Pirogênios – Conceito e Métodos de

detecção de Endotoxinas

Nicolas Souza do Nascimento

Guilherme Pereira dos Santos
 Breve histórico
◙ Gregos: acreditavam que a febre era um mecanismo mais terapêutico que
fisiopatológico.

◙ Início do séc. XIX

- Billbroth: primeiro a usar o termo “pirogênio” para descrever o princípio motor

da febre.
- Burdon-Sanderson: Febre com origem em um agente exógeno, como a bactéria,
ou de origem endógena, da célula do hospedeiro.

◙ Final do séc. XIX

- Centanni: primeiro a reconhecer a relação causa-efeito entre endotoxina e

febre.
- Gram desenvolveu o processo de coloração de bactérias. A partir daí, concluiu-
se que as endotoxinas estavam associadas às Gram (-).
◙ Passagem do séc. XIX para o séc. XX
- os métodos de eliminação de bactérias por esterilização térmica
ou filtração não eliminavam a pirogenicidade.
- teste em coelhos: classificava a bactéria em pirogênica e não
pirogênica e as correlacionava com o esquema Gram de
classificação bacteriana.
◙ 1952:
- Westphal e colaboradores – métodos de extração de lipopolissacarídeos
(LPS) purificados, livres de proteínas, de diferentes enterobactérias.
- Demonstrou-se ser o LPS o responsável pelas reações biológicas
induzidas pela endotoxina, pois causava febre mesmo em quantidades
reduzidas.
Conceito
● Pirogênios são substâncias que induzem febre, atuando na elevação
da temperatura corporal.
Classes de Pirogênios
● Existem basicamente duas classes de pirogênios, os chamados
pirogênios exógenos e os pirogênios endógenos.

● Pirogênios exógenos: lipopolissacarídeo (endotoxina), bactérias,

fungos, vírus, fármacos, esteróides, frações do plasma, bem como
componentes de bactérias Gram (-) e Gram (+).
● Pirogênios endógenos: são produzidos internamente pelo hospedeiro
em resposta ao estímulo de vários pirogênios exógenos.
Endotoxinas
● São complexos de alto peso molecular, associado à membrana
externa de bactérias gram-negativas.
● Constituem a mais significativa fonte de pirogênio para a indústria
farmacêutica.
● Endotoxinas purificadas recebem o nome de polissacarídeos.
Despirogenização

Atualmente, a melhor forma de eliminar as endotoxinas é a

despirogenização em forno, à temperatura de 250º C por minutos
ou 180º C por três horas (Sharma, 1986).
Ensaio de Pirogênio pelo método in
vivo – Teste em Coelhos

● O teste fundamenta-se na medida do aumento da

temperatura corporal em coelhos, após a injeção de
solução estéril em análise.
Considerações Gerais
● Observação da variação da temperatura dos coelhos e
modo do seu acondicionamento.
Material utilizado no teste

◙ As seringas, agulhas e vidrarias devem ser estéreis e

apirogênicas. Os diluentes e soluções extratoras ou de lavagem
devem, também ser estéreis e apirogênicos.
Procedimento
Interpretação
◙ O aumento da temperatura é verificado pela diferença entre a maior
temperatura do coelho apresentada no teste e a sua temperatura de controle.

◙ Se nenhum coelho apresentar um aumento individual de temperatura de 0,5 °C

ou mais, acima da respectiva temperatura de controle, o produto atende aos
requisitos para ausência de pirogênio.

◙ Se o aumento individual for 0,5 °C, o ensaio deve ser repetido em outros cinco
coelhos.

◙ Se no máximo três dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de

temperatura de 0,5 °C ou mais, e se a soma dos oito aumentos máximos individuais
não exceder 3,3 °C, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio.
Vantagens e Desvantagens
◙ Envolvimento de toda a reação
fisiológica do animal
◙ Segurança para os produtos
injetáveis, líquidos para infusão e
perfusão, materiais cirúrgicos e
descartáveis em geral
◙ tempo
◙ demanda muito trabalho para
manuseio e controle dos coelhos
◙ inadequado para determinar
pirogênios em medicamentos como
esteróides
◙ não pode quantificar o conteúdo
de endotoxinas
◙ falso negativo (plasma sanguíneo)
Origem do Método LAL (Lisado do Amebócito
Limulus) – Primeiras Descobertas

◙ 1885: Sangue do caranguejo Limulus polyphemus

apresentava formação de coágulo em gel quando associado a
doenças provocadas por bactérias marinhas (Gram negativas).

