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INTRODUO A MTODOS CROMATOGRFICOS CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E EM COLUNA

OBJETIVOS Estudar o comportamento de substncias orgnicas em termos de estrutura qumica versus fenmeno adsoro/partio cromatogrfica. Demonstrar experimentalmente princpios fundamentais da cromatografia. Empregar a tcnica de cromatografia em camada delgada na anlise uma amostra e utilizar o Rf na identificao de compostos orgnicos usualmente presentes em diversas formulaes farmacuticas. Empregar a tcnica de cromatografia em coluna na purificao de compostos orgnicos. LEITURA RECOMENDADA Mtodos de separao, cromatografia, fator de reteno, em livros de Qumica Analtica ou Qumica Orgnica. INTRODUO Os termos cromatografia, cromatograma e mtodo cromatogrfico so atribudos ao botnico russo Mikhael S. Tswett, que em 1906 utilizou estes termos para descrever suas experincias com extratos de folhas e gema de ovo. Tswett usou colunas de vidro contendo vrios slidos finamente divididos atravs das quais filtrou os extratos, lavando-os a seguir com ter de petrleo. Obteve assim, uma separao dos componentes em bandas coloridas ao longo das colunas. Os termos derivam das palavras gregas chrom (cor) e graphe (escrever), embora o processo no dependa da cor, exceto para facilitar a identificao dos componentes separados. Existem vrias tcnicas cromatogrficas, desde as mais simples, como cromatografia em coluna ou camada fina, at as mais sofisticadas, como a cromatografia lquida de alta eficincia 1 (CLAE) , que exigem aparelhagem complexa. Entre os mtodos de anlises as tcnicas cromatogrficas ocupam um lugar de destaque na qumica e bioqumica devido eficincia e facilidade na separao, identificao e quantificao das espcies qumicas presentes em uma amostra, mesmo que constituda de misturas complexas. A cromatografia , fundamentalmente, um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuio dos mesmos entre duas fases em ntimo contato. Uma das fases permanece estacionria enquanto a outra se move atravs dela. Durante a passagem da fase mvel pela estacionria, os componentes de uma mistura se distribuem entre elas, de tal forma que cada um dos componentes retido seletivamente na fase estacionria, de acordo com sua maior ou menor interao, resultando em migraes diferenciadas. A cromatografia de adsoro baseia-se no grau de partio relativa das substncias entre uma fase lquida mvel (o eluente) e uma fase slida estacionria (o adsorvente) geralmente a slicagel (SiO2.xH2O) ou o xido de alumnio (Al2O3). Outros adsorventes ocasionalmente usados so o Florisil (um silicato de magnsio), o carvo ativo, o hidrxido de magnsio, o carbonato de clcio, certas poli-amidas e at mesmo o acar. O grau de adsoro depende de vrios fatores, como a quantidade de gua presente na fase slida (que ser mais reativa quanto mais sca estiver), da estrutura da substncia adsorvida (presena de grupos funcionais polares, capacidade de formar ligaes hidrognio, etc.), da ocupao dos stios ativos da fase slida pelo solvente e da fora atrativa entre o soluto e o solvente (Figura 1).

