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Mdulo: Biologia
Molecular
- Dezembro de 2001 -
Introduo Biologia Molecular 1
ndice
Introduo ......................................................................................................................... 2
Clonagem ........................................................................................................................... 15
Seqenciamento de DNA.................................................................................................. 18
Nota: Esta apostila foi elaborada por alunos do curso de Introduo engenharia
gentica da UFSCar (ano de 1999), com superviso, adaptaes e edies do Prof.
Flvio Henrique Silva.
Introduo
Foi intuitivamente que o homem comeou a fazer uso da gentica a seu favor.
J em 9000 A.C., mesmo sem compreender alguns conceitos, que seriam descobertos
mais tarde, o homem selecionou as melhores sementes para o plantio e escolheu os
animais mais vigorosos para a reproduo. Os primeiros filsofos da humanidade j
falavam de alguns fenmenos genticos (sem saber a suas causas) e com o desenvolver
da sociedade pessoas de todas as reas como mdicos, matemticos, fsicos, padres e
filsofos, tambm contriburam com idias para o entendimento da hereditariedade.
No sculo XVII, um monge Augustiniano chamado Gregor Mendel, deu o
primeiro grande passo para desvendar a hereditariedade. Atravs da anlise dos
cruzamentos entre ervilhas, Mendel deduziu a presena de fatores hereditrios que eram
propagados de forma estvel de gerao a gerao, sendo responsveis pela formao de
caractersticas individuais.
Com o avano dos estudos de biologia celular, pde-se determinar quais os
principais componentes moleculares da clula. Durante muito tempo as protenas
carregaram o papel de propagadoras da informao hereditria. Em 1928, Frederick
Griffth, um mdico londrino, em experimentos com Pneumococcus, clulas bacterianas
causadoras de pneumonia, descobriu o fenmeno da transformao. Neste experimento
foi mostrado que Pneumococcus patognicos, portadores de cpsulas, quando mortos
por calor e colocados em contato com clulas de uma linhagem no encapsulada, e no
patognica, era capaz de transformar as clulas no patognicas em clulas patognicas
encapsuladas e letais (figura 1).
quando tratada com proteases ou quando era aquecido, todavia, o mesmo no valia para
o tratamento com DNAse.
Outro experimento que ajudou a confirmar que o DNA era o material gentico,
foi o clssico experimento do liquidificador de Alfred Hershey e Martha Chase em
1952. Para esse experimento marcaram-se duas culturas de fagos T2, uma com fosfato
radioativo (32P) e outra com enxofre radioativo (35S), sendo que o fosfato se incorporaria
ao DNA e o enxofre s protenas. De infeces paralelas de E. coli com fagos marcados
com enxofre e fosfato radioativos foram tiradas amostras em diferentes tempos e estas,
foram agitadas em um liquidificador de forma a separar as cpsulas dos fagos das
bactrias. Aps isso, as culturas foram centrifugadas, pois as cpsulas virais ficariam no
sobrenadante e as clulas ficariam no precipitado. Foi constatado que grande parte do
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P ficava na frao bacteriana, enquanto que a maior parte da frao protica ficava no
sobrenadante. Dessa forma, Hershey e Chase constataram que o que passava para dentro
da bactria, e que era responsvel pela formao dos outros fagos, era o DNA e no as
protenas.
Manipulao do DNA
Enzimas de restrio e vetores.
Clonagem
DNAs com seqncias de bases especficas podem ser identificados por uma
tcnica desenvolvida por Edwin Southern conhecida como Southern Blotting. Essa
tcnica baseia-se em fazer uma eletroforese em gel, e transferir o DNA, na forma de fita
simples, do gel de eletroforese para uma membrana de nitrocelulose ou nylon (que
possui afinidade por DNA), que ser uma rplica do gel. Essa transferncia feita em
meio alcalino para desnaturar o DNA, deixando-o assim em fita simples. Essa
membrana, que contm o DNA desnaturado, ento colocada em contato com
fragmentos de DNA, complementares a seqncia alvo, marcados com fsforo
radioativo ou fosfatase alcalina. Esses fragmentos marcados, chamados sondas,
hibridaro nas suas regies complementares e quando a membrana for lavada, apenas as
sondas hibridadas permanecero na membrana. Essa membrana ento colocada em
contato com um filme fotogrfico, que apresentar marcas na altura das bandas que
contiverem a seqncia alvo, devido as sondas que emitem radiao (no caso das
marcadas com fsforo radioativo) ou algum outro comprimento de onda capaz de
marcar o filme fotogrfico (outros tipos de marcao de sondas).
