CROMATOGRAFIA

Laboratrio de Qumica Orgnica

Definio Geral
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao que se fundamenta na migrao diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis: fase mvel (gs, lquido ou um fluido supercrtico) e fase estacionria (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfcie slida).

Transporte dos componentes de uma amostra por uma fase mvel atravs de uma fase estacionria

A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura.

Histrico
1906 o botnico russo Mikhail Tswett descreveu suas experincias na ter de separao dos componentes de petrleo extratos de folhas. Os termos cromatograma, cromatografia, mtodo CaCO3 cromatogrfico aparecem em dois trabalhos descrevendo suas experincias para separar pigmentos de um extrato de folhas (clorofila e xantofila) e gemas de ovo, utilizando uma coluna de vidro empacotada com CaCO3 finamente dividido (fase estacionria) e ter de petrleo (fase mvel). A separao dos componentes pode ser verificada por meio de faixas coloridas na coluna.

mistura de pigmentos

pigmentos separados

Cromatografia (grego) kroma [cor] + graph [escrever]

Apesar do estudo de Tswett e de outros anteriores que poderiam ser considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi praticamente ignorada at a dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea possibilitaram seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticao, resultando no seu grande potencial de aplicao em vrias reas.

Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)

Classificao dos Mtodos cromatogrficos

Cromatografia Planar Centrfuga (Chromatotron) Lquida Coluna

CCD

CP

CSC

Gasosa

Clssica

CLAE

CG

CGAR

Segundo a forma fsica do sistema cromatogrfico: cromatografia planar, cromatografia em coluna e centrfuga. Segundo o modo de separao: adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos.

Segundo a fase estacionria utilizada: fase estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas.

Esqueletos fsseis (SiO2 + xidos metlicos) de algas microscpicas

Exemplos de fases estacionrias

Segundo a fase mvel empregada: Cromatografia lquida Na cromatografia lquida clssica (CLC), a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas por fora da gravidade, enquanto que na cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para eluio da fase mvel. Cromatografia gasosa - As separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa simples (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre as duas reside nos tipos de colunas utilizadas. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na coluna. Cromatografia supercrtica (CSC) - Utiliza-se um vapor pressurizado, acima da sua temperatura crtica.

Classificao

Mtodo
Lquido-lquido ou partio Fase lquido-ligado

Fase Estacionria Tipo de equilbrio

Lquido adsorvido em um slido Espcies quimicamente ligadas a uma superfcie slida Slido Resina de trocainica Liquido em interstcios de slido polimrico ou gel polimrico Lquido adsorvido em um slido Espcies ligadas a uma superfcie slida Slido Espcies orgnicas ligadas a uma superfcie slida Partio entre lquidos imiscveis Partio entre lquidos e superfcie ligada Adsoro Troca inica Partio ou filtrao

Cromatografia Lquida

Lquido-slido ou adsoro Troca inica Excluso por tamanho ou gel filtrao Gs-lquido

Cromatografia gasosa

Gs-ligado

Partio entre gs e lquido Partio entre o gs e superfcie ligada Adsoro Partio entre fluido supercrtico e superfcie ligada

Cromatografia com fluido supercrtico

Gs-slido Fase mvel fluido supercrtico

Centrfuga - CHROMATOTRON
Chromatotron uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Foi desenvolvida pelos autores do Compendium of Organic Synthetic Methods. Substitue as CCD preparativas, pequenas colunas e HPLC. Com dimensies ~ 30 cm. US Patent no. 4139458. Pendentes em outros pases

Princpio de operao
A amostra a ser separada aplicada como uma soluo no centro do disco giratrio umedecido com o solvente. A eluio com solvente gera bandas circulares de separao dos componentes que so removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepo.

Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total. Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata. Solventes: Compatvel com todos os solventes comumente usados nas outras tcnicas cromatogrficas, inclusive cido actico. No apropriada para uso com cidos minerais. Vantagens especiais: * No aplicao de spot ou raspagem de bandas. * Separaes so rpidas, cerca de 20 min. * Permite a observao direta por UV ou de compostos coloridos durante a eluio. * Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade. * Utiliza-se pouco solvente e a eluio por gradiente fcil. O solvente regenerado in situ, podendo ser re-utilizado. * Atmosfera de nitrognio previne oxidao das amostras. * Compacta (facilmente removida de um laboratrio para outro), poucos controles e no necessita altas presses. * Baixo preo. Chromatotrons custam menos que um simple HPLC preparativo.

