-qPCR ou repetidas.
4.1.6. DETECÇÃO COLORIMÉTRICA COM O APOLLO

O sensor de cor TCS3200 não lê cores no formato RGB padrão com um
intervalo de 0 a 255 (faixa padrão utilizada para entendimento de cores no RGB,
sendo que cada componente (R, G e B) podem variar, de maneira independente, de
0 a 255), em vez disso, ele faz uma conversão de luz em frequência. Mesmo que o
valor lido não seja RGB, a variação das cores verde e azul ainda ocorre, e um
processo de calibração do instrumento com amostras reais o torna capaz de
interpretar as mudanças de cor. Aproximadamente 60 amostras clínicas processadas
no termociclador comercial Applied Biosystems ProFlex PCR System foram usadas
para calibrar o sistema de detecção colorimétrica. Primeiramente, a frequência da cor
verde (Gf) é lida, seguida pela frequência da cor azul (Bf).
Então, subtraiu-se um do outro (Gf - Bf) e o resultado nos mostra se a amostra
é positiva, negativa ou indeterminada. Os valores de interpretação Gf - Bf do
instrumento obtidos por meio da calibração são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 - Intervalo de valores de interpretação Gf - Bf do sistema de detecção de cores, no qual Gf é a

frequência da cor verde e Bf é a frequência da luz azul lidas pelo sensor TCS3200
Resultado Gf - Bf
Positivo ≤ -20
Negativo ≥ 25
Indeterminado -20 < (Gf – Bf) < 25
Este processo de interpretação da cor por diferença não consegue identificar

a cor em si, o que não é um problema dada a natureza da aplicação do instrumento.
77
4.1.7. CONCLUSÂO PARCIAL DO INSTRUMENTO APOLLO
Com uma sensibilidade de 100%, especificidade de 97,3% e capacidade de
detecção colorimétrica automática dos resultados, um instrumento RT-LAMP de baixo
custo para análise de até 8 amostras foi desenvolvido usando LEDs e sensores
comerciais, caixa de impressão 3D e placa Arduino Nano. O instrumento apresenta
um sistema automático de detecção colorimétrica e temperatura controlada da
amostra e da tampa. Para alterar a temperatura, placas de PCI personalizadas foram
usadas como elementos de aquecimento. Um bloco de alumínio foi projetado para
alinhar os frascos e aumentar a área de contato de aquecimento, e dois pequenos
ventiladores de computador foram usados para resfriar a reação. Um sistema de
controle PID foi implementado para controlar com precisão a temperatura. Um
sistema Mux/Demux, juntamente com uma matriz de oito LEDs e uma matriz de oito
sensores de cores TCS3200, foi usado para reduzir o poder de processamento,
otimizar o uso de recursos e melhorar nossa metodologia de detecção de cores. O
RT-LAMP de baixo custo apresentou resultados semelhantes em relação ao
equipamento comercial, o Applied Biosystems ProFlex PCR System, que é
amplamente utilizado em laboratórios. Apesar de não ter apresentado a mesma
eficiência do equipamento comercial do equipamento proposto não apresentou
nenhum falso negativo. O instrumento RT-LAMP de baixo custo é eficaz, portátil e
fácil de manusear, tornando-o fácil de usar, com o uso de apenas um botão. O
instrumento funciona apenas com uma fonte de alimentação externa e pode até ser
usado em combinação com baterias convencionais. Embora este instrumento tenha
sido projetado para operar com oito amostras, os mesmos princípios aqui aplicados
podem ser usados para executar muitas amostras desejadas. Custando cerca de US$
100, o instrumento RT-LAMP de baixo custo foi testado com sucesso na detecção do
vírus SARS-CoV-2 em um laboratório de prototipagem do IBMP (Instituto de Biologia
Molecular do Paraná) e no laboratório de biologia molecular do LaCTAS no ICC,
sendo comparado com outros equipamentos termocicladores, mostrando sua
estabilidade em ambiente de desenvolvimento (TRL 4), mostrando que mesmo uma
tecnologia simples é uma alternativa viável para diagnóstico em laboratórios com
baixos recursos financeiros. Também mostrou-se que placas de PCI personalizadas
podem ser usadas como elemento de aquecimento em instrumentos termocicladores.
No Apollo ainda existe uma dificuldade relacionada a sua confecção, estando
sujeita a alguns erros no seu processo de manufatura dado a forma que seu projeto
78
foi concebido, no qual: as trilhas são finas demais, descolam da placa na tentativa de
solda de alguns componentes, pouco espaço na trilha para fixação de solda,
possibilidade de queima da própria trilha por consequência de sua largura e a
separação de componentes analógicos e digitais não foi feita da melhor maneira, o
que gera ruídos e o Apollo não contém flexibilidade na sua aplicação.
Além disso, a calibração é feita de tal forma que não vai ser igual de
equipamento para equipamento caso sejam construídos em larga escala, então seu
processo de calibração deve ser mais bem pensado. O valor da iluminação muda
conforme a disposição física dos componentes, o sensor empregado e os LEDs que,
mesmo sendo iguais, diferem em sua iluminação de tal forma que é detectado pelo
sensor de cor.
Devido ao sucesso deste projeto e as possíveis melhorias empregáveis, foi
construído um novo protótipo de maior complexidade que é discutido a seguir.
4.2. CARDINAL
O segundo equipamento (codinome Cardinal) diz respeito a sua construção e
avaliação da tecnologia no LaCTAS. Esse equipamento foi desenvolvido visando-se
melhorias do projeto Apollo e alcançar o TRL 5.
4.2.1. CARCAÇA DO CARDINAL (HOUSING)

A carcaça do instrumento (Figura 63) foi projetada para ser de fácil utilização
e comportar todas as peças descritas anteriormente.
79
Figura 63 – Housing do equipamento Cardinal
Há aberturas em diversos pontos do housing e uma estrutura elevada para

permitir o fluxo de ar adequado no processo de resfriamento dos ventiladores e evitar
o superaquecimento dos componentes eletrônicos. A parte superior do instrumento
que contém o display OLED, um LED indicativo e o botão de controle foi projetada
com um ângulo de 30º para melhor experiência do usuário. Além disso, na parte
superior, há uma tampa com uma espessa camada plástica de material impresso para
evitar que o usuário se queime com a alta temperatura. A tampa também possui dois
pares de ímãs de neodímio para prendê-la quando fechada com firmeza.
4.2.2. SISTEMA ELETRÔNICO DO CARDINAL

