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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP

P 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA

PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRO NO SETOR DE IMUNOHEMATOLOGIA

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Elaborado: Hildenete Monteiro Fortes Data da Elaborao: 08.06.2004 Aprovado e liberado por: Hildenete Monteiro Fortes Data da implantao: Data da Reviso: 10/11/11 Periodicidade da Reviso: anual Tempo de arquivo: 05 anos Setor: Setor de Imunohematologia Cdigo do documento: Imunohem 07 Nmero da verso atual: 05 Nmero total de Pginas: 21

Assinatura:

REVISADO: Hildenete Monteiro Fores

Nmero de cpias - distribuio: 02 Original para a direo arquivo Setor de Imunohematologia da Agncia Transfusional

ESTE UM DOCUMENTO CONTROLADO No deve ser copiado ou distribudo sem a autorizao da chefia da agncia transfusional do HUJM.

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1. OBJETIVO E APLICAO: O objetivo da padronizao o melhor aproveitamento tcnico dos reagentes, mais agilidade e confiabilidade nos exames realizados no setor de imunohematologia da agncia transfusional do HUJM, obedecendo a (Portaria No1353 de 13 de Junho de 2011). 2. OBJETIVOS GERAIS: Identificar o Grupo Sangneo, realizar Coombs dirteo e pesquisar anticorpos irregulares dos pacientes do HUJM. 3. OBJETIVO ESPECFICO: Apoio tcnico nas investigaes imunohematolgicas para pacientes do HUJM. 4. PRINCPIO: Determinar o Grupo ABO: A tipagem sangnea direta pesquisa a presena de antgenos ABO nas hemcias teste e a reversa seus anticorpos correspondentes utilizando hemcias conhecidas A1 e B. Caso haja necessidade ser feita a pesquisa de subgrupos de A e AB. Determinar o Fator Rh: Na determinao do tipo Rho (D), obrigatrio o uso do soro anti-D e do controle Rh da mesmo fabricante e marca do soro Anti-D em uso, este ltimo pela possibilidade da presena de auto-anticorpos e /ou protenas sricas anormais. Pesquisar Anticorpos Irregulares: Visa detectar anticorpos irregulares clinicamente significantes no soro/plasma dos recm nascidos ou de suas mes, bem como de pacientes do HUJM, consiste em testar o soro teste com hemcias conhecidas (TRIACEL). Nos casos positivos devero ser identificados os anticorpos atravs do uso de painel. 5. TIPAGEM SANGNEA ABO/ Fator Rh/Subgrupos AMOSTRAS: Hemcias / soro ou plasma do doador O tcnico do servio de Hemoterapia - SETOR DE COLETA dever colher s amostras

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA Identificao dos tubos de hemlise da amostra do doador ser feita na triagem clnica com etiqueta de cdigo de barra, constando iniciais, nmero do doador e data coleta. Colher em tubo de hemlise 120x100 mm com EDTA - de 04 ml de sangue (ABO, Rh, CRh) Colher em tubo de hemlise seco 150x100 mm - 10 ml de sangue sem anticoagulante para realizao de PAI. As amostras hemolisadas ou lipmicas devem ser desprezadas. MATERIAIS: Equipamentos / Outros: Centrfuga sorolgica de mesa Estante porta tubos Banho Maria 37C Micropipetas: 50 l, 100 l e 1000 ul. Tubos de hemlise 120x100 mm e 150x100 mm. Negatoscpio ou aglutinoscpio REAGENTES: Soro mono ou policlonais anti-A, anti-B, anti-A,B. Caso seja utilizado anti-soros MONOCLONAIS, a utilizao do soro anti-A,B no necessria. Soro anti-D albuminoso (Rh), mono ou policlonais Soro anti-D salino Soro anti gama globulina = Coombs = Monoespecfico. Soro poliespecfico = Anti Humano. Controle de Rh, da mesma procedncia do soro anti-D. Hemcias conhecidas de grupo A1 e B em suspenso salina 3 5%. Hemcias comerciais para triagem de anticorpos. Controle de Coombs Lecitinas anti-A1 e anti-H. PROCEDIMENTOS: Antes de iniciar o trabalho de o dia fazer o controle interno de todos os reagentes que sero utilizados na rotina para testes em tubo modelo anexo.