Cromatografia em Papel
A cromatografia em papel (CP) uma tcnica de partio lquidolquido, estando um deles fixado a um suporte slido. O suporte saturado em gua e a partio se d devido presena de gua em celulose (papel de filtro). Este mtodo, embora menos eficiente que a CCD, muito til para a separao de compostos polares, sendo largamente usado em bioqumica. Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, etc) Cromatografia em papel com fase normal (papel saturado com a fase estacionria polar, p. ex. gua) e com fase reversa (papel tratado com outro lquido, p.ex.: acetona e dimetilformamida, parafina, leo, silicone, solventes orgnico).

Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de adsoro lquidoslido. Nesse caso, a separao dos componentes da mistura ocorre em funo da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo numa superfcie plana, por meio de uma fase mvel (um lquido ou misturas de lquidos). O fenmeno principalmente de adsoro (partio ou troca inica), a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionria. Os adsorventes comerciais mais utilizados so: slica, alumina, celulose, terra diatomcea e poliamida. Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, fluorescncias, radioatividade, etc.

O parmetro mais importante a ser considerado em CCD o fator de reteno (Rf), o qual a razo entre a distncia percorrida pela substncia em questo e a distncia percorrida pela fase mvel. Os valores ideais para Rf esto entre 0,4 e 0,6. A CCD pode ser usada tanto na escala analtica quanto na preparativa. Por ser um mtodo simples, rpido, visual e econmico, a CCD a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaes orgnicas, sendo tambm muito utilizada para a purificao de substncias e para a identificao de fraes coletadas em cromatografia lquida clssica.

Cromatografia em Coluna
A cromatografia em coluna uma tcnica usada para a separao de muitos compostos orgnicos. Essa tcnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das molculas envolvidas. Utiliza-se tubos de vidro compactado com um material polar finamente dividido (suporte slido ou fase estacionria), em geral, alumina ou silicagel, empacotado com um solvente orgnico ou uma mistura de solventes. Uma soluo contendo o composto que se deseja purificar aplicada na superfcie superior da fase estacionria, e aps eluio coletar fraes com volume predeterminados, as quais muito provavelmente contero os componentes da mistura separados.

Velocidade na qual um composto eluido da coluna depende de sua polaridade, da polaridade da fase estacionria e da polaridade do solvente utilizado como eluente. Se o composto mais atrado pela fase estacionria do que pelo solvente, ele migrar mais lentamente da coluna. Caso contrrio, se o composto tiver maior afinidade pelo solvente ele migrar mais rapidamente da coluna, gastando menos tempo e solvente. O xito de uma coluna depender ento da escolha de um suporte e solvente adequados para a sua realizao. Atualmente a tcnica mais utilizada pelos qumicos orgnicos para a separao de uma mistura de compostos a cromatografia rpida: Coluna Cromatogrfica Rpida (flashcolumn chromatography) e Coluna Cromatogrfica Rpida e a Seco (drycolumn flash chromatografy)

Variantes rpidas da cromatografia em coluna

Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR) e Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Cromatografia Gasosa
O principal mecanismo de separao da Cromatografia Gasosa (CG) est baseado na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria lquida. A utilizao de fases estacionrias slidas, as quais levariam separao por adsoro, apresenta poucas aplicaes. A cromatografia gasosa uma das tcnicas analticas mais utilizadas. Alm de possuir um alto poder de resoluo, muito atrativa devido possibilidade de deteco em escala de nano a picogramas (109 a 10-12 g). A grande limitao deste mtodo a necessidade de que a amostra seja voltil ou estvel termicamente, embora amostras no volteis ou instveis possam ser derivadas quimicamente.
Modelo de um CG moderno

Funcionamento do Cromatgrafo Gasoso

A amostra vaporizada e introduzida em um fluxo de um gs adequado denominado de fase mvel ( FM) ou gs de arraste. O fluxo de gs com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase estacionria FE (coluna cromatogrfica), onde ocorre a separao da mistura. A FE pode ser um slido adsorvente (Cromatografia Gs-Slido) ou, mais comumente, um filme de um lquido pouco voltil, suportado sobre um slido inerte (Cromatografia GsLquido com Coluna Empacotada ou Recheada) ou sobre a prpria parede do tubo (Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo).

