MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

CAMPUS UNIVERSITÁRIO PROFESSORA CINOBELINA ELVAS
COLEGIADO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ROTEIRO PRÁTICA I – LABORATÓRIO VIRTUAL

AMINOÁCIDOS E PEPTÍDEOS

Disciplina: Bioquímica

Professor: Dr. Rafael de Souza Miranda

Período Letivo: 2020.1 Horário: Quarta e quinta-feira entre 10:00 às 12:00 h

Link para acesso à videoaula explicando como acessar e utilizar o laboratório virtual:
https://drive.google.com/file/d/1t_4QVlG99h61BbunOHVE5C_PUlyuZbal/view?usp=sharing

Para traduções de inglês para português use:

https://translate.google.com.br/?hl=pt-BR#view=home&op=translate&sl=en&tl=pt

Link para acesso ao laboratório virtual e a respectiva atividade:

http://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=63&sim=156&cnt=1

Quantificação estimada de aminoácidos por ninhidrina.

I. OBJETIVO
1. Realizar a quantificação de aminoácidos usando a reação com ninhidrina.

II. TEORIA (em inglês Theory)

Tradução do conteúdo da prática disponibilizado no laboratório virtual:
Os aminoácidos são conhecidos como os blocos de construção de todas as proteínas. Existem 20
aminoácidos diferentes comumente encontrados em proteínas. Os aminoácidos são constituídos por um
grupo carboxila e um grupo amino ligado ao mesmo átomo de carbono (o carbono α).
Eles variam em tamanho, estrutura, carga elétrica e solubilidade na água devido à variação nas
cadeias laterais (grupos R). A detecção, quantificação e identificação de aminoácidos em qualquer amostra
constituem etapas importantes no estudo de proteínas. A estrutura geral de um aminoácido é mostrada
abaixo:

Figure 1. Fórmula geral dos aminoácidos.

O desenvolvimento da cor envolvida na reação dos alfa-aminoácidos com a ninidrina é explicada

pelas cinco etapas a seguir.

1. alfa-aminoácido + ninhidrina → ninhidrina reduzida + alfa-aminoácido + H2O

 Esta é uma reação de desaminação oxidativa que extrai dois hidrogênios do alfa-aminoácido para
produzir um alfa-iminoácido. A ninhidrina é reduzida e perde um átomo de oxigênio com isso a formação
da molécula de água.

2. alfa-aminoácido + H2O → alfa-cetoácido + NH3

A rápida hidrólise do grupo NH no alfa-iminoácido causará a formação de um alfa-cetoácido mais
uma molécula de amônia. Este alfa-cetoácido está ainda envolvido na reação de descarboxilação do passo
3.

3. alfa-cetoácido + NH3 → aldeído + CO2

Sob aquecimento se forma um aldeído, o qual possui um átomo de carbono a menos que o aminoácido
original, e uma molécula de dióxido de carbono (CO2) é produzida junto com o aldeído. Essas três primeiras
etapas produzem a ninhidrina reduzida e a amônia necessárias para a produção de cor.
A reação geral para as três reações acima é simplicana na Reação (4):

