Disciplina de Controle de Qualidade MICROBIOLOGIA ANALITICA

Microbiológico e Biológico

• Área da microbiologia

DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS • Os microrganismos são usados como reativos

• Avaliação de certos compostos bioquímicos

( vitaminas, aminoácidos e antibióticos)

Prof. Fábio Murakami

Murakami, F. S. Murakami, F. S.

Tipos de microrganismos usados CARACTERÍSTICAS BÁSICAS PARA

MICRORGANISMO IDEAL
nos ensaios

1. ser sensível à substância que se vai avaliar

2. ser facilmente cultivável

3. ter uma função metabólica ou resposta mensurável

- Bactérias
4. Não ser suscetível a variações (características metabólicas

- Leveduras devem permanecer constantes através de cultivos prolongados).

- Fungos

Outras características desejáveis:

5. se possível ter especificidade

6. não ser patogênico

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FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO

a) Idade e condições do cultivo

Usar fase logarítmica de crescimento para minimizar a fase de latência
a) Idade e condições do cultivo

Evitar o uso de cultivo com mais de 24 horas

b) Tamanho do inoculo Os cultivos velhos não respondem adequadamente :

Predominância de microrganismos inativos que dão resposta de
desenvolvimento insuficiente.
c) Temperatura

Variação de fatores de crescimento essenciais ou mudanças na
susceptibilidade a substância antimicrobiana.
d) Meio de cultivo
Falta de capacidade para ser padronizado o inóculo pela variação do
número de células vivas.

Possibilidade de autólise com o resultado de liberação de substâncias que
e) Relação de O2
podem interferir no ensaio.

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FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO
b) Tamanho do inoculo d) Meio de cultivo
Deve haver controle nítido sobre a composição do meio evitando variações na
concentração de certos ingredientes.
Não conter constituintes que afetam a substância a ensaiar ou o
c) Temperatura
microrganismo de ensaio.
pH não deve interferir nem na atividade da substância
A temperatura selecionada deverá dar os resultados desejados em
relação ao microrganismo de ensaio e a solução de ensaio dentro do e) Relação de O2.
tempo estabelecido para o ensaio em particular. Fator de menor importância mas que se deve levar em conta especialmente

nos métodos turbidimétricos.

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CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS SEGUNDO CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS SEGUNDO

BUCHANAN BUCHANAN

Fase inicial 1 – Estacionária (2 h) Fase de crescimento 3 (4 a 24 h)

Não há crescimento.

Cada célula se divide em duas.

Número de microrganismos contados = "inoculum"
Fases em que há velocidade máxima de crescimento.

O número de célula aumenta em progressão geométrica, enquanto que o
tempo cresce em progressão aritmética.

A variação logarítmica de (n° de bactérias x tempo) é expressa por uma
Lag fase ou Fase de latência 2 (4h) linha reta.

Dura poucas horas. Enzimas adaptativas (substrato).

Multiplicação muito lenta - o aumento é gradual até o
inicio da fase 3.

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CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS SEGUNDO

BUCHANAN DOSEAMENTO

POTÊNCIA - Antibióticos, vitamina as e aminoácidos
Fase estacionaria 4 (25 a 35 h)

Eficácia terapêutica - efeito inibitório sobre microrganismos

Contagem de bactérias viáveis permanece constante - numero de bactérias
neo-formadas é compensado pelas que começam a morrer.
 não é demonstrável por método químico.

Fase de declínio ou morte das bactérias 5
Diferentes concentrações de antibióticos  diferentes graus
de inibição

As bactérias viáveis diminuem em número, deduz-se que há a morte
devido à falta de elementos necessários ao seu crescimento e o meio muda
Diminuição da atividade antimicrobiana terapêutica.
de pH devido às transformações das bactérias produzindo substancias
tóxicas

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 HISTÓRICO

1929 - Penicilina foi descoberta por Fleming;

1948 - A dosagem microbiológica para a Penicilina foi descrita na
Farmacopéia Britânica;

1958 - A Farmacopéia Britânica inclui 10 novos antibióticos;

1955 - constou pela primeira vez na Farmacopéia Americana (USP XV) o
ensaio microbiológico para antibióticos (técnica de difusão em gel e
turbidimetria)

SQR  produzida pela United States Pharmacopeia (USP);
HISTÓRICO

Cepas microbianas: provenientes da American Type Culture Collection
(ATCC);

Período de incubação sugerido: 16 a 18 h, sob temperatura de 32 a 35°C
para a técnica de difusão e 4 h de 34,5 a 35,5º C para turbidimetria;

O tipo de delineamento experimental 5 x 1 da USP XXIV apareceu
inicialmente na sua 16ª edição.

