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Licenciatura de Bioquímica

Enzimologia

Trabalho prático n. º1 e n. º2

Doseamento da proteína de um extrato animal


&
Estudo da Fosfatase Alcalina

Discentes: Joana Pimpão n.º 42606


Edvânia Leopoldo n.º 43672
Mirian de Deus n.º 43528

Celestino Bastos n.º 45081

Docente: Professora Doutora Isabel Pereira

Ano Letivo

2019/2020
Universidade de Évora
Licenciatura de Bioquímica

Índice
1. Objetivo ............................................................................................................................ 5
2. Introdução ........................................................................................................................ 6
2.1. Enzimas ..................................................................................................................... 6
2.1.1. Propriedades das enzimas: ...................................................................................... 7
Especificidade dos enzimas ............................................................................................... 9
2.2.Fosfatase Alcalina.......................................................................................................... 10
2.2.1. Utilidade da Fosfatase Alcalina .............................................................................. 11
2.3.Cinética Enzimática ....................................................................................................... 12
2.4.Modelo de Michaelis-Menten ....................................................................................... 14
2.5.Método de Lineaweaver-Burk ....................................................................................... 15
2.6.Método de Eadie e Hufstee ........................................................................................... 15
2.7.Método de Hanes .......................................................................................................... 16
2.8.Método de Eisenthal e Cornish-Bowden (método direto) .............................................. 17
2.9.Fatores que afetam a velocidade de uma reação enzimática ......................................... 18
➢ Temperatura ............................................................................................................... 18
➢ pH ............................................................................................................................... 18
➢ Concentração de substrato .......................................................................................... 19
➢ Concentração da enzima ............................................................................................. 19
2.10.Significado das constantes Vmax e Km ........................................................................ 21
3.Procedimento Experimental ................................................................................................. 22
3.1.Trabalho prático n.º1 .................................................................................................... 22
3.1.1. Fluxograma:........................................................................................................... 22
3.1.2.Registo e Tratamento de dados .............................................................................. 23
3.2.Trabalho prático n.º2 .................................................................................................... 24
3.2.1. Fluxograma:........................................................................................................... 24
4.Registo e Tratamento de dados ............................................................................................ 26
4.1.Efeito da Temperatura .................................................................................................. 26
4.1.1. Efeito da Temperatura a 25˚C ................................................................................ 26
....................................................................................................................................... 26
4.1.2.Efeito da Temperatura a 30˚C ................................................................................. 26
4.1.3.Efeito da Temperatura a 37˚C ................................................................................. 27
4.1.4.Determinação da velocidade inicial para as diferentes temperaturas através das
equações de reta obtidas: ............................................................................................... 27
4.2.Efeito da concentração de Enzima ................................................................................. 28
4.2.1. Concentração Enzimática 0,1M .............................................................................. 28

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4.2.2. Concentração Enzimática 0,2M .............................................................................. 28


4.2.3. Concentração Enzimática 0,3M .............................................................................. 29
4.2.4. Determinação da velocidade inicial para as diferentes temperaturas através das
equações de reta obtidas: ............................................................................................... 29
4.3. Efeito do pH ................................................................................................................. 30
4.3.1. Efeito do pH a 8,1 .................................................................................................. 30
4.3.2 Efeito da pH a 8,5 ................................................................................................... 31
4.3.3. Efeito do pH a 9,0 .................................................................................................. 31
4.3.4. Efeito do pH a 9,5 .................................................................................................. 32
4.3.5 Efeito do pH a 10 .................................................................................................... 32
4.3.6. Determinação da velocidade inicial para as diferentes temperaturas através das
equações de reta obtidas: ............................................................................................... 33
4.4 Efeito da Concentração de Substrato ............................................................................. 34
4.4.1 Efeito da concentração de substrato a 0,06 mM. .................................................... 34
4.4.2 Efeito da concentração de substrato a 0,18 mM. .................................................... 35
4.4.3 Efeito da concentração de substrato a 0,36 mM. .................................................... 35
4.4.4 Efeito da concentração de substrato a 0,6 mM. ...................................................... 36
4.4.5 Efeito da concentração de substrato a 1,2 mM. ...................................................... 36
4.4.6. Determinação da velocidade inicial para as diferentes concentrações através das
equações das retas obtidas: ............................................................................................ 37
4.4.7. Michaelis-Menten.................................................................................................. 37
4.4.8. Linewear Burk........................................................................................................ 38
4.4.9. Eadie-Hofstee ........................................................................................................ 39
4.4.10. Método de Hanes ................................................................................................ 40
4.4.11. Método Direto ..................................................................................................... 41
4.5. Efeito da Concentração de Substrato com inibidor ....................................................... 42
4.5.1. Ensaio 1 ................................................................................................................. 42
4.5.2. Ensaio 2 ................................................................................................................. 42
4.5.3. Ensaio 3 ................................................................................................................. 43
4.5.4. Ensaio 4 ................................................................................................................. 43
4.5.5. Ensaio 5 ................................................................................................................. 44
4.5.6 Michaellis-Menten ........................................................................................... 44
4.5.7 Lineweaver Burk ................................................................................................... 45
....................................................................................................................................... 45
4.5.8 Eadie-Hofstee .................................................................................................. 46
....................................................................................................................................... 46
4.5.9 Método de Hanes............................................................................................ 47

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Método Direto ................................................................................................................ 48


4.6. Os parâmetros cinéticos foram determinados através da sua linearização e respetiva
equação .............................................................................................................................. 49
5.Discussão e Conclusão ......................................................................................................... 50
6.Webgrafia ............................................................................................................................ 52

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1. Objetivo

Trabalho nº 1: Doseamento da proteína de um extrato animal.


Trabalho nº 2: Estudo da fosfatase alcalina.

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2. Introdução
2.1. Enzimas
As Enzimas são grupos de substância orgânicas normalmente de natureza proteínas
(exceto um grupo de RNA catalítico, as ribozimas) com atividades intra ou extracelular
que têm funções catalíticas, catalisando reações químicas que, sem a sua presença
dificilmente ocorrem. A enzima diminui a energia de ativação necessária para que se dê
uma reação química, resultando no aumento da velocidade da reação e possibilitando
o metabolismo dos seres vivos.

As enzimas são proteínas e tal como as proteínas são formadas por longas cadeias
lineares de aminoácidos que sofrem enovelamentos que tem como resultados um
produto com estrutura tridimensional.

As enzimas são importantes pois, a maioria das reações químicas que ocorrem nos
sistemas biológicos seria muito lenta para fornecer produtos na proporção adequada
para sustentar a vida. Elas contribuem para um funcionamento metabólico melhor, de
maneira mais regulada e especifica.

As enzimas são fundamentais para processos bioquímicos celulares tais como:

• Degradação das moléculas nutrientes;

• Transformação e conservação da energia química;

• Síntese de macromoléculas biológicas a partir de moléculas precursoras


simples.

Importância prática do estudo das enzimas:

- Em algumas doenças, especialmente nas desordens genéticas herdadas, pode ocorrer


uma deficiência ou mesmo a ausência total de uma ou mais enzimas. Ex: fenilcetonúria
(fenilalanina hidroxilase); doença de von Gierke (glicose-6-fosfatase hepática)

As enzimas podem ser:

- Constituídos apenas por proteínas

- Conjugados- parte proteica(apoenzimas) + grupos não proteicos (cofator)

A maioria das enzimas necessitam da associação com outras moléculas ou iões para
exercer o seu papel catalítico. Esses componentes da reação enzimática são
genericamente chamados cofatores, os quais podem ser iões metálicos (Ca, Mg, Mn, Fe,
Cu, Ni, Co, Zn, etc…) ou moléculas orgânicas não proteicas (coenzimas). Estes cofatores
não estão ligados permanentemente à molécula da enzima, mas na ausência deles a
enzima é inativo. A fração proteica de uma proteína na ausência do seu cofator é
chamada de apoenzima.

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Enzimas + cofatores = Holoenzima

A região que contém resíduos catalíticos, que se liga ao substrato e que desempenha
a reação, denomina-se sítio ativo. As enzimas também podem possuir sítios onde se liga
os cofatores, que são necessários às reações catalíticas.