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MTODO EM TUBO PREPARAR SUSPENSO HEMCIAS: Identificar um tubo de hemlise 120x100 mm com nmero do Doador Hemcias suspensa em SALINA 3 a 5% Identificar 01 tubo de hemlise 120x100 nmero do doador Colocar - 1000 l Salina soro fisiolgico Colocar - 75 l Hemcias do Doador no tubo identificado SEPARAO DO SORO Centrifugar o tubo sem anticoagulante 3 min / 3400 rpm. Separar o soro do doador em um tubo de hemlise j identificado. CLASSIFICAO SANGUNEA ABO/Rh O sistema ABO primeiro sistema de grupo sangneo descoberto, o nico onde anticorpos estaro certamente presentes no soro de indivduos que no possuam o(s) antgeno(s) correspondente(s). o sistema mais importante para a prtica transfusional. A classificao direta pesquisa a presena dos antgenos ABO nas hemcias testes, usando anti-soros, enquanto a reversa pesquisa seus anticorpos correspondentes no soro, utilizando hemcias comerciais. Identificar os tubos 120 x 100 mm com caneta de retro projetor

AB

Rh

CR h

HA

HB

DIRETA

REVERSA

1. Colocar

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA 50 ul Soro Anti A no tubo A 50 ul Soro Anti B no tubo B 50 ul Soro Anti A,B no tubo AB 50 ul Soro Anti Rh (D) no tubo Rh 50 ul Controle Rh no tubo CRh - Controle de Rh 100 ul Soro teste (doador) nos tubos de HA e HB

2. Colocar 50 ul hemcias A1 no tubo HA 50 ul hemcias B no tubo HB 50 ul Suspenso Hemcias do doador nos tubos de A a CRh 3. 4. 5. 6. 7. Homogeneizar bem os tubos Colocar para centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto Ressuspender o boto de hemcias formado agitando levemente Ler para aglutinao e hemlise, usando auxiliar tico. Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduao apropriada INTERPRETAO: DIRETA Soro Anti-B + + REVERSA Hemcias Hemcias A1 B + + + +

Reagentes / Grupo ABO A B AB O

Soro Anti-A + + -

Soro Anti-AB + + + -

A presena de aglutinao nos tubos de hemcias teste e presena de hemlise nos tubos de soro teste indicam reaes positivas. Hemcias suspensas, aps leitura do boto de hemcias, correspondem a resultado negativo. Discrepncias entre a classificao direta e reversa devem ser resolvidas antes da interpretao do grupo sanguneo da amostra teste. No devero ser liberados antes da realizao de testes adicionais necessrios, incluindo-se testes com lecitinas antiA1 e anti-H. Verso: 05 Cdigo: ImunoHem 07 paginao: 6 de 21

AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA Qualquer discrepncia entre a tipagem DIRETA e REVERSA dever ser resolvida pelo responsvel tcnico do servio que ser informado imediatamente. Rh Positivo e Rh Negativo O termo Rh positivo e Rh negativo, refere-se a presena (Rh positivo) ou ausncia (Rh negativo) na membrana da hemcia do antgeno D, que , aps os antgenos A e B, o mais importante em transfuso de sangue. O anticorpo anti-D no esta normalmente presente no soro/plasma dos pacientes Rh negativos. Seu desenvolvimento depende de uma exposio prvia ao antgeno, 80 % das pessoas Rh negativo que recebem pelo menos uma transfuso Rh positivo, poder desenvolver o anticorpo anti-D. O antgeno muito imunognico determinando que grandes partes das pessoas expostas ao antgeno desenvolvam o anticorpo. Os mecanismos comuns de imunizao gestao e/ou transfuso anterior. Outros antgenos do sistema Rh tem tambm importncia clnica, entre eles C (grande) e c (pequeno), E (grande) e e (pequeno). A combinao dos 05 principais antgenos do sistema Rh, avaliando-se a partir da nomenclatura de Fisher e Race oferece ferramentas para a resoluo de problemas dirios. INTERPRETAO para tipagem Rh e Pesquisa de D-fraco: Quando a tipagem para D ou D-fraco resultar positivo o sangue ser rotulado como Rh POSITIVO. Quando a tipagem para ambos resultar negativo o sangue ser rotulado como Rh NEGATIVO. Para que a tipagem do fator Rh possa ser considerado como vlido o resultado do controle de Rh sempre NEGATIVO. Caso o controle de Rh (tubo CRh) seja POSITIVO no considerar o seu Rh e proceder da seguinte maneira: Considerar INVLIDA a tipagem Rh. Chamar o responsvel para resolver o caso. Nestes casos dever ser utilizado o soro anti-D salino