Existem 5 placas no Cardinal. Placa mãe, placa de sensores de cor, placa do
display, placa da LEDs e a placas de aquecimento superior. A placa mãe do Cardinal
80
(Figura 64) é a que se diferencia do primeiro equipamento e foi desenhada levando
em conta os principais problemas encontrados na confecção das placas do Apollo.
Figura 64 - Placa mãe do Cardinal
As placas de sensores de cor VEML3328 e a de LEDs (Figura 56) contém os

elementos que permitem a detecção colorimétrica do Cardinal.
Figura 65 - Placa de recepção com os sensores de cor VEM3328 e a placa de emissão com os LEDs brancos.
Contendo 8 LEDs brancos para emissão de luz nos microtubos e 8 sensores

de cor responsáveis pela leitura das cores, o que habilita o processo de detecção
colorimétrica. O LED ilumina o tubo transversalmente e a cor da solução (rosa (-),
81
amarela (+) ou laranja (Indeterminada) acaba sendo emitida e capturada pelo sensor
de cor.
A placa de display (Figura 66) contém um LED indicador vermelho que é ligado
quando o LAMP ocorre, o Display que apresenta todas as telas e funcionalidades ao
usuário e o botão seletor Rotary Encoder para navegar pelos menus do equipamento.
Figura 66 - Placa do display, contendo um LED indicador, display OLED e botão seletor do tipo Rotary Encoder.
O posicionamento de todos os componentes dentro do equipamento Cardinal

pode ser visto na Figura 67.
82
Figura 67 - Posicionamento dos componentes internos do projeto Apollo.
Com a eletrônica posicionada no equipamento e funcional, é possível seguir

para a programação, calibração e teste do firmware do equipamento.
4.2.2.1. MELHORIAS NO DESENVOLVIMENTO DAS PLACAS

Do Apollo, um dos problemas era que as trilhas dos sinais são muito finas, o
que atrapalhava na integridade do sinal, aumentava a chance de erro no processo de
corte da placa (quanto menor a trilha, maior a precisão necessária pela máquina de
corte) e aumenta a chance da trilha se soltar da placa no processo de solda. Esses
problemas aumentam as fontes de erro possíveis na hora de teste do equipamento,
o que dificulta o processo de correção de erros. O aumento da grossura da trilha
também permite maior passagem de corrente, essencial para os dispositivos de
controle de aquecimento/resfriamento.
Para resolver esse problema, a grossura das trilhas foi aumentada em 2,5
vezes. Isso ocasionou o aumento da placa mãe, fazendo com que o housing do
equipamento aumentasse.
83
Outro problema encontrado no Apollo é que ao se soldar componentes
Through Hole (TH) (componentes cujos terminais atravessam a placa) as trilhas eram
forçadas e ocasionalmente se soltavam. Isto foi resolvido com a inserção do que é
conhecido como “Teardrop”, que tem o objetivo de melhorar a integridade estrutural
na presença de tensões térmicas ou mecânicas durante o processo de fabricação, e
com o aumento da área do círculo de cobre por onde são fixados e soldados os
componentes. O Teardrop também aumenta a superfície de contato disponível para
a soldagem de componentes. A Figura 68 mostra a inserção do Teardrop em trilhas
através de um programa para o projeto e a confecção de PCIs (parte das ilustrações
na coloração azulada).
Figura 68 - Exemplo de seleção do Teardrop em um programa de confecção de placas de circuito impresso
Fonte: Adaptado de Altium (2022)38
Outra mudança foi a inserção de planos de terra na placa. Um plano de terra

minimiza problemas de compatibilidade eletromagnética (EMC), no qual o sistema
38Disponível em: < https://www.altium.com/documentation/altium-designer/pcb-dlg-

teardropoptionsformteardrops-ad >
84
pode sofrer interferências eletromagnéticas do ambiente e/ou ser uma fonte de
emissão desses sinais. O plano de terra, na prática, é representado pela malha de
cobre que se apresenta cobrindo grande parte da superfície, dos dois lados da placa,
e está conectado ao GND (Ground/aterramento) de todos os componentes e ao GND
da fonte de alimentação.
Na Figura 69, o plano de terra é representado pela parte em verde que não se
apresenta como trilhas e que cobre toda a superfície da placa e, na Figura 70, o plano
de terra é a parte em azul que não se apresenta como trilhas e também cobre toda a
superfície da placa, ambas são conectadas entre si no projeto.
Figura 69 - Visão da parte inferior da PCI do projeto Cardinal
Figura 70 - Visão da parte superior da PCI do projeto Cardinal
85
A placa mãe contém também um texto com o nome do projeto e a versão da
placa (exemplificado na Figura 70). Isso ajuda no controle de versionamento de um
projeto que trabalha em diferentes frentes. Com isso é possível rastrear quais os
outros componentes do projeto que são usados junto a placa, como por exemplo: A
placa Cardinal rev 5 funciona com os firmwares Cardinal_1.1 e Cardinal_1.2, e pode
ser montada junto ao housing Cardinal_bloco_v2.3.
Com o software DipTrace foi possível gerar um arquivo BOM (Bill of Materials)
interativo que auxilia no processo de soldagem e verificação dos componentes na
placa. BOM é uma lista dos materiais, componentes, ou partes, e a quantidade
necessária de cada um para a criação do produto resultante do processo. A Figura
71 ilustra o uso do BOM interativo.
Figura 71 - BOM interativo da placa mãe do Cardinal
Com o BOM interativo é possível a verificação dos componentes da placa mãe

v5 do Cardinal, no qual os componentes selecionados apresentados na Figura 71 são
os conectores de 2 vias para a fiação presentes na placa.
4.2.3. FIRMWARE DO CARDINAL

O firmware é responsável por toda a lógica de funcionamento do equipamento.
O ESP32 recebe todas as informações do que acontece no equipamento através dos
sensores, e o firmware interpreta e executa ações baseado nessas informações. O
código é escrito na linguagem do Arduino (linguagem Arduino é compatível com
86
muitos sistemas embarcados), que é C++ com algumas modificações. O firmware do
projeto Cardinal está apresentado no Anexo B deste documento.
No início do programa são declaradas as bibliotecas utilizadas, sendo a
biblioteca PID_v1 para o controle PID e as bibliotecas Adafruit_GFX e
Adafruit_SSD1327 para o funcionamento do display. Também são declarados os
pinos do ESP32 a serem utilizados (Tabela 4), seus estados iniciais (ligado/desligado)
e as variáveis que irão armazenar os dados e informações processadas pelo
firmware. As imagens que aparecem no display também são declaradas em arquivos
separados ao do programa principal.
O firmware faz constantemente a leitura do estado do botão, que pode ser
utilizado em caso de emergência para interromper o funcionamento do dispositivo.
Tabela 4 - Portas do ESP32 utilizadas no equipamento Cardinal
Pino Função Pino Função
2 Ventoinha 27 Aquecimento Inferior
13 Detecção Colorimétrica 32 Aquecimento Superior
16 Chaveamento MUX C 33 Ponte H em resfriamento
17 Chaveamento MUX B 34 Sensor de Temp. inferior
18 Chaveamento MUX A 35 Data do Rotary Encoder
19 Ponte H em aquecimento 36 Sensor de Temp. Superior
23 Buzzer 39 Clock do Rotary Encoder
25 Botão - -
A lógica do firmware do projeto funciona conforme apresentado na Figura 72,

