Universidade Estadual de Campinas

Instituto de Biologia
Departamento de Biologia Estrutural e Funcional

Relatório final de Iniciação Científica

Análise de micro RNAs no hipotálamo de camundongos C57BL/6 treinados

alimentados com dieta hiperlipídica

Aluna: Jéssica de Assis Sofiatti

Orientadora: Profa. Dra. Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio

2017
Resumo

O controle do balanço energético ocorre no sistema nervoso central (SNC), através de

conexões neuroendócrinas, sendo a leptina e a insulina sinalizadores importantes em
neurônios especializados no hipotálamo. Estes hormônios ativam principalmente as vias
JAK-STAT e IRS-AKT para sinalizar atividades neuronais. Processos inflamatórios
prejudicam a sinalização destas vias e indivíduos resistentes à leptina e à insulina, e a
reversão desta resistência representa uma melhor ação destes hormônios. Uma resposta á
inflamação hipotalâmica que contribui para a resistência à leptina e à insulina é mediada
pelas proteínas SOCS3 e PTP1B, que são inibidores da sinalização desses hormônios. Os
miRs controlam a expressão e atividade dos diversos componentes envolvidos na
sensibilidade hipotalâmica e é provável que os mesmos desempenhem papel regulador sobre
proteínas participantes de vias importantes na sensibilidade hormonal do hipotálamo. Menor
quantidade de leptina circulante associada à maior sensibilidade à leptina é observada em
modelos de animais treinados, assim como atenuação dos efeitos anti-inflamatórios
decorrentes da obesidade. Considerando que os miRs representam uma nova perspectiva na
terapêutica para controlar distúrbios metabólicos, é importante elucidar os mecanismos de
ação dos MiRs, bem como seus possíveis alvos hipotalâmicos em resposta ao exercício em
um modelo de obesidade. Assim, este projeto tem como objetivo estudar o efeito da HFD e
do exercício físico sobre avia da leptina através da fosforilação de JAK2 e STAT3 no
hipotálamo, a expressão gênica e proteica da SOCS3 e da PTP1B hipotalâmicas, a expressão
de miR9, Let7c, miR7a emiR200a no hipotálamo, bem como correlacionar a expressão dos
miRs avaliados à melhorada sensibilidade hipotalâmica e fosforilação da JAK2 e da STAT3
em nossos modelos animais.
Abstract

The control of energy balance occurs in the central nervous system (CNS) through
neuroendocrine connections, where leptin and insulin are important signaling hormones in
specialized neurons in the hypothalamus. These hormones primarily activate the JAK-STAT
and IRS-AKT signaling pathways for neuronal activities. Inflammatory processes impair
these signaling pathways in individuals resistant to leptin and insulin, and reversal of the
resistance implies in a better action of these hormones. A response to hypothalamic
inflammation that contributes to the resistance to leptin and insulin are mediated by PTP1B
and SOCS3 proteins which are inhibitors of signaling of these hormones. The miRs control
the expression and activity of the various components involved in hypothalamic sensitivity
and is likely to play the same regulatory role on proteins involved in the hypothalamic
hormone sensitivity. Decreased circulating leptin associated to increased leptin sensitivity is
observed in trained animal models, improving the inflammatory effects of obesity. Whereas
miRs represent a new perspective on therapy to control metabolic disorders, it is important to
elucidate the mechanisms of action of miRs and its possible hypothalamic targets in response
to exercise in an obesity model. Thus, this project aims to study the effect of HFD and
physical exercise on the leptin signaling pathway through the phosphorylation of JAK2 and
STAT3 in the hypothalamus; gene and protein expression of hypothalamic SOCS3 and
PTP1B proteins, the expression of miR9, Let7c, miR7a and miR200a miR in the
hypothalamus, as well as to correlate the expression of miRs with the improved hypothalamic
sensitivity and phosphorylation of JAK2 and STAT3 in our animal models.
Introdução

