Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
MÉTODOS administração atrasada Experiências realizadas em veículos ou Camundongos machos adultos tratados com
B4Crry que foram submetidos a MCAO de 1 hora seguido por 30 dias de reperfusão. (A) Avaliação do déficit
neurológico realizada durante 30 dias. (B e C) Volume de infarto calculado a partir de secções cerebrais seriadas
coradas com Nissl (B) e lateralidade do membro anterior na tarefa de canto (C) 30 dias após a reperfusão. (D)
Design de estudo Gráfico de sobrevida de Kaplan-Meier durante 30 dias após o AVC (E e F) Experimentos realizados em
• Os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos de camundongos machos adultos com tempo de isquemia variável e desfechos avaliados 24 horas após a
reperfusão. (E) Escores de déficit neurológico às 24 horas após a MCAO. (F) Volume do enfarte calculado a
tratamento usando um gerador de números aleatórios. partir de secções cerebrais em série coradas com Nissl 15 dias após a MCAO. (G e H) Experimentos realizados
em camundongos fêmeas adultas com 1 hora de MCAO seguido de 15 dias de reperfusão. B4Crry / veículo
• Os profissionais envolvidos nas cirurgias e testes trabalharam administrado 2 horas após a isquemia. (G) Déficit neurológico avaliado ao longo da recuperação. (H) Volume de
infarto avaliado pela coloração de Nissl 15 dias após a MCAO. (I) Défice neurológico e volumes de enfarte
às cegas quanto a alocação dos grupos. (medidos por TTC) em ratinhos machos idosos (10 meses de idade) 24 horas após 1 hora de MCAO e B4Crry, 2
horas após MCAO. (J) Curva de Kaplan-Meier representando a sobrevivência em 7 dias de animais idosos após
• Os animais foram excluídos apenas se ocorresse mortalidade MCAO. (K a N) Experiências realizadas em camundongos machos adultos com 1 hora de MCAO seguida de
reperfusão, com administração de B4Crry 24 horas após a isquemia. (K) Avaliação do défice neurológico ao
durante a cirurgia, após ou depois da administração do longo de 15 dias após a MCAO, n = 15 (veículo) e 18 (B4Crry). (L) Índice de lateralidade normalizado na tarefa
de canto. (M) Desempenho cognitivo no aprendizado e retenção do Barnes Barnes 9 a 15 dias após a MCAO.
tratamento. (N) Volume da lesão reconstituído a partir de secções coradas com Nissl aos 15 dias após a MCAO. Modelos
• Os pontos de checagem após a reperfusão foram de 24 e 72 tridimensionais exibidos com lesão em vermelho. (O) Percentagem de animais que morreram no espaço de 48
horas após a MCAO devido a hemorragia intracerebral (HIC) após o tratamento com veículo ou B4Crry.
horas para estudos agudos e de 15 e 30 dias para estudos de
longo prazo.
• A determinação do tamanho da amostra foi feita utilizando o Fig. 7. A deposição a longo prazo do complemento está associada a microgliose robusta e
G*Power 3.1. infiltrado de células inflamatórias 15 dias após a MCAO. Experimentos realizados em camundongos
machos adultos com 1 hora de MCAO seguido por 15 dias de reperfusão com B4Crry ou veículo
• O tamanho do efeito para análises comportamentais foi administrado 2 horas após a coloração IF isquêmica (A) do núcleo de infarto em evolução mostrando a
expressão de Mac2, C3d, CD31 e DAPI. Insets 1 e 2: campos de alta resolução de (A). (B) Campos de alta
determinado com base em experiências piloto com B4Crry e resolução de animais tratados com B4Crry correspondentes à mesma localização que a inserção 1 em (A).
(C) IF para C3d, CD31 e DAPI. Os campos são pilhas renderizadas em 3D cobrindo 20 .m. Barras de
os cálculos foram feitos com base nos seguintes critérios: escala, 200 m. Setas brancas apontam para regiões de sobreposição entre C3d e CD31. (D e E) IF para
infiltrado celular CD3 + (D) e Gr1 + (E) em controlos de veículo em comparação com animais tratados com
poder de 80% e nível de significância < 0,05. B4Crry. (F) Quantificação de (D) e (E).