Figura 1: A esfera a cinzento é um ião de zinco que funciona como cofator no sítio ativo.

2.1.1. Propriedades das enzimas:


• São catalisadores biológicos que aceleram as reações termodinamicamente
possíveis;

• São verdadeiros catalisadores- não se consomem nem alteram;

• São macromoléculas de natureza proteica (exceto as ribozimas) que catalisam


reações-proteínas globulares;

• Apresentam massa molecular variável;

• São especificas para substratos ou grupos de substratos;

• Apresenta frequentemente um elevado grau de especificidade quer em relação


ao tipo de reação que catalisam quer em relação aos substratos que
transformam;

• Podem atuar em concentrações baixas;

• Podem ter sua atividade e concentração reguladas;

• - Atuam em condições especificas de temperatura e pH;

A velocidade da reação catalisada por uma enzima aumenta devido à diminuição da


energia de ativação necessária para converter o substrato no produto.

A combinação do substrato com a enzima cria uma via de reação que tem um estado
de transição de menor energia do que na ausência do substrato.

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Os enzimas:

✓ Diminui o valor de ΔG;

✓ Diminui a energia de ativação;

✓ Reduz a variação da entropia;

✓ Providência uma via alternativa á formação


do produto.

É importante salientar que a velocidade e a eficiência da catalise enzimática são


influenciadas por vários fatores, tais como:

• Temperatura;

• pH

• Regulação enzimática;

• Presença ou ausência dos cofatores;

• Presença de inibidores.

As proteínas podem sofrer desnaturação, isto é, a estrutura sofre degradação e


inativação devido ao aumento de temperatura, o que provoca alterações na
conformação tridimensional da proteína. Dependendo da enzima, a desnaturação pode
ser reversível ou irreversível.

- A variação do pH altera os fatores, como: a ligação do substrato à enzima, a atividade


catalítica da enzima, a ionização do substrato e a variação da estrutura da proteína. As
cadeias laterais podem agir como ácido ou base uma vez que são aminoácidos
influenciando diretamente a atividade enzimática.

- Se o pH for aceitável para a ação de determinadas enzimas, a velocidade da catalise


será mais rápida. Como podemos observar nas seguintes imagens.

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Especificidade dos enzimas


Os enzimas possuem uma alta especificidade em relação às reações que catalisam e
aos substratos envolvidos na reação. A forma complementar, carga e características
hidrofílicas ou hidrofóbicas são responsáveis por essa especificidade.

Para explicar melhor essa especificidade desenvolveu-se modelos, tais como:

➢ Modelo de chave-fechadura (não é mais usado): considera que a enzima possui


um sítio ativo complementar ao substrato.

➢ Modelo do encaixe induzido: defende que quando a enzima e o substrato se


encontram na presença um do outro, sofrem alterações de conformação para o

encaixe.

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2.2.Fosfatase Alcalina
A fosfatase alcalina é uma hidrólise que remove grupos fosfatos de um grande
número de moléculas diferentes, incluindo nucleósidos, proteínas e alcalóides. Como o
nome indica, a enzima é mais ativa em soluções alcalina pelo facto do seu pH ótimo ser
acima do neutro (pH 8-11). O processo de remoção desses grupos fosfatos é conhecido
como desfosforilação.

Figura 2: Estrutura da fosfatase alcalina da El-Coli.

A nível do corpo, uma enzima pode ser encontrada em diversos tecidos incluindo
fígado, ossos, rins, intestino e placenta. Mas a concentração mais elevada de fosfatase
alcalina estão presentes no fígado e nos ossos. O exame de fosfatase alcalina mede os
níveis dessa enzima no sangue.

No fígado, a fosfatase alcalina é encontrada nas bordas das células que se unem para
formar canais biliares, pequenos tubos que drenam a bile do fígado para o intestino,
onde ele é necessário para ajudar na digestão das gorduras. A fosfatase alcalina dos
ossos é produzida pelos osteoblastos, células que estão envolvidas na formação do osso.

O nível de fosfatase alcalina no sangue é verificada através do teste de ALP, o que é


muitas vezes parte de testes de rotina do sangue. O nível desta enzima no sangue
depende de fatores tais como a idade, sexo e o tipo de sangue. Os níveis sanguíneos de
fosfatase alcalina também aumentam duas a quatro vezes durante a gravidez. Este é um
resultado de fosfatase alcalina adicional produzida pela placenta. Além disso, níveis
anormais de fosfatase alcalina no sangue pode indicar questões relacionadas com o
fígado, vesícula biliar ou ossos. Tumores renais, infeções, bem como a desnutrição
também reflete nível anormal de fosfatase alcalina no sangue. Os níveis de fosfatase
alcalina em uma célula pode ser medida através de um processo chamado "O método
de pontuação", este método é uma técnica utilizada em que uma amostra da enzima é
extraída a partir do interior das células do sangue e são analisadas e comparadas para
fazer variar a atividade da enzima. Um esfregaço de sangue é geralmente tomado e
submisso a centrifugação diferencial para isolar leucócitos e coloração para categorizar
cada leucócito em específicos “índices de fosfatase alcalina leucocitária.” Este marcador
foi concebido para distinguir os leucócitos e determinar a atividade da enzima diferente
da extensão de cada amostra de coloração.

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A fosfatase alcanina hidrolisa o p-nitrofosfato libertando p-nitrofenol e fosfato


inorgânico, segundo a reação seguinte:

Figura 3: Mecanismo reacional do p-nitrofenilfosfato (pNPP).

2.2.1. Utilidade da Fosfatase Alcalina

➢ Uso na pesquisa científica:


A aferição do nível de Fosfatase Alcalina tornou-se uma ferramenta
extremamente útil nos laboratórios de biologia molecular, nomeadamente na extração
dos grupos fosfatos encontrados na extremidade 5’ das moléculas de DNA, o que
interrompe a conexão dessa extremidade com outras moléculas de DNA. A Fosfatase
Alcalina também é amplamente utilizada no procedimento de marcação radioativa. A
extração desses fosfatos possibilita a troca desses por grupos radioativos, permitindo a
posterior identificação dessas moléculas.

➢ Uso na Indústria:

Um uso comum da fosfatase alcalina na indústria é como marcador da


pasteurização.

➢ Uso no diagnóstico:

A hiperfosfatasemia (fosfatase alcalina total no sangue elevada) pode estar


relacionada com as seguintes condições patológicas:

• Colestase;

• Hepatites virais;

• Doença de paget;

• Tumores ósseos;

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• Hiperparatireoidismo;

• Osteomalacia;

• Raquitismo.

As isoenzimas produzidas pelo fígado e pelo osso podem ser separadas por
eletroforese para melhor perceber o motivo de um valor elevado nas análises; contundo
numa elevação simultânea da GGT (gama-glutamitranspeptidase) sugere que é o fígado
a causa da fosfatase alcalina elevada.

2.3.Cinética Enzimática
A Cinética Enzimática é um dos campos de estudo mais clássicos da Bioquímica.
Nenhum estudo sobre uma enzima se encontra completo sem estudos cinéticos.
O estudo da função de enzimas pode envolver vários processos como a
determinação da estrutura, usando técnicas espetroscópicas como a difração de raios-
X em proteínas cristalizadas ou a ressonância magnética nuclear (RMN) em proteínas
em solução, permitindo assim localizar a posição dos diferentes resíduos no espaço. Este
tipo de estudo revela muitas vezes detalhes sobre o mecanismo da reação, ou seja, a
forma e sequência de ligações do substrato ao centro ativo para ser catalisado. Por outro
lado, é importante conhecer parâmetros cinéticos, como a velocidade da reação
catalisada, o efeito de inibidores nessa velocidade, quantas moléculas a enzima
consegue catalisar por segundo para poder ser aferida a eficiência dessa enzima e a
forma como é regulada.
Para que uma reação enzimática ocorra, a enzima (E) e o substrato (S) têm de se
encontrar e formar o complexo enzima-substrato (ES). A formação deste complexo é
uma peça chave na compreensão da progressão de uma catálise. O complexo ES é
deslizante, isto é, a enzima pode dissociar-se do seu substrato sem ter havido reação.
Este equilíbrio é expresso sob a forma:
𝐄 + 𝐒 ⇆ 𝐄𝐒
A enzima pode então transformar o substrato num produto (P). Existe de forma
transiente um complexo EP, havendo então dissociação deste complexo em enzima
livre (E) e produto (P). Este mecanismo pode escrever-se na forma simplificada:
𝐄 + 𝐒 ⇆ [𝐄𝐒] → 𝐄 + 𝐏
A reação de formação de ES é normalmente mais rápida que a reação de
dissociação de EP, ou seja, a libertação do produto da reação é normalmente um passo
limitante da reação.

