POLITÉCNICO

DO PORTO
ESCOLA
SUPERIOR
DE SAUDE

MÉTODOS DE ANÁLISE EM
BIOQUÍMICA E BIOLOGIA CELULAR
01 Rúben Fernandes
Prof. Adjunto
Agregado em Biomedicina
Estrutura da aula

I. Cálculo em Bioquímica
II. Noção de biomarcador
III. Doseamento de biomarcadores
IV. Análise de DNA
V. Análise de Proteínas

2
POLITÉCNICO DO PORTO
ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE
POLITÉCNICO
DO PORTO
ESCOLA
SUPERIOR
DE SAUDE

PARTE I

CÁLCULO EM BIOQUIMICA

3
Preparação de soluções
A maior para dos reagentes num laboratório de bioquímica ou biologia
laboratorial encontram-se maioritariamente nos estados sólido ou líquido.
Operações

Transferência de volumes
Transferência de massa

4
Preparação de soluções
1 – Quantas moléculas existe na solução? número de Avogrado

É o número de partículas (átomos) que existe numa unidade

conhecida como mole
6.022 x 1023

5
Preparação de soluções
1 – Quantas moléculas existe na solução? número de Avogrado

É o número de partículas (átomos) que existe numa unidade

conhecida como mole
6.022 x 1023

6
Preparação de soluções
2 – Quanto pesam as moléculas?

Massa molar

A massa molar (MW, MM ou M) é a massa (peso) de uma mole

de átomos ou moléculas
CH3COOH

7
Preparação de soluções
2 – Quanto pesam as moléculas?

Massa molar

A massa molar (MW, MM ou M) é a massa (peso) de uma mole

de átomos ou moléculas
CH3COOH SOMA DAS MASSAS ATÓMICAS DOS SEUS ÁTOMOS

𝑚 𝑚 (𝑔)
𝑀 = ; 𝑀(𝑔/𝑚𝑜𝑙) =
𝑛 𝑛 (𝑚𝑜𝑙) 8
Preparação de soluções
3 – Quanto ocupam as moléculas?

Volume

Quando as moléculas estão em solução a solução ocupa um

determinado volume de acordo com a sua concentração.
Concentração
𝑛 /
𝑛 𝑚𝑜𝑙 𝒎𝒐𝒍é𝒖𝒍𝒂
𝐶 = ; 𝐶(𝑚𝑜𝑙/𝑑𝑚 ) =
𝑉 𝑉 𝑑𝑚/ 𝒔𝒐𝒍𝒖çã𝒐

9
Preparação de soluções
3 – Quanto ocupam as moléculas?

Volume

Quando as moléculas estão em solução a solução ocupa um

determinado volume de acordo com a sua concentração.
Concentração

10
Preparação de soluções
3 – Quanto ocupam as moléculas?

Volume

As moléculas podem ser ainda ser caracterizadas

pelo quociente entre a massa e o volume dessa
solução.

Massa volúmica
𝑚 /
𝑚 𝑘𝑔 𝒎𝒐𝒍é𝒖𝒍𝒂
𝜌 = ; 𝜌 (𝑘𝑔/𝑚 ) =
𝑉 𝑉 𝑚/ 𝒔𝒐𝒍𝒖çã𝒐

11
Preparação de soluções
4 – Como se prepara uma solução? Ex.: 500 mL de 1 mol/dm3 de
hidrogenofosfato de sódio

Na2HPO4
H2 O

12
Preparação de soluções
4 – Como se prepara uma solução? Ex.: 500 mL de 1 mol/dm3 de
hidrogenofosfato de sódio

Na2HPO4

13
Preparação de soluções
4 – Como se prepara uma solução?

Preparar uma solução a partir de um stock.

14
Preparação de soluções
4 – Como se prepara uma solução?

Preparar uma solução a partir de um stock.

15
POLITÉCNICO DO PORTO
ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE
POLITÉCNICO
DO PORTO
ESCOLA
SUPERIOR
DE SAUDE

PARTE II

NOÇÃO DE BIOMARCADOR

16
Conceito de biomarcador

Em 1998, o grupo de trabalho de definição de biomarcaores do National

Institutes of Health (NIH) definiu biomarcador como:

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3078627/

17
Biomarcadores

Provavelmente os mais relevantes em investigação médica são os

que podem ser obtidos com relativa facilidade a partir de e que estão ao
dispor dos investigadores.” (Roche)

18
Biomarcador

Linfa Sangue

19
Conceito de intervalo de referência

§ Qualquer resultado de concentração de uma deve

ser comparado com algo para que adquira significado

§ Desvio a valores “normais” de uma população de referência (indivíduos

aparentemente saudáveis) pode não representar um estado de
anormalidade ou doença.

20
Conceito de intervalo de referência

Muitas têm uma distribuição gaussiana

21
 Estabelecimento de um intervalo de referência

§ Se o analito têm possui uma

distribuição gaussiana na
população, o intervalo de
referência inclui os valores
para 95% da população

22
 Biomarcador ideal

Biomarcador discrimina na população Biomarcador não discrimina completamente

indivíduos saudáveis e doentes indivíduos saudáveis e doentes

Saudáveis Saudáveis

Frequência %
Frequência %

Doentes
Doentes

Concentração Concentração

23
24
25
POLITÉCNICO DO PORTO
ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE
POLITÉCNICO
DO PORTO
ESCOLA
SUPERIOR
DE SAUDE

PARTE III

DOSEAMENTO DE BIOMARCADORES

26
Como medir (dosear/quantificar) biomarcadores?
Espectrofotometria Princípio do método

► Lei de Lambert-Beer

Abs = ε l C

27
Como medir (dosear/quantificar) biomarcadores?
Espectrofotometria

28
POLITÉCNICO DO PORTO
ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE
POLITÉCNICO
DO PORTO
ESCOLA
SUPERIOR
DE SAUDE

PARTE IV

BIOMARCADORES GENÉTICOS

29
Biomarcadores Genéticos

Aplicações genómicas:

► Alterações cromossómicas
Alteração ao número de cromossomas
Rearranjos das regiões cromossómicas
Perda ou aumento de regiões cromossómicas

► Alterações moleculares
Alterações da estrutura / sequência do gene (mutação)
Presença de “novos genes” (infeção, cancro)
Alteração ao número de cópias do RNA (expressão)

30
Biomarcadores Genéticos

Técnica de PCR ou reação em cadeia da polimerase

► Permite avaliar a presença de um determinado segmento genético / gene

variante: qPCR

Técnica de Sequenciação
► Permite determinar a sequência de um segmento genético / gene

31
PCR

32
Eletroforese para a deteção de produtos de PCR

33
POLITÉCNICO DO PORTO
ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE
POLITÉCNICO
DO PORTO
ESCOLA
SUPERIOR
DE SAUDE

PARTE V

DETEÇÃO DE PROTEÍNAS

34
Marcadores Bioquímicos

Aplicações:

► Hormonas
► Factores de coagulação
► Vias de sinalização
► Globulinas e imunoglobulinas
► Enzimas
Alterações na quantidade (lesão de um órgão, aumento da produção)
Alterações na actividade (alterações genéticas ou bioquímicas)

35
Marcadores Bioquímicos

Técnicas imunológicas para a deteção de marcadores bioquímicos

► Baseiam-se na especificidade antigénio / anticorpo

► Um dos anticorpos liga-se a uma enzima para deteção da reação
► Exemplo: método de ELISA :

36
Dúvidas ?

Quarta-feira das 10h às 13h (sob marcação prévia)

Recursos web: www.rubenfernandes.pt
E-mail: ruben@rubenfernandes.pt

37