1.

Técnica imunohistoquímica

A técnica imunohistoquímica compreende três fases: fase pré-analítica, fase analítica e fase
pós-analítica.

Fase pré-analítica – compreende os passos de colheita e análise macroscópica, fixação,

processamento, inclusão e microtomia das amostras.

Fase analítica – compreende a fase propriamente dita de marcação imunohistoquímica das

amostras.

 Recuperação antigénica – permite a recuperação dos antigénios que foram

modificados pela fixação;
 Inativação da peroxidase endógena – permite o bloqueio da enzima peroxidase
presente no tecido de forma endógena, de forma a evitar marcação inespecífica e de
fundo;
 Aplicação do anticorpo primário – aplicação do anticorpo que se liga diretamente ao
antigénio de interesse;
 Aplicação do sistema de amplificação – o sistema de amplificação carrega consigo o
marcador (enzima HRP) e liga-se ao anticorpo primário;
 Aplicação do cromogénio – aquando da sua aplicação permite a visualização do
complexo antigénio/anticorpo primário através de uma reação com a enzima HRP, que
leva à formação de um precipitado castanho;
 Constraste – permite a visualização dos núcleos e da arquitetura geral dos tecidos.

Fase pós-analítica – compreende o passo de controlo de qualidade e interpretação da lâmina

pelo patologista.
2. Procedimento

1. Desparafinar em xilol durante 15 minutos;

2. Hidratação em concentrações decrescentes de etanol até água destilada;
3. Inativação da peroxidase endógena com Peroxidase-Blocking Solution durante 10
minutos;
4. Lavagem com água destilada;
5. Recuperação antigénica por alta temperatura em microondas (a lâmina é colocada num
recipiente de plástico com um volume de tampão suficiente para as lâminas ficarem
completamente submersas. O recipiente é então colocado no microondas durante 20
minutos, a uma potência de 720 W. Passados os 20 minutos deixa-se a lâmina
arrefecer durante 15 minutos.)1;
6. Lavagem com água corrente, seguido de Wash Buffer;
7. Contorno do corte com caneta hidrofóbica;
8. Lavagem com Wash Buffer durante 3 minutos;
9. Incubação em soro de anticorpos primários durante 30 minutos;
10. Lavagem com Wash Buffer durante 3 minutos;
11. Incubação em Envision+ durante 30 minutos;
12. Lavagem com Wash Buffer durante 3 minutos;
13. Revelação com DAB+ durante 8 minutos;
14. Lavagem com água destilada;
15. Constrastar com hematoxilina de Mayer durante 30 segundos;
16. Lavagem com água destilada, seguido de Wash Buffer;
17. Desidratação em concentrações crescentes de etanol;
18. Clarificação em xilol e montagem.
1
A escolha do tampão deve ter em conta o recomendado na bula do soro de anticorpos primários.
3. Material

 Microondas com indicação digital de tempo e potência;

 Micropipeta de precisão P10, P20 e P1000;
 Pontas de micropipeta de precisão P10, P20 e P1000;
 Tubos de Eppendorf (1,5 ml);
 Rack de tubos de Eppendorf;
 Caneta hidrofóbica (Dako Pen S2002).

4. Reagentes

 EnVision+ Kit (K4006 HRP. Mouse (DAB+) – 150 tests):

o EnVision+ (HRP. Mouse);
o Peroxidase-Blocking Solution;
o DAB+, Liquid.
 Target Retrieval Solution (S1699 Concentrate – 500 ml, 10x concentrated);
 Target Retrieval Solution, pH 9 (S2367 Concentrate – 500 ml, 10x concentrated);
 Wash Buffer 10x (S3006 Concentrate – 1 L, 10x concentrated);
 Hematoxylin, Mayer’s (S3309 Ready-to-use aqueous solution – 500 ml);
 Antibody Diluent (S0809 Ready-to-use diluent – 125 ml).

5. Validação de soros de anticorpos primários

Todos os soros de anticorpos primários devem ser validados aquando da sua chegada ao
laboratório, de forma a assegurar os melhores resultados imunohistoquímicos. A validação do
soro consiste na determinação da sua diluição ideal.

É considerada diluição ideal de um soro a diluição que permite maior intensidade de marcação
com o menor fundo possível. Deve ser tida como diluição de partida a diluição fornecida pelo
fabricante na bula do soro, testando conjuntamente as diluições que se encontram mais
próximas desta.

Considerando como exemplo prático o soro de anticorpos primários X, que tem como diluição
recomendada pelo fabricante a diluição de 1/50, esta deve ser testada juntamente com as
diluições 1/20 e 1/100, de forma a determinar a diluição ideal.

Todos os testes para validação de um soro devem ser realizados simultaneamento num tecido
que sirva como controlo-positivo e noutro que sirva como controlo-negativo.

Diluições de soros de anticorpos primários mais utilizadas

1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000
6. Controlo de Qualidade

Deve ser realizado o controlo de qualidade da técnica por parte do técnico que a executou,
tendo como objetivo máximo a melhoria permanente da qualidade do produto final do seu
trabalho.

De forma a avaliar a qualidade da técnica, todas as análises imunohistoquímicas devem ser

realizadas com controlo tecidual externo positivo e negativo, isto é, a técnica deve ser realizada
na lâmina de teste, na lâmina de controlo positivo e na lâmina de controlo negativo.

