CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIMETROCAMP WYDEN

Curso de Farmácia

ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

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Objetivo das aulas práticas

Cada aula prática só será iniciada após os alunos terem lido minuciosa e
cuidadosamente, o protocolo do assunto do dia. A seguir o professor ministrará uma
explanação teórica visando esclarecer ou explicar dúvidas ainda persistentes e acompanhará
todo o desenvolvimento da aula prática, auxiliado pelos monitores e técnicos de laboratório.
Ao final das experiências da aula prática, o professor verificará os resultados de cada
grupo. Para a maioria das operações de laboratório existem instruções específicas que cada
aluno deve obedecer para sua segurança e de seus colegas. Tais normas e procedimentos
serão detalhados posteriormente.

Dinâmica das aulas práticas no Laboratório de Bioquímica

- Será exigido dos alunos o uso de EPI completo;

- Deverá ser apresentado, ao final de cada aula prática, um relatório com descrição
dos experimentos e resultados obtidos.

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 NORMAS E CONDUTAS EM LABORATÓRIO

Objetivo:

Informar ao aluno a respeito dos riscos e cuidados que devem ser tomados em um laboratório
de Química Orgânica e mostrar a maioria das vidrarias e equipamentos que serão usados nas
aulas práticas.

Segurança no Laboratório

É o conjunto de medidas que são empregadas para prevenir acidentes, quer eliminando
condições inseguras do ambiente, quer instruindo ou convencendo pessoas na implantação
de práticas preventivas.

Risco

É o perigo a que determinado indivíduo está exposto ao entrar em contato com um agente
tóxico ou a certa situação perigosa.

Acidente
São todas as ocorrências não programadas, estranhas ao andamento normal do trabalho, das
quais poderão resultar danos físicos ou funcionais e danos materiais e econômicos à
instituição.

Prevenção De Acidentes

É o ato de se por em prática as regras e medidas de segurança, de maneira a se evitar a

ocorrência de acidentes.

Equipamentos De Segurança

São os instrumentos que têm por finalidade evitar ou amenizar riscos de acidentes. Os equipamentos de proteção
individual (EPI`s) mais usados para a prevenção da integridade física do indivíduo são: óculos, máscaras, luvas,
aventais, gorros, etc.

O QUE SEMPRE DEVEMOS SABER NUM LABORATÓRIO?

“A SEGURANÇA DEPENDE DE CADA UM”.

“É RESPONSABILIDADE DE CADA UM ZELAR PELA PRÓPRIA SEGURANÇA E DAS
PESSOAS COM QUEM TRABALHA”.

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NUNCA ESQUEÇAM:

 O aluno que faz brincadeiras no laboratório, não é um humorista. “ele é um elemento

perigoso”.
 É proibido fumar nos laboratórios, alto risco de acidentes.
 Verifique, ao encerrar suas atividades, se não foram esquecidos aparelhos ligados
(bombas, motores, mantas, chapas, gases, etc.) e reagentes ou resíduos em condições de
risco;
 É bom lembrar que o professor é sempre a pessoa melhor qualificada para orientar
quanto aos cuidados específicos a serem tomados em relação a cada experiência. Suas
instruções devem ser cuidadosamente seguidas e respeitadas.
 No laboratório de química orgânica é obrigatório o uso do jaleco e luvas

REGRAS BÁSICAS DE SEGURANÇA

 Saiba onde se encontra o material de emergência para primeiros socorros.

 Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer seu conteúdo pelo rótulo;
 Não pipete líquidos diretamente com a boca; use pipetadores adequados;
 Não tente identificar um produto químico pelo odor nem pelo sabor;
 Não execute reações desconhecidas em grande escala e sem proteção;
 Não adicione água aos ácidos, mas sim os ácidos à água;
 Não trabalhe de sandálias ou chinelos no laboratório;
 Não abandone seu experimento, sem identificá-lo e encarregar alguém qualificado pelo
seu acompanhamento;
 Mantenha os solventes inflamáveis em recipientes adequados e longe de fontes de
calor;
 Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores;
 Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las pela
primeira vez no laboratório;
 Se tiver cabelos longos, leve-os presos ao realizar qualquer experiência no laboratório;
 Não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios;
 Evite colocar na bancada de laboratório, bolsas, agasalhos ou qualquer material estranho ao trabalho;
 Comunique qualquer acidente, por menor que seja, ao responsável pelo laboratório;

 Se algum ácido ou produto químico for derramado, lave o local imediatamente

 Informe seus colegas sobre o andamento de qualquer experiência que possa oferecer perigo.
 Para sentir o odor de uma substância não coloque diretamente o nariz sobre o recipiente, mas com a
mão traga um pouco do vapor até ele.