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O estudo de uma reação enzimática in vitro não reflete a verdadeira situação das
enzimas em células, mas possibilita a simplificação da determinação de parâmetros
cinéticos. Dentro de uma célula, o substrato pode estar confinado a um dado
compartimento e não sofrer facilmente difusão: por exemplo, pode ser o produto de
uma reação anterior numa via metabólica, pelo que passa diretamente de uma enzima
para a outra. Normalmente, os estudos in vitro usam uma concentração de substrato
muito superior à concentração de enzima, para que a probabilidade de uma enzima
encontrar uma molécula de substrato seja o mais elevada possível.

Figura 4: Representação da variação da velocidade inicial da reação (V) em função da concentração de


substrato ([S]).

Uma outra vantagem do uso de uma concentração de substrato ([S]) maior que
a concentração de enzima ([E]) é a possibilidade de monitorizar a variação da velocidade
de reação com [E] sem que haja uma variação apreciável de [S]. Como S está a ser
convertido em P, [S] decresce com o tempo, à medida que o produto se acumula em
solução. Como a [S] influencia a formação do complexo ES (e, portanto, da formação de
produto), vai influenciar também a velocidade da reação. No entanto, se for feita apenas
a monitorização da velocidade inicial da reação (tipicamente, durante os primeiros 30 a
60 segundos), a variação de [S] não é significativa e pode ser tomada como constante.
Nestas condições, a velocidade medida (velocidade inicial, V0) depende apenas
de [E]. Um gráfico de V0 em função de [S] apresenta uma forma característica de semi-
hipérbole: a baixas concentrações de substrato, a variação de V0 com [S] é linear; à
medida que se usam [S] mais elevadas, V0 sofre uma variação cada vez menor, tendendo
para um valor limite. Este valor é denominado velocidade máxima, Vmax.
Este comportamento deve-se a baixas concentrações de substrato, a maior parte
da enzima em solução encontra-se na forma livre, E; usando concentrações
suficientemente elevadas de S, toda a enzima se encontrará, num dado instante, em
complexo com molécula(s) de substrato, isto é, na forma ES. Por maior que seja a
concentração de substrato utilizada, as moléculas de enzima não têm capacidade de
catalisar o substrato, por todos os centros ativos se encontrarem ocupados. Nestas
condições, diz-se que a enzima se encontra saturada.

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2.4.Modelo de Michaelis-Menten
Uma vez que a relação entre a variável
independente S e a variável dependente v é não-
linear, Michaelis e Menten (1913) reconheceram
desde cedo que não era prática a determinação
de 𝑉𝑚𝑎𝑥 e K m a partir da equação da hipérbole.
Para tal, contribuía o facto de haver restrições de
natureza física, as quais tornam apenas possível
a medição de v para valores positivos e finitos de
S. Não era assim fácil determinar com rigor
aqueles parâmetros, já que as assímptotas não
podem ser localizadas com precisão, além disso,
era difícil traçar com rigor uma hipérbole
retangular. A equação de Michaelis-Menten pode
hoje ser representada de maneira diferente para
a determinação de 𝑉𝑚𝑎𝑥 e 𝐾𝑚 , a partir de uma
série de medições da velocidade inicial a
diferentes concentrações de substrato: uns métodos são simples, rápidos e expeditos,
mas de menor precisão; outros são mais precisos e complexos, complexidade esta
apenas aparente dada a possibilidade de utilização de computadores cada vez mais
exatos e rápidos. De todos eles, apenas faremos referência a cinco, por serem talvez os
de utilização mais corrente. Dentro destes, os três mais conhecidos resultam de
transformações lineares da equação de Michaelis-Menten. A teoria/equação de
Michaelis-Menten aplica-se apenas a reações químicas catalisadas por enzimas com um
só substrato. Contudo, a maioria das reações enzimáticas do metabolismo celular são
reações com mais de um substrato. A cinética enzimática destas reações é
consideravelmente mais complexa. Por este motivo, e apenas no caso das enzimas que
seguem a cinética de Michaelis-Menten, utiliza-se comummente um truque: satura-se a
enzima relativamente a todos os seus substratos com exceção daquele que se pretende
estudar, ficando assim a velocidade da reação a depender da concentração de um único
substrato.
V × [S]
v0 =
[S] + K m

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2.5.Método de Lineaweaver-Burk
Invertendo ambos os membros da equação de Michaelis-Menten obtém-se a
seguinte equação:
1 Km 1 1
= × +
v Vmax [S] Vmax
Esta equação mostra que a representação gráfica de 1/v em função de 1/S é uma
reta, com derivada igual a Km/Vmáx, ordenada na origem igual a 1/Vmáx e abcissa na
origem igual a -1/Km.

➢ Principal defeito: tomando o inverso de v, os


menores valores de v (que são precisamente
aqueles valores que têm maior percentagem
de erro), ilustrado pelas barras verticais da
figura, as quais correspondem todas à
mesma amplitude de erro em v.

➢ Principais vantagens: as variáveis v e S estão


separadas e os maus dados experimentais
originam frequentemente bons
ajustamentos.

2.6.Método de Eadie e Hufstee


Multiplicando ambos os membros da equação de Lineweaver-Burk por v.Vmáx e
rearranjando a equação, obtém-se a 3ª transformação linear da equação de Michaelis-
Menten: a equação de Eadie-Hofstee:
v v Vmax
=− +
[S] Km Km
Esta equação mostra que a representação gráfica de v em função de v/S é uma
recta, com derivada igual a -Km, ordenada na origem igual a Vmáx e abcissa na origem
igual a Vmáx/Km.

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O facto de v aparecer em ambos os


membros da equação provoca um certo grau de
correlação inevitável entre as variáveis v e v/S de
tal modo que, mesmo quando S e v são duas
variáveis aleatórias independentes, as variáveis v
e v/S estão relacionadas entre si. Esta correlação,
sendo positiva, tende a enfraquecer a correlação
observada entre as variáveis no gráfico, já que a
relação teórica dada pela equação entre v e v/S é
negativa. - Como ambas as variáveis estão
sujeitas a erro, o método geral do ajustamento de
uma recta a pontos pelo método dos mínimos quadrados não é, teoricamente, aplicável.

2.7.Método de Hanes
Equação de uma reta cujo coeficiente angular é o inverso da velocidade máxima.
[S] 1 Km
= × [S] +
v V V

Figura 5: Representação gráfica da equação do método de Hanes.

Pontos positivos: Menor distorção dos erros.

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2.8.Método de Eisenthal e Cornish-Bowden (método direto)


Trata-se de um método estatístico não-paramétrico, gráfico, introduzido por
Eisenthal e Cornish-Bowden (1974). Rearranjando a equação de Michaelis-Menten de
modo a obter Vmáx em função de K m, chega-se à seguinte equação:
Vmax K m
− =1
v [S]

Então, se tratarmos Vmáx e Km como sendo variáveis e v e S como constantes,


esta equação define uma linha reta, com derivada v/S, ordenada na origem v e abcissa
na origem -S.

Cornish-Bowden (1979) refere que


isto não é tão estranho como pode parecer à
primeira vista, uma vez S e v medidos
experimentalmente, eles passam a ser
constantes já que qualquer análise dos
resultados os mantém inalterados. Em
relação a Vmáx e Km, eles podem ser tratados
como variáveis enquanto não forem
estimados os seus valores. Assim, neste
método, cada par de valores experimentais
(Si,vi) origina uma reta num gráfico que
Figura 6: Representação gráfica da equação do método de
representa Vmáx em função de Km. Eisenthal e Cornish-Bowden.