sempre estando em alguns dos estados apresentados.
87
Figura 72 - Estados de funcionamento do equipamento Cardinal, implementados no software do sistema
embarcado.
Fonte – Autoria Própria
O firmware do Cardinal foi feito usando a estrutura do firmware do Apollo e com

isso foi possível trabalhar melhor nas correções de desempenho apresentadas pelo
Apollo. O Cardinal também possui processamento 260 vezes mais rápido do que o
do Apollo, o que permite que suas funções sejam executadas em menor tempo pelo
sistema embarcado e que os sinais lidos e interpretados, bem como as respostas
enviadas aos periféricos sejam feitas de maneira mais veloz, o que melhora a
manipulação dos sinais do equipamento, como a calibração e controle de
temperatura.
88
4.2.3.1. TELAS DO EQUIPAMENTO
Dado que o ESP32 tem mais espaço em sua memória que o Arduino (125
vezes a mais) e maior velocidade de processamento (260 vezes mais), é possível
fazer a adição de recursos gráficos. Foram criadas telas para o display do
equipamento Cardinal cujo objetivo é guiar o usuário e facilitar a interação com o
equipamento. As telas foram criadas através de slides elaborados via PowerPoint,
salvas como imagens e posteriormente transformadas em código para sistemas
embarcados através da ferramenta image2cpp39.
O Cardinal também possui a opção de múltipla seleção de opções dentro de
menus, por causa da implementação do botão rotativo de seleção, o que permite
menus com mais complexidade e customização dos que os apresentados no projeto
Apollo.
Na Figura 73 é ilustrada a imagem que aparece no display do equipamento
sempre que ele é iniciado, ou seja, a tela de boas-vindas. As imagens quando
aparecem no display do equipamento aparecem em preto e branco.
Figura 73 - Tela de boas-vindas do equipamento Cardinal
Após o processo de inicialização, o equipamento apresenta o menu inicial,

ilustrado na Figura 74. Neste menu o usuário tem a opção de selecionar ir para o
menu de seleção de ciclos, para o menu de configurações ou para o menu de
informações do projeto.
Figura 74 - Menu inicial do equipamento Cardinal, com possibilidade de seleção do tipo de ciclo a ser executado,
configurações do equipamento e menu de informações.
39 Disponível em: < https://javl.github.io/image2cpp/ >
89
Caso seja selecionado o menu de seleção de ciclos, o usuário é direcionado a
uma tela onde ele pode escolher selecionar entre RT-LAMP e RT-PCR (opção não
implementada, porém o equipamento possui capacidade para ter essa função), ou
voltar para o menu inicial. As telas e as opções são ilustradas na Figura 75.
Figura 75 - Menu de seleção de ciclos do Cardinal, com a opção da escolha de RT-PCR (Não implementado),
RT-LAMP e voltar para o menu principal.
Caso seja escolhida a opção do RT-LAMP, o usuário pode então selecionar o

tempo e a temperatura de operação do equipamento. As telas são apresentadas na
Figura 76.
Figura 76 - Tela de escolha de temperatura e tempo para o RT-LAMP.
Após a seleção do tempo e da temperatura, uma tela instruindo o usuário a

inserir as amostras e apertar o botão aparece no display, como ilustrado na Figura
77.
Figura 77 - Tela instruindo a inserção das amostras e depois apertar o botão para dar prosseguimento
Após isso, o ciclo começa com o aquecimento da tampa até 95 ºC

(Aquecimento necessário para evitar a evaporação da amostra liquida); após a tampa
chegar na temperatura alvo a amostra é aquecida até 65 ºC (essa sequência de tampa
depois amostra acontece pois caso o bloco das amostras se aquecer antes da tampa,
há chances de a amostra evaporar) e o tempo da reação começa a contar. Após o
90
tempo do processo as amostras são resfriadas até 10 ºC. As telas que aparecem
nesse momento podem ser vistas na Figura 78.
Figura 78 – Telas que aparecem durante o LAMP. Começando pelo aquecimento da tampa, seguindo pelo RT-
LAMP e terminando com o resfriamento da amostra.
Por fim é feita a detecção colorimétrica das amostras e é apresentado no

display para o usuário que o equipamento está realizando o processo de detecção e
depois os resultados interpretados, variando entre negativo e positivo, as telas podem
ser vistas na Figura 79.
Figura 79 - Processo de detecção e tela dos resultados
E caso no menu inicial o usuário tenha escolhido a opção do menu de

Configurações (Figura 80), é apresentado a opção de ver os valores lidos pelos
sensores de temperatura e os valores lidos pelos sensores de cor.
Figura 80 - Menu de configurações, onde é possível ver os valores lidos pelos sensores de cor e de temperatura.
Na leitura dos sensores de cor, é possível usar os sensores no modo de leitura

para as cores nas escalas de vermelho, verde e azul de maneira isolada, como
ilustrado na Figura 81.
91
Figura 81 - Menu de cor em configurações, onde é possível ler os valores de cor de maneira individual.
E caso no menu inicial o usuário tenha escolhido a opção do menu de

informações, é apresentado o time responsável pelo projeto, e as instituições
parceiras, como ilustrado na Figura 82.
Figura 82 - Menu com as informações do projeto, informando a equipe que participou do projeto, e as
instituições patrocinadoras.
Em todas as opções o usuário pode voltar ao menu inicial a qualquer momento,

cancelando assim alguma ação.
4.2.4. IMPLEMENTAÇÃO DO PID NO CARDINAL E SEU SISTEMA DE

AQUECIMENTO
O bloco RT-LAMP (Figura 83) é composto por um bloco de alumínio utilizado
para a dissipação de energia em forma de calor, uma ventoinha para o auxílio da
remoção do calor acumulador no bloco de alumínio, um sensor de temperatura e o
bloco no qual são inseridas as oito amostras. No bloco RT-LAMP são conectadas as
placas de emissão e detecção para a detecção colorimétrica e a ponte H para o
controle do fluxo térmico.
92
Figura 83 - Bloco de aquecimento do Cardinal, com o alumínio de posicionamento de amostras, dispositivo
Peltier, Ponte H e ventoinha.
Fonte: Autoria Própria.
O controle PID implementado no Cardinal é uma replicação do mesmo usado

