Estudo Dirigido 3 - Disciplina: Engenharia Enzimática 

 
 
 
 
Atividade 1 
Qual  a  utilidade  do  chamado  gráfico  dos  duplos  recíprocos  ou  gráfico  de  Lineweaver-Burk? 
Demonstre  matematicamente  como  é  possível  obter  este  gráfico  a  partir  da  equação  de 
Michaelis-Menten. 
 
 
Resposta 1 
Com  base  nos  dados  do  gráfico  de  Lineweaver-Burk  é  possível determinar parâmetros como 
a  constante  de  Michaelis  e  a  velocidade  máxima  de  determinada  enzima  em  uma  reação, 
porém  a  determinação  daqueles  não  é  a  principal  utilidade  do  gráfico  e  sim a facilidade para 
se encontrar os mesmos. 
Em  uma  situação  normal  onde  você  se  encontra  com  uma  tabela  aos quais os elementos são; 
concentração  de  substrato  e  velocidade  da  enzima,  descobrir  os  valores  de  Km e Vmax seria 
mais  difícil  do  que  pelo  gráfico de Lineweaver-Burk. Isso ocorre pelo fato de que a plotagem 
de  um  gráfico  V  por  [S],  velocidade  por  concentração  de  substrato,  resulta  em  um  gráfico 
hiperbólico  de  difícil  compreensão  e  obtenção  de  dados,  visto  isso,  o  gráfico  de 
Lineweaver-Burk foi criado para facilitar a obtenção de tais dados.   
O  gráfico  de  Lineweaver-Burk funciona de maneira onde os dados “V” e “[S]” são invertidos 
de  forma  que  agora  a  plotagem  do  gráfico  resulta  em  uma  reta  onde  por meio do coeficiente 
angular  é  possível  encontrar  o  valor  de  “Km”  e  por  meio  do  coeficiente  linear  é  possível 
encontrar o valor de “Vmax”. 
Demonstração  do  gráfico  de  Lineweaver-Burk  a  partir  da  equação  de  Michaelis-Menten,  na 
demonstração  a  seguir  o  termo  “[S]”  representa  a  concentração de substrato, o elemento “V” 
representa  a  velocidade,  o  dado  “Vmax”  representa  a  velocidade  máxima  e  por  fim  o 
elemento “Km” representa a constante de Michaelis.  
O  primeiro  passo  é  inverter  a  equação  de  Michaelis-Menten,  feito  isso  o  segundo  passo  é 
separar  a  equação.  Com  a  equação  já  separada,  o  terceiro  passo é eliminar a concentração de 
substrato  da  segunda  parte  da  equação  de  forma  que  o  dado  se  apresente  da  forma  1/Vmax, 
seguindo todos os passos a equação de Lineweaver-Burk estará pronta. 
Com  a  equação  pronta,  é  possível  construir  o  gráfico  de  Lineweaver-Burk onde Km/Vmax é 
o  coeficiente  angular  da  equação  e  1/Vmax  o coeficiente linear. Com os dados de uma tabela 
1/V  por  1/[S]  é  possível  utilizar  o  programa  excel  para  plotar  um  gráfico,  criar uma linha de 
tendência  e  descobrir  a  equação  da  reta,  com  esta  é  possível  encontrar o valor do coeficiente 
angular  e  linear  da  equação,  substituir  pelos  seus  valores  na  equação  de  Lineweaver-Burk  e 
descobrir o valor de Km e Vmax desejado.  
​Imagem 1 - Demonstração da do gráfico de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten  

 
Imagem 2 - Demonstração da do gráfico de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten   

 
 
 
  
 
 
 
 
 
 
Imagem 3 - Demonstração da do gráfico de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten 

 
 
Atividade 2 
A  partir  da  construção  dos  gráficos de Lineweaver-Burk com o programa Excel determine os 
valores de Km e Vmáx para as enzimas A e B cujos dados de atividade estão disponibilizados 
nas  tabelas  abaixo.  Discuta  com  base  nos  resultados  as  características  cinéticas  das  duas 
enzimas,  considerando  que o mesmo substrato foi utilizado em ambos os ensaios de atividade 
enzimática realizados.  
Resposta 2 
 
Tabela 1 - Enzima A 

 
Por  meio  da  tabela  1  é possível identificar os valores de Km e Vmax mediante a plotagem do 
gráfico  V/[S],  porém  o  cálculo  daqueles  seriam  complicados,  visto  isso,  visando  simplificar 
os cálculos para obtenção de Km e Vmax, o gráfico de Lineweaver-Burk deve ser construído. 
Para  construção  do  gráfico  primeiramente  a  tabela  1  deve  ser  transformada  em  sua  forma 
inversa, isto é, 1/V e 1/[S]. 
 
Tabela 2 - Inverso da tabela 1 

  
Plotando  os  dados  da  tabela  2  em  um  gráfico  de  dispersão  utilizando  o  programa  excel  é 
possível construir o gráfico de Lineweaver-Burk. 
 