Esquema de um CG e de um cromatograma

Equipamento bsico de um cromatgrafo a gs

1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

Na cromatografia gs-lquido (CGL), os dois fatores que governam a separao dos constituintes de uma amostra so: a solubilidade na FE: quanto maior a solubilidade de um constituinte na FE, mais lentamente ele caminha pela coluna. a volatilidade: quanto mais voltil a substncia (ou, em outros termos, quanto maior a presso de vapor), maior a sua tendncia de permanecer vaporizada e mais rapidamente caminha pelo sistema. As substncias separadas saem da coluna dissolvidas no gs de arraste e passam por um detector; dispositivo que gera um sinal eltrico proporcional quantidade de material eluido. O registro deste sinal em funo do tempo o cromatograma, sendo que as substncias aparecem nele como picos com rea proporcional sua massa, o que possibilita a anlise quantitativa
Exemplo de um cromatograma.

Constituintes bsicos de um sistema cromatogrfico e cuidados especiais

Reservatrio de Gs de Arraste. O gs de arraste fica contido em cilindros sob presso. O parmetro mais importante para escolha do gs a sua compatibilidade com o detector. Os gases mais empregados so H2, He e N2 e a vazo do gs de arraste, que deve ser controlada, constante durante a anlise. Sistema de Introduo de Amostra. A a introduo da amostra feita no injetor (ou vaporizador). Na verso mais simples, trata-se de um bloco de metal conectado coluna cromatogrfica e alimentao de gs de arraste. Este bloco contm um orifcio com um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras lquidas ou gasosas podem ser injetadas com microseringas hipodrmicas. Amostras slidas podem ser dissolvidas em um solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a uma temperatura acima do ponto de ebulio dos componentes da amostra, para que a amostra se volatilize completa e instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposio da amostra.

A quantidade de amostra injetada depende da coluna e do detector empregado. Para colunas empacotadas, volumes de 0,1 l a 3,0 l de amostra lquida so tpicos. Volumes altos prejudicam a qualidade de injeo (alargamento dos picos) ou saturam a coluna cromatogrfica. Para a cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR), os volumes de injeo deveriam ser da ordem de nanolitros. Coluna Cromatogrfica e Controle de Temperatura da Coluna. A amostra deve entrar na coluna na forma de um segmento estreito, para evitar alargamento dos picos. Aps injetada e vaporizada, a amostra introduzida na coluna cromatogrfica, onde efetuada a separao. Na CG a "afinidade" de um soluto pela FM determinada pela volatilidade do soluto, sua presso de vapor, que funo da estrutura do composto e da temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se tambm a presso de vapor e, por conseguinte, a "afinidade" de uma substncia pela FM. O controle da temperatura deve ser rigoroso.

Detector - Um dispositivo que indica e quantifica os componentes separados pela coluna. Um grande nmero de detectores tm sido descritos e usados em CG. Existem, entretanto, algumas caractersticas bsicas comuns para descrever seu desempenho:
1.

Seletividade. Alguns detectores apresentam resposta para qualquer substncia diferente do gs de arraste que passe por ele. Estes so os chamados detectores universais. Por outro lado, existem detectores que respondem somente a compostos que contenham um determinado elemento qumico em sua estrutura, que so os detectores especficos. Alguns detectores respondem a certas classes de compostos (detectores seletivos). Rudo. So os desvios e oscilaes na linha de base (sinal do detector quando s passa o gs de arraste). Pode ser causado por problemas eletrnicos, impurezas e sujeiras nos gases e no detector, etc. Tipo de Resposta. Alguns detectores apresentam um sinal que proporcional concentrao do soluto no gs de arraste; em outros, o sinal proporcional taxa de entrada de massa do soluto no detector.

2.

3.

4.

Quantidade Mnima Detectvel (QMD). a quantidade de amostra mnima para gerar um sinal duas vezes mais intenso que o rudo. uma caracterstica intrnseca do detector. Quanto menor a QMD, mais sensvel o detector. Fator de Resposta. a intensidade de sinal gerado por uma determinada massa de soluto, que depende do detector e do composto estudado. Pode ser visualizado como a inclinao da reta que correlaciona o sinal com a massa de um soluto (curva de calibrao). Quanto maior o fator de resposta, mais confivel a anlise quantitativa. Faixa Linear Dinmica. a razo entre a menor e a maior massa entre as quais o fator de resposta de um detector para um soluto constante, isto , onde a curva de calibrao linear. Os dois detectores mais significativos em CG so o Detector por Condutividade Trmica (DCT) e o Detector por Ionizao em Chama (DIC).

5.

6.