4. alfa-aminoácido + 2 ninidrina → CO2 + aldeído + complexo final (AZUL) + 3H2O

Em resumo, a ninhidrina, que é originalmente amarela, reage com o aminoácido e fica roxa. É essa
cor roxa que é detectada neste método. A ninhidrina reagirá com um grupo alfa-amino livre, NH2-C-COOH.
Este grupo está presente em todos os aminoácidos, proteínas ou peptídeos. Enquanto a reação de
descarboxilação acontecerá com um aminoácido livre, não ocorrerá em peptídeos e proteínas. Teoricamente,
apenas aminoácidos produzem cor com o reagente ninhidrina. No entanto, deve-se sempre verificar a
possível interferência de peptídeos e proteínas, realizando testes controle (branco), especialmente quando
essas soluções estão prontamente disponíveis. Por exemplo, pode-se simplesmente adicionar o reagente
ninhidrina a uma solução pura de proteínas e verificar se há algum desenvolvimento de cor. Não há desculpa
para não realizar um teste tão vital quando a mistura da amostra contém proteínas e aminoácidos. Há
também relatos de que outros compostos químicos, que não aminoácidos, também respondem positivamente
a essa reação.
A reação da ninhidrina, um dos métodos mais importantes de detecção de aminoácidos, técnica e
historicamente, tem sido convencionalmente usada para detectar suas quantidades de microgramas. Quando
aminoácidos com um grupo alfa-amino livre são tratados com um excesso de ninhidrina, eles produzem um
produto de cor púrpura. Sob condições apropriadas, a intensidade da cor produzida é proporcional à
concentração de aminoácidos.
Os grupos amino primários reagem com a ninhidrina para formar um corante púrpura, chamado roxo
de Ruhemann (RP), o qual foi descoberto por Siegfried Ruhemann em 1910. Iminoácidos como prolina, o
grupo guanidino da arginina, os grupos amida da asparagina, o anel indol do triptofano, o grupo sulfidrila
da cisteína, os grupos amino da citosina e guanina, e os íons cianeto também reagem com a ninhidrina para
formar vários cromóforos que podem ser analisados. A reação geral pode ser escrita da seguinte maneira:
(veja a página do laboratório virtual).
As aminas primárias também reagem com a ninhidrina, mas não liberam CO2. [Cuidado: a
ninhidrina é um agente oxidante muito reativo, portanto deve ser manuseado com cuidado].
Estão disponíveis vários outros reagentes que podem reagir com o grupo alfa-amino para formar
derivados coloridos ou fluorescentes. Estes incluem fluorescamina, cloreto de dansilo, cloreto de dabsilo,
etc., utilizados na detecção de quantidades vestigiais de aminoácidos ao nível do nanograma.
Na estimativa quantitativa de aminoácidos utilizando o reagente Ninhidrina, é medida a absorbância
do roxo de Ruhemann formado pela reação a 570 nm. Para os iminoácidos, a absorção ocorre a 440 nm. O
princípio por trás da estimativa colorimétrica é dado abaixo:

Princípio colorimétrico:

Medição de absorbância (A):

Compostos desconhecidos podem ser identificados pelos seus espectros de absorção característicos
nas regiões ultravioleta, visível ou infravermelha. As reações catalisadas por enzimas frequentemente
podem ser seguidas medindo espectrofotometricamente a produção de um produto ou o desaparecimento
de um substrato. Um espectrofotômetro/colorímetro é um instrumento para medir a absorbância de uma
solução medindo a quantidade de luz de um determinado comprimento de onda que é transmitida por uma
amostra.
Espectro da luz:
A luz pode ser categorizada de acordo com seu comprimento de onda. A Figura abaixo (veja
também lab virtual) mostra a relação entre o comprimento de onda da luz e os tipos comuns de radiação
eletromagnética. A luz nos comprimentos de onda curtos de 200 a 400 nm é chamada de ultravioleta (UV).
A luz nos comprimentos de onda mais longos, de 700 a 900 nm, é chamada de infravermelho próximo (IR
próximo).

A luz visível está entre os comprimentos de onda de 400 e 700 nm. Todas as cores visíveis ao olho
humano se enquadram nessa faixa de comprimento de onda. Qualquer solução que contenha um composto
que absorva luz na região visível aparecerá colorida aos olhos. A solução é colorida porque comprimentos
de onda específicos da luz são absorvidos à medida que passam pela solução. Então, a única luz que os
olhos perceberão são os comprimentos de onda de luz que são transmitidos (não absorvidos).