no Apollo, utilizando a mesma biblioteca e metodologia de calibração. A principal
diferença entre os dois equipamentos é a taxa de aquecimento e resfriamento, o que
faz com que o controle para o bloco durante os 30 minutos que se mantem estável a
65 ºC seja o mesmo utilizado.
A precisão da temperatura no instrumento é de ±0,25 °C. A diferença em
relação ao Apollo é menor, pois o Peltier consegue responder mais rápido aos
comandos para variar sua temperatura em comparação com o aquecimento via
resistor.
A melhoria de maior impacto no projeto está na taxa de resfriamento. O Apollo
leva cerca de 5 minutos para levar o valor da temperatura de 65 para 25 ºC, e o
Cardinal leva 1 minuto para ir de 65 até 10 ºC. Isso significa que o Cardinal teve um
ganho no seu Rise Time no resfriamento de 5 vezes, ou 400%. No capítulo 4.2.5 é
apresentado o impacto resultante desta diferença.
4.2.5. AMPLIFICAÇÃO
Os ensaios de validação do instrumento para detecção de SARS-CoV-2 foram
implementados conforme descrito anteriormente. O instrumento pode realizar oito
amostras por ciclo, sendo duas para o controle positivo e negativo e as outras seis
para amostras clínicas. As mesmas condições e reações também foram realizadas
em um termociclador ProFlex PCR System (Applied Biosystems™) para comparar os
resultados. Para essas reações RT-LAMP convencionais, a interpretação dos
resultados foi realizada tanto a olho nu quanto pelos sensores do equipamento. O
93
indicador de pH Phenol Red muda a cor da reação de rosa (negativo) para amarelo
(positivo). Para estabelecer uma relação significativa entre esses dois métodos, 22
amostras clínicas foram analisadas; 11 foram positivas e 11 foram negativas, de
acordo com o método padrão-ouro RT-qPCR. Uma comparação dos resultados do
Cardinal com um termociclador comercial pode ser observado na Figura 84.
Figura 84 - Comparação de reações colorimétricas RT-LAMP no Cardinal e em um aparelho comercial.
Depois que todas as 22 amostras clínicas foram testadas, o instrumento atingiu

uma sensibilidade de 100% e especificidade de 95,5% quando amostras
indeterminadas são excluídas. Essas amostras devem ser analisadas por outras
técnicas como RT-qPCR ou repetidas.
Tabela 5 - Resultados do RT-LAMP testando 2 amostras clínicas no Cardinal
Termociclador Equipamento POC

ProFlex Cardinal
Positivo 50% (n = 11) 45,5% (n = 10)
Negativo 50% (n = 11) 50% (n = 11)
Indeterminado - 4,5% (n = 1)
Total n = 22 n = 22
Conforme mostrado na Tabela 5, o equipamento Cardinal reproduziu com

sucesso as condições necessárias para realizar as reações colorimétricas em 30
94
minutos. Os resultados indicam uma acurácia do instrumento de 95,5% quando
comparado ao termociclador comercial.

O que muda na detecção colorimétrica utilizada no Cardinal são os sensores
de cor. A lógica utilizada para leitura e para posicionamento dos componentes é a
mesma apresentada no Apollo, em 4.1.5 Os valores lidos pelos sensores de cor do
Cardinal são diferentes, logo sua tabela de interpretação de cor é diferente da do
Apollo. Os limites de detecção do Cardinal são apresentados na Tabela 6.
Tabela 6 - Intervalo de valores de interpretação Gf - Bf do sistema de detecção de cores, no qual Gf é a

frequência da cor verde e Bf é a frequência da luz azul lidas pelo sensor VEML3328
Resultado Gf - Bf
Positivo >= 400
Negativo < 300
Indeterminado 300 < (Gf – Bf) < 400
Para as reações RT-LAMP convencionais, a interpretação dos resultados foi

realizada a olho nu, no entanto, para o instrumento desenvolvido ocorreu
automaticamente pelo display do instrumento, devido ao software de interpretação de
cores.
4.2.7. CONCLUSÃO PARCIAL DO CARDINAL

Com uma sensibilidade de 100%, especificidade de 95,5% e capacidade de
detecção colorimétrica automática dos resultados, um instrumento RT-LAMP de baixo
custo para análise de até 8 amostras foi desenvolvido usando LEDs e sensores
comerciais, caixa de impressão 3D e placa ESP32. O instrumento apresenta um
sistema automático de detecção colorimétrica e temperatura controlada da amostra e
da tampa. Para alterar a temperatura da tampa, uma placa de PCI personalizada foi
usada como elemento de aquecimento e para aquecer e resfriar a amostra duas
pastilhas termoelétricas foram utilizadas. Um bloco de alumínio foi projetado para
alinhar os frascos e aumentar a área de contato de aquecimento, um outro bloco de
alumínio foi utilizado para dissipação de calor das pastilhas termoelétricas e uma
ventoinha de computador foi usada para resfriar o bloco de dissipação. Um sistema
95
de controle PID foi implementado para controlar com precisão a temperatura. Um
sistema Mux/Demux, juntamente com uma matriz de oito LEDs e uma matriz de oito
sensores de cores VEML3328, foi usado para reduzir o poder de processamento,
otimizar o uso de recursos e melhorar nossa metodologia de detecção de cores. O
RT-LAMP de baixo custo apresentou resultados semelhantes em relação ao
equipamento comercial, o Applied Biosystems ProFlex PCR System, que é
amplamente utilizado em laboratórios. Apesar de não ter apresentado a mesma
eficiência do equipamento comercial nosso equipamento não apresentou nenhum
falso negativo. O instrumento RT-LAMP de baixo custo é eficaz, portátil e fácil de
manusear, tornando-o fácil de usar, com o uso de apenas um botão. O instrumento
contém fonte de alimentação interna. Embora este instrumento tenha sido projetado
para operar com oito amostras, os mesmos princípios aqui aplicados podem ser
usados para executar muitas amostras desejadas. Custando cerca de US$ 150, o
instrumento RT-LAMP de baixo custo foi testado com sucesso na detecção do vírus
SARS-CoV-2 em no laboratório de biologia molecular do LaCTAS no ICC, sendo
comparado com outros equipamentos termocicladores, mostrando sua estabilidade
em ambiente relevante contendo melhorias em comparação com o equipamento
anterior (TRL 5), e que a tecnologia é uma alternativa viável para diagnóstico em
laboratórios com baixos recursos financeiros.
96
5. CONCLUSÃO
Foram construídos dois equipamentos do tipo POC para RT-LAMP (Figura 85)
usando o SARS-CoV-2 como exemplo de demonstração de suas funcionalidades.
Ambos os equipamentos foram capazes de amplificar e detectar amostras negativas
e positivas.
Figura 85 – Equipamentos do tipo POC RT-LAMP Cardinal e Apollo lado a lado
Os equipamentos custam em U$ 100 (Apollo) e U$ 150 (Cardinal) para serem