R N H

Al2O3 O Al H

O O

R H O

O Al R C O R R

O C O HOAl

Figura 1. Algumas formas de visualizar as interaes entre alumina e componentes orgnicos de uma amostra. Estruturas similares poderiam ser escritas para a slicagel. Cromatografia em camada delgada (CCD) A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica de fcil execuo, rotineiramente usada no laboratrio de qumica orgnica. Amostras muito pequenas (1-100g) podem ser rapidamente analisadas. Devido convenincia e rapidez usamos a tcnica para: estabelecer se dois compostos so idnticos, verificar a pureza de um composto, determinar o nmero de componentes em uma mistura, determinar o solvente apropriado para separao em uma coluna cromatogrfica, monitorar a separao de uma mistura em uma coluna cromatogrfica ou acompanhar o progresso de uma reao. A tcnica consiste em aplicar uma camada fina do adsorvente finamente pulverizado (geralmente slica ou xido de alumnio, s vezes adicionados de material fluorescente luz ultravioleta) sobre uma placa lisa e plana (vidro ou alumnio). O adsorvente fixado placa por adio de gesso ou lcool poli-vinlico. Alguns micro-litros de soluo da amostra a ser examinada so aplicados prximos a uma das bordas da placa, e a mesma imersa alguns milmetros em um eluente mantido em recipiente fechado. O eluente, por fora da capilaridade, percorre a fase fixa em movimento ascendente, carreando consigo os componentes da amostra. Diferentes compostos ascendem a diferentes alturas dependendo de suas estruturas moleculares. A tcnica especialmente til no caso de compostos pouco volteis ou sensveis ao calor, isto , substncias para as quais a cromatografia em fase gasosa inadequada. Instrues gerais sobre a tcnica CCD A escolha do solvente de eluio (desenvolvimento) adequado realizada da seguinte maneira: uma soluo da amostra nos vrios solventes que se deseja testar aplicada, por meio de tubos capilares, sobre uma camada do adsorvente a ser usado (Figura 2). Quando o crculo do solvente tiver atingido a posio final, o solvente apropriado aquele que tiver arrastado a amostra a cerca de 0,3 a 0,5 do raio do crculo do solvente (caso a amostra seja incolor obviamente necessrio revelar a posio da substncia eluda mediante uso de um reagente adequado!).

Figura 2. Escolha de solvente para a cromatografia em camada delgada (a) Bom desenvolvimento. (b) Superdesenvolvimento. (c) Subdesenvolvimento. Na Tabela 1 encontramos uma relao, em ordem crescente de polaridade, dos solventes mais usados em cromatografia. Pode-se usar misturas de dois ou mais solventes como eluente, de maneira a modular a polaridade. A mistura mais usada a de acetato de etila com ter de petrleo ou hexano, por ser constituda de solventes razoavelmente baratos, volteis e de regular ou baixa toxicidade.

Tabela 1: Solventes cromatogrficos em ordem crescente de polaridadea.

a

ter de petrleo Ciclohexano Tetracloreto de carbono Benzeno Cloreto de metileno Clorofrmio ter etlico Acetato de etila Piridina Acetona lcool n-proplico Etanol gua cido actico

(polaridade, neste contexto, s tem sentido para a cromatografia e no coincide, necessariamente, com a polaridade medida, por exemplo, pela constante dieltrica).

As amostras so aplicadas nas cromatoplacas em forma de solues (a 1-10% em solvente voltil) a cerca de 1cm da base inferior (Figura 3.1), mediante uso de um tubo capilar. Alguns cuidados devem ser tomados para evitar que a camada do adsorvente seja alterada, ou que o halo de difuso da amostra seja maior que 2 mm. Solues diludas da amostra podem ser aplicadas repetidamente, esperando-se a evaporao do solvente antes de nova aplicao, a fim de obter maior concentrao no ponto de partida. Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma placa, mantendo-se uma distncia de 1 cm entre os pontos, para evitar contato entre as amostras. A placa, com a extremidade semeada para baixo, ento mergulhada no solvente selecionado, mantido em cuba fechada (cmara). importante observar que o nvel do solvente dever ficar abaixo dos pontos de aplicao (Figura 3.2). Durante a corrida do solvente o sistema deve permanecer fechado, para garantir saturao da cmara pelo vapor do solvente. Um pedao de papel de filtro, colocado na parede interna da cmara, acelera a saturao. A cromatoplaca dever ser retirada da cuba somente quando a frente do solvente atingir um limite pr-determinado na parte superior da placa (cerca de 1 cm). Aps o desenvolvimento as cromatoplacas so secas e as posies dos componentes da amostra visualizadas por um meio adequado. A visualizao (revelao) pode ser feita por mtodos fsicos ou qumicos. Placas preparadas com adio de um material fluorescente permitem visualizar facilmente compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com lmpada de luz ultravioleta (cuidado).

