Cromatografia em Camada

Delgada

Discentes: Daniely de Godoy Silva

Germano Blaquez Junior
Gislaine Ap. da Cunha
Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira
Profª Amanda Coelho Danuello
 Histórico da Cromatografia em
Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada
sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas
de sais inorgânicos.

Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a

Cromatografia em Camada Delgada, para análise de
produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o
desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os
sólidos ao suporte.

Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método

de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.
Cromatografia :
Método físico-químico de separação dos componentes de uma
mistura, realizada através da distribuição destes componentes
entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases
permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.
 Técnicas cromatográficas
Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano

Cromatografia em coluna:
Fase estacionária permanece num tubo
Critério de classificação Cromatografia

Técnica Planar Coluna

Líquido Fluido
Fase Móvel Gás Líquido
supercrítico

Líquido Sólido Fase

Fase Líquido Sólido Líquido Sólido Fase
ligada
Estacionária ligada

CGL CGS CS CLL CLS CE CLFLCTI CB

Tipo de CP CCD
cromatografia
 Outra Classificação

Fase Normal > polaridade

Polaridade: FE > FM < polaridade

FE utilizada : Sílica G

Fase Reversa
< polaridade
Polaridade: FE < FM > polaridade

FE utilizada: Sílica C18

 Mecanismos
Adsorção Partição Exclusão
Líquido/gás gel/sólido
Líquido/gás líquido
Líquido/gás sólido

Troca Iônica
Líquido sólido

+
-
+

+ -
 MECANISMO DE AÇÃO

ABSORÇÃO ADSORÇÃO
 FORÇAS INTERMOLECULARES

MOLÉCULAS APOLARES Ex: Hidrocarbonetos

FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON

Afastadas = Não existe

Molécula  Molécula  atração
apolar apolar

Aproximação = Indução
Dipolo 
instantâneo

Atração
 Dipolo - Dipolo
Molécula polar sem H ligado a
F, ou O ou N

Moléculas Polares
Ligação de Hidrogênio
H ligado a F, ou O, ou N
Cromatografia em Camada Delgada
Consiste na separação dos componentes de uma
mistura através da migração diferencial sobre
uma camada delgada de adsorvente retido sobre
uma superfície plana.
Aplicações:

9Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um

extrato orgânico;
9Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de
estimulantes por atletas;

9 Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;

9Análise da pureza de compostos;
9Análise da eficiência de: destilação e cristalização
Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada
a. Simplicidade;
b. Baixo custo;
c. Facilidade de remover por raspagem a camada, com
espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para
recuperar, por eluição, o conteúdo de uma mancha ou de
uma banda;
 ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no
adsorvente:
Ausência de água = Adsorção
Presença de água = Partição
Exemplos de adsorventes:
¾Sílica-Gel ou àcido Silícico;
¾Óxido de alumínio ou alumina;
¾Celulose;
¾Kieselgur; Kieselgur Alumina

¾Poliamida;

Sílica gel
 Sílica gel ou Ácido silícico
Mais usada na CCD
O O Substância porosa e amorfa.
Apresenta caráter ácido.
O Si O Si OH Possui característica polar, devido à presença de
grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve
apresentar número de hidroxilas razoável para ser
O O seletivo na separação de substâncias de diferentes
polaridades
Mecanismo de adsorção:
-Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.
-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo

Tratamento térmico → eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de

105 a 110ºC)
CUIDADO! A aspiração da sílica causa
Caracterização do tipo básico de sílica gel :
silicose, um tipo de inflamação
G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante); pulmonar crônica!
H: indica ausência de aglutinante;
F: indica adição de substâncias fluorescentes;
P: indica adsorvente para uso preparativo;
R: indica adsorvente de alto grau de pureza;
Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3
mm
 Sílica C18

CH3
CH3

H3C
CH3
Usada em cromatografia de fase
Si HO
H3C O
Si

H3C
O
Si reversa, em que a fase
estacionária é menos polar que a
O
Si OH
O CH3
O
CH3
fase móvel
 Alumina ou Óxido de Alumínio
Segundo adsorvente mais empregado em CCD;
Há três grupos deste adsorvente:
Cl
ÁCIDA ONa
BÁSICA H3C Al O
H3C Al Cl
pH 4,0 H3C Al ONa
NEUTRA
pH 9,0 O Al pH 7,0
O Al Cl
O Al ONa 2+
O Al
O Al
O Al
CH3
CH3
Mecanismo de adsorção:
Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)
O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+

A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo

aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.
Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.
Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.
Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a
utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.
 Celulose
Existem dois tipos de celulose empregadas em
CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose
microcristalina.
Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas
aplicadas na CCD:
Mecanismo: Partição ou troca iônica.

