UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
BQI 101 – LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA 1

PRÁTICA 10

SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL
 INTRODUÇÃO

Conceitos:

 Cromatografia – deriva do grego

o Chrom – cor
o Graphe – escrever
Botânico russo Tswett ao lado de
sua "unidade cromatográfica" em
1910
 Amplamente usada na separação de componentes de
uma mistura, segundo propriedades físicas dos seus
componentes. CARBOIDRATOS
ÁMINOÁCIDOS
VITAMINAS
 Usada pela primeira vez por Mikhael S. Tswett (1906) ÁCIDOS GRAXOS
POLÍEROS
o Experimento: componentes coloridos de extratos de
ÁCIDOS
folhas e de gema de ovo. ORGÂNICOS
INTRODUÇÃO

PRINCÍPIO DA TÉCNICA
Diferentes substância – diferentes propriedades – diferentes associações

DUAS FASES PRESENTES

Fase móvel – contém o solvente

Fase estacionária – permanece imóvel

 Durante a corrida cromatográfica, a fase móvel desloca-se pela fase estacionária.

 A mistura (amostra) desloca-se junto com a fase móvel sendo que este deslocamento é de acordo com
sua afinidade pelas fases.

A medida que a fase móvel se desloca, substâncias são separadas na fase estacionária
INTRODUÇÃO
CLASSIFICAÇÃO DOS TIPOS DE CROMATOGRAFIA

 Forma física dos sistemas

• Cromatografia plana
• Cromatografia em coluna

 Propriedades da fase móvel e estacionária

• gasosa CROMATOGRAFIA EM COLUNA

• líquida
• supercrítica

 Princípio de separação
• Sorção e dessorção
• partição
• troca iônica
• exclusão molecular
• afinidade
INTRODUÇÃO
AULA DE HOJE

 Fase estacionária é a água ligada à celulose do papel por ligações de hidrogênio

 A celulose do papel atua apenas como suporte (o papel Whatman nº1 é o mais usado)

 A fase móvel é um solvente puro ou uma mistura de solventes que apresentam polaridade menor que
da água. (solvente misto: n-butanol, água, ácido fórmico; na proporção 100:25:30)

 A cromatografia em papel é um exemplo típico de separação por partição líquido-líquido

Variações da técnica – tipo de papel, polaridade da fase móvel (normal ou reversa), direção do
movimento da fase móvel (ascendente e descendente – mono e bidirecional)
INTRODUÇÃO
 Cromatografia ascendente de fase normal

 Rf – fator de retenção
• Rf =
• Exemplos de cálculo

 mancha correspondente à glicina

 mancha correspondente à leucina

OBJETIVO GERAL

 Entender o processo cromatográfico e por meio de cromatografia em papel, separar e

identificar os componentes de uma mistura contendo aminoácidos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Preparar um sistema adequado para a execução experimental de cromatografia de aminoácidos

 Executar as operações necessárias à cromatografia ascendente

 Revelar o cromatograma usando ninhidrina

 Identificar os aminoácidos no cromatograma pelos seus valores de Rf

 Definir fase móvel, fase estacionária, cromatografias mono e bidirecional e cromatografia ascendente.
MATERIAL

 EQUIPAMENTOS E UTENSÍLIOS  REAGENTES

• Papel Whatman nº1 • Soluções de aminoácidos 0,1 mol/L (prolina, acido

aspártico e isoleucina);
• Cuba cromatográfica com tampa
• Mistura 1 e Mistura 2
• Tubos capilares
• Solvente misto (n-butanol: ácido fórmico: água –
• Pulverizador 100:30:25)

• Estufa (90- 100 ºC) Revelador: solução de ninhidrina 0,1% em acetona

• Lápis

• Régua

• Luvas
CUIDADOS NECESSÁRIOS

 Não tocar o papel diretamente com as mãos

 Presença de aminoácidos na pele que poderão

mascarar o resultado. Usar luvas.

 Não inalar o odor que vem do solvente usado na cuba

de cromatografia.

 Cautela ao abrir a estufa de secagem por causa da alta

temperatura da massa de ar dentro dela.
 MÉTODOS Com luvas:
(c)
(a) (b)

2,0 cm M Asp Ile Pro

(d)

(f) (e)
1 hora
Rf = ? Secagem

Quais são os
aminoácidos
nas amostras1 M Asp Ile Pro M Asp Ile Pro

e2? Ninhidrina
óvel
Fase m
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Quais os valores de Rf calculados para cada mancha (mistura e padrões)?

Quais os aminoácidos encontrados na mistura?

LISTA DE EXERCÍCIOS E RELATÓRIO
Seguir orientações do professor

Caderno didático 119 – página 69