Figura 3. (1) Aplicao da amostra na cromatoplaca (2) Eluio de uma placa cromatogrfica; (3) Revelao de uma placa cromatogrfica em cuba de iodo Reagentes qumicos podem tambm ser usados. Quase todas as classes de substncias orgnicas (exceto alcanos e haletos alifticos) reagem com iodo formando complexos de transferncia de carga. Exposio da placa aos vapores do iodo (Figura 3.3) revelam manchas marrom, tanto mais escuras quanto maior o tempo de exposio e a concentrao da amostra. A formao desses complexos reversvel (muitas vezes rapidamente), de modo que a posio das manchas escuras deve ser marcada prontamente. A grande vantagem desse mtodo que, na maioria dos casos, o iodo pode ser eliminado posteriormente por aquecimento da placa, a qual pode ser borrifada, a seguir, com outro revelador (cido sulfrico, vanilina sulfrica, tricloreto de antimnio, permanganato de potssio/cido sulfrico, etc.). A literatura qumica traz uma srie de referncias a reveladores para cromatografia em camada delgada, variando desde os de aplicao muito especfica at os mais gerais. Em geral os mtodos qumicos de revelao so destrutivos e aplicveis a separaes analticas, mas no em separaes preparativas. Quando as condies experimentais so completamente especificadas possvel identificar uma substncia pelo seu valor de Rf. Define-se Rf, como a razo entre a distncia percorrida na placa pela substncia e a distncia percorrida pelo solvente (medidas no centro da mancha da substncia e a frente do solvente, Figura 4b). Contudo, para fins de identificao de uma substncia o solvente escolhido para eluio deve carrear o composto a um Rf entre 0,3 e 0,6 e uma amostra autntica deve ser aplicada lado a lado na mesma placa, para assegurar igualdade de condies experimentais. Alm disso, como muitas substncias podem ter o mesmo valor de Rf, assim com podem ter o mesmo ponto de fuso, mtodos adicionais devem ser utilizados para identificao inequvoca do composto. Distncia percorrida pela mancha desde a origem ( x) Rf = ----------------------------------------------------------------------------------Distncia percorrida pelo solvente desde a origem ( y)

Marca da frente do solvente

Marca da frente do solvente Mancha cromatogrfica y

Componente 1 x Origem Componente 2 Origem

Rf = x/y

(a) (b) Figura 4. (a) Cromatograma de uma separao em coluna; (b) Determinao de Rf no cromatograma em camada fina
Experimental da Parte A-I Preparao das placas cromatogrficas Experimento demonstrativo Objetivo: Demonstrar experimentalmente a preparao artesanal de placas para uso na cromatografia em camada delgada. Procedimento 1. As placas limpas e secas, no devem ser tocadas com os dedos. Segure-as pelas bordas. 2. Misture num bquer 30 g de slica gel com 60 mL de gua destilada at obter uma suspenso homognea. 3. Mantendo-se as placas em posio horizontal, transferir uma poro adequada da suspenso para a superfcie das placas, espalhando-a uniformemente com o auxlio de um basto de vidro. 4. Para facilitar a distribuio homognea da suspenso, manter a placa apoiada sobre a bancada, erguendo-se alternadamente as extremidades at que visualmente toda a superfcie esteja uniforme. A espessura do recobrimento deve ser aproximadamente 0,3 mm. 5. Repousa-se a placa em uma superfcie plana horizontal e deixa-se secar ao ar durante 15 a 30 minutos, quando o adsorvente adquire uma aparncia opaca. o 6. Para serem utilizadas, as placas devem ser ativadas por aquecimento em uma estufa a 110 C durante 30 minutos . Este processo visa eliminar a toda a gua adsorvida no suporte. As placas assim preparadas esto prontas para uso e podem ser guardadas em lugar protegido tomando-se cuidado para no tocar, contaminar ou ferir a camada de adsorvente. Micro-placas, muito teis na anlise rpida de misturas reacionais, podem ser facilmente obtidas por imerso de lminas de microscpio numa suspenso de 35 g de slica (para CCD) em cerca de 100 mL de clorofrmio ou tetracloreto de carbono. Duas lminas, arrumadas face a face, so rapidamente imersas e, com um movimento constante, removidas da suspenso. Aps a separao das lminas, e evaporao do CHCl3 (ou CCl4), umedecem-se as placas com vapor de gua para fixar o adsorvente. Obtm-se, assim, duas micro-placas com superfcie homognea de adsorvente em um dos lados, prontas para uso.