Lei Beer-Lambert:
A Lei de Beer-Lambert afirma que a quantidade de luz absorvida é proporcional ao número de
moléculas de substância absorvente no caminho da luz, ou seja, a absorção é proporcional tanto à
concentração da amostra em solução quanto ao comprimento do caminho óptico da luz através da solução.
Esse relacionamento pode ser expresso da seguinte maneira:
Absorbância, A= ε x c x l
c = concentração da amostra (em moles/litro), l = comprimento do percurso da luz através da solução
(em cm) e ε = coeficiente de extinção molar.

Para determinar a concentração absoluta de uma substância pura, uma curva padrão é construída a
partir de concentrações conhecidas e, usando essa curva padrão, a leitura de absorbância da concentração
desconhecida será determinada. A determinação da concentração desconhecida a partir da curva padrão é
feita desenhando uma linha paralela ao eixo X a partir do ponto no eixo Y que corresponde à absorbância
do desconhecido. Essa linha será feita para interceptar a curva padrão desenhada e é estendida verticalmente
de forma que atenda ao eixo X e a concentração de desconhecido seja lida no eixo X. Uma curva padrão
típica é representada na figura abaixo (veja também lab virtual).
Eixo X – concentração da amostra conhecida, nessa figura proteína em mg. Eixo Y – absorbância a
determinado comprimento de onda. Os pontos vermelhos representam a absorbância da curva padrão,
amostra de proteína de concentração conhecida. Os pontos verdes representam a absorbância do controle
negativo, que depende da solução em análise (no caso é uma amostra sem proteína, só o agente corante).
Os pontos rosas representam a absorção da amostra desconhecida e as linhas em qual ponto (concentração)
da curva elas interceptam (neste caso a amostra teria aproximadamente 30 mg).
Videoaula Khan Academy - Introdução à espectrofotometria - https://youtu.be/F5dCva8fnDg

III. PROCEDIMENTO (em inglês Procedure)

MATERIAIS REQUISITADOS:

REAGENTES NECESSÁRIOS:
Estoque da solução padrão de aminoácidos (150 microgramas de solução padrão de aminoácidos (150
µg/mL).
Tampão de acetato 0,2 M (pH = 5,5).
8% p/v de reagente Ninhidrina [Preparação: Pese 8 g de ninhidrina e dissolva em 100 ml de acetona].
Etanol a 50% v/v.
Água destilada.

APARELHOS E VIDRARIA NECESSÁRIOS:

Tubos de ensaio.
Pipetas [vidro/micropipeta].
Banho-maria.
Espectrofotômetro

PROCEDIMENTO:

1. Pipetar diferentes volumes (0,1 mL a 1 mL) de solução padrão de aminoácidos nos respectivos tubos
de ensaio rotulados.
2. Adicione água destilada em todos os tubos de ensaio para completar o volume em 4 mL.
3. Adicione 4 mL de água destilada ao tubo de ensaio rotulado como branco (controle negativo).
4. Adicione 1 mL do reagente ninhidrina a todos os tubos de ensaio, incluindo os marcados como
branco' e 'desconhecido'.
5. Misture o conteúdo dos tubos em vórtex ou agitando os tubos.
6. Coloque algumas lascas de calcário branco (Limestone) em cada tubo.
7. Cubra a boca dos tubos com papel alumínio.
8. Coloque todos os tubos de ensaio em banho-maria a 100 °C por 15 minutos.
9. Esfriar os tubos de ensaio em água fria e adicionar 1 mL de etanol em cada tubo e misturar bem.
10. Medir a absorbância a 570 nm de cada solução usando um espectrofotômetro.

COMO USAR O ESPECTROFOTÔMETRO:

 1. Ligue o espectrofotômetro e defina o comprimento de onda no qual a absorbância deve ser medida
[isso deve ser feito cerca de 30 minutos antes de fazer as leituras].
2. Enxágue a cubeta com a solução branco (nesse caso água destilada), escorra a solução invertendo a
cubeta e encostando a boca no papel de filtro.
3. Encha a cubeta com a solução branco (água destilada) até a marca apropriada e coloque-a no orifício
específico do espectrofotômetro.
4. Deve-se tomar cuidado para que a cubeta seja inserida corretamente no orifício.
5. Leia o valor de densidade ótica (DO) e tare o instrumento a zero.
6. Retire a cubeta e escorra a solução de branco.
7. Agora meça os valores de DO da concentração mais baixa para a mais alta da curva padrão.