O aumento do índice de obesidade no planeta vem se tornando um fenômeno

epidemiológico preocupante dos dias atuais. A obesidade é o acumulo excessivo ou anormal
de gordura que pode causar danos à saúde do indivíduo, assim definido pela Organização
Mundial da Saúda (OMS). É resultado de um desequilíbrio entre a ingestão alimentar e o
gasto de energia do organismo, existindo fatores que contribuem para essa doença, como
mudanças nos hábitos alimentares, estilo de vida sedentário e determinação genética. No
Brasil, dados apontam que cerca da metade da população adulta está com o peso acima do
normal, enquanto 12,5% dos homens e 16,9% das mulheres apresentam obesidade, sendo que
a expectativa é de números ainda maiores para o futuro. Esse acúmulo de peso exacerbado
pode acarretar em outras doenças, como diabetes melito tipo 2, hipertensão arterial sistêmica,
dislipidemia, aterosclerose, doenças respiratórias, osteoartrose e alguns tipos de câncer,
influenciando na qualidade de vida e longevidade da população (SandeLee, 2012).
O controle do balanço energético ocorre no sistema nervoso central (SNC), através de
conexões neuroendócrinas, sendo a leptina e a insulina sinalizadores importantes em
neurônios especializados no hipotálamo. Esses hormônios são sinalizadores da reserva de
gordura corporal e induzem respostas adequadas à sua manutenção, como a fome. Estudos
em animais mostram que a obesidade está relacionada a uma resistência desses hormônios no
hipotálamo, ocasionando um processo inflamatório, levando a acreditar que tal disfunção
hipotalâmica acontece em humanos obesos também (SandeLee, 2012). Evidências apontam
uma correlação entre as vias de sinalização da leptina e da insulina. Esses estudos mostram
que o tratamento periférico com leptina é capaz de melhorar a hiperglicemia de camundongos
obesos e hiperglicêmicos com deficiência de leptina (Sivitz et al, 1997). A sinalização da
leptina ocorre através da ligação a um receptor monomérico transmembrana da família dos
receptores de citocinas da classe I, chamados de ObRaf. Essa forma de receptor é
predominantemente expressa em neurônios do hipotálamo, na região do núcleo arqueado,
sendo o principal responsável pelo sinal da leptina. O ObRb está ligado a uma proteína
citosólica com atividade tirosina quinase chamada Janus quinase2 (JAK2). Essa ligação
produz uma modificação conformacional e dimerização de receptores, que induz a
fosforilação da JAK2, e a continuidade ao sinal da leptina pode occorer via ativação dos
substratos do receptor de insulina (IRSs) ou fosforilação da STAT3. Os IRSs fosforilados
ativam uma enzima chamada fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K), que tem como alvo
downstream a AKT (Roman et al, 2010). Assim, ocorre a tradução do sinal da leptina no
controle dos disparos neuronais, que regulam a fome e a termogênese. As STATs são
responsáveis por levar o sinal da leptina ao núcleo, onde ocorrerá a transcrição de genes de
neurotransmissores, envolvidos na resposta hormonal. Há evidências de que a atuação em
conjunto com a insulina potencializa a atividade da STAT3 induzida pela leptina, pela via
JAK2-STAT3, bem como pela via IRS-PI3K (Carvalheira et al, 2001; Carvalheira et al,
2005).
A obesidade pode estar relacionada diretamente a resistência à leptina e à insulina no
hipotálamo. Indivíduos obesos apresentam aumento da concentração plasmática desses
hormônios, sem no entanto apresentar redução da ingesta (Considine et at, 1996). Há
evidências de um aumento significativo da expressão de proteínas de resposta inflamatória
como TNFalfa, interleucina1beta e interleucina6 no hipotálamo, em ratos em dieta rica em
lipídeos (HFD) (De Souza et al, 2005). Ainda, a neutralização do TNF-alfa in vivo mostrou
melhora da capitação de glicose em resposta à insulina (Hotamisgil, 1993). Assim, a ativação
de proteínas quinases sensíveis à inflamação, como a quinase cJun Nterminal (JNK),
mostraram prejudicar a sinalização da via JAK-STAT bem como da via IRS-AKT (De Souza
et al, 2005; Unger, 2010). Uma resposta à inflamação hipotalâmica que contribui para a
resistência à leptina e à insulina é mediada pelas proteínas SOCS3 e PTP1B, que são
inibidores da sinalização desses hormônios (Zabolotny et al, 2002; Mori et al, 2004; Sande-
Lee, 2012). Há evidências de aumento da indução dessas proteínas num quadro de
inflamação hipotalâmica (Bence et al, 2006; Reed et al, 2010), bem como associação entre a
via TNFα/NFκB e controle da expressão de PTP1B (Picardi et al, 2010). Camundongos
TNFα-/- apresentaram expressão reduzida de PTP1B, apesar do consumo de dieta HFD,
sugerindo que a inflamação e sinalização desencadeada pelo TNFα é essencial para a
expressão de PTP1B e, portanto, indução de resistência hipotalâmica (Zabolotny et al, 2008).
Na sinalização desses hormônios, é importante mencionar a relação com os
microRNAs (miRs), que são pequenas sequências de RNA que não são traduzidas em
proteínas, capazes de regular a expressão gênica dos RNA codificantes. Eles estão associados
a várias descobertas recentes em regulações fisiológicas do metabolismo (Bagga S et al,
2005; Derghal A et al, 2015). Entretanto, ainda pouco se sabe sobre o mecanismo desses
miRs relacionado a ação da leptina e da insulina em contextos de obesidade. Um estudo
mostrou aumento da expressão dos receptores da leptina e da insulina no hipotálamo, melhora
da resposta à insulina no fígado e redução de peso em camundongos Ob/Ob quando os miR-
200a são silenciados (Crépina et al, 2014).
Outro trabalho mostrou que os miRs let7, miR7a, miR7b e miR9 correspondem a,
aproximadamente, 50% de todos os miRs expressos no hipotálamo de ratos. Esse estudo
mostrou o perfil de núcleos hipotalâmicos exibindo expressões semelhantes para um conjunto
de mais de 210 genes de miRs (Amar et al, 2012). Em outro estudo, foi observado que
miR383, miR384 e miR488 foram altamente expressados em ratos obesos. Enquanto o
tratamento com leptina em ratos resistentes, o miR488 teve sua expressão diminuída
(Derghal A et al, 2015). Assim, é evidente que os miRs podem modular a expressão e
atividade de componentes hipotalâmicos que podem, portanto, refletir em alterações na
sensibilidade à leptina e à insulina, bem como no metabolismo glicêmico.
Há uma série de evidências sobre a influência positiva do exercício físico na saúde,
como efeitos anti-inflamatórios sobre a obesidade, resistência a insulina, entre outras
complicações. Portanto, os exercícios físicos são uma ferramenta importante para combater
certas enfermidades e, assim, sendo um dos fatores preponderantes para se manter uma boa
qualidade de vida (Pauli et al, 2009). Os níveis plasmáticos de leptina são reduzidos depois
do treinamento físico em animais, e essa diminuição é mais significativa quando a quantidade
de dieta é reduzida (Steinberg GR, 2004; Zanesco, 2006). Exercício agudo se mostrou
eficaz em reduzir a expressão de PTP1B em modelo de ratos obesos através de mediadores
anti-inflamatórios (Carreotto-Ropelle et al, 2013), como a IL-6, IL-10 e IL-1. Essas
substâncias, principalmente a IL-6, são produzidas na contração do músculo durante
exercício físico (Petersen AM et al, 2005), que por sua vez, podem induzir alterações
metabólicas em outros tecidos, como por exemplo, no fígado, tecido adiposo, pâncreas e
hipotálamo (Ellingsgaard H et al, 2011; Gobatto CA et al, 2001). Essas interleucinas
reduzem a expressão de PTP1B através de uma resposta anti-inflamatória, evitando sua
interação com proteínas envolvidas com a sinalização da leptina e insulina no hipotálamo,
tais como, a IRS1 e JAK2 (Carreotto-Ropelle et al, 2013).
Neste presente relatório, contém os resultados dos experimentos de PCR quantitativo
e de Western Blotting, realizados a partir das amostras processadas dos animais dos grupos
Controle, Controle Treinado, High Fat Diet, High Fat Diet treinado. Assim sendo possível
analisar o exercício físico sobre a obesidade.
Materiais e Métodos