Detector por Condutividade Trmica (DCT)

O funcionamento do DCT baseado no fato de que a velocidade de perda de calor de um corpo quente para um corpo mais frio proporcional, dentre outros fatores, condutividade trmica do gs que separa estes corpos. Um filamento metlico muito fino (de W, Au ou liga W-Re) aquecido pela passagem de uma corrente eltrica constante. Este filamento fica montado dentro de um orifcio em um bloco metlico (cela), aquecido uma temperatura mais baixa que aquela do filamento, por onde o gs de arraste proveniente da coluna passa continuamente. Quando um componente eluido da coluna, ele sai misturado com o gs de arraste e passa pelo detector. Se a condutividade desta mistura for diferente daquela do gs de arraste puro, o filamento passa a perder calor para o bloco numa taxa diferente daquela do equilbrio. O aquecimento do filamento quando a amostra eluida causa uma variao na sua resistncia eltrica e a resistividade de um metal aumenta com a temperatura. O filamento montado em um circuito de ponte de Wheatstone, que converte a variao na resistncia eltrica do filamento numa variao de voltagem, que coletada em um registrador gerando o cromatograma.

1. Bloco metlico; 2. Entrada de gs; 3. Sada de gs; 4. Filamento metlico; 5. Alimentao de corrente

O DCT um detector universal, sensvel concentrao do soluto no gs de arraste. Geralmente, quando se usa DCT, o gs de arraste He ou H2. Pelo fato destes gases terem condutividades trmicas altssimas, as misturas gs de arraste mais o soluto sempre tero condutividades trmicas menores que a do gs de arraste puro, o que impede sinais negativos, alm de se obter maiores fatores de resposta. Entretanto, o DIC considerado um detector pouco sensvel. A QMD de um modelo moderno, para propano, de 400 pg/ml de gs de arraste, com faixa linear de 106. Apesar disso, o fato de ser universal, barato e de operao simples, o faz extremamente til para anlises que no necessitem de alta sensibilidade.

Detector por Ionizao em Chama (DIC).

Durante a queima de um composto orgnico, so formados diversos ons e como conseqncia, a chama resultante torna-se condutora de eletricidade. O funcionamento do DIC baseia-se neste fenmeno. O gs de arraste saindo da coluna cromatogrfica misturado com H2 e queimado com ar ou O2. A chama resultante fica contida entre dois eletrodos, polarizados por uma voltagem constante. Como a chama de H2 forma poucos ons, ela um mau condutor eltrico e quase nenhuma corrente passa entre os eletrodos. Ao eluir um composto orgnico, ele queimado e so formados ons na chama, que passa a conduzir corrente eltrica. A corrente eltrica resultante, da ordem de pA, amplificada e constitui o sinal cromatogrfico.

Cela de um detector por ionizao de chama

Quase todos compostos orgnicos podem ser detectados pelo DIC. Apenas substncias no inflamveis (CCl4, H2O) ou algumas poucas que no formam ons na chama (HCOOH) no do sinal. Assim, ele um detector praticamente universal. De um modo geral, quanto ligaes C-H tiver o composto, maior a sua resposta (maior sensibilidade). Ele muito mais sensvel que o DCT, pois dependendo do composto, podem ser detectados entre 10 pg e 400 pg, com faixa linear dinmica de 107. Provavelmente o detector mais usado em CG.

Parmetros fundamentais de um sistema de CG

Reteno - O tempo de reteno (tr) definido como o tempo transcorrido entre a injeo da amostra e o mximo do pico cromatogrfico. Porm, mesmo que a substncia no interagisse de forma alguma com a FE, o seu tempo de reteno no seria nulo, pois transcorreria algum tempo entre a sua injeo e a sua passagem pelo detector. O parmetro que realmente reflete as caractersticas fsico-qumicas de reteno tempo de reteno ajustado (tr), que determinado composto o tempo de reteno descontado do tempo morto, tm, (tempo que o gs de arraste demora para percorrer a coluna).

Seletividade - Capacidade de um sistema diferenciar dois compostos, definida por , sendo uma caracterstica que, na CG, mais associada coluna cromatogrfica.

Eficincia - A eficincia expressa pelo nmero de pratos tericos (n), que calculada usando-se um parmetro de reteno (o tr) e a largura do pico cromatogrfico - no caso, a largura de base, wb. A altura equivalente a um prato terico (h) dada pela razo entre o comprimento da coluna cromatogrfica (L) e n.

Resoluo - A resoluo entre duas substncia a razo entre a diferena das distncias de migrao e a mdia das larguras das bandas.