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Parte Experimental A-II. Cromatografia em camada delgada (CCD) na anlise de cafena e N-acetil-p-aminofenol em analgsicos Objetivo: Investigar a presena de cafena e N-acetil-p-aminofenol (paracetamol) em analgsicos [Tylenol, Saridon, Dorflex, Paracetamol (Genrico), etc.]. Procedimento 1. Aplicar em pontos separados da placa cromatogrfica, a 1 cm da borda inferior e mantendo cerca de 1 cm de distncia entre os pontos de aplicao, uma gotinha (tubos capilares) das solues de cafena (1), N-acetil-p-aminofenol (2) e das amostras de analgsicos (solues 3 a 5). 2. Adicionar uma certa quantidade de acetato de etila cuba de cromatografia de modo que o mesmo alcance o nvel de cerca de 5 mm. 3. Revestir a parede interna da cuba com um pedao de papel de filtro que v at o fundo. Feche a cuba e aguardar alguns minutos para que a atmosfera da cuba fique saturada com vapores do solvente de eluio. Eventualmente o nvel do lquido dever ser completado. 4. Introduzir a placa na cuba de modo que o nvel do lquido fique abaixo dos pontos de aplicao. Esperar o desenvolvimento do cromatograma mantendo a cuba fechada. 5. Quando a frente do solvente chegar a 1 cm da borda superior da placa, retira-la e marcar a distncia percorrida. Deixar a placa secar totalmente ao ar (10 a 15 minutos). 6. Antes da revelao com iodo examinar o cromatograma sob luz UV. Marcar cuidadosamente o contorno das manchas das substncias UV-ativas, com o auxlio de uma lapiseira ou outro objeto pontiagudo. 7. Para revelao definitiva, inserir a placa em recipiente seco contendo um pouco de cristais de iodo slido. Fechar devidamente a cmara de iodo e aguardar o surgimento de manchas na placa. 8. Medir (pelo centro da mancha!) as distncias percorridas pelos componentes de cada amostra analisada. Discusso 1. Com base no experimento realizado responda as seguintes questes: (a) Esquematize um desenho do cromatograma e diga quantos componentes foram detectados em cada amostra aplicada? (b) Determine os Rf das substncias puras (cafena e N-acetil-p-aminofenol) e de todos os componentes das solues de analgsico analisadas (solues 3 a 5). (c) Voc pode inferir inequivocamente que algumas amostras contm paracetamol? Ou cafena? Ou nenhum dos dois? Ou outros constituintes? Explique. 2. Sobre a tcnica cromatografia em camada delgada, responda: (a) Quais os fundamentos bsicos? (b) Cite os usos mais consagrados da tcnica (importncia). (c) Enumere as vantagens e desvantagens da tcnica. (d) Que caractersticas deve ter um solvente para ser considerado um bom eluente de desenvolvimento? No caso em questo voc considera o acetato de etila um bom solvente de eluio? (e) Que artifcios podemos utilizar quando suspeitamos que o(s) componente(s) da amostra a ser analisada pode no ser visvel a olho nu? 3. (Provo 2000) Uma mistura contendo os compostos I, II e III, representados abaixo, foi analisada pela tcnica de cromatografia em camada fina. A mistura foi aplicada em uma cromatoplaca de slica sem indicador de fluorescncia. Aps eluio com hexano:ter etlico (4:1) e revelao sob luz ultravioleta (254nm), a cromatoplaca apresentou o seguinte aspecto:

Rf = 0,77

(I)

(II)

(III)