Todos os resultados Rh Negativo fazer a pesquisa de D-fraco

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PESQUISA de D-fraco: Pegar os 02 tubos de hemlise identificados Rh e CRh que deram negativos Incubar os 02 tubos - Rh e CRh em Banho Maria a 37C durante 15 minutos Retirar os tubos do BM e centrifuga-los a 3400 rpm por 15 segundos Fazer a leitura para presena ou ausncia de aglutinao Quando negativo realizar a lavagem 3 x com soro fisiolgico Desprezar o sobrenadante e secar bem os tubos Adicionar soro de Coombs (Anti IgG) 100 ul, homogeneizar bem os tubos Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos Fazer a leitura Se houver ausncia de aglutinao nos 02 tubos: Pingar Controle de Coombs 50 ul cada tubo Homogeneizar, centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos e fazer a leitura. Para que o teste seja validado os tubos devem dar positivos, caso contrrio reiniciar todos os procedimentos. D fraco A caracterstica de reagir de modo atpico com anti-D apresentada por algumas clulas foi descrita por Stratton, em 1946, como sendo tais clulas portadoras do fentipo D-fracas. De acordo com a descrio original, esse fentipo no reagia ao mtodo de aglutinao direta, mas podiam ser expressos com o uso da tcnica de AGH indireto (Coombs Indireto). Atualmente sabemos que a diferena entre D Positivo e D-fraco quantitativa, no qualitativa. A maioria dos soros monoclonais utilizados regularmente nas rotinas capaz de detectar a maioria das amostras que foram at ento classificadas como D-fraco. D Parcial As hemcias que ao ser testado com antisoros monoclonais apresentarem resultados negativos para o antgeno D, ou seja, Rh negativo devero ser testadas novamente utilizando-se reagentes de origem humana, policlonais para determinao da possibilidade de tratar-se de um D categoria. Sabe-se que a presena de epitopos de um antgeno D parcial capaz de determinar a formao de um anticorpo correspondente.

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA Os D parciais, fentipos raros de antgeno D positivos, foram divididos em categorias numeradas de I a VII. As categorias III, IV e V, em face de algumas outras evidencias sorolgicas foram subdivididas. RECOMENDAES: 1. Utilizar um antissoro monoclonal que detecta o antgeno D parcial categoria VI (DVI- ou IgG) e um antissoro que no detecta o antgeno D parcial categoria VI (DVI- ou Ig M), quando houver discrepncia nos resultados entre os dois antissoros utilizados deve-se investigar a presena de D fraco e D parcial na amostra. 2. Em pacientes RhD-negativo recomenda-se a pesquisa de antgeno C e E

6. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PRINCPIO: Anticorpos ditos irregulares so aqueles formados por imunizao devido a transfuses, gestao ou ingesto constante de material imunognico, sendo de classe IgG ou IgM. um teste de triagem onde em casos de pesquisa positiva, deve-se identificar a classe e especificidade do anticorpo. O teste emprega um KIT contendo no mnimo duas suspenses de hemcias O (hemcias de triagem), as quais possuem a maioria dos antgenos estudados em rotina de banco de sangue. Havendo presena de anticorpos irregulares no soro a ser testado, estes reagiram com os antgenos correspondentes, presentes nas hemcias de triagem. Anticorpos da classe IgM so normalmente detectados em meio salino e temperatura ambiente, enquanto que anticorpos da classe IgG so detectados atravs da utilizao do soro antiglobulina humana aps a incubao a 37C. Quanto s enzimas proteolticas, sabe-se que modificam os antgenos presentes na membrana eritrocitria, podendo retir-los ou torn-los aglutinveis em suspenses salinas. Os antgenos sensveis ao enzimtica so os dos sistemas MNS Duffy Xga. Os anticorpos cuja reatividade aumentada pela ao de enzimas so os dos sistemas Rh, Kidd, Lewis e P. A ao enzimtica inclui ainda modificaes nas propriedades fsicas da suspenso de hemcias, podendo causar auto-aglutinao sem presena de processos auto-imunes. As tcnicas enzimticas podem ser associadas ao soro anti-gama globulina humana (soro anti IgG) e podem ser utilizadas em tcnicas de 1 ou 2 estgios. Na primeira adiciona-se a enzima diretamente mistura soro + hemcias, sendo mais bem indicada

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA para testes de triagem enquanto que no segundo procedimento as hemcias so previamente tratadas com enzimas e depois misturadas ao soro teste, sendo mais bem indicado para identificao de anticorpos. As principais enzimas utilizadas em testes imunohematolgicos so: BROMELINA (abacaxi), PAPAINA (mamo), TRIPSINA (estmago de porco) e FICINA (ficus). As alquotas de soluo enzimticas devem ser mantidas em freezer, devendo-se desprez-las aps o descongelamento e utilizao.

