Objetivo da Pesquisa

Esse experimento tem como objetivo pesquisar

a possibilidade de usar células-tronco
embrionárias na regeneração de tecidos
danificados por lesões na medula espinal,
região cervical. Foi usado células-tronco para
obtenção de células progenitoras de
oligodendrócitos aptas para serem
transplantadas. A eficácia da substituição foi
analisada por medidas histológicas e
funcionais.
 Patogênese da lesão
• Perda de neurônios, principalmente axônios e
bainhas de mielina,
• Hemorragia e hipoperfusão
• Processos secundários: inflamação, respostas
imunes, migração dos astrocitos, gliose e formação
de cistos.
• Essas lesões interrompem a conexão entre SNC
cranial e caudal.
• Afetam principalmente a relação entre matéria cinza
e branca, a extensão da remielinização endógena, e
o nível do déficits de locomoção
 Benefícios do Transplante
• Atenuam lesões patogênicas e melhoram
a recuperação de funções dos membros
superiores. Efeitos histológicos de
transplantes incluem poupar a matéria
branca e cinza no epicentro da lesão e
preservação de neurônios motores
correlacionados com a recuperação dos
movimentos
• Terapias de combinação inerente – trazem
benefícios ao fenótipo e ao tecido
circundante
• Efeitos pleiotrópicos – mielinização de
axônios ou suporte neurotrófico ao tecido
No presente experimento, exploramos a
capacidade das células-tronco fornecerem
um benefício anatômico e funcional após o
transplante em lesões medulares cervicais
agudas
Materiais e Métodos
 Lesão da Medula Espinhal

Foi realizada laminectomia dorsal em ratos

fêmeas na quinta vértebra cervical,
causando uma lesão
 Diferenciação das Células-Tronco

Nessa etapa foi realizado uma serie de

procedimentos para proliferação e
diferenciação de células-tronco
embrionárias em células progenitoras
de oligodendrócitos prontas para
serem transplantadas.
 Teste Comportamental
Nessa fase foram realizados testes para
medir e comparar as mudanças na
função motora dos membros afetados.
- Comprimento do passo
- Alcance do passo
- Passo perpendicular
- Frquência de repetições
 Transplante

Foi realizado uma cirurgia para injetar as

células-tronco preparadas.
Metade recebeu o transplante e metade
ficou como controle.
Administração ocorreu 7 dias após lesão
 Perfil de Expressão Gênica
O RNA foi isolado das celulas
progenitoras de oligodendrócitos
cultivadas, digerido e purificado e em
seguida feito uma transcriptase reversa
para obter cDNAs para serem
amplificados na PCR. Para finalizar foi
realizado a eletroforese em gel para
analisar os resultados.
 Histologia
• Os animais foram sacrificados 8
semanas após o transplante de células.
• A medula espinhal dos animais foram
divididas em blocos e através de
técnicas histológicas foram preparadas
lâminas para análise microscópica.
 Imunodetecção
• Detecção de anticorpos foi realizada
em culturas de células fixas ou cortes
criosseccionados da medula espinhal,
usando protocolo padrão.
• Secções celulares foram fotografadas
ao microscópio.
 Contagem Mielinica Patológica
• Contagem de axônios mielinizados (normalmente),
as desmielinizações, oligodendrócitos ou células
de Schwann remielinizados.
• O número de axônios com oligodendrócitos e
células de Schwann remielinizados e
desmielinizados, foi usado para determinar a
eficiência da remielinização de oligodendrócitos.
• Calculada proporção de axônios com
oligodendrócitos remielinizados e axônios
desmielinizados e células de Schwann
remielinizados.
 Morfometria
• Cortes transversais semifinos da medula
espinhal foram fotografados no microscópio
e as medições foram rastreadas na imagem
para determinar área e perímetro.
• A área de matéria cinzenta, de substância
branca e cavitação de transplante foram
claramente identificadas.
• A área da substância branca poupada foi
definida como área da matéria branca
marcada que incluía patologia que inclui
aberrantes marcas e inchaço, axônios
danificados e desmielinização grave.
 Quantitatificação de Expressão
do Gene em Medula espinhal:

• RNA foi isolado, homogeneizado,

tratado, cDNAs gerado com ação da
Transcriptase Reversa. Utilizados
termociclador para PCRs (Real Time)
de 40 ciclos, confirmando dados da
curva de fusão e analisados por
método comparativo.
• A expressão diferencial foi avaliada em
ratas lesionadas X ratas não lesionadas
(14 a 21 dias após lesão).
 Métodos Estatísticos

Comprimento de passadas dos membros

anteriores foram analisados como
parâmetro geral da marcha.