Incêndios

 Além de materiais usualmente inflamáveis (madeira, cortiça, gás, o próprio vestuário, cabelos) todo
laboratório contém solventes altamente inflamáveis (éter, acetona, álcool, benzeno e outros).

Para Evitar Acidentes

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 Use a chama do bico de bunsen apenas quando necessário, apagando-a imediatamente depois de
terminada a operação.
 Nunca acenda um bico de bunsen perto de material inflamável.
 Não deixe chamas acesas ao sair do laboratório.

Em Caso de Incêndio

 Se for um acidente de pequenas proporções, abafe imediatamente com uma toalha.

 Feche os bicos de gás e desligue aparelhos elétricos das proximidades.
 Apague o fogo com extintor de incêndio.
 Coloque-se em segurança.
 Procure ler e entender os roteiros experimentais; consulte a literatura especializada. Em caso de dúvidas,
discuta o assunto com o professor antes de tentar fazer o experimento;
 Em caso de possuir alguma alergia, estar grávida ou em qualquer outra situação que
possa ser afetado quando exposto a determinados reagentes químicos, comunique o
professor logo no primeiro dia de aula;

SIMBOLOS DE PERÍGO E SEUS SIGNIFICADOS

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 MÉTODOS E VIDRARIAS EM LABORATÓRIO

Objetivo:

Apresentar ao aluno as vidrarias e equipamentos que serão usados nas aulas práticas.

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 ESPECTROFOTOMETRIA

MÉTODOS ESPECTROSCOPICOS E PREPARO DE SOLUÇÕES

INTRODUÇÃO:

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação

eletromagnética por muitas moléculas, quando os seus elétrons se movimentam entre níveis
energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de
onda entre o ultravioleta e o infravermelho

A = - log T = - log (I/I0) = log (I0/I) = abc

Resumidamente, esta técnica permite a análise quantitativa de compostos. (os aspectos

teóricos foram discutidos em aula teórica)

MATERIAIS E MÉTODOS

Espectrofotômetro
Pisseta de água destilada
Balões Volumétricos de 250mL (1) 50mL (5)
Bureta de 25mL
Béquer de 150mL
Béquer de 600mL para descarte
Papel Toalha
Cubetas para espectrofotômetro
Permanganato de Potássio (KMnO4) P.A cristais (MM: 158,034 g mol -1 ) / 1 L de solução de
Permanganato de concentração 5,0 x 10-4 mol/L (solução estoque)

Procedimentos:

a)Ligar o equipamento
b)Prepare 5 soluções diluídas a partir da solução estoque .
c)Calcule a massa pesada da solução estoque
d)Fixar o λ correto para o KMnO4 ( 524nm) calibre com água destilada e acerte o zero de
absorbância.
e)Faça a leitura das amostras das cinco diluições anotando os valores de absorbância.

Amostra 1 (10mL p/ 50 de água ) A:_____

Amostra 2 (12mL p/ 50 de água) A:_____
Amostra 3 (15mL p/ 50 de água) A:_____
Amostra 4 (18mL p/ 50 de água) A:_____
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Amostra 5 (20mL p/ 50 de água) A:_____

f)Anote os valores de absorbância encontrados na tabela do roteiro de aula.

g)Construa um gráfico em papel milimetrado (ou no Excel) uma curva de absorbância versus
mol/L (curva analítica)

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 TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE

AGENTES TÓXICOS – TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS

Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes

tóxicos têm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos
direcionar um pouco mais o trabalho analítico.
Para que seja possível a comparação de coloração, são utilizados nestes testes
controles positivo (adicionado de medicamentos) e negativo (isento de medicamentos),
podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita.