Seqncias de RNAs podem tambm ser detectadas por uma tcnica, que usa o
mesmo princpio chamada Northern Blotting; assim como protenas que podem ser
detectadas usando-se seus anticorpos como sonda na tcnica chamada Western
Blotting ou Imunoblotting.
A Hibridao uma tcnica muito utilizada em laboratrios de biologia
molecular. Suas aplicaes vo desde tipagem de indivduos (teste de paternidade,
identificao de criminosos) at a descoberta de novos genes envolvidos nos mais
diversos processos celulares.
Seqenciamnto de DNA
Quatro reaes so feitas em paralelo, cada uma delas contendo um dos quatro
terminadores de cadeia 2', 3'-didesoxi: ddGTP,ddATP, ddCTP e ddTTP. As quatro
reaes contm: uma fita molde (simples fita), a seqncia de nucleotdeos a ser
determinada, uma fita iniciadora com uma hidroxila 3 livre (normalmente obtida por
sntese qumica), os quatro precursores de DNA: dGTP, dATP, dTTP e dCTP, um deles
pelo menos radioativo (32P -dCTP ), e o "fragmento Klenow"da DNA polimerase I de
E. Coli. O "fragmento Klenow"representa 2/3 DNA polimersica I de E.Coli produzido
por clivagem com enzima proteoltica tripsina. O fragmento possui as atividades
polimersica 5' 3' e exonuclesica 3' 5' da DNA polimerase I, mas no possui
atividade exonuclesica 5' 3'. Esta atividade exonuclesica 5' 3' critica para a
tcnica, pois se esta atividade estiver presente, ela ir reduzir a fita iniciadora a partir da
extremidade 5'.
O importante nesta tcnica de seqenciamento usar a relao correta do
didesoxirribonucleosdeo trifosfato normal (por exemplo, dGTP na reao 1) e de
didesoxirribonucleosdeo trifosfato terminador (por exemplo ddGTP na reao 1),de
modo a obter uma populao de cadeias nascentes terminando em todas as posies de
nucleotdeos possveis (por exemplo,em todos os Cs de fita-molde na reao 1). A
relao de 100 desoxirribonucleosdeos trifosfatos para 1 didesoxirribonucleosdeo
trifosfato normalmente d a freqncia de terminao desejada em cada stio potencial
de terminao.
Os produtos das quatro reaes so ento separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida e as posies dos produtos de reao radiativos (cadeias nascentes de
DNA) so determinadas por autorradiografia. Uma vez que as cadeias menores migram
distncias maiores no gel, a seqncia de nucleotdeos definida pelas cadeias nascentes
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Introduo Biologia Molecular 19
dada pela leitura na direo 5 3 , a partir da parte de baixo (anodo) at o topo (catodo)
do gel.
Figura 13 - Esquema mostrando como feito o seqnciamento de DNA pelo mtodo dos
desoxirribonucleotdeos desenvolvido por Sanger
A produo de protenas em laboratrio uma tcnica que vem sendo cada vez mais
utilizada. Essa produo feita atravs de uma tcnica chamada expresso heterloga, que
consiste em produzir em um organismo protenas originrias de outros (Ex: produo de
hormnios humanos em leveduras).
Para modificar esses organismos, normalmente utiliza-se de plasmdeos como vetores.