Pontos positivos: Resultados podem ser representados sem tratamento aritmético, os


resultados incluem o erro de literatura, são mais sensíveis para detetar resultados forma
da norma.

Pontos negativos: Apenas permite a representação de um número pequeno de


resultados, dificuldade em detetar cinéticas não hiperbólicas, não pode ser expandido
facilmente para reações com vários substratos ou com inibidores, por vezes torna-se
difícil distinguir interseções.

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2.9.Fatores que afetam a velocidade de uma reação enzimática


➢ Temperatura
A temperatura é um fator importante na atividade das enzimas. Dentro de certos
limites, a velocidade de uma reação enzimática aumenta com o aumento da
temperatura. Entretanto, a partir de uma determinada temperatura, a velocidade da
reação diminui bruscamente.
O aumento de temperatura provoca maior agitação das moléculas e, portanto,
maiores possibilidades de elas se chocarem para reagir. Porém, se for ultrapassada certa
temperatura, a agitação das moléculas se torna tão intensa que as ligações que
estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompem e ela se desnatura.
Para cada tipo de enzima existe uma
temperatura ótima, na qual a velocidade da
reação é máxima, permitindo o maior número
possível de colisões moleculares sem desnaturar
a enzima. A maioria das enzimas humanas, têm
sua temperatura ótima entre 35 e 40ºC, a faixa de
temperatura normal do nosso corpo. Já bactéria
que vivem em fontes de água quente têm enzimas
cuja temperatura ótima fica ao redor de 70ºC.

➢ pH
Outro fator que afeta a forma das proteínas é
o grau de acidez do meio, também conhecido
como pH (potencial hidrogeniónico). A escala de
pH vai de 0 a 14 e mede a concentração relativa
de iões hidrogénio (H+) em um determinado
meio. O valor 7 apresenta um meio neutro, nem
ácido nem básico. Valores próximos de 0 são os
mais ácidos e os próximos de 14 são os mais
básicos (alcalinos).

Cada enzima tem um pH ótimo de atuação, no qual a sua atividade é máxima. O pH


ótimo para a maioria das enzimas fica entre 6 e 8, mas há exceções. A pepsina, por
exemplo, uma enzima digestiva estomacal, atua eficientemente no pH fortemente ácido
de nosso estômago (em torno de 2), onde a maioria das enzimas seria desnaturada. A
tripsina, por sua vez, é uma enzima digestiva que atua no ambiente alcalino do intestino,
tendo um pH ótimo situado em torno de 8.

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➢ Concentração de substrato
Após a determinação das velocidades iniciais (𝑣0 ) de uma dada reação enzimática
para uma série de concentrações de substrato (S), a representação gráfica de V em
função de [𝑆] fornece uma secção de uma hipérbole retangular de equação.
a × [S]
v0 =
[S] + b
Onde a e b são duas constantes, a é o valor máximo de V – ponto de tangência à
1
assíntota- e o valor de [𝑆] para o qual 𝑣0 = 2 ª. O a normalmente tem a designação de
velocidade máxima, representado por 𝑉𝑚𝑎𝑥 ou V, e b – constante importante das reações
enzimáticas- tem o nome de constante de Michaelis, representado por 𝐾𝑚 . por sua vez,
a equação anterior toma, para reações enzimáticas, a seguinte forma.
V × [S]
v0 =
[S] + K m

Equação de Michaelis-Menten

➢ Concentração da enzima
Existe proporcionalidade entre as velocidades iniciais (no tempo zero, 𝑡0 ) e as
quantidades de enzima:
𝑣0 = 𝑘[𝐸]

Portanto, dentro de condições adequadas e idênticas, duas moléculas de enzima


que atuam independentemente, transformarão uma quantidade de substrato
duas vezes superior à que é transformada por uma única molécula, no mesmo
intervalo de tempo.

[Enzima]

Velocidade de catálise

19
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Figura 7: Efeito da concentração de substrato na reação enzimática, assumindo que a


concentração de enzima permanece constante.

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2.10.Significado das constantes Vmax e K m


A constante de Michaelis-Menten, Km, representa o valor da concentração do
substrato para o qual esta reação se processa a uma velocidade inicial igual a metade da
Vmax . Esta constante exprime-se em unidades de concentração (e.g mol/L), sendo
obviamente independente das unidades em que se exprime a velocidade da reação.
Do ponto de vista prático, K m , dá indicações sobre a eficiência com que a enzima
“interatua” com um dado substrato. Um valor pequeno indica que - para uma igual
concentração- a enzima é capaz de catalisar a transformação desse substrato a uma
maior velocidade do que quando o K m é grande.
K m só é uma medida da afinidade da enzima ao substrato quando a teoria de
Michaelis-Menten for verificada, sendo então K m uma constante de dissociação,
K s . Nestes casos é em geral o inverso de K m que é
utilizado como medida da afinidade. Valores baixos de K m correspondem a elevadas
afinidades e valores elevados a baixas afinidades.
[𝐸][𝑆] 1
𝐾𝑠 = =
[𝐸𝑆] 𝐾𝑎
Onde 𝐾𝑎 é a constante de associação, ou afinidade.

Por sua vez Vmax é uma velocidade enzimática e, portanto, terá as dimensões dessa
velocidade, exprimindo-se usualmente em mol/s. A constante K m é independente da
quantidade de enzima presente na reação, enquanto que Vmax depende dessa
quantidade pois quanto mais enzima estiver presente maior será a velocidade ada
reação, tendo-se por definição (quando a enzima esta saturada),
Vmax = 𝑘[𝐸]

21
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3.Procedimento Experimental
3.1.Trabalho prático n.º1
3.1.1. Fluxograma:

Colocar 0,5 mL do reagente B e 0,5 mL Colocar 0,5 mL do reagente B e 0,5 mL do


do reagente C para um balão de 50 cm3 reagente C para um balão de 50 mL e
e preencher o restante volume do balão preencher o restante volume do balão com a
com a solução A (reagente de Lowry). solução A (reagente de Lowry).

Diluir a mucosa com NaOH.


0,5 M

Preparação dos tubos Agitar no vortex.


(indicados na tabela).

Agitar no vortex e aguardar 30 minutos. Ler a absorvância a 720 nm.

22
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3.1.2.Registo e Tratamento de dados

[BSA](µg/cm3) Absorvência(nm)
Amostra ? 0,1595 Absorvência vs [BSA]
Branco 0 0,074 0,4

Absorvência(nm)
Tubo 1 50 0,1605 0,3
Tubo 2 75 0,187
0,2
Tubo 3 100 0,2145 y = 0,0014773x + 0,0789211
0,1
Tubo 4 125 0,2885 R² = 0,9862471
Tubo 5 150 0,2915 0
0 50 100 150 200 250
Tubo 6 175 0,336
[BSA](µg/cm3)
Tubo 7 200 0,372
Série1 Linear (Série1)

Amostra
Absorvência(nm) 0,1595
Declive 0,0015
Interseção 0,0789
[BSA Inicial](µg/cm3) 53,7
[BSA](µg/cm3) 268,5

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3.2.Trabalho prático n.º2


3.2.1. Fluxograma:
➢ Parte A
Abrir a cavidade intestinal e Remover os detritos intestinais
Sacrificar um murganho remover o intestino para um fazendo passar a mesma solução
mantido em jejum durante copo com uma solução de pelo seu interior com o auxílio de
24 horas. cloreto de sódio 0,9% gelado. uma seringa.

Inverter o intestino inserindo uma vareta num dos seus


Pesar a mucosa num terminais. Fixar o terminal e proceder à sua inversão
vidro de relógio. forçando o intestino a passar por cima da vareta. A
mucosa intestinal fica então exposta e é removida.

Transferir a mucosa para um Filtrar a suspensão através de um passador de rede para


homogeneizador de vidro e adicionar remover resíduos sólidos. Distribuir o extrato em várias
NaCl 0.9% para obter uma diluição de 50 alíquotas e mantê-las a -20ºC até as utilizar.
volumes do peso da mucosa original.