1. Salicilatos

A presença de salicilatos pode ser identificada pela adição de solução de cloreto

férrico a urina do paciente.
Os polifenóis, quando em presença do elemento ferro, podem ter os oxigênios de
suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento.
Esses produtos apresentam uma coloração que varia do azul ao violeta, por terem
maior número de ligas duplas conjugadas do que seu precursor.
Como o ácido acetilsalicílico não possui hidroxila fenólica disponível, somente o ácido
salicílico é capaz de formar complexos com sais de ferro.

Procedimento:

a) A 1 mL de urina adicionar 0,5 mL de cloreto férrico 1%. Esta reação não é específica; vale
como triagem para todos os compostos fenólicos. Para concentrações maiores do que 150
mg/mL (nas intoxicações agudas) a cor violeta é inconfundível.

b) Ferver cerca de 2 mL de urina em tudo de ensaio sem tampa, por aproximadamente 2 min.
Esfriar (temperatura ambiente) e adicionar cloreto férrico 10% gota a gota. Inicialmente forma-
se um precipitado esbranquiçado que após ficará púrpura (azul-violáceo). Derivados fenólicos
também dão essa reação. O aquecimento elimina corpos cetônicos que podem estar
interferindo na análise.

c) Em tubo de centrífuga, acidificar 5 mL de urina com cerca de 2 gotas de ácido sulfúrico 6N.
Adicionar 2,5 mL de éter etílico e agitar por 1 minuto por inversão. Centrifugar por 5 minutos a
2000 rpm. Transferir o éter decantado para outro tudo e agitar com 2,5 mL de água destilada
e uma gota de cloreto férrico 10%. A camada aquosa ficará violácea.

Reagentes:

Cloreto férrico 1%: pesar 1 g de cloreto férrico e elevar o volume para 100 mL com água
destilada em balão volumétrico.

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Cloreto férrico 10%: pesar 10 g de cloreto férrico e elevar o volume para 100 mL com
água destilada em balão volumétrico.

Ácido sulfúrico 6N: diluir 16,7 mL de ácido sulfúrico concentrado em água destilada e
levar para 100 mL em balão volumétrico.

2. Paracetamol

O paracetamol é em sua maior parte metabolizado por conjugação com ácido

glicurônico previamente a excreção urinária. A hidrólise do conjugado glicurônico se dá por
tratamento com ácido clorídrico concentrado, resultando em paminofenol. Este se conjuga
com solução de fenol e hidróxido de amônio, resultando numa tintura fortemente colorida,
assim dando um teste qualitativo sensível. Cor azul desenvolvida em 10 min. indica a
presença de fenacetina ou paracetamol.

Procedimento:

Em tubo de ensaio adicionar 1 mL de urina, 1 mL de HCl concentrado. Submeter ao

banho de água fervente por 20 minutos. Resfriar a temperatura ambiente (jamais resfriar na
torneira). Retirar 0,2 mL da urina hidrolisada e adicionar 5 mL de fenol 1% e 3 mL de NH4OH
4M.

Reagentes:

Solução aquosa de fenol 1%: colocar 1 g de fenol em balão volumétrico de 100 mL e

completar o volume com água destilada.

Solução de hidróxido de amônio 4M: colocar 10,4 mL de hidróxido de amônio em um balão

volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada.

3. Clorpromazina e outros fenotiazínicos

Fenotiazinícos são extensamente metabolizados. Clorpromazina, por exemplo, possui mais

de 50 metabólitos em humanos. O teste descrito abaixo é baseado na reação de muitos
destes compostos com íon férrico sob condições ácidas.

Prodecimento:

a) Com reagente FPN

A 1 mL de urina adicionar 1 mL do reagente FPN. Uma coloração rosa-vermelha indica a

presença de fenotiazínicos (a coloração depende da quantidade presente). Interferentes:
constituintes endógenos da urina, pigmentos biliares.

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A reação com FPN é rápida (5 segundos); se a coloração aparecer após alguns minutos
provavelmente é interferente; o ácido salicílico não sendo estável em meio fortemente ácido
não interfere nesta reação.