Rf = 0,34

Quando a cromatoplaca foi revelada com iodo, foram observadas trs manchas. Pode-se afirmar que as manchas obtidas nos Rf 0,34 e 0,77 correspondem, respectivamente, s estruturas: (a) I e II. (b) I e III. (c) II e III. (d) III e I. (d) III e II. Cromatografia em coluna A cromatografia em coluna geralmente usada na separao preparativa ou purificao de substncias orgnicas. A tcnica requer uso de tubos de vidro, montados verticalmente, contendo o suporte slido finamente dividido (fase estacionria), em geral slica gel ou xido de alumnio. A substncia que se deseja purificar (ou mistura que se quer fracionar) aplicada no topo da coluna e a eluio da substncia efetuada mediante a percolao com solvente adequado. Na parte inferior da coluna recolhe-se um nmero de fraes, nas quais se encontram os componentes da mistura separados. A velocidade com que uma substncia trafega pela coluna depende de sua polaridade, da polaridade da fase estacionria e da polaridade do solvente (eluente). Se o composto mais atrado pela fase estacionria do que pelo solvente, ele migrar lentamente. Se sua afinidade for maior pelo solvente ele migrar mais rapidamente, gastando menos tempo e solvente. O xito de uma coluna depender ento da escolha do suporte e solvente adequados. Em alguns casos possvel visualizar a separao dos componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de faixas diferentes na coluna ou iluminando-a com luz ultravioleta (a coluna precisa ser de quartzo!). Entretanto, na maioria das vezes, torna-se necessrio o acompanhar a separao dos componentes examinando cada frao eluda por cromatografia em camada delgada (ccd). Instrues gerais sobre a tcnica de cromatografia em coluna 1. Escolha da fase estacionria e do solvente para uma coluna cromatogrfica Os suportes e solventes usados em uma coluna cromatogrfica, so normalmente, os mesmos utilizados em CCD. Portanto devem ser escolhidos mediante um exame prvio da amostra por cromatografia em camada delgada. A quantidade de adsorvente utilizada depende da quantidade de amostra a ser separada e do tipo de adsorvente. Misturas pouco complexas, tendo slica gel como suporte requer, no mnimo, a relao 1:50 amostra/slica. 2. Empacotamento da coluna As colunas de vidro utilizadas na tcnica tm a configurao que lembra uma bureta. Suas dimenses, obviamente, dependem da quantidade da amostra a ser processada. Dois mtodos so comumente usados para a introduo do suporte na coluna (empacotamento). No primeiro mtodo o

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suporte introduzido seco (Figura 5a,b). Coloca-se uma pequena bucha de algodo na base inferior da coluna para evitar a passagem do suporte slido pela torneira e a mesma preenchida at cerca da metade com solvente. Com a ajuda de um funil adaptado na parte superior da coluna introduz-se, lentamente, a fase estacionria que ser empacotada com o solvente, tendo-se o cuidado de retirar quaisquer bolhas de ar formadas. O empacotamento poder ser auxiliado com a introduo e escoamento de novas quantidades de solvente. Nunca deixe a superfcie do suporte livre de solvente. No segundo mtodo o suporte introduzido em suspenso no solvente, portanto, os mesmos cuidados devem ser observados durante a preparao e o empacotamento da coluna.

Figura 5. Colunas cromatogrficas. (a) Solvente adicionado coluna; (b) suporte slido sendo introduzido na coluna. 3. Introduo da mistura de compostos a ser separada; eluio dos compostos e monitoramento da coluna Quando a coluna estiver preparada deixa-se escoar o solvente at que reste uma diminuta quantidade de solvente na superfcie (evitar a todo custo que a coluna seque!). Introduzir, na sequncia, uma soluo concentrada (no solvente de eluio) do material que se deseja separar, com a ajuda de uma pipeta de Pasteur, tendo cuidado para no perturbar a superfcie do adsorvente. Se a mistura for lquida ela poder ser introduzida diretamente na coluna. Uma metodologia alternativa envolve a impregnao da amostra em pequena quantidade do adsorvente, com o auxlio de um solvente, seguida de evaporao e introduo do p resultante (farofa) na coluna. Esse procedimento particularmente til quando pelo menos um dos constituintes da amostra se dissolve apenas em solventes muitos polares. Inicialmente deixa-se eluir a amostra com um pouco de solvente at quase a secura (evitando-se que a coluna seque!). Introduz-se uma nova quantidade de solvente e a operao repetida. A coluna , ento, preenchida com o solvente, e iniciada a eluio propriamente dita. medida que as fraes vo sendo recolhidas na base da coluna (usando vrios Erlenmeyers numerados) torna-se necessrio adicionar mais solvente (Figura 6), cuja polaridade eventualmente pode ser modificada mediante mistura com outro solvente polar. Faa um monitoramento das fraes recolhidas por CCD, para verificar se todos os componentes da amostra foram eludos e quais as fraes podem ser combinadas, pois um componente individual pode estar presente em vrias fraes contguas. Algumas fraes podem conter mais de um componente, essas fraes no devem ser reunidas com as que contm apenas um componente. Posto que as fraes recolhidas encontram-se diludas, necessrio evapora-las para obter o componente puro. Em alguns casos, a evaporao do solvente indispensvel, mesmo antes da anlise cromatogrfica.