PESQUISA de ANTICORPOS: SALINA / ALBUMINA / A.G.H. Identificar 2 Tubos

II

Soro desconhecido Pingar 100 ul cada tubo Hemcias Triacel I Pingar 50 ul no tubo I Hemcias Triacel II Pingar 50 ul no tubo II Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto Ressuspender o boto de hemcias formado agitando levemente Ler para aglutinao e hemlise, usando um auxiliar tico. Interpretar Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduao apropriad CASO os tubos I e II seja:

II

A. Negativo Albumina Bovina 22% acrescentar 100 ul cada tubo Incubar em Banho-maria 37C por perodo variando entre 15 minutos e 1 hora de acordo com a orientao do fabricante. Centrifugar 3400 rmp por 15 segundos, ler e anotar os resultados. Verso: 05 Cdigo: ImunoHem 07 paginao: 10 de 21

AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA Lavar 03 vezes com soro fisiolgico, desprezar o sobrenadante e secar os tubos. Soro Anti Humano (Poli especfico) acrescentar 100 ul em cada tubo Homogeneizar e centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os resultados.

POSITIVO = presena de anticorpos irregulares encaminharem amostra ao MT HEMOCENTRO para identificao de anticorpos e comunicar ao responsvel pelo Servio. NEGATIVO = Ausncia de anticorpos irregulares neste caso: Acrescentar Controle Coombs 1 gota em cada tubo, Homogeneizar e centrifugar os tubos a 3400 rpm por 15 segundos e ler, o resultado dever ser POSITIVO com intensidade de 3 / 4+.

Esta ltima etapa permite avaliar: Se as hemcias testes foram corretamente lavadas, caso contrrio haver neutralizao dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no soro do paciente, que no foram totalmente retiradas com a lavagem das hemcias, apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro AGH que est sendo utilizado esta funcionando. Repetir a pesquisa caso no se observe aglutinao, utilizando um frasco novo de soro AGH.
B. Positivo: Fazer a identificao de anticorpos 7. IDENTIFICAO DE ANTICORPOS IRREGULARES: OBJETIVO: Identificar e caracterizar o anticorpo, para fins de pesquisa de reaes transfusionais e doena Hemoltica Peri-Natal. Seleo de sangue compatvel antgeno negativo. PRINCPIO: Anticorpos ditos irregulares so aqueles formados por imunizao devido a transfuses, gestaes ou ingesto constante de material imunognico, sendo de classe IgM ou IgG, Em testes pr-transfusionais, alm da determinao ABO e Rh e prova de compatibilidade, obrigatria tambm a realizao da pesquisa de anticorpos irregulares em receptores de hemocomponentes (RDC No 153 de 14/06/04). Quando observada positividade no teste de triagem, deve-se identificar a classe e especificidade do anticorpo responsvel e selecionar sangue compatvel, antgeno

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA negativo para a transfuso. A identificao de anticorpos emprega um kit contendo no mnimo 10 suspenses de hemcias de adulto O e 01 suspenso de hemcia de cordo O. A determinao da especificidade se d por comparao do resultado obtido com o soro teste e um diagrama listando os fentipos das 11 hemcias, as quais possuem a maioria dos antgenos estudados em rotinas de banco de sangue. Anticorpos de classe IgM so normalmente detectados em meio salino e temperatura ambiente, enquanto que anticorpos IgG so detectados atravs da utilizao do soro anti-humano (POLIESPECIFICO) aps incubao a 37C.