Obs.: quando colocar o reagente FPN colocá-lo gota a gota pelas paredes do tubo.
Não agitar o tubo. Resultados positivos devem ser confirmados por CCD.

b) Com cloreto de ouro

A 1 gota de urina adicionar 1 gota de cloreto de ouro. Uma coloração vermelha indica
clorpromazina e outros fenotiazínicos.
Reagentes:

FPN: misturar 5 mL de solução aquosa de cloreto Férrico 50 g/L, 45 mL de solução

aquosa de ácido Perclórico 20% (20 mL HClO4 em 100 mL H2O) e 50 mL de solução
aquosa de ácido Nítrico 50% (50 mL HNO3 em 100 mLde H2O).

Reagente Cloreto de ouro: misturar partes iguais de ácido tricloroacético 20% e

cloreto de ouro a 0,25%.

4. Antidepressivos tricíclicos (imipramina e derivados)

O antidepressivo tricíclico imipramina é usado extensamente, sendo metabolizada por

desmetilação para desipramina, a qual também é usada como antidepressivo. O teste
descrito abaixo, (Teste de Forrest), é baseado na reação destes compostos com solução de
dicromato de potássio acidificada.

Procedimento:

Em tubo de ensaio colocar 0,5 mL de amostra (urina ou conteúdo estomacal). Adicionar 1 mL

do Reagente de Forrest e misturar por 5 segundos. Observar, imediatamente, o surgimento
de coloração. Colorações que variam do amareloesverdeado até verde escuro ou azul
sugerem a presença dos antidepressivos tricíclicos (imipramina e desipramina).

Reagente de Forrest:

25 mL da solução aquosa de dicromato de potássio 0,2%;

25 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 30%;
25 mL de solução aquosa de ácido perclórico 20%;
25 mL de solução aquosa de ácido nítrico 50%.

Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma análise é 2 mL do reagente de Forrest –
0,5 mL de cada reagente). Solução estável se mantida em refrigeração a 4oC.

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K2Cr2O7 0,2 % (0,2 g K2Cr2O7 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)
H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)
HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL)
HNO3 50 % v/v (50 mL – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

6. Bibliografia:

COSTA, A. F. Farmacognosia. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 1972. v. III,

Cap. 10. p. 640.
DECKER, W.J. Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. Clin. Toxic., 4: 89-97,
1971.
MEREK, S. B.; PIVA, R.; ITINOSE, A. M. Padronização de spot testes para uso em
laboratórios com atendimento em emergência toxicológicas. Rev. Bras. An. Clin. 36:
143-144, 2004.

18
 Identificação de drogas - Testes coloridos

Reagentes químicos e modo de preparo.

REAGENTE MODO DE PREPARO

Dissolver 2,0g de tiocianato de Co II em 100ml de
A.1. Tiocianato de Cobalto (II)
água destilada.
Adicionar 1ml da solução de sulfato cúprico
pentahidratado 2% juntamente com o HCl 0,1N.
Em seguida, adicionar 1ml de tiocianato de cobalto
A.2. Basil Travnikoff
a 2%. Adicionar 2ml de clorofórmio. O teste será
positivo se a cor designada puder ser extraída na
fase clorofórmica.
Solução A: Adicionar 2,5ml de acetaldeído de 2,0g
de vanilina a 100ml de etanol a 95%.
Solução B: HCl concentrado.

Solução C: Clorofórmio.
A.3. Duquenois - Levine, modificado Procedimento: adicionar 1 volume da solução A à
droga e agitar durante 1 minuto. Depois de
adicionar a solução B, agitar suavemente e
determinar a cor obtida. Adicionar 3 volumes da
solução C e agitar. O teste é positivo se a cor
designada puder ser extraída na solução C.
Dissolver 1,0g de vanadato de amônio em 100mol
A.4. Mandelin
de ácido sulfúrico concentrado.
Adicionar cuidadosamente 100ml de ácido
A.5. Marques
sulfúrico concentrado a 5ml de formaldeído a 40%.
A.6. Ácido Nítrico concentrado
Adicionar 2,0g de p.DMAB a 50ml de etanol a 95%
A.7. Para-dimetilaminobenzaldeído
e 50ml de ácido clorídrico concentrado.
Dissolver 2,0g de cloreto férrico anidro ou 3,3g de
A.8. Cloreto Férrico hexahidratado de cloreto férrico em 100ml de água
destilada.
Dissolver 2,0g de ácido molibdênico ou molibdato
A.9. Froehde sódico em 100ml de ácido sulfúrico concentrado a
quente.
Dissolver 1,0g de ácido selênico em 100ml de
A.10. Mecke
ácido sulfúrico concentrado.
Solução A: Dissolver 0,5g de pentahidratado de
sulfato de cobre II em 100ml de água destilada.
Solução B: Adicionar 5ml de piridina a 95ml de
clorofórmio.
A.11. Zwikker
Procedimento: adicionar 1 volume de solução A à
droga; seguidamente, adicionar 1 volume da
solução B.