produzidos, fazendo assim com que sejam equipamentos de baixo custo em
comparação com equipamentos comerciais. Além disso, é possível facilmente
transportar os equipamentos e eles ocupam pouco espaço, fazendo com que sejam
ideais para serem utilizados como dispositivos POC.
O Cardinal, sendo uma melhoria do Apollo, ainda pode ser aprimorado com a
adição de funcionalidades para o uso das pastilhas termoelétricas (como RT-PCR e
outras aplicações termo sensíveis) e pode ter sua detecção calibrada para detectar
outros indicadores colorimétricos (como o Azul de hidroxinaftol, que varia entre violeta
e azul). Também é possível utilizar o equipamento para pré-amplificação a ser
utilizado em conjunto com testes de fluxo lateral.
Se alinhando com o objetivo principal deste trabalho, o Apollo se encontra em
TRL4, pois seus componentes, subsistemas e processos integrados foram validados
em um ambiente de laboratório (tanto o laboratório de prototipagem do IBMP quanto
97
o LaCTAS). E foi feito um estudo dos seus resultados para entender como diferenciam
dos objetivos esperados do sistema, visando o aprimoramento em um outro
equipamento.
Também se alinhando com o objetivo final deste trabalho, o Cardinal se
encontra em TRL5 e seu projeto é uma melhorai direta do projeto do Apollo e também
foi validado em diferentes ambientes. E demonstrando um aprimoramento em relação
ao Apollo em seus parâmetros de desempenho, como taxas de aquecimento e
resfriamento, amadurecimento do sistema eletrônico e otimização do seu firmware.
O Cardinal tem alta capacidade resfriamento e de atingir temperaturas
próximas a 0 ºC, o que melhora a coloração final das amostras amplificadas através
do LAMP e facilitam o processo de detecção colorimétrica, além de que permite ciclos
rápidos o que possibilita a implementação de amplificação usando PCR. O Apollo leva
até 5 minutos para ir de 65 ºC para 30 ºC e não fica menor que a temperatura
ambiente, enquanto o cardinal demora até 30 segundos para ir de 65 ºC até 10 ºC e
consegue segurar a temperatura em 0 ºC por tempo indeterminado, sendo esses
parâmetros os maiores indicativos da melhora no projeto dos equipamentos LAMP.
Os sensores de cor utilizados funcionam como esperado. O Cardinal se
beneficia em relação ao Apollo por conter sensores de cor mais modernos e que ainda
estão em produção, uma vez que o TCS3200 não está mais em produção e
impossibilita um projeto de um produto em larga escala. Sendo que em termos de
funcionalidade, ambos os sensores cumprem com o esperado e indicam que o sensor
de cor a ser escolhido para qualquer um dos equipamentos vai ser suficiente para a
aplicação (desde que tenham capacidade de ler as cores esperadas para prover a
detecção, sejam do tamanho esperado para as placas e que possam ser calibrados
via software), o que cumpre um dos objetivos deste trabalho que é o entendimento do
uso de sensores de cor para detecção de resultados de amplificações com resultados
colorimétricos.
O Cardinal também possui também um display maior que o do Apollo, cabos
mais bem manufaturados, melhor integridade dos sinais e de entrega de energia aos
dispositivos de aquecimento/resfriamento e um botão rotativo que permite a seleção
de opções em menus e a personalização de tempos, temperaturas e ciclos. O Apollo
se utiliza do Arduino Nano, sendo o sistema embarcado mais comum para hobbies e,
neste caso, o microcontrolador foi suficiente para cumprir com os requerimentos do
projeto. O Cardinal com o ESP32 consegue suprir com os maiores problemas do
98
Apollo, pela sua maior capacidade de memória, processamento e funcionalidades,
cumprindo com um dos objetivos deste trabalho que seria a melhora da escolha dos
sistemas embarcados se alinhando com cada equipamento.
Por possuir maior capacidade de armazenamento (125 vezes a mais) e um
botão rotativo de seleção, o Cardinal possibilita que no futuro sejam implementadas
mais funções para o equipamento sem que sejam feitas alterações na eletrônica e na
mecânica de sua construção, como por exemplo a implementação de RT-PCR e a
adição de conectividade com outros dispositivos e plataformas na internet, por possuir
Wi-Fi e Bluetooth, mostrando assim potencial de conectividade do equipamento.
O Apollo passou por mais testes que o Cardinal, o que faz com que o
aprendizado do projeto seja transferido de um equipamento para o outro. Além disso
o Cardinal ainda pode passar por diferentes baterias de testes para rastreio de
problemas que possam ser corrigidos via software. Porém sua concepção enquanto
projeto está no estágio final o que significa que as melhorias e testes a serem
executados ainda compreendem o mesmo equipamento, sem grandes alterações em
sua estrutura e/ou projeto, o que possibilita sua consolidação no TRL5 e
posteriormente o seu avanço para o próximo nível de maturidade tecnológica.
Por fim, o equipamento aprimorado permite que sejam feitos testes em campo
e que seus resultados sejam documentados com a finalidade de melhoria de seu
desempenho com pequenas correções e com uma documentação limitada do
equipamento, como relatórios de desempenho, manuais técnicos, de serviço e de
usuário e sua transformação em um sistema de alta fidelidade que o leva para o nível
de maturidade TRL6 e o prepara para os próximos níveis de regulamentação,
produção e comercialização.
Como sugestão para trabalhos futuros, é essencial entender as necessidades do
usuário final em relação ao Cardinal. O feedback de profissionais que utilizarão o
equipamento é crucial para desenvolver algo que atenda às condições reais de uso.
Além disso, tanto o Cardinal quanto o Apollo enfrentam problemas relacionados à
calibração de cor e temperatura. Embora esses valores possam funcionar bem em
um equipamento específico, não garantem que um novo dispositivo possa operar com
os mesmos valores. É necessário aprimorar essa parte do produto para garantir sua
escalabilidade. Por último, seria interessante adicionar conectividade com um servidor
em nuvem para a troca de informações em tempo real. Como o ESP32 já possui
99
conectividade habilitada, essa adição poderia melhorar significativamente a
experiência do usuário.
100
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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https://doi.org/10.1109/IMCCC.2016.89
105
ANEXO A – ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO NA REVISTA BIOMEDICAL
MICRODEVICES
106
ANEXO B – FIRMWARE DO PROJETO CARDINAL
/*Firmware elaborado por Bruno Dias Camargo para o termociclador Cardinal.