AMOSTRAS: 10 ml de sangue sem anticoagulante. Encaminhada HEMOCENTRO, no fazemos identificao de anticorpos. REAGENTES:

ao

MT-

Estojo contendo no mnimo 10 hemcias de adultos em pool de hemcias de cordo de grupo O, contendo a maior combinao de 3/5%, obtidas comercialmente ou preparadas diariamente no laboratrio a partir de uma populao de doadores locais (no aconselhvel). Soluo fisiolgica. Soro anti-humano (poli especfico). Reagente comercial de hemcias controle, recobertas por anticorpos IgG Albumina bovina a 22% (opcional). MATERIAIS: Centrfuga sorolgica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automtica 50 l e 100 l e 1000 l. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscpio para leitura. PROCEDIMENTO: 1. Identificao de Anticorpos Irregulares (mtodo tubo) 2. Identificar 11 tubos de 10x75 mm, dispensar 50 ul das hemcias de painel correspondente. Incluir tambm 01 tubo de autocontrole, dispensando 1 gota das hemcias testes, em suspenso de 3-5%.

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA 3. 4. 5. 6. 7. Adicionar 100 ul do soro a ser testados aos tubos. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. Realizar leitura e anotar os resultados. No observando positividade, incubar os tubos a 37C por 60 minutos ou adicionar 2 gotas de albumina bovina a 22%, reduzindo o perodo de incubao para 20 minutos. Em caso de presena de positividade nesta fase, resfriar os tubos a temperatura de 16C tambm por 60 minutos (no utilizar albumina bovina aqui, evitando-se resultados falsos positivos). 8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 9. Realizar leitura e anotar os resultados. 10. Lavar 03 vezes o contedo dos tubos com salina, decantando e secando bem as bordas destes na ultima lavada. 11. Adicionar 100 ul de soro anti-humano (poli especfico). 12. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 13. Realizar leitura, anotar e interpretar os resultados. 14. Adicionar 50 ul de hemcias controle comercial (controcel), aos tubos onde se observou reao negativa. 15. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 16. Realizar leitura o resultado dever ser positivo com intensidade de 3+/4+.

Esta ltima etapa permite avaliar: Se as hemcias testes foram corretamente lavadas, caso contrrio haver neutralizao dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no soro do paciente, que no foram totalmente retiradas com a lavagem das hemcias, apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro AGH que est sendo utilizada esta funcionando. Repetir a pesquisa caso no se observe aglutinao, utilizando um frasco novo de soro AGH.
INTERPRETAO: Ausncia de aglutinao em todas as etapas do teste indica ausncia de anticorpos irregulares contra os antgenos presentes nas hemcias de triagem. Presena de aglutinao em incubao em temperatura ambiente indica presena de anticorpos de classe IgM. Presena de aglutinao em incubao a 37C indica presena de anticorpo de classe IgM reativo e/ou anticorpo classe IgG. Anticorpos de classe IgM so considerados de

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA importncia clinica quando so reativos a partir de temperaturas de 30C, devendo-se nesses casos selecionar sangue antgeno negativo para transfuso. Presena de aglutinao em fase de anti-gamaglobulina humana indica presena de anticorpos de classe IgG, os quais possuem importncia transfusional, devendo-se sempre selecionar sangue antgeno negativo para transfuso. Casos inconclusivos ou com presena de mltiplos anticorpos devero ser testados em outras tcnicas descritas neste manual (P.E.G., D.T.T. enzimas), comparando-se os resultados da(s) tcnica(s) apropriada(s) com o primeiro teste de identificao de anticorpos realizados. 8. SELEO DE DOADORES DO GRUPO O COM BAIXO TTULO DE AGLUTININAS O PERIGOSO OBJETIVO: Seleo de sangue total ou plasma do tipo O em transfuses heterologa. Este procedimento est sendo realizado no MT-HEMOCENTRO. PRINCPIO: O sangue total de grupo O pode ser usado em pacientes com outros grupos sangneos, em uma quantidade que no exceda um litro e nas emergncias. Nestes casos devem ser testados em salina e ter um ttulo de aglutininas anti-A e antiB menor que 100. AMOSTRAS: 05 ml de sangue sem anticoagulante. MATERIAIS: Centrfuga sorolgica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automtica 50 l e 100 l e 1000 l. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscpio para leitura. REAGENTES: Soluo fisiolgica. Suspenso de hemcias A1 e B, a 3-5%. PROCEDIMENTO: 1. Em tubo de ensaio 10x75 mm, limpo preparar uma diluio do soro a ser testado a 1/100 (diluio em soluo fisiolgica).