Figura 6. Coluna cromatogrfica acoplada a um funil de separao para manter o nvel do solvente na superfcie superior.

Cromatografia Rpida (flash-column chromatography, FC)

Uma tcnica muito utilizada no fracionamento de uma mistura de compostos a cromatografia rpida ou cromatografia sob baixa presso. A tcnica, que se vale de colunas curtas e eluio acelerada sob presso, efetua a separao de componentes com diferenas de Rf 0,05 em tempo relativamente reduzido (1-3h). Presses mais elevadas permitem a separao de maneira mais rpida (10-15min), entretanto, a resoluo apenas moderada (Rf 0,15). O aparato necessrio para a tcnica consiste em uma coluna com dimetro apropriado, equipada com reservatrio de solvente e vlvula de controle de presso (Figura 7). A presso necessria fornecida por cilindro de nitrognio ou argnio, e a quantidade de suporte a ser utilizada normalmente calculada multiplicando-se a quantidade de material que se deseja separar por fator de 20-60. A coluna empacotada dever ter cerca de 10 a 15 cm. A escolha do eluente feita da mesma forma que numa coluna normal (CCD), recomendando-se o eluente capaz de carrear o componente desejado da mistura a um Rf = 0,35. A coluna preenchida com adsorvente (slica-gel 60) e o solvente de eluio forado sob presso at que a coluna esteja empacotada (livre de bolhas de gs). Adiciona-se, ento, a amostra no topo da coluna (com as precaues mencionadas na cromatografia de coluna convencional) e procede-se a eluio sob presso, a uma velocidade controlada ( 2 pol/min medida pelo nvel do eluente). Uma separao tpica por esta tcnica mostrada na Figura 8. Por essa tcnica tambm se recomenda no deixar a coluna secar.

Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A.; Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem., 1978, 43, 2923.

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Figura 7. Coluna para cromatografia rpida.

Figura 8. Separao tpica em cromatografia rpida. A cromatografia rpida um bom mtodo para a separao de componentes de uma mistura de complexidade moderada. Entretanto, a necessidade de presso e aparelhagem sofisticada (colunas com dimetros variveis, vlvula para controle de presso, reservatrio de solvente, cilindro de gases) constituem fatores limitantes da tcnica. Cromatografica rpida a seco (dry-column flash chromatografy)
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Um mtodo alternativo cromatografia rpida (FC) a cromatografia rpida a seco. A tcnica combina as vantagens de aparelhagem e operao simples. Um fator de distino entre ambas o uso de suco em lugar da presso positiva. Um segundo fator de diferenciao que os solventes de eluio so adicionados em volumes pr-determinados e a coluna drenada at a secura, antes da adio de uma nova adio do eluente. A aparelhagem usada constitui-se apenas de um funil cilndrico sinterizado, adaptado a um balo com sada para trompa dgua (Figura 9).

Harwood, L. M.; Dry-Column Flash chromatography. Aldrichimica Acta, 1985, 18, 25; (b) Yau, E. K.; Coward, J. K.; Filtering-Column Chromatography - A Fast, Convenient Chromatographic Method - Aldrichimica Acta, 1988, 21, 106.

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Figura 9. Equipamento para cromatografia rpida a seco. A tabela abaixo fornece a orientao para escolha do tamanho de funil, da quantidade de adsorvente, de amostra e do solvente utilizados. Tamanho do funil (mm) dimetro/comprimento 30/46 40/50 70/55 Slica (g) 15 30 100 Quantidade de amostra 15-500 mg 500 mg 3 g 2-15 g Frao de solvente (mL) 10-15 15-30 20-50