Se as larguras dos picos forem prximas, pode-se utilizar a simplificao

Na CG existe um grande nmero de fases estacionrias lquidas e slidas disponveis comercialmente, de modo que a natureza da FE a varivel mais importante na otimizao da seletividade.
As FE lquidas so as mais empregadas em CG. FE slidas (carvo ativo, slica, peneiras moleculares e polmeros porosos) so aplicadas para separao de gases e compostos de baixo massa molar. Em princpio, para um lquido ser usado como FE em CG ele deve ser pouco voltil (presso de vapor at 0,1 mmHg ou 13,332 Pa na temperatura de trabalho) e termicamente estvel. Para esta fase ser empregada em uma separao em particular, ela precisa:
1.

2.

3.

ser um bom solvente para os componentes da amostra, caso contrrio o efeito ser o mesmo de temperaturas de coluna excessivamente altas (os compostos ficaro quase que o tempo todo no gs de arraste, sendo eluidos muito rapidamente e sem separao); ser um bom solvente diferencial, isto , alm de dissolver bem todos os constituintes da amostra, faz-lo com solubilidades suficientemente diferentes para que eles possam ser separados; e ser quimicamente inerte em relao amostra.

As FE mais populares so os silicones. Silicones so polmeros extremamente estveis e inertes, o que os torna especialmente adequados CG. Nesta classe, as polidimetilsiloxanas so os menos polares. A substituio dos grupos metila na cadeia por outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil, etc.) fornece FE com polaridades crescentes. Comercialmente, so disponveis sob diversas denominaes, muitas delas praticamente equivalentes. SE-30, OV-1 e DC-200 so nomes comerciais para polidimetilsiloxano de fabricantes diferentes. Outra classe de FE importante a dos poliglicis. So polmeros de etilenoglicol e epxido, preparados com diferentes tamanhos de cadeia polimrica. So FE moderadamente polares, adequadas para separao de lcoois, aldedos, teres, etc. A denominao comercial "Carbowax" designa a srie de poliglicis mais conhecida (p.ex., Carbowax 20M polietilenoglicol com massa molar mdia de 20.000.000 g/mol). Um terceiro grupo importante de FE o dos polisteres. So obtidos por condensao de dicidos com glicis. So fases altamente polares. As fases mais comuns desta categoria so o succinato de dietilenoglicol (DEGS) e o adipato de dietilenoglicol (DEGA).

A coluna cromatogrfica o local onde ocorre a interao entre a amostra e a FE. Existem duas geometrias bsicas de colunas para CG: as colunas empacotadas (ou recheadas), e as colunas tubulares abertas (ou capilares). Nas colunas empacotadas, a FE lquida depositada sob a forma de um filme fino e uniforme sobre partculas de um suporte adequado. O suporte deve ser um slido poroso com grande rea superficial, inerte e de boa resistncia mecnica. O tamanho das partculas e dos poros deve ser o mais uniforme possvel. O material mais empregado como suporte a diatomite, esqueletos fsseis de algas microscpicas (diatomceas), compostos principalmente de SiO2 amorfa e traos de xidos metlicos. A diatomite preparada para suporte de CG comercializada com o nome de "Chromosorb", dentre outros. Para preparar uma coluna empacotada, o material de enchimento (FE sobre suporte) colocado da forma mais uniforme e compacta possvel ("empacotado") em um tubo de comprimento e dimetro adequados. Os materiais mais usados para os tubos de colunas so o ao inox e o vidro, sendo o primeiro preferido pelo manuseio mais fcil. Se o material de enchimento no for colocado na coluna de forma compacta e uniforme, os espaos vazios resultantes funcionaro como cmaras de diluio para a amostra. O resultado sero picos mais largos e menor eficincia.

O tamanho da coluna varivel. Tipicamente so usadas colunas com dimetros internos de 1 mm a 4 mm e 1 m a 3 m de comprimento. Quanto maior a coluna, maior a eficincia; entretanto, tambm aumenta o tempo de anlise. Colunas muito longas oferecem uma resistncia muito alta passagem de gs, exigindo presses excessivamente altas. Alm da natureza da FE e da qualidade do empacotamento, existem duas variveis importantes que influem no desempenho de uma coluna empacotada: A percentagem de FE no material de enchimento. A percentagem de FE sobre o suporte um parmetro que deve ser rigidamente controlado. Se a quantidade de FE for muito baixa, partes da superfcie do suporte ficaro expostas amostra, que poder ser adsorvida. O resultado o alargamento ou deformao dos picos. Quanto mais FE, maior a reteno. A seletividade tambm aumenta, porm s custas de aumento do tempo de anlise e diminuio da eficincia. O dimetro das partculas do suporte. Quanto menor o dimetro das partculas do suporte, maior a eficincia da coluna. A uniformidade das partculas tambm importante. Recheios com partculas cuja distribuio de tamanho seja muito grande sero pouco eficientes. Se for usado suporte com partculas excessivamente finas, a resistncia passagem de gs ser muito alta.