Alcance, frequência de passadas e função

de pisar foram analisados.
 Resultados:
Os transplantados em relação aos
controle tiveram melhor locomoção.
Diferenciação das Células-Tronco
• No final da diferenciação, as células
tinham uma morfologia característica
bipolar de células progenitoras de
oligodendrócitos imaturos e um perfil
típico antigênico.

• Imunopositivas para os marcadores

OPC: Olig1, NG2 e PDGFRa
 Patologia da Contusão Cervical Bilateral
• A contusão não resultou em desconforto respiratório ou
de falência nos animais; indicativo de uma preservação
funcional global.
• O exame dos não transplantados, 9 semanas após a lesão
revelou cavitação bilateral.
• Exame de planos transversais revelou cavitação no
epicentro da lesão (Fig. 2A)
• A medula espinhal lesada sofreu perda de massa
cinzenta, desmielinização dispersa, remielinização de
oligodendrocitos e de células de Schwann (Fig. 2B)
• Infiltrado inflamatório perivasculares (Fig. 2C).
Células-tronco transplantadas sobrevivem,
lacalizam a lesão, e diferenciam

• Células-tronco sobreviveram e localizaram o local da

lesão durante o período de estudo.
• No epicentro da lesão, foram identificadas células em
torno da área de formação de cavitação (Fig.3A). Células
de roedores também estiveram presentes nesta área,
conforme identificado por coloração de metilo somente
de verde (Fig. 3B).
• Foi usado immunocoloração para nucleos humanos e
marcadores de oligodendrocitos Olig1 ou proteinas
tumorais (APC/CC1). As células que coraram com
nucleos de anticorpos humanos e Olig1 (Fig. 3D).
• Os OPCs transplantados tornaram-se oligodendrócitos
em regiões apropriadas para a diferenciação
Transplante Melhora a Função
Motora Após Lesão
Análise do movimento do membro
anterior proximal apresentou durante o
Após Lesão pisar crescimento significativo no
intervalo de passo do grupo
transplantado em comparação ao
grupo não transplantados.
 Transplante Melhora a Função
Motora Após Lesão
O aumento do alcance do passo A função pisar também foi analisada. A
observado no G. transplantado ocorrência de passos perpendiculares
ocorreu ao levantamento do passo e foi mais frequênte no G. transplantado
não no posicionamento em relação ao G. controle.
determinado pelo ângulo.
 Transplantes Altera Patogênese de Lesões
- perda generalizada de
Formação de Cicatriz Glial.
matéria branca e cinzenta
(F5A)
Transplantes Altera Patogênese de Lesões
extensa remielinização de
oligodendrócitos e dividida remielinização
de células de Schwann com
desmielinização difusa hemorragia e
infiltrados inflamatórias perivasculares,
sugerindo patologia dinâmica.
uma concentração elevada de OPCs com uma
distribuição homogênea que sugere uma falta de
divisão dos astrócitos; máteria branca tinha axônios
com oligodendrócitos remielinizados e axônios
desmielinizados espalhados; tinham mais axônios
mielinizados normalmente e menos axônios
desmielinizados e células de Schwann remielinizados
Transplantes Altera Patogênese de Lesões
Quantificação de axônios exibiram mais
Análises morfométricas no epicentro
axônios mielinizados normalmente e menos
células de Schuwann em comparação do da lesão mostraram um aumento
G.transplantado com o G. não transplantado. significativo na redução de cavitação
Transplantes Altera
Patogênese de Lesões

A quantificação revelou
aumentos nas matérias branca
(FC) e cinzenta (FD) poupada em
comparação aos controles.
Assim, a redução da perda de
neurônios motores e massa
cinzenta pode ser responsável
pela melhoria da locomoção nos
transplantados
Estes dados sugerem que o
transplante pode atenuar a perda
de tecido e preservar a função
da medula espinhal.
 Transplantes Afeta Expressão Gênica na Fase Aguda da
Lesão