Gráfico 1 - Gráfico de Lineweaver-Burk para enzima A 

 
Para  obtenção  da  equação  da  reta  primeiramente  deve  ser  criado  a  linha  de  tendência  que 
uniara  todos  os  pontos  do  gráfico,  posteriormente com a equação da reta é possível encontrar 
o valor de Km e Vmax.  
 
Tabela 3 - Valores de Km e Vmax 

 
 
Substituindo  os  valores  do  coeficiente  angular,  Km/Vmax,  e  linear,  1/Vmax,  com  os  seus 
correspondentes  encontrados  na  equação  da  reta,  é  possível  encontrar  os  valores  de  Km  e 
Vmax.  
Os mesmos métodos aplicados para a enzima 1 devem ser aplicados a enzima 2.  
Tabela 4 - Enzima B 

Tabela 5 - Inverso da tabela 4 

Gráfico 2 - Gráfico de Lineweaver-Burk para enzima B 

 Tabela 6 - Valores de Km e Vmax 

Imagem 4 - Comparação dos resultados para enzima 1 e 2 

 
Para  os  valores  encontrados  para  cada  uma  das  enzimas,  utilizando  o  mesmo  substrato, 
podemos  inferir  que  os  diferentes valores são causados pela diferença de afinidade da enzima 
pelo  substrato.  Isso  ocorre  pelo  fato  de  que  baixos  valores  de  Km  caracterizam  uma  alta 
afinidade  da  enzima  pelo  substrato,  em  contrapartida  um  alto  valor  de  Km  evidencia  uma 
baixa afinidade da enzima pelo substrato. 
Quando  o  Km  de  uma  reação  é  alto,  a  mesma  necessitará  de  uma  grande  quantidade  de 
substrato  para  alcançar  metade  de sua velocidade máxima para reação, observando os valores 
podemos  deduzir  que  na  reação  da  enzima  1,  há  uma  alto  valor  de  Km,  consequentemente 
teremos um alto valor para Vmax.  
Com  base  nos  dados  apresentados,  podemos  concluir  que  devido  o  menor  valor  de  Km  da 
enzima  2  em  relação  a  enzima  1,  aquela  deverá  possuir  uma  maior  afinidade  pelo  substrato 
comparando com a enzima 1.  
 
Atividade 3 
Explique  cada  um  dos  mecanismos  de  inibição  reversíveis  das  enzimas  e  o  gráfico  de 
Lineweaver-Burk correspondente a cada um destes mecanismos de inibição enzimática.  
 
Resposta 3 
Na  inibição  competitiva,  a  enzima  pode  se  ligar  tanto  com  inibidor  quanto  com  substrato, 
mas  não  a  um  complexo  formado  pelos  três.  Esse  tipo de inibidor se assemelha ao sítio ativo 
do  substrato  e  se  liga  a  enzima  impedindo  dessa  forma  a  ligação  da enzima com o substrato, 
seu  mecanismo  de  ação  funciona  diminuindo  a  velocidade  de  catálise ao reduzir a proporção 
de moléculas de enzimas ligadas a seu determinado substrato.  
A  inibição  competitiva  pode  ser combatida pelo aumento da concentração do substrato, dessa 
forma  ocorre  novamente  a  competição entre substrato e inibidor para ligação ao sítio ativo da 
enzima,  um  parâmetro  importante  é  que  independentemente  da  ligação  do  inibidor  com  a 
enzima,  haverá  sempre  a  formação  de  produtos,  porém  esse  processo  ocorrerá  com  uma 
velocidade muito menor que a normal.  
 
Imagem 5 -Gráfico Cinético para inibidores reversíveis competitivos 

Fonte:​(BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012) 

 
Imagem 6 -Gráfico Lineweaver-Burk para inibidores reversíveis competitivos

Fonte:​(BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012)

Observando  o  gráfico,  podemos  deduzir  que  com  o  aumento  da concentração dos inibidores, 

ocorrerá  uma  diminuição  na  velocidade  da  reação  pois  haverá  uma  menor  quantidade  de 
sítios ativos para ligação com substrato.  
Em  uma  situação  onde  ocorra  o  aumento  da  concentração  de  substrato,  é  possível  observar 
que  a  velocidade  relativa  da  reação  retorne  a  valores  próximos  ao  normal,  dessa  forma  é 
possível  que  ocorra  a  inviabilização  da  interação  do  inibidor  com  o  sítio  ativo  da  enzima, 
revertendo assim o quadro de inibição. 
Outro  fator  importante  é  a  mudança  do  valor  aparente  de  Km,  ou  seja,  será  necessário  uma 
maior quantidade de substrato para obter a mesma velocidade da reação.  
 