A capacidade de processamento de amostra das colunas capilares menor que aquela das empacotadas. Dependendo da coluna, ela pode ser saturada com quantidades to pequenas quanto 0,001 l de amostra. Como a injeo direta de volumes de amostra desta ordem de grandeza invivel, devese recorrer ao artifcio da diviso de amostra na injeo. Um inconveniente dessa metodologia ajustar reprodutivelmente a razo de diviso (frao da amostra injetada que entra na coluna) o que pode acarretar erros na anlise quantitativa. Alm disso, amostras contendo constituintes com volatilidades muito diferentes podem ser alteradas pela diviso: a frao da amostra que realmente vai para a coluna fica enriquecida com os componentes menos volteis. Dada a grande eficincia das colunas capilares, podem ser realizadas separaes de misturas extremamente complexas: fraes de petrleo, essncias, amostras biolgicas, etc. No caso especfico de anlises de interesse ambiental (poluentes em guas e ar, por exemplo), quase que obrigatrio o seu uso. A tendncia atual que a maioria das anlises seja feita com o uso de colunas capilares. Isto no significa que as colunas empacotadas esto sendo abandonadas, porm o seu uso deve ficar restrito aplicaes especficas.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Em contraste CG, o principal mecanismo de separao da cromatografia gasosa est baseado na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel lquida e a fase estacionria slida. A versatilidade desta tcnica reside no grande nmero de fases estacionrias existentes, as quais possibilitam anlises e separaes de uma ampla gama de compostos com alta eficincia.

Modelo esquemtico de um equipamento bsico de CLAE

a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.

Exemplo de cromatograma

Perfil cromatogrfico de uma anlise registrada automaticamente, de padres de aminocidos. Fonte: Lehninger, 1990.

Funcionamento do cromatgrafo lquido

As fase mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e degaseificadas antes de uso. A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado. A necessidade de uma bomba de alta presso para eluio da fase mvel na cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) tendo sido no princpio denominada de cromatografia lquida de alta presso. As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao para a coluna. Existem alas de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alas na faixa de 5-50 mL para injees analticas e 0,52 mL para preparativas.

As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca de 0,45 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas.

O comprimento das colunas varivel, sendo comuns colunas analticas de 1025 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo necessria sua regenerao aps cada separao. O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada.

Registro de Dados na Cromatografia Lquida

O registro de dados pode ser feito atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador. Tanto na cromatografia gasosa (CG) quanto na cromatografia lquida (comumente de alta eficincia, CLAE) e a banda registrada como um pico, que idealmente deve ter formato gaussiano.

Cromatograma mostrando a separao dos enantimeros do tetramisol, princpio ativo de vrios medicamentos usados para ascaridase.

Mecanismos das separaes em CLAE

As separaes em CLAE podem se dar por adsoro, partio ou ambos. O suporte mais comumente utilizado a slica. O uso de fases estacionrias lquidas adsorvidas a um suporte no tem grande aplicao devido perda de fase estacionria, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqncia do problema acima, possibilita a produo de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas so chamadas de quimicamente ligadas. As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificao feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionria mais polar que a fase mvel, e em fase reversa, a fase mvel mais polar.

Separaes analticas so predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilslica) a mais usada, ao passo que so preferidas fases que atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de que separaes no modo reverso utilizam fases mveis aquosas. Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado s fases estacionrias quirais, as quais possibilitam a separao direta de enantimeros. Para tanto, necessria a presena de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionria. Tem sido utilizada em vrias reas da cincia, no acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas, feromnios, no isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes.

Utilizao da HPLC acoplado a tcnicas espectroscpicas na elucidao estrutural de produtos naturais

Cromatgrafos acoplados Espectrofotmetros de Massa: GC-MS e HPLC-MS

HPLC - Diagrama esquemtico

ESI and APCI HPLC/MS

Exemplos desenvolvidos no IQ Espectro de massa (CG/MS)

O C H3 I MM = 570 C 15 H 31 I

Anlise quantitativa por cromatografia

A anlise quantitativa em cromatografia baseada em estabelecer o valor da rea da banda cromatogrfica. Na cromatografia em coluna, isto , gasosa (CG) e em cromatografia lquida (comumente de alta eficincia, CLAE) a banda registrada como um pico que, idealmente deve ter formato gaussiano. Em cromatografia gasosa de alta resoluo, onde so usadas colunas capilares, no incomum que os picos tenham perfil gaussiano.