O procedimento tcnico envolve o preenchimento do funil com o adsorvente sob suco, de forma que se obtenha uma superfcie superior uniforme. Ainda sob vcuo, adicione coluna o solvente de menor polaridade (e no qual a amostra a cromatografar seja solvel); se a coluna estiver empacotada corretamente, a frente de solvente ser vista descendo em uma linha horizontal. Se isto no ocorrer, repita o procedimento de empacotamento. Com a coluna corretamente empacotada adicione (cuidadosamente!) o eluente superfcie da mesma at que o solvente chegue ao frasco receptor. Nesse momento cesse o fornecimento do eluente e seque adsorvente sob suco. Introduza a amostra a ser processada no topo da coluna pelos mtodos usuais. Sempre sob suco, inicie a eluio das fraes por adio sucessiva de pores definidas do solvente, drenando completamente a coluna aps cada adio (a superfcie do adsorvente no dever ser perturbada durante a adio de solvente). Os solventes mais recomendados para a maioria das separaes so pentano (hexano), ter, acetato de etila e metanol. A polaridade dos solventes pode ser alterada mediante misturas, observando-se que o gradiente de aumento dever situar-se na faixa de 5 a 10%. Separaes com a mesma eficincia das obtidas em CCD so facilmente realizadas. A perda de material mnima, e h economia de tempo e solventes. A baixa difuso das bandas dos componentes da mistura durante a cromatografia significa que, geralmente, cada um eludo praticamente puro em uma ou duas fraes. Parte Experimental B-I. Separao do orto e para-nitrofenis por cromatografia de camada delgada Objetivo: Estabelecer as condies experimentais para a separao de o- e p-nitrofenol por CCD (cromatografia em camada delgada). Nesse estudo sero utilizadas solues de amostras autnticas de p-nitrofenol (soluo 1) e de o-nitrofenol (soluo 2). A mistura reacional de nitrao do fenol (soluo 3) foi preparada por diluio do produto bruto obtido segundo o esquema abaixo:

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OH HNO3-H2O OH NO2 + NO2 OH

Procedimento 1. Preparar trs cmaras cromatogrficas com alguns mL dos solventes em ensaio (por ex. diclorometano, acetato de etila, hexano, metanol, puros ou com polaridades ajustadas por misturas). Colocar meia folha de papel de filtro encostada parede das cmaras para acelerar a saturao das mesmas com o vapor do solvente. 2. Preparar trs micro-placas com slica gel para CCD (confira mtodos descritos na parte terica sobre CCD). Com um tubo capilar, aplicar em cada micro-placa, devidamente espaadas entre si e a cerca de 10 mm da margem, as solues autnticas de p-nitrofenol e o-nitrofenol, e a soluo da mistura reacional da nitrao do fenol. As manchas resultantes no devem atingir dimetros superiores a 3 mm. 3. Marcar na placa o ponto at onde o solvente deve atingir - cerca de 10 mm da borda superior. 4. Mergulhar cuidadosamente cada micro-placa em cada solvente escolhido, de modo que os pontos de aplicao das amostras fiquem acima do nvel do solvente. Aguardar o desenvolvimento dos cromatogramas. Atingido o ponto final, remover as placas. 5. Observar os resultados, estabelecendo qual solvente efetuou melhor separao (as manchas devem ser visveis!) Para fins de registro, desenhar as cromatoplacas. Discusso 1. Com base nos resultados escolha o melhor solvente de desenvolvimento (melhor separao). 2. Determine os valores de Rf de cada componente, obtidos na melhor separao. 3. Voc pode inferir inequivocamente que alm do o- e p-nitrofenol, existe um outro componente na soluo 3? Em caso afirmativo, que impureza (contaminante) poderia estar presente na soluo reacional? Explique. 4. Qual (ais) dos eluentes testados voc recomendaria para eluir a coluna cromatogrfica? Justifique. PARTE EXPERIMENTAL B-II. Separao da mistura de o- e p-nitrofenol por cromatografia em coluna Procedimento 1. Preparao da coluna Colocar um pequeno chumao de algodo hidrfilo na base inferior da coluna (use basto de tamanho adequado). Encher a coluna at cerca de 1/4 com o primeiro eluente da srie. Testar se a torneira est estanque. Pesar aproximadamente 20 g de slica-gel em bquer de 100 mL; adicionar o primeiro eluente em quantidade bastante para formar uma papa homognea; misturar bem removendo as bolhas de ar.