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Coloração final produzida por reagentes A.1 até A.11.

MATERIAL REAGENTE COLORAÇÃO FINAL

Cocaína A.1 Azul esverdeado intenso
Heroína A.1 Azul esverdeado intenso
Cocaína A.2 Marrom
Maconha A.3 Azul acinzentado
Cocaína A.4 Alaranjado intenso
Heroína A.4 Pardo-roxo médio
Morfina A.4 Verde escuro
Ópio A.4 Verde claro
Mescalina A.5 Alaranjado escuro
Morfina A.5 Vermelho muito escuro
Ópio A.5 Pardo-roxo escuro
Heroína A.6 Amarelo claro
Morfina A.6 Alaranjado brilhante
LSD A.7 Vermelho escuro
Morfina A.8 Alaranjado brilhante
Codeína A.9 Amarelo intenso
Mescalina A.9 Amarelo intenso
Codeína A.10 Azul esverdeado escuro
Heroína A.10 Verde azulado intenso
Pentabarbital A.11 Vermelho claro
Fenobarbital A.11 Vermelho claro

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 Identificação de cocaína - Testes coloridos

Amostra: pó (branco cristalino)

1 Reação de Marquis
1 mL de formaldeído a 40% em 20mL de H2SO4 conc.

Em uma lâmina escavada de porcelana, colocar uma pequena porção de pó e adicionar

gotas do reativo de Marguis
Levar ao aquecimento (positivo se o resultado for vermelho tijolo)

2- Teste de Scott

Reativos
Reativo I - tiocianato de cobalto: solubilizar 2,0 g de tiocianato de cobalto em 100 mL
de água.
Reativo II - HCl concentrado
Reativo III - Clorofórmio

 Colocar em um tubo de ensaio, pequena quantidade do pó e 1 mL de água destilada ou

deionizada. Adicionar 50 uL do Reativo I. Observar aparecimento de precipitado azulado.
 Adicionar 100 uL do Reativo II. Observar aparecimento de coloração rósea.
 Adicionar 1mL do Reativo III. Agitar e observar a formação de coloração azulada na fase
orgânica.

OBS.: o reativo I poderá ser preparado como se segue: Misturar partes iguais das soluções
de tiocianato de potássio a 1 M e de nitrato de cobalto a 0,1 M.

3 - Reação com hipoclorito de sódio

 em uma lâmina escavada de vidro, ou em placa de Petri, colocar uma pequena porção do
pó e adicionar gotas de hipoclorito de sódio.
 na presença de cocaína formar-se-á um precipitado branco flocoso (reação positiva).

21
Testes de identificação de lança perfume

22
 Determinação espectrofotométrica da creatinina urinária

1 - Referência

Análise realizada através do KIT da Labtest

2 - Método Analítico

 Diluição da amostra: pipetar 0,2 mL da amostra de urina, transferir para um balão

volumétrico de 5 mL e completar o volume com água deionizada (diluição 1:25). Agitar.
 Rotular 3 tubos de ensaio como Branco, Amostra diluída e Padrão e seguir a
sequência abaixo:

Branco Amostra diluída Padrão

Tampão (mL) 2,0 2,0 2,0

Água deionizada (mL) 0,25 - -
urina diluída (mL) - 0,25 -
solução padrão (mL) - - 0,25
ácido pícrico (mL) 0,5 0,5 0,5

 Agitar os tubos e deixá-los por 10 minutos a 37ºC (banho-maria).