Análises estatísticas
• Análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad. CONCLUSÂO
• Em geral foi utilizado o teste paramétrico, exceto em casos de
comparação do score do déficit neurológico, no qual foram Para concluir, notamos que existem limitações para este
utilizados como teste não-paramétrico o teste de Kruskal- estudo. Não abordamos especificamente como a
Fig. 4. B4Cryry inibe a fagoptose microglial de neurônios que expressam c-fos de forma aguda após a
Wallis. isquemia. Experimentos realizados em camundongos adultos WT machos tratados com B4Crry, B4scFv ou inibição do complemento afeta a vasculatura. É provável
• As análises dos grupos foram realizadas utilizando one-way veículo ou em camundongos C3 - / - que foram submetidos a MCAO de 1 hora seguido de 24 horas de
reperfusão.Os tratamentos foram administrados 2 horas após a isquemia (A) Início: Visualização do localização que o B4Crry também afete a ativação de células
ANOVA ou two-way ANOVA, seguido por uma análise de da selecção de campos para coloração IF para as Figs. 4 e 5 usando o atlas cerebral do mouse. Abaixo: IF para
NeuN (vermelho) mostrando densidade neuronal. (B) Quantificação da densidade celular neuronal em três endoteliais ou perivasculares e a transferência de
comparação múltipla. campos perilesionais (240 ×m × 240 m) por animal (n = 5 animais por grupo). (C) coloração IF e microscopia
proteínas e células sanguíneas para o local da lesão,
de super-resolução de células c-fos + e microglia (Iba1 +). (D) Reconstrução do volume de alta magnitude de
• Valores de P abaixo de 0,05 foram considerados campos de (C) usando Amira mostrando material c-fos dentro de corpos celulares de micro-glial com setas
que podem contribuir para os efeitos protetores do
pretas. (E) Quantificação da densidade celular c-fos + neuronal em três campos perilesionais. (F) Quantificação
significativos. da expressão da caspase-3 clivada em células c-fos +. (G) Quantificação da densidade celular neuronal Iba1 +
B4Crry. B4Crry também influencia a geração de
• O teste de Brown-Forsythe foi usado para avaliar a em três campos perilesionais. (H) Frequência do material c-fos nos corpos celulares microgliais. (I e J) Campos
de alta resolução do córtex silesional mostrando localização de c-fos e Iba1 (I) e localização de Iba1 e NeuN (J).
anafilatoxina; No presente estudo, não abordamos o
Painéis esquerdos em (D) e (E): Reconstrução tridimensional de uma pilha de 20-m usando ZEN. Painel direito
homogeneidade da variância. em (D): vista ortogonal mostrando colocalização de c-fos (verde) e Iba1 (vermelho). Painel direito em (E): papel das anafilatoxinas fora de demonstrar que elas
• O teste t de Student foi usado para comparar dois grupos. visualização ortográfica mostrando colocalização de Iba1 (verde) e NeuN (vermelho). Inserções em (D) mostram
contrastação DAPI (em azul). (K) Quantificação do número de células Iba1 contendo material c-fos sobre o não afetavam a fagocitose dos neurônios após o AVC.
• Os coeficientes de Pearson foram usados para comparar as número total de células Iba1. (L) Quantificação da densidade de células Mac2 + no hemisfério ipsilateral. (M)
Mac2 IF e localização de c-fos em áreas cerebrais perilesionais. (N) SE usando anticorpo anti-FCRLS. Caixas Não se sabe se os neoepitopos pós-isquêmicos
correlações. brancas em (D) a (F) regiões de colocação de colocalização. (O) Quantificação de IF mostrada em (N) e na fig.