◙ Levin e Bang: lise (ruptura) dos amebócitos do caranguejo

acelerava a reação de formação de gel.

◙ LAL: Lisado dos Amebócitos do Limulus.

Método LAL in vitro para detecção
de endotoxinas

● O Teste do LAL é utilizado na determinação das endotoxinas

bacterianas em produtos injetáveis. O princípio do teste baseia-se
no processo de coagulação que ocorre com a hemolinfa do Limulus
polyphemus na presença de lipopolissacarídeos.
● Os responsáveis pela coagulação da hemolinfa dos caranguejos
Limulus polyphemus são os amebócitos, os principais componentes
da hemolinfa deste animal.
a) Limulus em praia da costa leste dos Estados Unidos, b) e c) lavagem dos animais, d)
preparação para a extração do sangue.
e) Limulus polyphemus, f) extração da hemolinfa, g) recolhimento da hemolinfa e h)
tratamento do extrato.
Um estudo feito em 1970
mostrou que o teste de LAL é
mais sensível do que os testes
realizados em coelhos, pois a
intensidade com que o gel é
formado é semelhante à
concentração das endotoxinas
(LEVIN; BANG, 1964).
Métodos de ensaio
◙ Gel-Clot (End-Point)
◙ Cromogênico (End-point)
◙ Cromogênico (Kinetic)
◙ Turbidimétrico (End-point)
◙ Turbidimétrico (Kinetic)
Procedimento (Gel-Clot)
O teste do gel clot é comercializado desde a década de 1970,
baseando-se na formação do gel. Volumes iguais do reagente e da
solução a ser analisada são transferidos a tubos de ensaio. Esta mistura
é incubada a 37°C durante 1 hora. O ponto final da reação é verificado
através da inversão dos tubos a 180°C, sendo que a presença do gel que
se mantém sólido durante a inversão é considerado positivo para a
presença de endotoxinas.
Vantagens
●
Baixo limite de detecção
●
Maior especificidade
●
Menor custo
●
Menor variabilidade dos resultados
●
Possibilidade de quantificar o conteúdo de
endotoxinas
Determinação Farmacopeica

◙ A Farmacopéia Brasileira, 6ª edição, descreve o método da

formação do gel, turbidimétrico ou colorimétrico do tipo cinético.
Sendo que o método de formação do gel deve ser validado de
acordo com a recomendação farmacopeica.
Referências Bibliográficas

DETERMINAÇÃO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (PIROGÊNIO) EM RADIOFÁRMACOS PELO MÉTODO DE

FORMAÇÃO DE GEL. VALIDAÇÃO. Disponível em: (Microsoft Word - Disserta\347\343o-NeuzaFukumori.doc)
(usp.br). Acesso em 21 de Janeiro de 2021.
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO PIROGÊNICA EM SOROS HIPERIMUNES E AMBIENTES SUJEITOS A
VIGILÂNCIA SANITÁRIA: COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS IN VITRO E IN VIVO APLICADOS AO CONTROLE DA
QUALIDADE. Disponível em: Tese_Cristiane_BIBLIOTECA. Acesso em 23 de Janeiro de 2021.
Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopéia Brasileira - 6° edição , v. 1.
Guimarães, Dayane Santos. Controle de Endotoxina na Indústria Farmacêutica – Análise dos Métodos in vivo e
in vitro. Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Brum, Ricardo Cristiano de Souza. Padronização e Validação da técnica do Limulus Amebocyte Lysate
(LAL) Semi-Quantitativa e Quantitativa para o Biofármaco Alfainterferona 2b Humana Recombinante.
Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2009.
WILLIAMS, K. L. Endotoxins. Pyrogens, LAL testing, and despyrogenation. New York: Marcel Dekker, c.2001.