Kieselgur ou terra de diatomáceas

É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.
Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.

Poliamida
Separação de fenóis e ácidos carboxílicos
A separação depende da intesindade das forças
decorrentes das ligações de hidrogênio com o
analito.
Baixa aderência ao vidro: dificuldade de
preparação da placas
Técnica Geral
Escolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Ativação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Documentação;
Calculo do fator de retenção Rf;
 Escolha da fase estacionária

Liofilicidade e liofobicidade
Interação com os componentes (polaridade)

Necessidade de aditivos
Aglutinantes
Substâncias fluorescentes

Capacidade adsorvedora
 Preparação da placas
As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à
temperatura e uniformes.

Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.

Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e
homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais
reprodutíveis.
Procedimentos para a preparação das placas
Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de
gordura);

Secagem → em estufa
Preparação das camadas finas dos adsorventes:
Utilização de espalhadores ( mais empregada);
Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do
adsorvente apropriado.
 Riscar as placas,
determinando a altura
de ínicio e fim da
cromatografia
 Ativação das placas

Objetivo: retirar substâncias interferentes e

eliminar água

Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.

Exemplo : Sílica e alumina ⇒ estufa 105 – 110 ºC por 30 –
60 min;
Celulose ⇒ estufa 105ºC por 10 min;
 Seleção da fase móvel
Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase
móvel.
Método de seleção

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a

natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto.

Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um

processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes
das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.
 Aplicação das amostras
A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo
da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis
possíveis.

Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos

capilares.
As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm acima da
parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em
contato direto com o solvente durante o desenvolvimento do
cromatograma.
Alinhamento horizontal uniforme.
 Preparação da cuba
A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso,
coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação.
A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la
hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera
interna.
Desenvolvimento de um cromatograma numa
cuba
A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e
verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase
móvel desejada
 Revelação dos cromatogramas

A- Procedimentos Físicos:
sicos Luz ultravioleta (aromáticos ou
dupla ligação conjugada).

B- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos:

ticos Antibióticos,
Enzimas e Substratos.

C- Procedimentos Químicos:
micos Aplicação de um reativo
químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
 Reveladores Físicos

Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.

Ex: clorofila.
 Reveladores Químicos
Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com
as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.

Anisaldeído

Iodo
Ác. fosfomolibdico
Tipos de reveladores químicos
Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato
Flavonóides: NP-PEG
Anti-oxidantes: β-caroteno
Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico
Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia
Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de CeSO4
Compostos fenólicos: FeCl3
 Reveladores Biológicos
Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para
tornar a mancha visível.
Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-
fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de
fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas
substâncias.
Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate
factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase
móvel.
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a
vírgula.
 Parâmetros Utilizados na Cromatografia Planar

• Fartor de Retenção (Rf):

• Linha de chegada da FM
• Rf = dr / dm
Ws1
•
• Resolução (Rs):

dm
•
Ws2
• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)

dr1
•

dr2
• Eficiência:
•
• n = 16 (dr – Ws)2 Ponto de partida da amostra
Profundidade da FM
 Desvantagens da CCD
Difícil reprodutibilidade:
quantidade de amostra aplicada
obtenção de cromatoplacas com características idênticas.

Dificuldade de detecção devido à difusão da amostra

Difícil determinação exata do Rf.

Constantes Físicas
 Bibliografia

•COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed.

Unicamp,Campinas,1995.

•NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005

•THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.

•Labjeduardo.iq.unesp.br
 Agradecimentos
• Marcos Antonio Alves (Marquinho)
• Alberto Camilo Alécio (Albertinho)
• Amanda Coelho Danuello