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA 2. Transferir 100 l da diluio para dois tubos de ensaio 10x75mm, previamente identificados como, A1 e B. 3. Adicionar aos tubos 50 ul das hemcias A1 e B, em seus respectivos tubos. 4. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 5. Realizar leitura e interpretar os resultados. INTERPRETAO: Aglutinao em um dos dois tubos, A1 e B indica presena de aglutininas salinas a um ttulo maior que 1/100. Os soros que no aglutinarem considerado de baixo titulo e este sangue pode ser usado para transfuso heterloga. Os soros que aglutinarem para uma ou ambas as hemcias, devero ser consideradas de alto ttulo e no devem ser usados em transfuso Heterloga. 9. TITULAO DE ISOHEMAGLUTININAS OBJETIVO: Exame imunohematolgico de auxilio no diagnstico de incompatibilidade ABO materno-fetal. Este procedimento est sendo realizado no MTHEMOCENTRO. PRINCPIO: A titulao de isohemaglutininas anti-A e anti-B realizada a fim de se obter a quantidade relativa de anticorpos presentes no soro ou plasma a ser testado. O titulo de um anticorpo dado pela realizao de diluies seriadas do soro contra hemcias contendo o antgeno correspondente. O resultado obtido considerando-se a maior diluio do soro onde observada a aglutinao. AMOSTRAS: 04 ml de sangue sem anticoagulante. MATERIAIS: Centrfuga sorolgica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automtica 50 l e 100 l e 1000 l. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscpio para leitura. REAGENTES: Soluo fisiolgica. Hemcias de grupo A1 e B em suspenso de 2 a 5%, as quais podem ser obtidas comercialmente ou preparadas diariamente no laboratrio.

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PROCEDIMENTO: 1. Preparar uma bateria de tubo 10x75 mm identificando-os como: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048 e 1/4096, para uma titulao seriada. 2. Com exceo do tubo 1/1, adicionar 100 l de salina em todos. 3. Adicionar 100 l do soro a ser testado aos tubos 1/1 e 1/2. 4. A partir do tubo 1/2 transferir 100 l da mistura para o tubo seguinte sucessivamente. 5. Reservar a ponteira no tubo 1/4096, caso seja necessrio continuar as diluies. 6. Com exceo do tubo 1/4096, adicionar 50 ul da suspenso de hemcias contendo o antgeno correspondente a tipagem reserva do soro teste. 7. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. 8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 9. Realizar leitura e anotar os resultados. INTERPRETAO: Considerar como titulo a maior diluio do soro onde se observa aglutinao fidedigna. Em caso de soro teste O, efetuar uma bateria para Anti-A e outra para Anti-B. Soros de grupo AB, no tero titulo de isohemaglutininas. 10. DIFERENCIAO ENTRE AGLUTINAO E FNOMENO DE ROLEAUX OBJETIVO: Descartar uma reao de falsa aglutinao PRINCPIO: O fenmeno de Roleaux, confundido com o de aglutinao, pode ser identificado microscopicamente e caracterizam-se por aderncia das hemcias umas as outras se assemelhando uma pilha de moedas. importante tambm conhecer o diagnstico do paciente e o meio diluente dos reagentes usados (protico ou salino). Pois, sabe-se que as globulinas normalmente esto aumentadas quando a proporo 2:1 de albumina: globulina est invertida. MATERIAIS: Centrfuga sorolgica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automtica 50 l e 100 l e 1000 l. Tubos de ensaio 10 x 75 mm e Negatoscpio para leitura. REAGENTES: Soluo fisiolgica.

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PROCEDIMENTO (mtodo tubo) 1. Realizada a leitura do teste e detectado o fenmeno de Roleaux 2. Recentrifugar o contedo do tubo por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 3. Remover o soro do tubo teste e adicionar a mesma quantidade de salina (100 l) homogeneizar. 4. Centrifugar novamente por 15 segundos a 3400 R.P.M.. ou 1 minuto a 1000 R.P.M.. 5. Ressuspender o boto formado, realizando leitura. INTERPRETAO: Adicionando-se a salina o fenmeno de roleaux desaparece e havendo realmente aglutinao, esta permanecer visvel. Em caso de dvida, observar em microscpio. 11. TESTE DA ANTIGLOBULINA DIRETA (T.A.D.) OBJETIVO: Pesquisar sensibilizao in vivo atravs de transfuso e gestao PRINCPIO: utilizado para demonstrar-se a presena de hemcias recobertas por anticorpos in vivo, principalmente IgG e C3d. AMOSTRAS: 05 ml de sangue com anticoagulante. MATERIAIS: Centrfuga sorolgica de mesa. Estante de metal, porta tubos. Pipeta automtica 50 l e 100 l e 1000 l. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Negatoscpio para leitura. REAGENTES: Soro anti-gama globulina humana poli especfico (soro anti-humano). Soro anti-gama globulina humana mono especfico (soro anti-IgG). O uso deste reagente importante na diferenciao do tipo de globulinas presentes na superfcie das hemcias a serem testadas Hemcias a serem testadas lavadas por no mnimo 03 vezes com soluo fisiolgica e preparadas em suspenso de 3-5%. Reagente comercial de hemcias controle, recobertas por anticorpos IgG.