Em uma inibição incompetitiva o inibidor se liga ao complexo enzima-substrato de forma que 
a enzima seja desativada, ou seja, não haverá formação de produto na reação de catálise. 
 Imagem 7 -Gráfico Cinético para inibição reversível incompetitiva 

  
Fonte:​(BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012)

Imagem 8 -Gráfico Lineweaver-Burk para inibição reversível incompetitiva 

“Um inibidor incompetitivo não afeta a inclinação do gráfico de dupla recíproca. A Vmáx. e o KM
são reduzidos em quantidades equivalentes”. Fonte:​(BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012)
 
Observando  o  gráfico  é  possível  observar  a  diminuição  do  valor  aparente  de  Km  e 
consequente  diminuição  no  valor  da  Vmax,  isso  ocorre  pelo  fato de que o inibidor forma um 
complexo  com  a  enzima  e  o  substrato  causando  assim  depleção  ao  complexo  ES,  visto  isso, 
para  manter  o  equilíbrio  entre  a  concentração  de  enzima  com  o  complexo  ES,  uma  maior 
quantidade  de  substrato  deve  se  ligar  a  enzima.  Consequentemente  uma menor concentração 
de  substrato  será  necessária  para  formar  metade  da  concentração  máxima  de  ES  e  assim  o 
valor  de  Km  é  reduzido.  Nesse  cenário  o  Vmax  não  pode  ser  alcançada  mesmo  com  altas 
concentrações  de  substrato,  além  disso  quanto  maior  a  concentração  de  inibidor,  menor  o 
valor de Km.  
 
Por  fim  em uma inibição não competitiva, o inibidor pode se ligar tanto na enzima, quanto no 
complexo  enzima-substrato.  Para  ligação  no  complexo,  o  inibidor  deve  se  ligar  a  outro  sítio 
na  enzima  de  forma  que  o  substrato também se ligue a um sítio ativo. Neste caso o complexo 
enzima-inibidor-substrato não prossegue para formar qualquer tipo de produto.   
 
Imagem 9 -Gráfico cinético para inibição reversível não competitiva 

 
Fonte:​(BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012)

 
Imagem 10 -Gráfico Lineweaver-Burk para inibição reversível não competitiva

Fonte:​(BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2012)

No  gráfico  para  inibidores  não  competitivos,  quanto  maior a quantidade de inibidor, menor a 

velocidade  máxima  da  reação,  nesse caso não há mudança no Km pois o substrato continuará 
se ligando a enzima normalmente.  
Seu  mecanismo  de  ação atua diminuindo a concentração de enzima funcional, isto é, ao invés 
de  reduzir  a  proporção  de  moléculas  de  enzimas  que  estão  ligadas  ao  substrato,  ocorre 
diminuição  na  concentração  funcional  da  enzima.  Essa  diminuição  provoca  diminuição  no 
valor de Vmax enquanto para Km, o mesmo permanece inalterado.   
  

Atividade 4 
O  que  caracteriza  o  mecanismo  de  inibição  irreversível  de  uma  enzima?  O  que  são 
inativadores  "suicidas"? Explique o mecanismo de ação de um inativador "suicida" utilizando 
um exemplo de sua escolha. 
 
Resposta 4  
A  classe  de  inibidores  irreversíveis  é  dividida  em  três  classes,  reagentes  específicos  de 
grupos,  análogos  de  substratos  reativos  e  inibidores  suicidas.  Esses inibidores reagem com a 
enzima  independentemente de sua concentração de forma que ocorra a desativação da enzima 
por  meio  de  uma  ligação  covalente  que  levará um longo tempo para se soltar da mesma, essa 
interação  é  responsável  por  destruir  os  grupos  funcionais  da  enzima  inibindo  assim  a  sua 
capacidade de reação da mesma.  
Reagentes  específicos  de  grupos  reagem  com os grupos laterais específicos dos aminoácidos, 
já  os  ​análogos  de  substratos  reativos  se  ligam de maneira covalente a resíduos do sítio ativo, 
esse  tipo  de  ligação  é  mais  específico  para  o  sítio  ativo  quando  comparados  aos  reagentes 
específicos de grupos.  
Inibidores  suicidas  são  “substratos  modificados  que  fornecem  o  meio  mais  específico  de 
modificar  o  sítio  ativo  de  uma  enzima”.  O  modo  de  ação  desse  inibidor  adota  uma 
conformação  de  substrato  que  inicialmente  sofre  o  processo  de  catálise  normal. 
Posteriormente  ocorre  a  formação  de  um  intermediário  reativo  pela  própria  enzima  que 
inativa a mesma de modo covalente.  
Como  exemplo  podemos  citar  o  inibidor  N,N-dimetilpropargilamina  que  inibe  a  enzima 
monoamina  oxidase,  por  meio  de  uma  ligação  entre  um  grupo  prostético,  flavina,  da enzima 
com  o  inibidor.  Essa  enzima  é  responsável  pela  desaminação  de  neurotransmissores, 
reduzindo  assim  o  seu  nível  no  cérebro,  ou  seja,  utilizando  esses  inibidores  suicidas,  a  ação 
dessa  enzima  é  afetada  de  forma  a  preservar  a  quantidade  de  neurotransmissores  como 
dopamina e serotonina.  
Doenças  que  são  causadas pela baixa concentração desses neurotransmissores como a doença 
de  Parkinson  e  a  depressão,  requerem  a  utilização  de  inibidores  suicidas como a (-)deprenila 
que são inibidores utilizados no tratamento das mesmas.