No final da execução da técnica, o técnico deve avaliar as lâminas de acordo com os seguintes
parâmetros: preservação da morfologia tecidular, sensibilidade (intensidade de marcação
específica e quantidade relativa de estruturas marcadas), especificidade (marcação
inespecífica/fundo) e contraste.

Preservação da morfologia tecidular – permite avaliar a capacidade de agressão tecidular dos

métodos utilizados.

Intensidade da marcação específica – permite a avaliar a capacidade amplificativa dos

métodos de amplificação utilizados. Após a visualização ao microscópio da totalidade da
lâmina em estudo, esta é classifica quanto à intensidade da marcação.

Quantidade relativa de estruturas marcadas (sensibilidade) – permite avaliar o rácio entre

estruturas “marcáveis” e estruturas marcadas. Após a visualização ao microscópio da
totalidade da lâmina em estudo, esta é classificada quanto à proporção de estruturas
verdadeiras-positivas.

Marcação inespecífica/fundo – permite avaliar o rácio entre estruturas “não-marcáveis” e

estruturas marcadas. Após a visualização ao microscópio da totalidade da lâmina em estudo,
esta é classificada quanto à proporção de estruturas falsas-positivas.

Contraste – permite avaliar a qualidade da coloração de contraste.

Tabela 1: Grelha de avaliação de qualidade da imunohistoquímica.

7. Lista de Anticorpos
Anticorpo Referência Controlo Tipo de Tecido normal Patologia Aplicações
positivo marcação
Músculo liso
Vasos
Tumores do
sanguíneos Identificação de
músculo liso
Glândulas leiomiomas,
Actina (do Leiomiomas
Apêndice Citoplasmática salivares (canais leiomiosarcomas e
músculo liso) Leiomiosarcomas
excretores) adenomas
Adenomas
Células pleomórficos
pleomórficos
mioepiteliais
Miofibroblastos
Diagnóstico
diferencial entre
Epitélio simples e carcinomas (+) e
estratificado linfomas/sarcomas
Membranar (glandular e Maior parte dos (-)
AE1/AE3 Pele
Citoplasmática pavimentoso)´ carcinomas Carcinomas
Parênquima hepatocelulares e
pancreático renais são
geralmente
negativos
Identificação de
Células do fígado Tumores do saco doenças
fetal vitelino neoplásicas e
Células do fígado Tumores das não-neoplásicas
Alfa-1- Citoplasmática em regeneração células do fígado, tumores
Fígado fetal
fetoproteína (granular) Células germinativas do saco vitelino e
endodérmicas do mistos tumores das
interior do saco Carcinomas células
vitelino hepatocelulares germinativas
mistos
Identificação de
Adenomas e
adenomas e
adenocarcinomas
adenocarcinomas
do cólon
do cólon,
Carcinoma da
carcinomas da
mama,
mama, estômago,
Nuclear (tumor) Epitélio glandular estômago,
ovário, próstata e
Membranar do cólon, mama, ovário, próstata e
tiróide,
Β-catenina Cólon (ténue) esófago e tiróide
carcinomas
Citoplasmática estômago, Carcinoma
pavimento
(ténue) urotélio e tiróide pavimento celular
celulares do
do esófago
esófago e
Carcinoma de
carcinomas de
células de
células de
transição e
transição e
hepatocelulares
hepatocelulares
Adenocarcinoma
do cólon
Carcinomas da Diagnóstico
mama diferencial de
Mesotelioma adenocarcinomas,
Células Tumor uma vez que
Carcinoma do mioepiteliais adenomatóide reatividade
CA 125 Citoplasmática
ovário Células uterino positiva é rara em
mesoteliais Carcinoma carcinomas da
bronquioalveolar próstata,
do pulmão colorretais e
Carcinomas renais
endometrióides e
serosos do ovário
Hiperplasia das
Identificação de
Carcinoma Células C células C
carcinomas
Calcitonina medular da Citoplasmática parafoliculares da Carcinoma
medulares da
tiróide tiróide medular da
tiróide
tiróide
Diagnóstico
Células do Carcinoma da
diferencial entre
músculo liso mama
tumores do
Caldesmona Apêndice Citoplasmática Células Leiomiomas
músculo liso (+) e
endoteliais Leiomiosarcomas
lesões
Fibroblastos GIST
mioepiteliais (-)
Diagnóstico
Células
diferencial entre
mesoteliais
Citoplasmática mesoteliomas (+)
Calretinina Mesotelioma Queratinócitos Mesotelioma
Nuclear e
Epitélio do ovário
adenocarcinomas
Timo
do pulmão (-)
Tecidos fetais Adenocarcinoma Identificação de
Colón do fígado, cólon, adenocarcinomas
CEA Apêndice Citoplasmática Células pâncreas, ductos gastrointestinais,
mesenquimatosas biliares e pulmão nomeadamente
do estômago, Carcinoma de carcinomas do
cólon e baço células de cólon e
transição pancreáticos
Carcinoma Diagnóstico
medular da diferencial entre
tiróide adenocarcinoma
do pulmão (+) e
mesotelioma (-)