A Farmacopéia Brasileira 5ª edição descreve as metodologias de difusão
em ágar e de turbidimetria para antibióticos, assim como procedimentos
estatísticos aplicáveis aos ensaios biológicos.

Padrão de trabalho: fornecido pelo FDA;

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METODOS DE DOSEAMENTO DE ANTIBIOTICOS

E FATORES DE CRESCIMENTO MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

Método de Difusão em Ensaio em Placas

O crescimento bacteriano em meio líquido

é medido por turbidimetria e leitura da

Método Turbidimétrico
turvação = crescimento)

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

PARA ANTIBIÓTICOS
PARA VITAMINAS E AMINOÁCIDOS

Diferentes concentrações de antibióticos produzirão diferentes
graus de inibição.

Maior concentração de vitamina  maior

A representação gráfica das leituras de ABSORBANCIA ou
crescimento  maior turbidez  maior
TRANSMITANCIA nos tubos de diferentes concentrações de
antibiótico, permite comparar a amostra com um padrão absorbância e menor transmitância.
(antibiótico de referência).

Maior concentração antibiótico  menor turbidez  menor

crescimento  menor absorbância e maior transmitância .

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 MÉTODO TURBIDIMÉTRICO MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

Antibiótico Vitaminas e aa
DO
T% DO
T%

Log conc Log conc

Log conc Log conc

Antibiótico
Vitamina
Meio Rico
Meio pobre

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO TÉCNICA MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

VANTAGENS DO MÉTODO Transferir 1,0 mL de cada solução, seja do padrão ou da amostra, para serie de 3 a 4 tubos

Rapidez, pouco espaço exigido, trabalho e material simples quando de dimensão padronizada, previamente esterilizados. Deve-se incluir na serie tubos controles
positivos e negativo
computado com outros métodos biológicos, método especifico e sensível.

Adicionar 9,0 mL do meio de cultura inoculado

DESVANTAGENS

Alta sensibilidade  sofre interferência de vários fatores – impurezas,
Homogeneizar e incubar sob as condições especificadas
soluções turvas ou coloridas. (geralmente 36-37,5 C em banho-maria ou estufa 4 a 5 horas)

É necessário validar o método e manter sempre as mesmas condições. Adicionar 0,5 mL de formaldeído diluído em cada tubo e ler a absorbância ou transmitância
em espectrofotômetro a 530 ou 580nm

Nota: O equipamento deve ser zerado com caldo não inoculado especificado para o antibiótico ou fator de
crescimento teste, incluindo a mesma quantidade da solução teste e formaldeído como adicionado em
cada tubo teste.

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METODO DA DIFUSÃO EM PLACAS METODO DA DIFUSÃO EM PLACAS

Depende da difusão do produto em análise através de um cilindro
O halo de inibição ou de crescimento terá o diâmetro, dentro de
apropriado ou discos de papel ou em orifícios feitos na camada de Ágar certos limites, proporcional a concentração do produto.
semeado e solidificado numa placa de Petri.

A leitura é feita nas zonas de inibição de crescimento (antibiótico), ou nas
zonas de crescimento (vitamina e aminoácidos) dos microrganismos.

Cilindros  10 mm H x 8 mm de diâmetro externo x 6 mm interno  0,1 mL de solução. Tempo de incubação:

16 a 24 horas;
Discos  8 mm de diâmetro. Papel de filtro embebido na solução da subst.

5 a 7 dias B. subtilis

temperatura: 32 a 37°C

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 METODO DA DIFUSÃO EM PLACAS METODO DA DIFUSÃO EM PLACAS
Ensaio Balanceado ou Fatorial (2 x 2)
O valor resultante da zona de inibição depende:

Foi descrito por Knudsen e Randall (1945);

São empregados duas doses do padrão e duas da amostra, com idêntica

a) Da difusão externa do antibiótico. razão entre as doses;

Em que cada placa de petri de 10 cm de diâmetro inclui todas as quatro

doses, de forma que o número de réplicas é igual ao numero de placas
empregado;

b) Crescimento da bactéria que tende a cobrir a superfície nutriente

Também conhecido como simétrico ou balanceado.