Abaixo estão dois links para vídeos curtos de manuseio real de espectrofotômetros, o primeiro
apresenta um equipamento mais moderno que no segundo vídeo.
https://youtu.be/EYRmnC7RdNQ
https://youtu.be/WJH8wGq5BZQ

Diferenças encontradas em um laboratório real:

Em um laboratório real (físico), existem certas etapas importantes que não são necessariamente aplicáveis
em um laboratório virtual:
1. Sempre use jaleco e luvas quando estiver no laboratório. Ao entrar no laboratório, ligue o exaustor
e verifique se todos os reagentes necessários para o experimento estão disponíveis. Se não estiver
disponível, prepare os reagentes usando os componentes mostrados na preparação do reagente.
2. Deve-se tomar cuidado ao manusear reagentes como o reagente Ninhhidrina. Este reagente é um
forte agente oxidante e não deve ser inalado ou derramado nas mãos ou em outras partes do corpo.
O derramamento acidental deste reagente causará uma sensação intensa de prurido. Lave a área com
água fria e informe o assistente de laboratório imediatamente.
3. Sempre verifique o nível da água no banho-maria e, se estiver até o nível adequado [quase metade
do volume], ligue o banho-maria e ajuste a temperatura desejada antes de prosseguir com o
experimento. Tome cuidado ao usar o banho de água na etapa de ebulição do experimento. Sempre
segure o tubo de ensaio usando um suporte para tubos de ensaio.
4. Ao operar o espectrofotômetro, cuide para que gotas de água não entram no slot do equipamento,
pois isso danificará o instrumento. Portanto, limpe a cubeta usando um lenço de papel sem fiapos
antes de inseri-la no slot.
5. Não toque na parte da cubeta que é inserida no slot espectrofotômetro com as mãos e verifique se a
cubeta está livre de gotas de água.

IV. AUTO AVALIAÇÃO (em inglês self evaluation)

-
V. ANIMAÇÃO (em inglês Animation)
Aperte o botão Start para iniciar a animação do experimento.