➢ Parte B
B.1. Efeito da temperatura:

B.2. Efeito da concentração de enzima:

B.3. Efeito do pH:

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B.4.Efeito da concentração de substrato:

B.5. Efeito da concentração de fosfato inorgânico:

25
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4.Registo e Tratamento de dados


4.1.Efeito da Temperatura
4.1.1. Efeito da Temperatura a 25˚C

Tempo Absorvência 0,1


0 0,011 0,09 y = 0,0006615x + 0,0102308
10 0,008 R² = 0,9839406
0,08
20 0,029 0,07
30 0,03 0,06
40 0,039 Absorvância 0,05
Absorvância
50 0,046 0,04
60 0,049 0,03 Linear (Absorvância)
70 0,057 0,02
80 0,064 0,01
90 0,068 0
100 0,077 0 50 100 150
110 0,083 tempo,s
120 0,088
Tabela 1: Valores de absorvância Gráfico 1: Curva de reação a uma temperatura de 25C.
registados a uma temperatura de
25C durante 120 segundos.

4.1.2.Efeito da Temperatura a 30˚C


Tempo Absorvência 0,09
0 0 y = 0,0006401x + 0,0012088
0,08 R² = 0,9968191
10 0,008 0,07
20 0,016 0,06
Absorvância

30 0,019 0,05
40 0,026 0,04 Absorvância
50 0,034 0,03 Linear (Absorvância)
60 0,04 0,02
70 0,045 0,01
80 0,054 0
90 0,059 0 50 100 150

100 0,064 tempo, s


110 0,074
Gráfico 2: Curva de reação a uma temperatura de 30C.
120 0,076
Tabela 2: Valores de absorvância registados a uma
temperatura de 30C durante 120 segundos.

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4.1.3.Efeito da Temperatura a 37˚C


Tempo Absorvância 0,1
0 0,01 y = 0,0006473x + 0,0090110
0,09 R² = 0,9969854
10 0,016 0,08
20 0,02 0,07
30 0,027

Absorvância
0,06
40 0,037 0,05
50 0,041 Absorvância
0,04
60 0,047 0,03
Linear (Absorvância)
70 0,055
0,02
80 0,061
0,01
90 0,067
0
100 0,076 0 50 100 150
110 0,078 tempo, s
120 0,087
Tabela 3: Valores de absorvância Gráfico 3: Curva de reação a uma temperatura de 37C.
registados a uma temperatura de
37C durante 120 segundos.

4.1.4.Determinação da velocidade inicial para as diferentes temperaturas


através das equações de reta obtidas:

Temperatura Velocidade inicial 0,000665


(°C) (s-1)
0,00066
25 0,0006615
0,000655
v0, s-1

30 0,0006401 0,00065

0,000645
37 0,0006473
0,00064

0,000635
Tabela 4: Valores da V0 para cada
20 25 30 35 40
temperatura.
Temperatura, °C

Gráfico 4: Curva de reação das temperaturas no geral.

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4.2.Efeito da concentração de Enzima


4.2.1. Concentração Enzimática 0,1M

Tempo Absorvância
0 0,01
Absorvâncias
10 0,016 0,1
y = 0,0006473x + 0,0090110
20 0,02 0,09 R² = 0,9969854
0,08
30 0,027
0,07

Título do Eixo
40 0,037
0,06
50 0,041 0,05
60 0,047 Absorvâncias
0,04
70 0,055 0,03 Linear (Absorvâncias)
80 0,061 0,02
90 0,067 0,01
100 0,076 0
0 50 100 150
110 0,078
Título do Eixo
120 0,087
Gráfico 5: Curva de reação a uma concentração de enzima 0,1M.
Tabela 5: Valores de absorvância registados para
as concentrações de enzima de 0,1 durante 120
segundos.

4.2.2. Concentração Enzimática 0,2M


Tempo Absorvância
0 0,001 Absorvâncias
10 0,009 0,14
y = 0,0010819x - 0,0021429
20 0,019 0,12 R² = 0,9980171
30 0,028
0,1
40 0,038
Título do Eixo

0,08
50 0,051
0,06 Absorvâncias
60 0,063
70 0,074 0,04 Linear (Absorvâncias)

80 0,085 0,02
90 0,098 0
100 0,108 0 50 100 150
-0,02
110 0,115 Título do Eixo
120 0,127
Gráfico 6: Curva de reação a uma concentração de enzima 0,2M.
Tabela 6: Valores de absorvância
registados para as concentrações
de enzima de 0,2 durante 120
segundos.

28
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4.2.3. Concentração Enzimática 0,3M


Tempo Absorvância
0 0,002 Absorvâncias
10 0,028 0,25
y = 0,0015379x + 0,0106484
20 0,04 R² = 0,9963715
0,2
30 0,062

Título do Eixo
40 0,076 0,15
50 0,089
Absorvâncias
60 0,104 0,1
Linear (Absorvâncias)
70 0,118
0,05
80 0,133
90 0,153 0
100 0,163 0 50 100 150
110 0,177 Título do Eixo
120 0,193
Gráfico 7: Curva de reação a uma concentração de enzima 0,3M.
Tabela 7: Valores de absorvância registados
para as concentrações de enzima de 0,3
durante 120 segundos.

4.2.4. Determinação da velocidade inicial para as diferentes temperaturas


através das equações de reta obtidas:

[Enzima] Velocidade inicial 0,0018


M (s-1) 0,0016
0,0014
Título do Eixo

0,0012
0,001
0,1 0,0006473
0,0008
0,2 0,0010819 0,0006
0,0004
0,3 0,0015379 0,0002
Gráfico 8: Curva de reação das três 0
concentrações enzimáticas. 0,07 0,12 0,17 0,22 0,27 0,32
Título do Eixo

Tabela 8: Valores de V0 para cada concentração enzimática.

29
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4.3. Efeito do pH
4.3.1. Efeito do pH a 8,1

pH = 8,1
pH = 8,1
Tempo Absorvência
0,08
0 0
0,07
10 0,003 0,06
20 0,012 0,05
30 0,016 0,04

Abs
40 0,024 0,03
0,02
50 0,032
0,01
60 0,034 0
70 0,041 -0,01 0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (s)
80 0,05
90 0,056
Gráfico 9: Curva de reação a pH 8,1.
100 0,059
110 0,068
120 0,07

Tabela 9: Valores de absorvância registados


para o pH a 8,1 durante 120 segundos.

30
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4.3.2 Efeito da pH a 8,5

pH = 8,5
Tempo Abs pH = 8,5
0 0,002 0,08
10 0,006 0,07
20 0,01 0,06
30 0,018 0,05
40 0,024 0,04
Abs
50 0,028 0,03
60 0,033 0,02
70 0,042 0,01
80 0,049 0
90 0,052 -0,01 0 20 40 60 80 100 120 140
100 0,06 Tempo (s)
110 0,07
Gráfico 10: Curva de reação a pH 8,5.
120 0,071

Tabela 10: Valores de absorvância registados


para o pH a 8,5 durante 120 segundos.

4.3.3. Efeito do pH a 9,0

pH = 9
Tempo Abs
pH = 9
0 0,002 0,08
10 0,006 0,07
20 0,011 0,06
30 0,019
0,05
40 0,026
Abs

0,04
50 0,028
60 0,036 0,03
70 0,044 0,02
80 0,048 0,01
90 0,054
0
100 0,063 0 20 40 60 80 100 120 140
110 0,071 Tempo (s)
120 0,068
Tabela 11: Valores de absorvância registados Gráfico 11: Curva de reação a pH 9,0.
para o pH a 9,0 durante 120 segundos.

31
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4.3.4. Efeito do pH a 9,5

pH = 9,5
Tempo Abs pH = 9,5
0 0,013 0,1
10 0,018 0,09
20 0,026 0,08
30 0,029 0,07

40 0,035 0,06

50 0,042 Abs 0,05

60 0,051 0,04

70 0,057 0,03

80 0,063 0,02
0,01
90 0,07
0
100 0,078
0 20 40 60 80 100 120 140
110 0,088
Tempo (s)
120 0,091
Tabela 12: Valores de absorvância Gráfico 12: Curva de reação a pH 9,5.
registados para o pH a 9,5 durante 120
segundos.