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METODO DA DIFUSÃO EM PLACAS TÉCNICA DA DIFUSÃO EM PLACAS

Ensaio Balanceado ou Fatorial (2 x 2)
Ensaio de difusão  emprego do meio de cultura em bicamada

Ensaio quantitativo Base busca uniformização corrigindo interferências e falhas técnicas, a superfície contem
o inóculo)

Resultado através de cálculos matemáticos ou graficamente

O inóculo a ser empregado deve apresentar a menor concentração
Leitura: microbiana, porém suficiente para apresentar crescimento que

Curva padrão - amostra. propicie contraste com a zona de inibição de crescimento, sem se

2 diluições - cálculo da potência;
apresentar como colônias isoladas;

2 dil. padrão ( P e p ) ;

As concentrações usadas na curva de dosagem devem estar em

2 dil. Desconhecido (D e d ) ou Amostra (A 1 e A 2)
progressão geométrica;

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TEORIA DO MÉTODO DE DIFUSÃO DELINEAMENTO DO ENSAIO

Sempre essencial que se trabalhe com réplicas

Emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em

sistema de mono ou bicamada, através da qual a substância-teste se
Devem ser considerados no cálculo de potência da amostra: condições
difunde. de tratamento prévio, extrações, diluições, teor de umidades

A solução teste é aplicada sobre a superfície deste meio, em uma área
A potência de amostras desconhecidas pode ser determinada pelo
restrita, e as placas são então incubadas.
dimensionamento da resposta de uma diluição ao apropriada, seguido
de leitura em curva padrão.

O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porém, áreas onde
tenha ocorrido a difusão do antibiótico, gerando contraste e resultando a

É importante que a cada dia do ensaio haja a comparação da amostra
chamada zona de inibição de crescimento, ou ainda restrito a áreas onde
tenha ocorrido a difusão do fator de crescimento. com padrão de referência, sob as mesmas condições.

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 3x1
Dispositivo para leitura de halos Eli Lilly Antibiotic Zone Reader

Placas de doseamento microbiológico

de gentamicina pelo delineamento 3 x 1
antes e depois do período de incubação

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ENSAIOS COM INTERPOLAÇÃO EM CURVA ENSAIOS COM INTERPOLAÇÃO EM CURVA

PADRÃO (5 X 1)

Utilizado para determinação de potência de número grande de amostras de
mesma natureza;

Este delineamento estaria poupando esforços, pois permite análise de várias
amostras e o maior número de níveis de concentração do padrão estaria
contribuindo para melhor estimativa da inclinação da reta;
PADRÃO (5 X 1)

Cada placa inclui duas doses, em posições alternadas, cada uma em triplicata.

Em todas as placas uma das concentrações é a de referência, que é a
concentração central da curva padrão; a outra é uma das quatro concentrações
do padrão (1, 2, 4 ou 5), ou a dose da amostra de potência desconhecida, em
nível de dose nominal equivalente à da referência do padrão

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ENSAIOS COM INTERPOLAÇÃO EM CURVA ENSAIOS COM INTERPOLAÇÃO EM CURVA

PADRÃO (5 X 1) PADRÃO (5 X 1)

São preparadas 3 réplicas de placas para cada uma das 4 concentrações do
padrão e para a concentração da amostra;

Gráfico e construído posicionando, em papel monolog, as médias das leituras
das zonas de inibição corrigidas do padrão, no eixo x, em escala aritmética, e a
concentração (dose) do antibiótico (escala logaritma), no eixo y;
A potênncia da amostra pode também ser obtida pela equação da reta, e
o cálculo do coeficiente de correlação possibilita avaliar a
correspondência de resposta do ensaio.
Os valores L e H são posicionados e ligados em linha reta, no papel
monolog.

Outra possibilidade consiste em aplicar equações que conduzam ao cálculo de Log dose
dois pontos, através dos quais será traçada a reta, com maior segurança.

Diâmetro dos padrões

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 PREPARO DO INÓCULO ETAPAS DO PREPARO DO INÓCULO

Microrganismo teste em tubos 10 mL do meio de cultura indicado na farmacopéia

Microrganismos são fornecidos liofilizados

Incubação do tubo na temperatura e tempo indicado pela farmacopéia

3 mL de solução salina estéril  transferir a cultura para maior superfície de ágar 

Recuperação em meio liquido, frasco de Roux contendo 250 mL do meio de cultura indicado para o microrganismo

Incubar o frasco de Roux a 32-35 C/24h

Sub-culturas para retornar a características fisiológicas

Lavar a cultura resultante na superfície do meio com 50 mL de solução fisiológica estéril
normais;

PADRONIZAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS por contagem microscópica
direta, contagem de viáveis, medida de turbidez ou método espectrofotométrico

Manutenção com repiques em freqüência mensal;
Determinar a quantidade de suspensão a ser adicionada a cada 100mL de agar ou
calda nutriente para produzir zonas de inibição claras e definidas ou relação satisfatória
dose-resposta no método turbidimétrico.