S11A mostrando a porcentagem de clusters c-fos + / Iba + localizados dentro de células FCRLS +. alternativos, individualmente ou em conjunto, fornecerão
• O teste Fisher r-to-z transformation foi usado para comparar melhor proteção do que a segmentação por B4scFv,
os coeficientes de correlação. assim como a conservação entre espécies de outros
neoepitopos específicos para lesões. No entanto,
RESULTADOS mostramos que o epitopo B4 é expresso em cérebros
pós-isquémicos de murganho e humanos e que o
tratamento com B4Crry protege contra o AVC isquémico
murino mesmo quando administrado 24 horas após a
MCAO, uma janela terapêutica clinicamente relevante.
FINANCIAMENTO
Este trabalho foi apoiado por doações do NIH para
S.T. (1P20GM109040), o Department of Veterans
Fig. 5. A fagocitose de Microglia de neurônios estressados é um complemento dependente de C3d.
Affairs to S.T. (Prêmio de Mérito 1I01RX001141 e
Experimentos realizados em camundongos machos adultos com 1 hora de MCAO seguido de 24 horas de
reperfusão, com B4Crry ou veículo administrado 2 horas após a isquemia. (A) coloração IF e microscopia de
1BX001218) e uma bolsa de estudos pré-doutorado
super-resolução mostrando C3d, Iba1, c-fos e DAPI em áreas perilesionais em camundongos tratados com
veículo (A) ou tratados com B4Crry (B). Para quantificação da deposição de C3d em neurónios c-fos +,
da American Heart Association para A.A.
consultar a fig. S13 (C) Co-coloração para NeuN, c-fos, Iba1 e C3d. As setas apontam para o local de
deposição de C3d na interface microglia-neuronio. (D) Top: Ilustração esquemática da abordagem utilizada
(15PRE25250009).
para quantificar a interação neuronal-microglial. Os contactos de NeuN-Iba1 foram primeiro identificados e
Fig. 1. B4Crry administrado sistemicamente inibe localmente e transitoriamente a ativação do complemento no depois classificados com base na presença de expressão de C3d ou c-fos. As células não neuronais não
cérebro pós-isquêmico e reduz a lesão aguda.(A) Biodistribuição de B4Crry radiomarcado com I^125 administrado às 2 foram identificadas ou classificadas. Parte inferior: Distribuição dos contatos Iba1-NeuN baseados na
ou 24 horas após MCAO e medido às 6 horas após administração em animais MCAO ou placebo. (B) Concentrao de C3a imunorreatividade de C3d e c-fos. O teste exato de Fisher foi usado para comparar a proporção de contatos
medida por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) em homogenatos de cebro de animais falsificados ou C3d + entre os grupos de tratamento com veículo e B4Crry, mostrando uma diferença significativa. (E) SE
animais MCAO tratados com B4Crry ou veulo 2 horas ap apc. (C) Coloração por imunofluorescência (IF) da deposição de coloração para material c-fos dentro da microglia e localizada em vesículas fagolisossômicas (LAMP1 +).
C3d no hemisfério isquémico 24 horas após o AVC. O B4Crry foi administrado 2 horas após a MCAO. (D) Volume de Setas e retângulo mostram o site da colocalização. (F) Vista 3D representativa do material de NeuN localizada
enfarte medido por colorao com cloreto de tetrafenil tetrazio (TTC) de seces de 2 mm de espessura 24 ou 72 horas ap dentro de vesículas fagolisossómicas microgliais (LAMP1 +). O retângulo branco indica a região de
apagao em animais WT tratados com murganhos de veulo, B4scFv, ou B4Crry e em Rag1 - / -. Os tratamentos foram colocalização. Barras de escala, 20 .m. (G e H) Quantificao da sobreposio de LAMP1 / c-fos / Iba1 mostrada
administrados 2 horas após a MCAO, n = 8 por grupo (5 para Rag1 - / -). (E) Escores de déficit neurológico em 24 ou 72 como intensidade por pixel (G) e agrupamentos colocalizados (H). Barras pretas em (G) mostram o número de
horas após o AVC. picos sobrepostos. Teste t de Student, n = 6 animais (três campos por animal).