 Ler as absorbâncias da amostra diluída e do padrão em 510 nm, zerando o aparelho
com o branco.
 Adicionar aos tubos com o branco e a amostra diluída 100 L de acidificante,
homogeinizar e deixar à temperatura ambiente por 5 minutos.
 Ler a absorbância da amostra diluída + acidificante em 510 nm, zerando o aparelho
com o branco + acidificante.
 Calcular a concentração de creatinina, expressa em mg/dL, utilizando a seguinte
fórmula:

sendo:

A1 = absorbância 1 da amostra diluída

A2= absorbância 2 da amostra diluída
25 = fator de diluição

23
 Determinação de Metemoglobina no sangue

1 – Referência

Grossman, S.J., Jollow, D.J. J. Pharmacol. Exp. Ther. 244, 118-125, 1988.

2 -Equipamentos e Reagentes

2.1 - Espectrofotômetro, região visível, monofeixe

2.2 - Agitador de tubos
2.3 - Solução de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 20%
2.4 - Solução de cianeto de potássio KCN a 10%
2.5 - Solução tampão fosfato 0,02 M - pH=7,8 com Triton X-100 a 0,05%

3 - Método Analítico

3.1 - Colher sangue heparinizado.

3.2 - Tomar 200 L da amostra de sangue heparinizado e o adicionar, em tubo grande, a 10
mL do tampão fosfato com triton X-100.
3.3 - Agitar por 30 segundos em agitador tipo mixer para ocorrer a hemólise do sangue.
3.4 - Dividir a solução hemolisada em quatro tubos numerados de 1 a 4.

3.5 - Adicionar aos tubos:

3.5.1 - Tubo 1 - somente sangue hemolisado, sem aditivo

3.5.2 - Tubo 2 - adicionar 50 L de KCN a 10%
3.5.3 - Tubo 3 - adicionar 50 L de [K3Fe(CN)6] a 20%.
3.5.4 - Tubo 4 - adicionar 50 L de [K3Fe(CN)6] a 20% e 50 L de KCN a 10%

3.6 - Realizar a leitura em espectrofotômetro ajustado no comprimento de onda de 635 nm.

3.7 - Calcular a concentração de metemoglobina pela fórmula a seguir:

4 - Interpretação

VR = até 2% (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

IBMP = 5% (quadro I, NR-7, 1994, MT/Br)

24
 Noções básicas sobre cromatografia

I – Cromatografia em fase gasosa (CG)

1 –Fundamentos e equipamento básico

A cromatografia em fase gasosa, também denominada cromatografia gasosa (CG) é

uma téccnica cromatográfica que possibilita a separação, identificação e quantificação de
substâncias volatilizáveis, gases e vapores. Basea-se, como todas as técnicas
cromatográficas, na diferente distribuição das substâncias entre uma fase estacionária e outra
móvel.
Na CG, a fase móvel é um gás e a fase fixa (estacionária) pode ser um líquido
(embebido em um sólido denominado suporte) ou um sólido. A fase estacionária está
acondicionada em um recipiente denominado coluna cromatográfica, que por sua vez está
conectada ao vaporizador ou injetor (no seu início) e ao detector (no seu final). O esquema de
um aparelho CG está na figura 1 (extraído de trabalho de Fábio Augusto-UNICAMP,
disponível no endereço http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/cagced_2/cagced_2.htm.)

1 - Cilindro do gás de arraste e

controlador da vazão
- Injetor ou vaporizador
3 - Forno com coluna cromatográfica
4 - Detector
5 – Registrador/Integrador 25
6-Cromatograma
 Todo o aparelho CG está estabilizado em temperaturas elevadas, possibilitando que
a amostra ao ser introduzida no aparelho se volatilize e possa ser arrastada pela fase móvel.
Assim, a amostra injetada através do vaporizador (injetor), é introduzida na coluna
contendo a fase fixa, por onde esta passando, continuamente a fase móvel. As substâncias,
de acordo com suas propriedades e as das fases estacionárias, serão eluidas em um tempo
maior ou menor através da coluna ou seja, ficarão retidas por tempos determinados (tempo
de retenção) e chegarão à saída da coluna em momentos diferentes. O uso de um detector
acoplado ao final da coluna origina um sinal eletrônico que é enviado ao registrador, gerando
o cromatograma (registro gráfico das substâncias).
As substâncias são representadas graficamente no cromatograma, na forma de picos
ou „linhas cromatográficas”. No registrador, existi papel cromatográfico que se movimenta em
velocidade estabelecida previamente. Sobre este papel existe uma pena; assim, quando o
sinal eletrônico gerado pela substância no detector é enviado para o registrador, ocorre um
impulso na pena que começa a subir. Como o papel está em movimento, quando o sinal
eletrônico decai e a pena volta para a linha de base, forma-se o pico cromatográfico. Caso a
volta da pena ocorra muito rapidamente, forma-se apenas a “linha cromatográfica” (muito
pouco frequente). A figura 2 esquematiza um cromatograma.