• Para elucidar os eventos agudos que precedem o

transplante examinamos a expressão diferencial de
genes selecionados durante a fase aguda pós-lesão.
• Para avaliar a capacidade dos transplantes de afetar os
padrões de expressão de genes induzidos por SCI, a
expressão diferencial de genes foi examinada em
animais transplantados e não transplantados 21 dias
pós-lesão
• Os resultados obtidos indicam que o transplante pode
afetar a expressão gênica induzida por SCI aguda
consistente com mudanças na preservação e apoio aos
achados histológicos e funcionais em 8 semanas pós-
transplante.
Discussão
• Este estudo avaliou diretamente o potencial
de células-tronco fornecerem benefício para
lesões ao nível do cervical.
• Estes resultados aumentam ainda mais a
nossa compreensão da patologia e os
resultados funcionais de SCI cervical e são
os primeiros a demonstrar benefício
anatômico e funcional após o transplante de
células-tronco para SCI cervical.
• Agentes terapêuticos baseados em células
têm sido eficazes em modelos pré-clínicos
de SCI, como a perda de células, a
desmielinização, ou perda da homeostase,
devido à sua capacidade de tratar várias
características de SCI
• Transplantes mielionogenicos obtém reparação
histológica e recuperação funcional após uma lesão
medular, validando desmielinização como um alvo
terapêutico para a SCI
• Células-tronco podem contribuir para o nível
histológico e funcional através de um mecanismo
não mielinico;
• Estes resultados sugerem que as células-tronco
podem produzir efeitos benéficos no SCI a parte da
remielinização, como neuroprotecção, a supressão
da inflamação, a promoção da regeneração axonal,
e/ou manutenção da homeostase.
• Assimetrias entre potenciais lesões cervical e
torácica reforçam a necessidade de testar a eficácia
de tratamentos potenciais para SCI em ambos os
• Segundo dados coletados, células-tronco podem
seguir pistas migratórias fora do epicentro das lesões,
porém não podemos descartar a possibilidade de que
a dispersão durante a injeção de transplante também
pode contribuir para a distribuição celular.
• A quantificação de células positivas Olig1 e APC/CC1
dentro do epicentro da lesão sugere que a falta de
nicho impede a maturação de uma percentagem
elevada de células transplantadas.
• Células transplantados mantiveram uma linhagem
oligodendroglial apesar do método de derivação e
meio molecular diversificada
• Estes dados, em conjunto com a ausência de células
humanas que expressam astrócitos, neuronal, ou
marcadores embrionários, indicam que a população de
transplante não trans-diferenciou ou tornou
pluripotentes
• Não foi detectada nenhuma diferença na remielinização entre os
transplantados e não transplantados. Este resultado não é
inesperado, tendo em conta a extensa remielinização endógena
evidenciado no grupo de controle.
• O grupo de tratamento mostra uma maior eficiência na
remielinização em relação ao controle.
• A melhoria na função motora no grupo de transplante foi observada
em vários parâmetros importantes na marcha.
• Morfometria e quantificação revelaram uma série de resultados
histológicos melhorados significativamente nos transplantes em
comparação aos controles
• Não há correlações nos resultados funcionais comparados à
cavitação, o que indica que a redução na cavitação sozinho foi
insuficiente.
• O transplante reduz apoptose induzida e inflamação e suporta a
sobrevivência de neurônios in vivo durante a fase aguda após a
lesão. Tendo identificado mudanças significativas de expressão de
genes 21 dias pós-lesão, espera-se que será possível investigar
mais, para formar uma melhor compreensão de como os OPCs
Conclusão
• Estes resultados demonstram que o
transplante de OPCs humanos em SCI
cervical aguda melhora os resultados
histológicos que se correlacionam com
melhor recuperação. Mais importante, os
nossos dados indicam que a SCI cervical
apresenta uma patogênese da lesão distinta e
que o mecanismo e resultado do tratamento
pode diferir daquela na medula espinal
torácica. Estes dados reforçam a importância
do uso de modelos de lesão cervical, além de
modelos torácicas para o desenvolvimento
pré-clínico da terapêutica dos SCI, a fim de
melhor atender a população SCI humana.
Agradecimentos