Similarmente ao que ocorre na cromatografia em camada delgada (CCD), onde as manchas observadas tendem ao perfil gaussiano, isto , aumentam das bordas para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro para a outra borda. Isto mostrado na ao lado, em que as quantidades de analito numa mancha foram obtidas para seces verticais.

Nas correspondentes bandas cromatogrficas as quantidades dos analitos tendem ao perfil gaussiano, isto , aumentam das bordas para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro para a outra borda. Quando a banda cromatogrfica registrada na forma de pico, a sua rea pode ser calculada, como mostrado abaixo, como a rea do tringulo issceles que engloba o pico cromatogrfico.

Na cromatografia em camada delgada a rea da mancha estabelecida pelo princpio de densitometria. A densitometria faz a contagem do nmero de pontos de uma imagem. O procedimento e princpio de obter reas em CCD a partir de imagens digitalizadas e arquivadas em computador . O nmero de pontos que define a mancha (como vista por um densitmetro ou computador) proporcional rea da mancha.
O princpio da densitometria

As placas no caso com manchas visveis de corantes so digitalizadas e com o arquivo gerado realiza-se a contagem dos pontos (pixeis o termo usado na rea de computao) que compem cada mancha. A contagem pode ser feita manualmente com muita pacincia ou por meio de um programa que conte os pixeis. O nmero de pontos proporcional rea da correspondente mancha e, conseqentemente, proporcional quantidade de analito nela existente. Esta metodologia representa o princpio de estabelecimento de reas cromatogrficas.

Princpio do estabelecimento de rea de uma mancha de CCD por meio de escaneamento da placa cromatogrfica.

Apesar do mtodo de determinar reas ser diferente para CG e CLAE, o princpio o mesmo do usado em CCD. O princpio bsico da quantificao que a rea dos picos registradas no cromatograma proporcional massa do composto injetada. Assim, fundamental para a confiabilidade da anlise que a rea dos picos seja medida o mais exata e reprodutvel possvel. Existem vrios modos de se medir a rea de um pico cromatogrfico:
1.

Tcnicas Manuais. Quando o cromatograma coletado por um registrador analgico, usualmente a rea dos picos (~tringulo issceles) medida manualmente. O procedimento mais empregado consiste em medir a altura do pico (h) e a sua largura de base (wb) ou meia-altura (wh), e calcula-se a rea pelas frmulas usadas para clculo de rea de tringulo:
ou

2.

Integradores Eletrnicos. Integradores so dispositivos baseados em microprocessadores que coletam o sinal cromatogrfico, digitalizam-no (transformam o sinal eltrico em nmeros), detectam a presena de picos e calculam a sua rea. Integradores so muito mais precisos e rpidos que qualquer mtodo manual de medida, desde que empregados convenientemente. Embora sejam dispositivos caros, quando necessria rapidez na produo de resultados, o seu uso quase mandatrio. Computadores. O integrador pode ser substitudo por um computador, desde que este tenha um dispositivo para converter o sinal eltrico em nmeros que possam ser guardados em memria (conversor analgico-digital), e se disponha de programas adequados para fazer a anlise do cromatograma digitalizado. O custo de um computador com os acessrios necessrios para coletar e analisar cromatogramas , via de regra, inferior ao de um bom integrador. Alm disso, com um software e operao adequada, pode fornecer resultados mais confiveis que este ltimo.

3.

Qualquer que seja o modo usado para medir a rea dos picos, o procedimento geral de uma anlise quantitativa por CG envolve a obteno do cromatograma da amostra, a medida da rea dos picos de interesse e o clculo da massa correspondente a cada um dos picos. Este clculo deve ser feito empregando uma curva de calibrao: um grfico correlacionando a rea do pico com a massa do composto. A curva de calibrao obtida cromatografando-se padres contendo massas conhecidas dos compostos a serem quantificados. Para cada substncia, deve ser feita uma curva de calibrao prpria, j que cada composto responde de maneira diferente ao detector. O esquema geral proposto acima chamado de padronizao externa. Como muito difcil conseguir boa reprodutibilidade entre injees diferentes, ele muitas vezes sujeito grande impreciso e inexatido. Para contornar este problema, pode-se usar a chamada padronizao interna, onde a cada soluo a ser injetada adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um composto que seja separvel dos componentes da amostra, e que no exista nela (padro interno).