pico do subst. A
solvente
subst. B

subst. C

injeção

linha de base Figura 2 : Esquema de um cromatograma (ideal)

2 – Classificação da cromatografia gasosa

De acordo com a fase estacionária usada, a cromatografia gasosa pode ser

classificada em cromatografia gás-sólido ou gás-líquida.
 cromatografia gás-sólido: a fase estacionária é um sólido com grande área
superficial. A separação baseia-se em mecanismos de adsorção das substâncias
26
 neste sólido. A cromatografia gá-sólido é usada principalmente na análise de gases
e compostos apolares de baixa massa molecular.
 cromatografia gá-líquido: a fase estacionária é um líquido pouco volátil, cobrindo um
suporte sólido. A separação baseia-se em mecanismos de partição das substâncias
entre as fases líquida e gasosa. Devido ao grande número de fases estacionárias
líquidas disponíveis no mercado, a utilização deste tipo de cromatografia
corresponde a cerca de 95% do total de aplicações.

3 – Condições Cromatográficas

Uma vez que a separação e identificação das substâncias depende da afinidade delas
frente às fases fixa e móvel, é importante otimizar e padronizar as condições que podem
influenciar nesta afinidade, e, consequentemente, no resultado da análise. São as chamadas
condiçoes cromatográficas que podem, quando modificadas, alterar o tempo de retenção das
substâncias. As principais estão a seguir:
 Temperaturas de operações: são três estas temperaturas; a da coluna
denominada TC, a do injetor ou vaporizador denominada TV e a do detector ou
TD.
 Os fluxos dos gases: a fase móvel é sempre um gás inerte como nitrogênio
ultra-puro, hélio ou argônio. A alteração deste fluxo vai modificar o tempo de
retenção das substâncias.
 O tipo de fase estacionária utilizada: existem inúmeras colunas cromatográficas
com fases fixas, cuja polaridade varia entre baixa, média e elevada.
Para os cromatógrafos que não possuem o acessório denominado Integrador de
Áreas, a velocidade do papel cromatográfico é essencial, como será visto nos próximos itens.

4 – Tipos de Detectores

Os detectores podem ser seletivos ou universais. Os primeiros respondem apenas a

uma classe de substâncias e o segundo às substâncias em geral. Os seletivos apresentam
uma utilização mais restrita, mas são mais sensíveis que os universais.
Dentro do grupo dos detectores seletivos, destaca-se o Detector de Captura de
Elétrons (DCE) que identificam somente compostos que possuem moléculas/grupos
eletrofílicos (halogênios, por exemplo). Neste detector é gerada uma corrente de eletrons por
uma fonte radioativa (chamada corrente de fundo). Esta corrente será diminuída pela captura
dos elétrons quando as substâncias eletron-afins, injetadas no CG, alcançam o detector.
Dentre os detectores universais destacam-se o de Condutividade Térmica (DCT) e o
Detector de Ionização de Chama (DIC). O mais usado, por ser universal e ter sensibilidade
elevada, é o DIC. Este detector é capaz de identificar todo o composto que, ao ser queimado,
produza uma corrente de ions elevada. Esta ionização determina uma queda de voltagem no
interior do DIC que representa o sinal eletrônico enviado ao registrador. É importante salientar
que, ao se trabalhar com o DIC é necessário utilizar os chamados gases auxiliares, ou seja,

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os gases capazes de manter a chama do DIC acesa; correspondem, geralmente, ao
hidrogênio e oxigênio.