Esses vetores devem possuir algumas caractersticas desejveis: um promotor de transcrio
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forte, especfico para o organismo que produzir a protena, que funcionar somente na
presena de alguma substncia indutora (IPTG, Metanol, Celulose, Arabinose, etc); um gene
de seleo, que confere uma caracterstica diferencial entre as clulas com e sem o vetor
(crescimento em meio mnimo, resistncia a antibiticos, etc) e um stio para clonagem.
Em um sistema bastante utilizado, a fase aberta de leitura do gene que codifica a
protena a ser produzida clonada no vetor, aps o promotor forte e uma seqncia de 18
(dezoito) nucleotdeos que codificam 6 (seis) histidinas, que serviro para futura purificao
em coluna de afinidade. Esse vetor recombinante servir para transformar o organismo que
produzir a protena. Esse vetor pode ficar na clula de duas formas: como uma estrutura
circular de replicao autnoma (plasmdeo), ou pode integrar-se no genoma do organismo
atravs de uma recombinao homloga.
As clulas transformadas so crescidas at ficarem bem vigorosas e ento adiciona-se
a substncia indutora que promover a transcrio e traduo do gene de interesse em grandes
quantidades.
A protena de interesse estar ento em grande quantidade na clula, todavia, para t-la
na forma pura precisa-se separ-la das outras protenas celulares. Foi pensando nisso que as 6
(seis) histidinas foram adicionadas protena, pois essa cauda de histidina possui afinidade
por nquel. Desta forma, aps separao de todas as protenas celulares por uma coluna com
uma resina complexada com nquel, as protenas que possurem a cauda de histidina (somente
a de interesse) ficaro grudadas na resina e as outras passaro direto. Para retirar a sua
protena da coluna de nquel, s passar um tampo que reduza a afinidade das histidinas ao
nquel, geralmente contendo um competidor.
A tcnica de expresso pode apresentar muitas variaes, desde o promotor usado at
o organismo produtor. Cada um desses fatores confere vantagens e desvantagens em relao a
outro. Como exemplo pode-se comparar a expresso em fungos e em bactrias: As bactrias
possuem crescimento muito mais rpido, todavia geralmente apresentam problemas ao
expressar protenas muito grandes (formao de corpos de incluso), alm disso, no realizam
modificaes ps-traducionais, enquanto que os fungos, apesar de crescerem mais lentamente
possuem mecanismos que possibilitam que a protena fique na sua forma ativa e com
modificaes ps-traducionais. So desvantagens destes ltimos a difcil manipulao e a
presena de proteases.
Em ultima escala, a transformao pode ser feita em organismos inteiros, criando os
organismos transgnicos. H toda uma discusso tica por trs dos transgnicos, todavia, os
transgnicos podem em muitos casos ser a soluo para vrios problemas mundiais como a
fome e a falta de espao.
A produo de protenas em laboratrio um grande avano para a cincia, graas a
ela, facilitou-se muito a determinao da estrutura de protenas, que podem estar envolvidas
em doenas, possibilitando a fabricao de drogas para bloquear ou controlar a sua ao ou as
protenas purificadas podem ser usadas diretamente no tratamento de doenas como diabetes
(insulina), nanismo (Hormnio de Crescimento) entre outras.
Figura 14- Esquema mostrando resultado de um teste de paternidade para um loco. Um alelo
do filho vem da me (verde) e o outro (azul) tem que vir do pai biolgico. Esse um caso de
incluso no qual o suposto pai o pai da criana (ao menos considerando esse loco).
Aplicaes na medicina
Terapia Gnica
Leitura Recomendada
Lodish et al., Molecular Cell Biology (1999) W.H. Freeman and Company, New York, 4th
Ed
Watson et al., Recombinant DNA (1992) Ed. Scientific American Books, New York, 2nd
Ed
Strachan and Read , Human Molecular Genetics (2000) - BIOS Scientific Publishers Ltd,
2nd Ed
Lubert Stryer, Bioqumica (1996) Guanabara Koogan S.A., RJ, Brasil, 4a Ed.
Benjamin Lewin, Genes VII (2000) Oxford University Press, Inc., New York
Voet and Voet, Biochemistry (1997) John Wiley & Sons, New York, 2nd Ed.