O uso das reas cromatogrficas A curva analtica

medindo-se as reas cromatogrficas que se estabelecem as quantidades de analitos em amostras analisadas e a melhor forma de realizar quantificaes a baseada numa Curva Analtica. A Curva Analtica a relao entre sinais no caso as reas e quantidades do analito a ser quantificado. Dispondo da equao da curva analtica pode-se calcular as quantidades do analito em amostras. As amostras a serem analisadas so preparadas da mesma maneira que as solues-padro, a corrida realizada sob as mesmas condies usadas para o conjunto de padres e as reas do analito nas amostras so determinadas.

Esboo de uma Curva Analtica linear (representada pela equao de uma reta).

Obtendo-se uma curva analtica

O primeiro passo para obter a curva analtica preparar um conjunto de solues com um padro do analito que se deseja quantificar em amostras. Portanto, necessrio conhecer a identidade do analito e dispor dele na forma de padro (puro ou, se isso no for possvel, com pureza exatamente conhecida e determinada independentemente). Dispondo dos dados aplica-se a eles uma Regresso Linear para obter a equao da curva analtica, isto , a relao funcional entre Sinais e Quantidades. Para o caso dos dados da Tabela, a equao de reta que relaciona as reas com as concentraes do analito :

Concentraes preparadas e reas obtidas para as correspondentes sinais cromatogrficos

Suponhamos que para uma amostra esta rea foi estabelecida como de 184 pixeis. Este valor substitudo na equao da curva analtica e obtm-se a quantidade do analito na amostra (no caso a sua concentrao). Note-se que a curva analtica definida como a relao entre sinais e quantidades; no entanto, na equao as quantidades so representadas pelas concentraes das solues. Isto implica que os volumes de amostra aplicados na placa cromatogrfica foram iguais, pois, C = Q / V (C= concentrao; Q = quantidade; V =volume). Numa curva analtica interpolam-se resultados. As extrapolaes no refletem resultados efetivamente quantitativos.
Grfico da curva analtica obtida para os dados da tabelado.

Exemplos desenvolvidos no IQ Separao de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

A separao do o- e p-nitrofenol por CG constitui-se um bom exemplo do efeito das interaes intramoleculares sobre as propriedades fsicas dos compostos. No ismero orto, os grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio de ligaes hidrognio, transformando-se no componente menos polar.
OH HNO3-H2O OH NO2 + NO2 OH

Separao de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

Cromatogramas obtidos no CG-Varian, mtodo 2. (a) CH2Cl2 puro. (b) o-Nitrofenol padro dissolvido em CH2Cl2.

Separao de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

Cromatogramas obtidos no CG-Varian, mtodo 2: (a) pNitrofenol padro dissolvido em CH2Cl2. (b) Mistura de o-e p-nitrofenol dissolvido em CH2Cl2 obtida por meio da reao de nitrao (HNO3-H2SO4).

Exemplos desenvolvidos no IQ Acompanhamento de reao por anlise cromatogrfica no CG

H2SO4 AcOH, H2O2

HO O OH
IBX, AcOEt, o 80 C
+

HO O

OH

OH O

O Antibitico macroldeo O O

IBX c. iodxibenzico
O

Acompanhamento de reao por anlise cromatogrfica no CG

HO O OH
+

HO O

OH

Acompanhamento de reao por anlise cromatogrfica no CG

HO O OH
IBX, AcOEt, o 80 C

O O O

Exerccio de CLAE - Provo

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um dos mtodos cromatogrficos mais modernos utilizados em anlise (CLAE analtica) e separao/purificao de misturas (CLAE preparativa). No prximo slide so dados os cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de compostos presentes em analgsicos: aspirina (A), cafena (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando trs fases mveis diferentes, no modo isocrtico, em uma mesma coluna. Avaliando esses cromatogramas, responda s perguntas abaixo. (a) Qual a fase mvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase mvel mais adequada para utilizao em escala analtica, considerando um grande nmero de amostras a serem analisadas? Justifique sua resposta. (c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de reteno? Justifique sua resposta. (b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes trs experimentos? Justifique sua resposta.

Referncias
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos.5 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993. DEGANI, A. L. G.; QUEZIA , B. C.; VIEIRA, P. C. Cromatografia Um breve ensaio. Qumica Nova Na Escola. 1998, No. 7, 21. Pereira, A. S.; Radler, F. A. N. Estado da arte da cromatografia gasosa de alta resoluo e alta temperatura. Qumica Nova, 2000, 23, ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDO, A.M. Determinao de cafena em bebidas atravs de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). Qumica Nova, 1995, 18, 379. Antnio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e Cssio Ricardo Fares Riedo - ANLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA Universidade Estadual de Campinas, Chemkeys.com.

http://www.chromatotron.com/chromatotron/specs.html