Trabalho para o programa de pós-graduação em biociência e biotecnologia do Instituto Carlos Chagas – FIOCRUZ Paraná. */
//Bibliotecas
#include "PID_v1.h" //Controlador PID
#include "Adafruit_SSD1327.h" //Display OLED 128x128
#include "AiEsp32RotaryEncoder.h" //Rotary Encoder
#include "VEML3328.h" //Sensor de cor
//Telas
#include "ccardinal.h" //Inicial
#include "cmenu1.h" //Menu com opção Ciclos
#include "cmenu2.h" //Menu com opção Configuração
#include "cmenu3.h" //Menu com opção Info
#include "ccycle1.h" //Ciclo RT-PCR
#include "ccycle2.h" //Ciclo RT-LAMP
#include "ccycle3.h" //Voltar ao menu inicial
#include "cLAMPT.h" //Escolha da temperatura do LAMP
#include "cLAMPtime.h" //Escolha do tempo do LAMP
#include "csettings1.h" //Settings para temperatura
#include "csettings2.h" //Settings para cor
#include "csettings3.h" //Voltar ao menu inicial
#include "cteam.h" //Integrantes do time
#include "csponsors.h" //Apoiadores do projeto
#include "cinsert.h" //Insira as amotras
#include "clid.h" //Tampa aquecendo
#include "ccool.h" //Esfriando
#include "cdetection.h" //Em processo de detecção
#include "cresult.h" //Tela de resultados
#include "cabout.h" //Sobre o projeto
#include "clampProcess.h" //Ciclo LAMP
#include "ccolor1.h" //Escolha da leitura da cor vermelha
#include "ccolor2.h" //Escolha da leitura da cor verde
#include "ccolor3.h" //Escolha da leitura da cor azul
#include "ccolor4.h" //Voltar ao menu inicial
#include "ctempconfig.h" //Leitura dos sensores de temperatura
//Pinos
#define FAN 2 //Ventoinha
#define COM 13 //Porta comum para o processo de detecção
#define CC0 16 //Chaveamento do MUX C
#define BB0 17 //Chaveamento do MUX B
#define AA0 18 //Chaveamento do MUX A
#define LF 19 //Controle da Ponte H para aquecimento
#define BUZZER 23 //Alarme sonoro
#define SW 25 //Switch - botão
#define HB 27 //Heat Bottom - Aquecimento Inferior
#define HT 32 //Heat Top - Aquecimento Superior
#define FANH 33 //Controle da Ponte H para resfriamento
#define LM35BOT 34 //Sensor de temperatura Inferior
#define DT 35 //Data para o Rotary Encoder
#define LM35TOP 36 //Sensor de temperatura Superior
#define CLK 39 //Clock para o Rotary Encoder
//Criando os PIDs - Explicação da função em https://playground.arduino.cc/Code/PIDLibraryConstructor/

double Setpoint, Input, Output, Setpoint2, Input2, Output2; // Variáveis a serem utilizadas no PID 1 - HB e PID 2 - HT
PID myPID(&Input, &Output, &Setpoint, 15, 0.4, 1.00, P_ON_M, DIRECT);
PID myPID2(&Input2, &Output2, &Setpoint2, 12.5, 0.30, 1.00, P_ON_M, DIRECT);
AiEsp32RotaryEncoder rotaryEncoder = AiEsp32RotaryEncoder(DT, CLK, SW, -1, 2); //Inicializando a biblioteca do ESP32
para giro do botão
Adafruit_SSD1327 display(128, 128, &Wire, -1, 1000000); //Inicialização do OLED Display
// Configuração do PWM
const int freq = 5000;
const byte ChannelB = 5, ChannelT = 4, resolution = 8; //Usando os canais 4 e 5 com até 8 bits na resolução (0-255)
// Declaração das váriaveis

bool buttonState, lastButtonState = 1; //Estado atual do botão e anterior do botão
bool x = 0; //Variavel de controle do RotaryEncoder
byte setTemperature = 65, setTime = 30; //Definição do tempo e temperatura do LAMP em graus minutos e graus Celsius
107
byte deviceState = 0, count = 0; //Contador para estado em que o dispositivo se encontra e para o Rotary Encoder
const byte lidTemperature = 90; //Definição da temperatura da tampa.
long accumulator = 0; //Usado como contador de tempo
float sensorG[8] = { 0 }; //Variaveis que armazenam informação de cor Verde
float sensorB[8] = { 0 }; //Variaveis que armazenam informação de cor Azul
float sensor[8] = { 0 }; //Variaveis que armazenam informação de cor Resultante
unsigned long previousMillis = 0; //Usado para contar o tempo
float botTemperature, topTemperature; //Temperatura da placa de aquecimento inferior e superior, adquiridas via sensor
//Inicializando o Rotary Encoder como interrupção

void IRAM_ATTR readEncoderISR() {
rotaryEncoder.readEncoder_ISR();
}
VEML3328 RGBCIR; //Inicializando o Sensor de Cor
void setup() {
//Modos dos pinos

pinMode(FANH, OUTPUT);
pinMode(FAN, OUTPUT);
pinMode(BUZZER, OUTPUT);
pinMode(LF, OUTPUT);
pinMode(AA0, OUTPUT);
pinMode(BB0, OUTPUT);
pinMode(CC0, OUTPUT);
pinMode(COM, OUTPUT);
pinMode(SW, INPUT_PULLUP);
pinMode(CLK, INPUT);
pinMode(DT, INPUT);
//Inicializando os pinos em nivel lógico baixo

digitalWrite(FANH, LOW);
digitalWrite(FAN, LOW);
digitalWrite(BUZZER, LOW);
digitalWrite(LF, LOW);
digitalWrite(AA0, LOW);
digitalWrite(BB0, LOW);
digitalWrite(CC0, LOW);
digitalWrite(COM, LOW);
digitalWrite(HT, LOW);
//Configurando o PID das amostras

Input = botTemperature;
Setpoint = setTemperature;
myPID.SetOutputLimits(0, 212);
myPID.SetMode(AUTOMATIC);
//Iniciando o PID da tampa

Input2 = topTemperature;
Setpoint2 = lidTemperature;
myPID2.SetOutputLimits(0, 100);
myPID2.SetMode(AUTOMATIC);
//Configurando o PWM do aquecimento inferior e do superior

ledcSetup(ChannelB, freq, resolution);
ledcAttachPin(HB, ChannelB);
ledcWrite(ChannelB, 0);
ledcSetup(ChannelT, freq, resolution);

ledcAttachPin(HT, ChannelT);
ledcWrite(ChannelT, 0);
//Iniciando o Rotary Encoder

rotaryEncoder.begin();
rotaryEncoder.setup(readEncoderISR);
//Iniciando o Display OLED