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PROCEDIMENTO (mtodo tubo) 1. Identificar 2 tubos de 10x75 mm um TESTE e um P POSITIVO), 2. Pingar 1 gota das suspenso de hemcias (j lavada anteriormente) de 3-5% a ser testada T e o controle (controcel) no tubo P 3. Pingar 2 gotas do soro de Coombs ou AGH em cada tubo 4. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M ou 1 minuto a 1000 R.P.M, a fim de observar-se reao por anticorpos classe IgG e C3d (AGH). 5. Realizar leitura e anotar os resultados. 6. Observando-se ausncia de aglutinao. 7. Adicionar 1 gota de hemcias controle comerciais (controcel) no tubo T caso se observou reao negativa. 8. Centrifugar por 15 segundos a 3400 R.P.M ou 1 minuto a 1000 R.P.M. 9. Realizar leitura, o resultado dever ser positivo com intensidade de 3+/4+.

Esta ltima etapa permite avaliar:


Se as hemcias testes foram corretamente lavadas, caso contrrio haver neutralizao dos anticorpos do reagente AGH pelas globulinas residuais presentes no soro do paciente, que no foram totalmente retiradas com a lavagem das hemcias, apresentando resultado falso-negativo, devendo-se assim repetir a pesquisa. Se o soro AGH que est sendo utilizada esta funcionando. Repetir a pesquisa caso no se observe aglutinao, utilizando um frasco novo de AGH. Interpretao Hemcias testes sem aglutinao e o controle com aglutinao indicam resultado negativo. Caso no seja observada aglutinao no tubo de hemcias controle devem-se desconsiderar os resultados do T.A.D. e realizar-se um novo procedimento. Em amostras com T.A.D. positivo, devero ser realizados testes adicionais, incluindo-se eluio e pesquisa de fraes de complementos e IgA. No devero ser liberados resultados antes da concluso de toda a pesquisa. Reao Positiva: Presena de anticorpos. Presena de alo-anticorpos em casos de Doena Hemoltica do Recm-Nascido (D.H.R.N.) ou Reaes Hemolticas PsTransfusionais. 12. RESPONSABILIDADES: Dos colaboradores que executam as atividades neste setor.

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Bioqumico Tcnico de laboratrio. Auxiliar de analises clinica. 13. COMENTRIOS: Este manual foi elaborado e implantado para ser seguido por todos os profissionais envolvidos, padronizando todas as atividades desenvolvidas neste setor.

14. NORMAS DE SEGURANA Os profissionais da rea de sade que manipulam materiais biolgicos devem obedecer aos procedimentos bsicos de biossegurana tambm devero estar fazendo a segurana do meio ambiente. GERAIS: 1. Descartar as lancetas, algodo e capilar dentro do descarpack. 2. Nunca recapar as lancetas. 3. No abrir a centrfuga de microhematcrito antes da sua parada completa. 4. No jogar material biolgico na pia. 5. Fazer desinfeco concorrente no trmino de cada perodo e desinfeco terminal mensalmente. 6. Lixo comum acondicionar em sacos escuros 7. Lixo infectante acondicionar em sacos brancos leitoso 8. Em caso de derramamento de material biolgico, despeje hipoclorito de sdio 1% e deixe agir por 20 minutos, limpar com papel toalha e descart-lo em recipiente apropriado. 9. Todo material cortante, perfurante ou perfuro-cortante tais como ampolas, lminas cortantes, agulhas e seringas, devem ser lacrados e enviados ao expurgo. No despreze estes materiais em outros cestos de lixo. 10. Caso ocorra algum ferimento durante seu trabalho, procure imediatamente o servio mdico dos funcionrios para comunicar a ocorrncia e receber orientao. 11. Todo material cortante, perfurante ou perfuro-cortante tais como ampolas, lminas cortantes, agulhas e seringas, devem ser lacrados e enviados ao expurgo. No despreze estes materiais em outros cestos de lixo. 12. As bolsas de hemocomponentes no devem ser colocadas diretamente nas latas ou depsitos de lixo;