4.3.5 Efeito do pH a 10

pH = 10
Tempo Abs pH = 10
0 0,002 0,07
10 0,01 0,06
20 0,013
0,05
30 0,02
40 0,023 0,04
Abs

50 0,027 0,03
60 0,035
0,02
70 0,038
80 0,04 0,01
90 0,047
0
100 0,049 0 20 40 60 80 100 120 140
110 0,055 Tempo (s)
120 0,06
Gráfico 13: Curva de reação a pH 10,0.
Tabela 13: Valores de absorvância registados
para o pH a 10,0 durante 120 segundos.

32
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4.3.6. Determinação da velocidade inicial para as diferentes temperaturas


através das equações de reta obtidas:

Vo s-1 pH 0,0008

0,0006121 8,1 0,0007

0,0006044 8,5 0,0006

Título do Eixo
0,0006011 9 0,0005

0,0006703 9,5 0,0004

0,0003
0,0004632 10
0,0002
Tabela 14: Valores de V0 para cada
0,0001
valor de pH.
0
8 8,5 9 9,5 10 10,5
Título do Eixo

Gráfico 14: Curva de reação dos cinco valores de pH.

33
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4.4 Efeito da Concentração de Substrato


pNPP 6mM (cm3)
3
V= 0,01 cm 6 x 0,001 = 1 x cf cf = 0,06 mM
V= 0,03 cm3 6 x 0,03 = 1 x cf cf = 0,18 mM
V= 0,06 cm3 6 x 0,06 = 1 x cf cf = 0,36 mM
V= 0,1 cm3 6 x 0,1 = 1 x cf cf = 0,6 mM
V= 0,2 cm3 6 x 0,2 = 1 x cf cf = 1,2 mM
Tabela 15: Cálculo da concentração de fosfato inorgânico.

4.4.1 Efeito da concentração de substrato a 0,06 mM.

Tempo Absorvência
0 0 Absorvância
10 0 0,025
y = 0,0001758x - 0,0006264
20 0,003 R² = 0,9854872
0,02
30 0,006
40 0,007 0,015
Título do Eixo

50 0,007
60 0,009 0,01 Absorvância

70 0,012 Linear (Absorvância)


0,005
80 0,014
90 0,014 0
100 0,017 0 50 100 150
110 0,019 -0,005
Título do Eixo
120 0,021

Tabela 16: Valores de absorvância registados Gráfico 16: Efeito da concentração de substrato a 0,06 mM.
para a concentração de substrato de 0,06 mM,
durante 120 segundos.

34
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4.4.2 Efeito da concentração de substrato a 0,18 mM.

Tempo Absorvência
0 0 Absorvância
10 0,007 0,07
y = 0,0004742x + 0,0012418
20 0,009 0,06 R² = 0,9944998
30 0,015
0,05
40 0,021

Título do Eixo
50 0,027 0,04
60 0,029 0,03 Absorvância
70 0,036 Linear (Absorvância)
0,02
80 0,04
90 0,043 0,01

100 0,05 0
110 0,051 0 50 100 150

120 0,058 Título do Eixo

Tabela 17: Valores de absorvância registados Gráfico 17: Efeito da concentração de substrato a 0,18mM.
para a concentração de 0,18 mM durante 120
segundos.

4.4.3 Efeito da concentração de substrato a 0,36 mM.

Tempo Absorvância
0 0,001
Absorvância
10 0,005 0,08
y = 0,0006187x - 0,0007363
20 0,011 0,07 R² = 0,9961783
30 0,016 0,06
40 0,022 0,05
Título do Eixo

50 0,031
0,04
60 0,038 Absorvância
0,03
70 0,043 Linear (Absorvância)
0,02
80 0,05
90 0,054 0,01

100 0,062 0
0 50 100 150
110 0,069 -0,01
Título do Eixo
120 0,071

Tabela 18: Valores de absorvância registados Gráfico 18: Efeito da concentração de substrato a 0,36 mM.
para a concentração de 0,36 mM durante 120
segundos.

35
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4.4.4 Efeito da concentração de substrato a 0,6 mM.

Tempo Absorvân-
cia Absorvância
0 0 0,08
10 0,007 y = 0,0006x + 0,0013
0,07 R² = 0,9965
20 0,014
0,06
30 0,02

Título do Eixo
0,05
40 0,022
0,04
50 0,03 Absorvância
60 0,038 0,03
Linear (Absorvância)
70 0,041 0,02
80 0,046 0,01
90 0,054 0
100 0,059 0 50 100 150
110 0,063 Título do Eixo
120 0,071
Gráfico 19: Efeito da concentração de substrato a 0,6 mM.
Tabela 19: Valores de absorvância registados
para a concentração de 0,6 mM, durante 120
segundos.

4.4.5 Efeito da concentração de substrato a 1,2 mM.

Tempo Absorvância
Absorvância
0 0,002
10 0,009 0,08
y = 0,0006093x + 0,0018242
20 0,012 0,07 R² = 0,9953618
30 0,019 0,06
Título do Eixo

40 0,025 0,05
50 0,032 0,04
Absorvância
60 0,041 0,03
70 0,047 Linear (Absorvância )
0,02
80 0,051
0,01
90 0,056
0
100 0,064 0 50 100 150
110 0,066 Título do Eixo
120 0,075
Tabela 20: Valores de absorvância registados Gráfico 20: Efeitos da concentração de substrato a 1,2 mM.
para a concentração de 1,2 mM, durante 120
segundos.

36
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4.4.6. Determinação da velocidade inicial para as diferentes concentrações


através das equações das retas obtidas:

[Substrato] Velocidade inicial (s-1)


Velocidade inicial (s-1)
M
0,06 0,0001758 0,0007

0,0006
0,18 0,0004742
0,0005
0,36 0,0006187 0,0004

0,6 0,0005753 0,0003

0,0002
1,2 0,0006093
0,0001

0
Tabela 21: Velocidade incial para as diferentes
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
concentrações de substrato.
Gráfico 21: Curva dos cinco ensaios realizados.

4.4.7. Michaelis-Menten

0,00065
0,0006
0,00055
Velocidade inicial (s-1)

0,0005
0,00045
0,0004
0,00035
0,0003
0,00025
0,0002
0,00015
0,0001
0,00005
0
00,050,10,150,20,250,30,350,40,450,50,550,60,650,70,750,80,850,90,9511,051,11,151,21,251,3
[Substrato] M

Gráfico 22: Linearização de Henri-Michaelis-Menten, para estudar o efeito da concentração de substrato.

37
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[Substrato]
Velocidade inicial (s-1)
M Vmáx 0,0006
0,06 0,0001758 0,11
Km
0,18 0,0004742 Tabela 22.2: Parâmetros cinéticos obtidos através da
0,36 0,0006187 linearização de Michaelis-Menten.

0,6 0,0005753
1,2 0,0006093

Tabela 22.1: Valores de velocidade inicial para diferentes


concentrações de substrato.

4.4.8. Linewear Burk


6000
y = 266,43x + 1093,2
R² = 0,965
1/Velocidade inicial (s-1)

5000

4000

3000 1/Velocidade inicial (s-


1)
2000 Linear (1/Velocidade
inicial (s-1))
1000

0
-10 0 10 20
1/[Substrato] M

Gráfico 23: Linearização de Lineweaver-Burk, para o estudo do efeito da concentração


de substrato.

Vmáx 9,15E-04
1/[Substrato] 1/Velocidade inicial (s-
M 1) Km 0,243706
16,6666667 5688,282139
Tabela 23.2: Parâmetros cinéticos obtidos
5,55555556 2108,814846 através da Linearização de Linewear Burk.
2,77777778 1616,292226
1,66666667 1738,223536
0,83333333 1641,227638

Tabela 23.1: Valores utilizados para a linearização


de Linewear Burk.