Serial.begin(9600);
if (!display.begin(0x3D)) {
while (1) yield();
}
display.setTextColor(SSD1327_WHITE);
display.clearDisplay();
}
108
void loop() {
buttonState = digitalRead(SW); //Leitura do estado do botão
switch (deviceState) {
case 0: //Welcome
//Display
display.drawBitmap(0, 0, ccardinal, 128, 128, SSD1327_WHITE);
display.display();
//Buzzer
digitalWrite(BUZZER, HIGH);
delay(500);
delay(500);
delay(100);
delay(100);
delay(100);
delay(700);
//Botão
deviceState = 1;
break;
case 1: //Menu
//Rotary
if (x == 0) {
x = 1;
setRotary(2);
}
count = rotaryEncoder.readEncoder();
//Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, cmenu1, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else if (count == 1) {
} else {
}
display.display();
//Ventoinha
digitalWrite(FANH, LOW);
digitalWrite(FAN, LOW);
//Botão
if (buttonState == LOW && buttonState != lastButtonState) {
if (count == 0) {
deviceState = 10;
deviceState = 2;
deviceState = 3;
}
x = 0;
delay(25);
}
lastButtonState = buttonState;
break;
case 10: //Escolha do ciclo

//Rotary
if (x == 0) {
x = 1;
setRotary(2);
}
109
//Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, ccycle1, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
}
display.display();
//Botão
if (count == 0) {
deviceState = 10;
deviceState = 11;
deviceState = 1;
}
count = 0;
x = 0;
delay(25);
}
break;
case 11: //RTLAMP Tempo e temperatura

//Leitura do Rotary Encoder
if (count == 0) {
if (x == 0) {
rotaryEncoder.setBoundaries(55, 75, false);
rotaryEncoder.setEncoderValue(65);
x = 1;
}
setTemperature = rotaryEncoder.readEncoder();
} else {
if (x == 0) {
rotaryEncoder.setBoundaries(5, 90, false);
rotaryEncoder.setEncoderValue(30);
x = 1;
}
setTime = rotaryEncoder.readEncoder();
}
//Display
display.setTextSize(2);
display.setCursor(50, 62);
display.print(setTemperature);
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, cLAMPT, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
display.print(setTime);
display.drawBitmap(0, 0, cLAMPtime, 128, 128, SSD1327_WHITE);
}
display.display();
//Botão
if (count == 0) {
x = 0;
count = 1;
} else {
Setpoint = setTemperature;
myPID.SetOutputLimits(0, 212);
myPID.SetMode(AUTOMATIC);
count = 0;
x = 0;
deviceState = 12;
110
digitalWrite(COM, HIGH);
sensor[0] = lerSensorCor(1);
digitalWrite(AA0, HIGH);
digitalWrite(BB0, HIGH);
digitalWrite(CC0, HIGH);
delay(250);
}
delay(25);
}
break;
case 12: //Insira as amostras e tampa aquecendo

//Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, cinsert, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
display.print(topTemperature);
display.drawBitmap(0, 0, clid, 128, 128, SSD1327_WHITE);
}
display.display();
//Aquecimento Superior
readTopTemperature();
if (count == 0) {
ledcWrite(ChannelT, 0);
} else {
myPID2.Compute();
ledcWrite(ChannelT, Output2);
111
}
if (topTemperature >= lidTemperature - 10) {

delay(250);
deviceState = 13;
}
//Botão
if (count == 0) {
count = 1;
} else if (buttonState != lastButtonState) {
count = 0;
x = 0;
deviceState = 14;
}
delay(25);
}
break;
case 13: //Ciclo RTLAMP

//Tempo
if (botTemperature > setTemperature - 2) {
conteTempo();
} else {
accumulator = 0;
}
//Display
if ((setTime - 1 - (accumulator / 60)) < 10) {

display.print("0");
display.print(setTime - 1 - (accumulator / 60));
display.print(":");
} else {
display.print(setTime - 1 - (accumulator / 60));
display.print(":");
}
if (accumulator % 60 > 49) {

display.print("0");
display.print(59 - accumulator % 60);
} else {
display.print(59 - accumulator % 60);
}
display.print(botTemperature);
display.drawBitmap(0, 0, clampProcess, 128, 128, SSD1327_WHITE);

display.display();
digitalWrite(LF, HIGH); //LedFace
digitalWrite(FAN, HIGH); //Ventoinha
//Aquecimento Inferior
readBotTemperature();
112
myPID.Compute();
ledcWrite(ChannelB, Output);
if (accumulator >= 60 * setTime) {

accumulator = 0;
delay(250);
deviceState = 14;
}
//Aquecimento Superior
myPID2.Compute();
ledcWrite(ChannelT, Output2);
//Botão
count = 0;
x = 0;
deviceState = 14;
delay(250);
}
break;
case 14: //Resfriamento

//Display
display.drawBitmap(0, 0, ccool, 128, 128, SSD1327_WHITE);
display.display();
//Ventoinha
digitalWrite(FANH, HIGH);
digitalWrite(FAN, HIGH);
digitalWrite(LF, LOW); //LedFace
ledcWrite(ChannelB, 212); //Aquecimento Inferior
ledcWrite(ChannelT, 0); //Aquecimento Superior
//Botão
if (botTemperature <= 10) {
delay(750);
count = 0;
x = 0;
deviceState = 15;
}
break;
case 15: //Detecção e resultado LAMP

//Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, cdetection, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
if (sensor[0] > sensorG[0] + 80) {
display.print("Positivo");
} else if (sensor[0] > sensorG[0] + 55) {
display.print("Incerto");
} else {
113
display.print("Negativo");
}
} else {
}
} else {
}
} else {
}
} else {
}
} else {
}
} else {
}
} else {
}
display.drawBitmap(0, 0, cresult, 128, 128, SSD1327_WHITE);

}
display.display();
//Ventoinha
digitalWrite(FANH, HIGH);
digitalWrite(FAN, HIGH);
ledcWrite(ChannelB, 0); //Aquecimento Inferior
114
//Leitura dos sensores de cor
if (count == 0) {
sensorG[0] = lerSensorCor(1);
sensorB[0] = lerSensorCor(2);
}
count = 1;
//Botão
if (buttonState == LOW && buttonState != lastButtonState && count == 1) {
count = 0;
x = 0;
deviceState = 1;
delay(250);
}
break;
case 2: //Configuração
//Rotary
if (x == 0) {
x = 1;
setRotary(2);
115
}
//Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, csettings1, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
}
display.display();
//Botão
if (count == 0) {
deviceState = 20;
deviceState = 21;
deviceState = 1;
}
count = 0;
x = 0;
delay(25);
}
break;
case 20: //Configuração Temperatura

//Leitura
//Display
display.drawBitmap(0, 0, ctempconfig, 128, 128, SSD1327_WHITE);
display.display();
//Botão
deviceState = 2;
count = 0;
x = 0;
delay(25);
}
break;
case 21: //Leitura das cores

//Rotary
if (x == 0) {
x = 1;
setRotary(3);
}
//Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, ccolor1, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
}
display.display();
116
//Botão
if (count == 0 || count == 1 || count == 2) {
sensor[0] = lerSensorCor(count);
deviceState = 22;
deviceState = 1;
}
count = 0;
x = 0;
delay(25);
}
break;
case 22: //Mostra dos resultados de cor