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ETAPAS DO PREPARO DO INÓCULO FATORES DE INFLUÊNCIA

Preparar a camada basal pela transferência de 21 mL do meio solido esterilizado e

Presença de outras substancias inibidoras;
fundido nas placas de Petri. Esperar solidificar

Presença de nutrientes na amostra;

Transferir 4-5 mL do meio de superfície previamente inoculado, mantido a 48-50 C,
e espalhar, sob rotação, até solidificação
Tamanho do inóculo;

Fase de crescimento da população microbiana;

Dispensar quantidades definidas da solução do antibiótico em reservatórios (cilindros
de vidro ou aço inoxidável, templates de aço, discos de papel de filtro, cavidades
Natureza do meio;
perfuradas no próprio agar nutriente)
Tempo e temperatura críticos.

Incubar 32-35 C/16-18h

Para algumas situações pode ser recomendada a permanência das placas por 30
minutos a 2 horas a temperatura ambiente anteriormente a incubação (pré-difusão)

Medir o diâmetro das zonas de inibição de crescimento com precisão de 0,1 mm
(paquímetro, régua milimetrada ou projetor óptico)

Calcular a potência da substância conforme tipo de ensaio devendo ser determinados
os limites de confiança, empregando metodologia estatística

Técnica empregada: se em mono ou bicamada. A última resulta em zonas
de inibição mais nítidas, porém envolve maior dispêndio de tempo;

Natureza inibitória ou estimulante dos componentes da amostra sobre o
microrganismo teste, alem de hidrossolubilidade e difusibilidade no ágar;

Área de aplicação da solução teste;

Tempo de aplicação da solução teste

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Outros fatores que afetam o tamanho da zona DOSEAMENTO DE ANTIBIÓTICOS –

de inibição no meio todo de difusão: USP NF XXXI 2008
1. antibiótico: P = penicilina G potássica 1.000.000 UI

Escolha do microrganismo e sua sensibilidade  deve ser sensível A = penicilina G potássica 5.000.000 UI
ao antibiótico que se quer dosear 2. método: CP = cylinder plate (difusão em placas)  discos de papel

Fase de crescimento do microrganismo (cultura recente) 3. diluente: B1 = tampão nº 1

Condições exigidas pelo organismo teste para o crescimento  4. organismo teste: S.aureus ATCC 297337
formulação e condição do meio de cultura, pH do meio 5. condições de incubação: 32 – 35 ºC, 24 horas (meio I)

densidade do inóculo (padronização) 6. preparo do inóculo

Espessura e uniformidade do agar 7. soluções para doseamento: P e D = 2,0 UI/mL

Volume de solução teste aplicada a placa p e d = 1,0 UI/mL

Temperatura e tempo de incubação 8. relação de doses: 2

Uso correto dos padrões e amostras 9. ensaio: Ensaio Paralelo 2x 2

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 ou considerar:

log M = log R x (D-P) + (d – p) se o desconhecido tivesse 100%  M seria = 1

(D- d) + (P –p)
Conc. Teórica  1
X  M obtido

Aceita-se ± 10%
concentração Desconhecido = M x conc. Padrão

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Exemplo de cálculo

Potência do desconhecido em relação ao padrão PLACA P p D d

1 25 21 23 20
2 25 20 25 21
3 23 19 23 18
M D/P = conc D em U/mL = quantidade de P em vol que produza um certo efeito 4 24 20 24 20
conc P em U/mL quantidade de D em vol que produz o mesmo efeito
Média 24,25 20,00 23,75 19,75

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Exemplo de cálculo Exemplo de cálculo

log M = log 2 x (23,75 – 24,25) + (19,75 - 20) Assumindo que o frasco desconhecido tenha 5.000.000 U
(23,75 – 19,75) + (24,25 - 20)
Log M = (- 0,50) + (-0,25) x 0,3010 = -0,75 x 0,3010 = - 0,02736 5.000.000 U  1
X  0,94
(4,00) + (4,25) 8,25 X = 4.700.000 U

M = 0,9389 = ~0,94 Aceita-se 5.000.000 U ± 10% (4.500.000 --- 5.500.000), logo o valor encontrado está
dentro dos limites permitidos.
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 Fim

Exemplo de cálculo

Ou

Fim
concentração real = concentração esperada x M
concentração real = 5.000.000 U x 0,94
concentração real = 4.700.000 U

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