38
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4.4.9. Eadie-Hofstee

0,0035 y = -4,4107605x + 0,0039141


R² = 0,6136393
0,003

0,0025
V/[Substrato]

0,002
V0/[Substrato]
0,0015

0,001 Linear (V0/[Substrato]


)
0,0005

0
-0,001 -0,0005 0 0,0005 0,001
Velocidade inicial (s-1)

Gráfico 24: Linearização de Eadie e Hofstee, para o estudo do efeito da


concentração de substrato.

Velocidade inicial (s-1) V0/[Substrato] Vmáx 0,0039141


(s-1/M)
Km 4,4107605
0,0001758 0,00293
0,0004742 0,00263444 Tabela 24.2: Parâmetros cinéticos obtidos
através da Linearização de Eadie-Hofstee.
0,0006187 0,00171861
0,0005753 0,00095883
0,0006093 0,00050775
Tabela 24.1: Valores utilizados para a linearização
de Eadie-Hofstee.

39
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4.4.10. Método de Hanes


2300
y = 1 494,7495554x + 145,5514312
R² = 0,9871026
[S]/Velocidade inicial (s-1)
1800

1300
[S]/Velocidade inicial
(s-1)
800 Linear ([S]/Velocidade
inicial (s-1))
300

-200-0,02 0,48 0,98 1,48

[Substrato] M

Gráfico 25: Linearização de Hanes, para o estudo do efeito da


concentração de substrato.

[Substrato] M [S]/Velocidade inicial (s-1) Vmáx 6,69E-04


Km 0,097375129
0,06 341,2969283
Tabela 25.2: Parâmetros cinéticos obtidos através
0,18 379,5866723 da Linearização do Método de Hanes.
0,36 581,8652012
0,6 1042,934121
1,2 1969,473166
Tabela 25.1: Valores utilizados para a linearização
do Método de Hanes.

40
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4.4.11. Método Direto


0,0009
0,0008
0,0007
0,0006
0,0005
V0

0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0
-1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0
[S]

Gráfico 26: Linearização de Eisenthal e Cornish-Bowden para o estudo do efeito da


concentração do substrato.

[S] V0 Vmáx 6,69E-03


Km 0,07
-0,06 0
0 0,000176
Tabela 26.2: Parâmetros cinéticos obtidos através da
-0,18 0 Linearização do Método Direto.
0 0,000474
-0,36 0
0 0,000619
-0,6 0
0 0,000575
-1,2 0
0 0,000609
Tabela 26.1: Valores utilizados para
a linearização do Método Direto.

41
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4.5. Efeito da Concentração de Substrato com inibidor


4.5.1. Ensaio 1
Tempo Abs
0,0045 0 0
0,004 10 0
0,0035 20 0
0,003 30 0
0,0025 40 0
0,002 50 0,001
Abs

0,0015 60 0,001
0,001 70 0,001
0,0005 80 0,001
0 90 0
-0,0005 0 20 40 60 80 100 120 140 100 0
-0,001
110 0,002
Tempo (s) 120 0,004

Tabela 27: Valores de absorvância


Gráfico 27: Efeito da concentração de substrato a 0,06 mM, com registados para a concentração de 0,6
inibidor. mM, com inibidor, durante 120
segundos.

4.5.2. Ensaio 2

0,016 Tempo Abs


0 0,001
0,014
10 0,002
0,012 20 0,005
0,01 30 0,007
40 0,007
Abs

0,008
50 0,009
0,006
60 0,009
0,004 70 0,009
0,002 80 0,009
90 0,009
0
0 20 40 60 80 100 120 140 100 0,011
Tempo (s) 110 0,009
120 0,014
Gráfico 28: Efeito da concentração de substrato a 0,18 mM, com Tabela 28: Valores de absorvância registados
inibidor. para a concentração de 0,18 mM, com inibidor,
durante 120 segundos.

42
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4.5.3. Ensaio 3
0,025
Tempo Abs
(s) (nm)
0 0,003
0,02
10 0,003
20 0,003
0,015 30 0,004
Abs

40 0,006
0,01 50 0,007
60 0,007
0,005 70 0,008
80 0,0013
0 90 0,014
0 20 40 60 80 100 120 140
100 0,016
Tempo (s)
110 0,016
120 0,021
Gráfico 29: Efeito da concentração de substrato a 0,36 mM, com
inibidor. Tabela 29: Valores de absorvância registados
para a concentração de 0,36 mM, com inibidor,
durante 120 segundos.

4.5.4. Ensaio 4
Tempo Abs
0,1
(s) (nm)
0,09
0 0
0,08
10 0
0,07 20 0,026
0,06 30 0,029
Abs

0,05 40 0,035
0,04 50 0,042
0,03 60 0,051
0,02 70 0,057
0,01 80 0,063
0 90 0,07
0 20 40 60 80 100 120 140 100 0,078
Tempo (s) 110 0,088
Gráfico 30: Efeito da concentração de substrato a 0,6 mM, com 120 0,091
inibidor. Tabela 30: Valores de absorvância registados
para a concentração de 0,6 mM, com inibidor,
durante 120 segundos.

43
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4.5.5. Ensaio 5
Tempo Abs
0,06
0 0,003
0,05 10 0,002
20 0,009
0,04 30 0,01
40 0,016
0,03
50 0,017
Abs

0,02 60 0,023
70 0,025
0,01 80 0,032
90 0,033
0
0 20 40 60 80 100 120 140 100 0,042
-0,01 110 0,041
Tempo (s)
120 0,048

Gráfico 31: Efeito da concentração de substrato a 1,2 mM, com Tabela 31: Valores de absorvância registados
inibidor. para a concentração de 1,2 mM, com inibidor,
durante 120 segundos.

4.5.6 Michaellis-Menten

0,00085
0,0008
0,00075
0,0007
0,00065
0,0006
0,00055
Título do Eixo

0,0005
0,00045
0,0004
0,00035
0,0003
0,00025
0,0002
0,00015
0,0001
0,00005
0
0 0,050,10,150,20,250,30,350,40,450,50,550,60,650,70,750,80,850,90,95 1 1,051,11,151,21,251,3
Título do Eixo

Gráfico 32: Linearização de Henri-Michaelis-Menten, para estudar o efeito da concentração de substrato com inibidor.

44
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Vmáx 0,00035
[Substrato] M Velocidade inicial (s-1)
Km 0,37
0,06 0,0000198
Vo 0,000175
0,18 0,0000808
0,36 0,0001355 Tabela 32.2: Parâmetros cinéticos obtidos através
da linearização de Michaelis-Menten.
0,6 0,0007626
1,2 0,0003879
Tabela 32.1: Velocidade inicial para as diferentes concentrações de
substrato com inibidor.

4.5.7 Lineweaver Burk

60000

50000
1/Velocidade inicial (s-1)

y = 3 129,1517615x - 2 380,2048118
40000 R² = 0,9901446

30000 1/Velocidade inicial (s-1)

20000 Linear (1/Velocidade


inicial (s-1))
10000

0
-10 0 10 20
1/[Substrato] M

Gráfico 33: Linearização de Lineweaver-Burk, para o estudo do efeito da concentração


de substrato com inibidor.
Vmax 4,20E-04
1/[Substrato]
1/Velocidade inicial (s-1) Km 1,314657
M
16,66666667 50505,05051 Tabela 33.2: Parâmetros cinéticos obtidos
5,555555556 12376,23762 através da Linearização de Linewear Burk.
2,777777778 7380,073801
1,666666667 1311,303436
0,833333333 2577,984016
Tabela 33.1: Valores utilizados para a
linearização de Linewear Burk.

45
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4.5.8 Eadie-Hofstee

0,0035

0,003
y = -0,6534595x + 0,0012511
0,0025 R² = 0,0323236
V/[Substrato]

0,002

0,0015 V0/[Substrato]
Linear (V0/[Substrato] )
0,001

0,0005

0
-0,001 -0,0005 0 0,0005 0,001
Velocidade inicial (s-1)

Gráfico 34: Linearização de Eadie e Hofstee, para o estudo do efeito da concentração de


substrato com inibidor.