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Abrir a coluna de modo a gotejar o solvente em um Erlenmeyer durante o processo de empacotamento. Com a ajuda de basto de vidro deitar, de modo contnuo, a suspenso de slica na coluna (o solvente recolhido no Erlenmeyer deve ser utilizado novamente para carrear todo adsorvente para a coluna). Se a adio da suspenso de adsorvente coluna for interrompida por algum tempo, o mesmo tende a sedimentar-se, formando zonas estratificadas. Uma maneira de evitar esta situao agitar o solvente na coluna com uma vareta de vidro entre duas adies sucessivas. Deixar gotejar o solvente 5-10 minutos aps o enchimento da coluna para facilitar a sedimentao da slica. Fechar a torneira quando o solvente apenas cobrir a coluna de slica. Opcionalmente colocar uma rodela de papel de filtro, ou fina camada de algodo, no topo da coluna para proteger a superfcie da slica (recomendvel aps introduo da amostra a fracionar! ). 2. Preparao e aplicao da amostra Com o auxlio de pipeta ou seringa introduzir, lentamente, no topo da coluna cerca de 2 mL da soluo de nitrofenis. Deixar que a soluo a cromatografar penetre na coluna mediante controle da torneira. Com pequenas quantidades de solvente carrear toda a amostra para dentro da coluna. 3. Eluio dos componentes da amostra Encher a coluna com o solvente (ou mistura de solventes) menos polar, tomando extrema precauo para no perturbar a superfcie do adsorvente (a rodela de papel de filtro ou camada de algodo so teis nesse estgio!). Recolher as fraes eludas em Erlenmayers de 50 mL, previamente numerados. O volume de cada frao deve, em mdia, ser de aproximadamente 1/10 do volume da coluna. Vigiar constantemente o volume de solvente na coluna, a qual deve jamais secar! Monitorar a separao e pureza de cada frao por cromatografia em camada delgada (ccd). A eluio dever ser continuada at a sada total de todos os componentes. As fraes contendo cada componente puro devero ser reunidas em bales apropriados e o eluente evaporado com auxlio de roto-evaporador. Discusso 1. Baseado em argumentos estruturais, comente sobre separao do o-nitrofenol e p-nitrofenol. Que outras diferenas nas propriedades fsicas desses dois ismeros podem ser explicadas usando-se os mesmos argumentos? (Propriedades do o-nitrofenol e p-nitrofenol descritas no Index Merck, cpia anexa). 2. Compare os obtidos na CCD com os tempos de reteno observados em cromatografia em fase gasosa (CG, cromatogramas anexos). 3. (Provo 2001) Um qumico deseja separar os compostos abaixo por cromatografia em coluna, utilizando slica como adsorvente.
CH2CH3 CH2CH3 CH2CH3

(X)

(Y)

(Z)

Para tal, percolou a coluna seqencialmente com os solventes I, II e III, que formam uma srie eluotrpica. A primeira frao continha o composto X, a segunda frao, o composto Y, e a ltima

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frao, o composto Z. Qual dos sistemas de solventes abaixo serve como fase lquida para justificar a ordem de eluio encontrada? Solvente I Solvente II Solvente III (A) hexano acetonitrila tolueno (B) hexano tolueno CH2Cl2 (C) tolueno hexano acetonitrila (D) acetonitrila CH2Cl2 hexano (E) CH2Cl2 tolueno hexano 1. (Provo 2001) A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) um dos mtodos cromatogrficos mais modernos utilizados em anlise (CLAE analtica) e separao/purificao de misturas (CLAE preparativa). Abaixo so dados os cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de compostos presentes em analgsicos: aspirina (A), cafena (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando trs fases mveis diferentes, no modo isocrtico, em uma mesma coluna.

Avaliando esses cromatogramas, responda s perguntas abaixo. (a) Qual a fase mvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase mvel mais adequada para utilizao em escala analtica, considerando um grande nmero de amostras a serem analisadas? Justifique sua resposta. (b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes trs experimentos? Justifique sua resposta. (c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de reteno? Justifique sua resposta. DISPOSIO DOS RESDUOS E INSUMOS Alguns resduos aquosos podero ser descartados na pia com gua corrente. O demais resduos lquidos e slidos (solventes, mistura de solventes, slica, etc.) devero ser acondicionados em frascos apropriados, segundo orientao do instrutor. Os produtos slidos e lquidos devero ser reservados, aps a purificao, para utilizao como insumos em prticas posteriores.