Tradução:
1. Clique em cada aparelho/reagente para saber seu nome ou clique em “continue” para iniciar o
experimento.
2. Peque 13 tubos de ensaio de 10 mL e preencha 2 deles com amostras.
3. Agora, pegue o primeiro tubo de ensaio.
4. Pegue o primeiro tubo e rotule como branco.
5. Pegue o segundo tubo.
6. Rotule como 0,1.
7. Rotule o terceiro tubo como 0,2.
8. Pegue uma pipeta graduada.
9. Ajuste-a ao pipetador.
10. Pegue 1 mL de aminoácido usando a pipeta como mostrado.
 11. Coloque 0,1 mL de aminoácido no tubo rotulado como 0,1.
12. De forma similar, coloque 0,2 mL de aminoácido no tubo rotulado como 0,2.
13. Agora, nós preenchemos todos os 10 tubos com a solução de aminoácido conhecido.
14. Pegue outra pipeta graduada.
15. Ajuste-a ao pipetador.
16. Pegue 10 mL de água destilada usando a pipeta como mostrado.
17. Coloque 4 mL no tubo rotulado como branco.
18. Coloque 3,9 mL de água no tubo rotulado como 0,1 para completar os 4 mL.
19. Agora, nós preenchemos todos os 10 tubos com água destilada.
20. Selecione 13 mL de ninhidrina usando a pipeta como mostrado.
21. Coloque 1 mL de ninhidrina no tubo rotulado como branco.
22. Coloque 1 mL de ninhidrina em todos os tubos.
23. Observamos que todos os tubos têm 5 mL de uma solução amarelada.
24. Coloque 1 mL de ninhidrina em todos os tubos.
25. Coloque lascas de calcário branco em todos os tubos para evitar borbulhamento durante o
aquecimento.
26. Pegue o primeiro tudo.
27. Coloque na máquina de agitação.
28. Ligue a máquina.
29. Agite até a solução estar ficar uniforme.
30. Desligue a máquina.
31. Peque o próximo tubo e agite.
32. Coloque de volta na estante de tubos.
33. Repita com todos os tubos.
34. Cubra os tubos com papel alumínio.
35. Peque a estante de tubos e coloque no banho-maria.
36. Mantenha 15 min a 100 °C.
37. Com o passar do tempo, a cor das soluções passará para um tom azulado, exceto o tubo indicado
como branco.
38. Agora retire os tubos do banho-maria.
39. Pegue 1 mL de solução diluente usando a pipeta como mostrado.
40. Remova o papel alumínio do primeiro tubo.
41. Pipete no primeiro tubo, ajustando o volume da solução para 6 mL.
42. Repita o procedimento com todos os tubos.
43. Podemos observar a mudança de cor em cada tubo de ensaio, exceto o primeiro tubo indicado com
branco, o qual não apresenta cor. O tubo rotulado como 1,0 terá a coloração mais intensa.
44. Pegue uma cubeta e coloque a solução do tubo branco.
45. Coloque a cubeta no suporte de cubeta do espectrofotômetro ajustado para leitura a 570 nm.
46. Pegue uma segunda cubeta, coloque a solução do tubo 2 nesta cubeta.
47. Coloque a cubeta no suporte de cubeta do espectrofotômetro.
48. Anote o valor de absorbância.
49. Repita esse procedimento com todos os tubos.
50. Agora construa o gráfico, DO a 570 nm versus a concentração de aminoácido em µg, observamos
uma linha reta.
51. Agora marque o valor de DO do aminoácido desconhecido e extrapole no eixo x do gráfico.
VI. TAREFA (em inglês Assignment)
Essa tarefa vocês devem exercitar após a prática, a resolução será avaliada no questionário pela plataforma
Google Forms.

1. Com base nos dados experimentais fornecidos pelo método de Ninhidrina, calcule a concentração
do aminoácido desconhecido na tabela.

2. Calcule a concentração de 0,2 mL de um dado aminoácido que obteve um valor de absorbância de

0,5, sabendo que uma solução de 0,5 mL do mesmo aminoácido possui uma concentração de 0,72
mg/mL com uma absorbância de 0,9.
 Tubo Volume de solução padrão de aminoácido Concentração de aminoácido em µg DO 570
adicionado (mL) nm
1 Branco 0,0 0,0
2 0,2 20 0,12
3 0,4 40 0,25
4 0,6 60 0,42
5 0,8 80 0,55
6 1,0 100 0,68
7 0,5 desconhecido 0,41

A concentração desconhecida do aminoácido (tubo 7) pode ser determinada construindo um gráfico de

dispersão dos valores de absorbância (DO) versus os valores de concentração do padrão (µg/mL), após
obtém-se a equação da reta (y = ax + b), partir da equação calcular a concentração dos aminoácidos
desconhecidos (y = absorbância (DO); x = concentração).

Link de videoaula de como obter a equação da reta a partir de curva padrão pelo o programa excel.
https://youtu.be/DGf68DC43tQ

VII. REFERÊNCIA
Livros didáticos:
An Introduction to Practical biochemistry by David T. Plummer.
Experimental Biochemistry, A student Companion by Beedu Sashidhar Rao and Vijay Deshpande.

Bibliografia na Web:
H. Meyer, Biochem. J. (1957) 67 (333-340)
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Bio111/Bio111LabMan/Lab%201.html
http://www.scribd.com/doc/50963301/Experimental-Biochemistry
http://www.m2c3.com/c106/lab/AminoAcids_by_Ninhydrin/aminoacids.htm