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA 13. Toda bolsa de sangue e hemocomponentes a ser descartada deve ser submetida a algum mtodo que elimine a infectividade de patgenos eventualmente presentes; 14. Depois de inativados as bolsas devem ser acondicionadas em sacos plsticos destinados a resduos biolgicos; 15. permitido o transporte de bolsas para serem incineradas em outros locais desde que, sejam transportados em recipientes rgidos, lacrados, identificados e em veculos apropriados; 16. Os demais materiais que devero ser desprezados tais como frascos de soros, seringas e equipos que no contenham sangue devem ser colocados em outro cesto de lixo. INDIVIDUAIS: 1. Lavar as mos antes e aps qualquer procedimento. 2. O papel utilizado para enxugar as mos aps a lavagem pode ser usado para fechar a torneira, evitando uma eventual "recontaminao". 3. Troque as luvas imediatamente caso elas se contaminem com material biolgico ou apresentem sinais de perfurao ou rompimento; 4. Ao remover as luvas inverta-as completamente, evitando, que sua poro exterior entre em contato com qualquer superfcie; 5. Quando estiver utilizando luvas evitar tocar superfcies limpas, tais como telefones, mesas ou maanetas de portas; 6. Ao manipular o paciente utilize uma nova luva desprezando a anterior em local adequado. 7. Utilizar os equipamentos de proteo individual. 8. Trajar vestimentas totalmente brancas ou aventais longos brancos de mangas compridas, caso estejam trajando roupas que no sejam brancas; 9. Troque o avental sempre que estiver sujo e/ou contaminado. 10. Evitar sentar nas macas ou nas camas dos pacientes, sentar no cho, sentar nas mesas ou nos balces existentes no ambulatrio; 11. proibido comer, beber, fumar, cortar as unhas, passar cosmtico ou colocar lentes de contato no setor; 12. Cabelos longos devem ser presos; 15. TREINAMENTO - Objetivo o aprimoramento contnuo Ser dado treinamento a todos os colaboradores da AGNCIA TRANSFUSIONAL, antes da implantao deste manual de procedimentos, so responsabilidades dos colaboradores participarem dos treinamentos e implant-los na

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AGNCIA TRANSFUSIONAL - HOSPITAL UNIVERSITRIO JLIO MULLER Rua Luis Philippe Pereira Leite, S/N Jardim Alvorada CEP 78048-902 Fone: 3615-7391 TITULO: IMUNOHEMATOLOGIA prtica. A reciclagem ser feita anualmente ou quando novos colaboradores sejam admitidos. 16. FORMULRIOS/DOCUMENTOS RELACIONADOS Mapa para controle dirio dos reagentes utilizados. 17. CONTROLE DE REGISTRO: Deve-se ter registrado todos os exames realizados no setor e arquivados por 20 anos. 18. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS: 1. Issitt, Peter D. & Issitt, Charla H. Applied Blood Group Serology. Second Edition Second Repriting, jully 1977. Editora Spectra Biologicals (Division of Becton, Dickinson and Company B-D). 2. Biotest S/A Industria E Comrcio. Triacel Reagente de Glbulos Vermelhos Humanos (bula). Mdico Resp. Dr Jacob Rosenblit CRM 4313. 3. Manual De Procedimentos Operacionais Padro. Fundao Pr-Sangue, So Paulo SP. 4. Padronizao Laboratrio de Compatibilidade UNICAMP 5. Unidade de Pesquisa lmunohematolgica HEMOAM 6. Biotest s/a industria e comrcio. triacel reagente de glbulos vermelhos humanos (bula). mdico resp. Dr Jacob Rosenblit CRM 4313. 7. Manual de procedimentos operacionais padro. Fundao Pr-Sangue, So Paulo SP. 8. Marcelli. a. et alli. Techniques en Imuno-hmatologie. mdecine-sciences. flamarion. 1981. 9. Lima, Callado Santos. Curso de imunohematologia. Faculdade de Medicina de Botucatu. UNESP. 1992. 10. Technical Manual, American Association of Blood Banks 12 th edition, 1996. 11. Conselho Federal de Enfermagem - Resoluo COFEN N 200 de 15 de Abril de 1997 12. ABO Revista de MEDICINA Transfusional, Nmero 12 Dezembro de 2002 13. Ministrio de Estado da Sade Portaria No1353 de 13 de Junho de 2011.

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