Velocidade inicial (s-1) V0/[Substrato] Vmáx 0,0012511


0,0000198 0,00293 Km 0,6534595
0,0000808 0,000448889 Tabela 34.2: Parâmetros cinéticos obtidos através
0,0001355 0,000376389 da Linearização de Eadie-Hofstee.

0,0007626 0,001271
0,0003879 0,00032325
Tabela 34.1: Valores utilizados para a linearização
de Eadie-Hofstee.

46
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4.5.9 Método de Hanes

[S]/Velocidade inicial (s-1)


3300
y = 76,1169432x + 2 322,5069176
[S]/Velocidade inicial (s-1)

2800 R² = 0,0013211
2300

1800 [S]/Velocidade inicial (s-1)


1300
Linear ([S]/Velocidade inicial
800 (s-1))
300

-200-0,02 0,48 0,98 1,48

[Substrato] M

Gráfico 35: Linearização de Hanes, para o estudo do efeito da concentração de substrato com
inibidor.

[Substrato] M [S]/Velocidade inicial (s-1)


0,06 3030,30303 Vmáx 1,31E-02
0,18 2227,722772 Km 35.2: Parâmetros cinéticos
Tabela 30.5123514
obtidos
através da Linearização do Método de
0,36 2656,826568
Hanes.
0,6 786,7820614
1,2 3093,58082
Tabela 35.1: Valores utilizados para a linearização do
Método de Hanes.

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Método Direto
0,0009
0,0008
0,0007
0,0006
0,0005
V0

0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0
-1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0
[S]

Gráfico 36: Linearização de Eisenthal e Cornish-Bowden para o estudo do efeito da concentração do substrato
com inibidor.

[S] V0 Vmáx 0.0007943


-0,06 0 Km 0,187

0 1,98E-05 Tabela 36.2: Parâmetros cinéticos obtidos através da Linearização do


Método Direto.
-0,18 0
0 8,08E-05
-0,36 0
0 0,000136
-0,6 0
0 0,000763
-1,2 0
0 0,000388
Tabela 36.1: Valores utilizados para a linearização do
Método Direto.

48
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4.6. Os parâmetros cinéticos foram determinados através da sua


linearização e respetiva equação

Substrato Inibidor
Linearização KM(mM) Vmáx Km(mM) Vmáx
Henri-Michaelis-Menten 0,11 0,0006 0,37 0,00035
Lineweaver-Burk 0,243706 9,51E-04 1,314657 4,20E-04
Eadie e Hofstee 4,4107605 0,0039141 0,6534595 0,0012511
Hanes 0,097375129 6,69E-04 30.5123514 1,31E-02
Eisenthal e Cornish-Bowden 0,07 6,69E-03 0,187 0.0007943

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5.Discussão e Conclusão
Nesta aula laboratorial pretendeu-se a extração e caraterização de proteínas
presentes em alguns órgãos do murganho como mucosa intestinal, testículos, fígado e
rins e também na determinação da sua atividade enzimática.
Sendo a fosfatasse alcalina envolvida na identificação de doenças e em reações
extremamente importante para o estudo bioquímicos, torna-se uma proteína muito
importante para os estudos laboratoriais.
Foi possível determinar a concentração das proteínas usando o método da curva
de calibração e a sua caraterização enzimática através do método de Lowry da medição
da absorvência ao longo da curva de reação em função do tempo.
Tendo em conta os resultados obtidos verificou-se que esse método é eficiente
para a determinação da concentração e da atividade enzimática uma vez que a
concentração e os parâmetros cinéticos estão dentro da idealidade.
Na análise do estudo do efeito do pH na atividade enzimática da fosfatase
alcalina construiu-se um gráfico de absorvância em função do tempo (curva de reação).
A partir da análise do gráfico da atividade enzimática em função do pH, verificamos que
o pH ótimo da fosfatase alcalina é entre os 9 a 9,5.
Como se pode observar pelo gráfico, a seguir ao valor de pH 8,5, há um aumento
da atividade enzimática, chegando ao seu máximo a um pH ótimo de 9,5,
posteriormente a atividade enzimática da fosfatase alcalina diminui. Este enzima
desnatura a pH muito baixos ou muito altos, resultando na diminuição da atividade
catalítica. Assim o pH ótimo desta proteína é a 9 a 9,5.
Foi efetuado outro estudo que analisa o efeito da concentração do enzima na
atividade enzimática. Através da curva de reação relativa à variação de absorvência em
função do tempo para este ensaio, podemos verificar que existe uma proporcionalidade
direta entre os quatro primeiros valores destes dois parâmetros. Ao traçar o gráfico da
atividade especifica em função da concentração do enzima, verificou-se que a atividade
enzimática é máxima para uma concentração de enzima de 0,36.
Para observar o efeito da concentração fosfato inorgânico, na atividade
enzimática, desenvolveu-se a curva de Henri-Michaelis-Menten e outras linearizações
desta, tal como a linearização de Lineweaver-Burk, de Eadie e Hofstee, de Hanes e de
Eisenthal e Cornish-Bowden. A partir da análise destas linearizações foram
determinados os parâmetros cinéticos, Km e Vmáx , caracterizando-se assim o enzima.
Estas linearizações têm vantagens e desvantagens, como por exemplo, a linearização de
Lineweaver-Burk, tem uma equação que corresponde a uma reta cujo coeficiente
angular e a ordenada na origem permitem caracterizar criticamente o sistema
enzimático, no entanto a sua desvantagem é ter um intervalo de distorção dos erros
experimentais grande. A linearização de Eadie e Hofstee, tem uma maior distribuição
dos pontos experimentais, qualquer concentração de substrato entre zero e o infinito é
representável, no entanto tem as suas desvantagens, pois o intervalo da distorção dos
erros experimentais é grande e a velocidade aparece em ambos os eixos. Na linearização

50
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de Hanes, a sua equação é uma reta cujo coeficiente angular é igual ao inverso da
velocidade, ao contrário das duas linearizações anteriores, esta linearização tem um
intervalo menor de distorção dos erros experimentais; a linearização de Eisenthal e
Cornish-Bowden, tem diversas vantagens , pois não tem que se transformar
matematicamente os resultados, estes podem ser tratados de forma assimétrica,
incluem erros de leitura e são mais sensíveis para detetar resultados aberrantes,
contudo também tem diversas desvantagens, tendo em conta que só permitirem
representar um pequeno número de resultados, não se detetam facilmente cinéticas
não hiperbólicas, não pode ser expandido facilmente para o estado de reações
multisubstrato ou de inibição e por vezes é difícil distinguir as interseções.
Uma vez que tanto estas linearizações, como os parâmetros cinéticos serão afetados
pela presença, ou ausência de fosfato inorgânico. Com base na tabela 36, observa-se
que na presença de inibidor, na linearização de Eisenthal e Cornish-Bowden não é
possível obter valores para os parâmetros cineticos, pois as equações não se intersetam
entre si não permitindo a determinação de Km e Vmáx. Sendo assim um método pouco
viável para a determinação dos parâmetros cinéticos (devido ás suas limitações), pode-
se dizer, que a partir dos resultados obtidos (tabela 36) a melhor linearização é a de
Hanes.
Em suma, conclui-se que se está na presença de uma inibição anticompetitiva.

51
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6.Webgrafia
[1] https://www.infoescola.com/bioquimica/enzimas/

[2] https://www.passeidireto.com/arquivo/3320656/enzimas-questoes-respondidas

[3] https://brasilescola.uol.com.br/quimica/catalise-enzimatica.htm

[4] https://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima

[5] https://www.infoescola.com/bioquimica/complexo-chave-e-fechadura/

[6] https://www.infoescola.com/bioquimica/fosfatase-alcalina/

[7]https://pt.wikibooks.org/wiki/Bioqu%C3%ADmica/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica

[8] http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422010000700033

[9] https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-
biology/lineweaver-burk-plot

[10] https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4610553/mod_resource/content/1/T2%20-
%20CIN%C3%89TICA%20ENZIM%C3%81TICA%202019.pdf

[11] https://www.passeidireto.com/arquivo/58836462/cinetica-enzimatica/3

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