//Display
display.print(sensor[0]);
117
display.drawBitmap(0, 0, cresult, 128, 128, SSD1327_WHITE);

display.display();

deviceState = 21;
count = 0;
x = 0;
delay(25);
}
break;
case 3: //Info
//Rotary
if (x == 0) {
x = 1;
setRotary(2);
}
// Display
if (count == 0) {
display.drawBitmap(0, 0, cteam, 128, 128, SSD1327_WHITE);
display.drawBitmap(0, 0, csponsors, 128, 128, SSD1327_WHITE);
} else {
display.drawBitmap(0, 0, cabout, 128, 128, SSD1327_WHITE);
}
display.display();
// Botão
count = 0;
x = 0;
deviceState = 1;
delay(25);
}
break;
}
}
//Leitura do sensor de cor

unsigned int lerSensorCor(int selectCor) {
unsigned int readValue = 0;
Serial.begin(9600);
Wire.begin();
if (!RGBCIR.begin()) { //Checando se o sensor está conectado
return 0;
while (1) {}
}
RGBCIR.Enable(); //Habilita os canais do sensor
RGBCIR.setGain(0.5); //Ganho de amplificação em 4 (0.5,1,2)
RGBCIR.setSensitivity(low_sens); //Seleciona o modo de sensibilidade (low_sens, high_sens)
RGBCIR.setDG(1); //Ganho digital (1,2)
RGBCIR.setIntegrationTime(IT_50MS); //Tempo de integração do sensor ou tempo para fazer uma medida (IT_100MS,
IT_200MS, IT_400MS)
delay(250);
switch (selectCor) {
case 0:
readValue = RGBCIR.getRed(); //Leitura do canal vermelho
break;
case 1:
readValue = RGBCIR.getGreen(); //Leitura do canal verde
break;
case 2:
readValue = RGBCIR.getBlue(); //Leitura do canal azul
break;
118
case 3:
readValue = RGBCIR.getClear(); //Leitura do canal limpo
break;
}
RGBCIR.Disable(); //Desativa o sensor

delay(250);
return readValue;
}
//Leitura da temperatura do bloco inferior

void readBotTemperature() {
for (byte j = 1; j <= 10; j++) {
botTemperature += ((float(analogRead(LM35BOT)) * 3.3 / (4095)) / 0.01) + 5.15;
}
botTemperature /= 10;
}
//Leitura da temperatura da tampa

void readTopTemperature() {
for (byte k = 1; k <= 5; k++) {
topTemperature += ((float(analogRead(LM35TOP)) * 3.3 / (4095)) / 0.01);
}
topTemperature /= 5;
}
//Contagem do tempo, registro a cada 1 segundo

void conteTempo() {
unsigned long currentMillis = millis();
if (currentMillis - previousMillis >= 1000) {
previousMillis = currentMillis;
accumulator++;
}
}
//Configura Rotary Encoder

void setRotary(int rightBoundarie) {
rotaryEncoder.setBoundaries(0, rightBoundarie, true);
rotaryEncoder.setEncoderValue(0)
119

Bruno Dias Camargo Fiopr Mest 2023

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INSTITUTO CARLOS CHAGAS

MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA

BRUNO DIAS CAMARGO

DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO DE BAIXO CUSTO PARA

BRUNO DIAS CAMARGO

DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO DE BAIXO CUSTO PARA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Orientador: Dr. Lucas Blanes

MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA

Autor: Bruno Dias Camargo

Título: DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO DE BAIXO CUSTO PARA

Orientador: Dr. Lucas Blanes (ICC)

Instituição: Instituto Carlos Chagas

Data da aprovação: 14/02/2023

Essencialmente, gostaria de agradecer as pessoas com as quais compartilho

Equipamentos baseados no conceito Point-of-care (POC) (diagnóstico no ponto de

Palavras-chave: SARS-CoV-2; RT-LAMP; Detecção Colorimétrica; Controle PID;

Keywords: SARS-CoV-2; RT-LAMP; Color Detection; PID Control; Point-of-Care.

Figura 1 - Linha do tempo da COVID-19 no Brasil .................................................... 16

Tabela 1 - Portas do Arduino Nano utilizadas no equipamento Apollo

ADC Analog-to-digital converter (Conversor analógico para digital)

1.1. A PANDEMIA DA COVID-19

Figura 1 - Linha do tempo da COVID-19 no Brasil

Fonte: Correio Braziliense1 (2021)

1 Disponível em: < https://tinyurl.com/488dtjja >

1.2. TESTES DIAGNÓSTICO DO TIPO POINT-OF-CARE

1.3. LAMP PARA AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Figura 2 - Ilustração esquemática da técnica LAMP

Fonte: Isothermal Amplification (NEB)2 2022.

2 Disponível em: < https://www.neb-online.de/en/pcr-and-dna-amplification/isothermal-amplification/ >

Fonte: Moehling et al. (2021)

1.4. DISPOSITIVOS LAMP

Figura 4 - Exemplos de equipamentos LAMP

Tempo de duração do teste 30 minutos

Tempo de duração do teste 30 minutos

Tempo de duração do teste 15 – 25 minutos

Tempo de duração do teste 60 minutos

Tempo de duração do teste 30-60 minutos

3 Disponível em: < https://www.medicalexpo.com/prod/k-dod-korea/product-305202-1053174.html >

1.5. CONSTRUÇÃO DE DISPOSITIVOS POC LAMP

1.5.1. CONTROLE DE TEMPERATURA

Fonte: Novus8, 2019

Nesses sistemas, o sensor de temperatura alimenta constantemente o

8 Disponível em: < https://tinyurl.com/ms6b36ur >

1.5.1.1. EFEITO DAS VÁRIAVEIS DO CONTROLE PID

Fonte: Adaptado de TLK Energy9 (2022)

Esse entendimento do comportamento das variáveis auxilia no processo

1.5.1.2. RESPOSTA TRANSITÓRIA DE UM SISTEMA

9 Disponível em: < https://tlk-energy.de/blog-en/practical-pid-tuning-guide >

Fonte: Bayram et al. 2013

Entender esses parâmetros da resposta transitória é essencial para que o

Fonte: Adaptado de Arduino Store10 e Espressif11 (2023)

Arduino é uma plataforma eletrônica de código aberto usada para controlar

10 Disponível em: < https://store.arduino.cc/products/arduino-nano >

Figura 9 – Especificações técnicas do sistema embarcado ESP32

Processador tensa Dual ore 2 bit

ensão de operação 2.2V a . V

1 pinos com conversão D

Fonte: Adaptado de Last Minute Engineers (2023)

A energia ao ESP32 é fornecida ou por sua entrada Micro USB (quando

1.5.2.2. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS DO ARDUINO NANO

Figura 10 – Especificações técnicas do sistema embarcado Arduino Nano

Fonte: Autoria própria