5 – Análise Qualitativa

A identificação de uma substância é feita, geralmente, comparando-se o Tempo de

Retenção (Tr) de um padrão com o da substâncias (amostra). Se o Tr do padrão é o mesmo
do composto presente na amostra pode-se concluir tratar-se de uma mesma substância. Isto
não é conclusivo porque duas substâncias diferentes podem ter o mesmo Tr em
determinadas condições cromatográficas.
O Tr pode ser calculado automatica ou manualmente. No primeiro caso é necessário
existir, acoplado ao CG, uma espécie de computador denominado Integrador de Áreas, que
realiza todos os cálculos quali e quantitativos da análise. O método manual utiliza a fórmula:
onde: Tr = tempo de retenção
dr = distância de retenção (distância medida no cromatograma,
do Tr = dr
vp ápice do pico ao ponto de injeção)
vp = velocidade do papel do registrador/integrador

6 – Análise Quantitativa
A quantificação analítica é feita através da comparação da área ou altura dos picos do
padrão e amostra. Quando existe o integrador de áreas há a quantificação automática, caso
contrário é necessário a quantificação manual. Esta é feita através da altura ou área dos
picos.
 Altura do pico: não pode ser utilizada para quantificar picos assimétricos ou de base
larga. É a técnica de escolha quando se trabalha com “linhas cromatográficas”. As
alturas dos picos são medidas traçando-se uma perpendicular à linha de base
passando pela inflexão máxima dos picos.
 Área do pico: é a técnica manual mais utilizada, uma vez que a grande
maioria dos picos cromatográficos são assimétricos. Utiliza-se, geralmente
para tal quantificação, a chamada Triangulação dos picos. Traça-se as
tangentes dos dois lados do pico e a intercção destas com a linha de base.
Forma-se um triangulo cuja área é calculada pela fórmula:

A = a x wb sendo A = área do pico; a = altura do pico;

2 wb=largura do pico na linha de base

Quando o pico não é assimétrico ou está muito distante da linha de base, aconselha-se
encontrar a largura do pico na base do próprio pico e não na linha de base.
As áreas dos picos das soluções-padrão versus as concentrações correspondentes
são lançadas em um gráfico, construindo-se a curva de calibração através da qual se
quantificará a amostra.

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7 – Uso do Padrão Interno (PI)

O uso do Padrão Interno (substância quimicamente semelhante ao composto de

interesse), permite a realização de um controle de qualidade interno da análise e mais,
possibilita minimizar os erros decorrentes de alterações nas condições cromatográficas.
Muitas vezes, após a injeção e cálculo do Tr da solução padrão, ocorrem modificações nas
condições cromatográficas estabelecidas previamente. Isto faz com que o Tr calculado para a
amostra seja muito diferente daquele encontrado para o padrão, impossibilitando a
identificação da substância de interesse.
Com o uso da padrão interno, ao invés de se identificar a substância pelo Tr, identifica-
se pelo cálculo do Trr ou seja, Tempo de Retenção Relativo da substância em relação ao
padrão interno. O Trr é calculado dividindo-se o Tr da substância (e/ou do padrão) pelo Tr do
padrão interno.

II –Cromatografia Líquida de alta eficiência

Apresenta quase todos os mesmos fundamentos do CG. Agumas diferenças são

 As fases móveis são líquidos altamente puros sem oxigênio e outors gases mistyrados
(devem ser filtradas e degaseificadas).
 As fases móveis são impulsionadas e desenvolvidas ao longo das colunas, com o auxílio
de uma bomba de alta pressão que deve proporcionar uma vazão contínua e sem
pulsação ou seja, em um fluxo contínuo
 As colunas são geralmente de aço inxidável, com 10 a 30 cm de cumprimento e 0,4 a 2,2
cm de diâmetro interno, e preenchidas com diferentes fases estacionárias. Essas fases
são geralmente ligadas quimicamente e, dependendo das modificações nelas realizadas,
poderão atuar no modo normal (polaridade da fase fixa é maior do que a fase móbel),
reverso (polaridade da faze estacionária é MENOR do que a da fase móvel) ou em ambos.
 As determinações analíticas, em CLAE são, via de regra realizadas em colunas de fase
reversa (as mais comuns são as C18-octadecilsílica) que operam com fases móveis
aquosas..
 As injeções das amostras e padrões são feitas em um injetor que possui uma alça (loop)
com duas posições: uma que prende a amostra injetada dentro dela (ou seja, a amostra
preenche o loop) e a outra que libera as amostras para dentro da coluna. Existem alças de
diferentes volumes.
Um esquema de um cromatógrafo líquido é apresentado a seguir:

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