● Sinalização da via da Leptina

Foi injetado no camundongo volume de leptina equivalente a 1 mg/kg via ip. Após 20
minutos, o animal foi morto e o hipotálamo foi retirado e homogeneizado em tampão de
imunoprecipitado, para preservação das fosforilações proteicas. Foi avaliada a fosforilação da
JAK2 (Tyr1007/1008) e da STAT3 (Tyr705), normalizadas pelo conteúdo total das
respectivas proteínas, através de Western Blotting.
● Western Blotting
Extratos proteicos foram quantificados utilizando-se reagente Bradford (BioRad), e
tendo como base uma curva padrão de albumina (BSA). As amostras foram então incubadas à
100°C por 3 min em Tampão de Laemmli contendo DTT. Para corrida eletroforética foi
aplicado um volume correspondente a 30 µg de proteína em gel bifásico: gel de
empilhamento e gel de resolução. Após a corrida as amostras foram transferidas para uma
membrana de nitrocelulose (BioRad) com tampão de transferência. Após bloqueio (5% de
albumina bovina) as proteínas de interesse foram detectadas com anticorpo específico
(instruções do fabricante) seguida de incubação com anticorpo secundário contendo
peroxidase (HRP) e, finalmente, com reagentes de quimioluminescência. As imagens foram
capturadas em fotodocumentador (Amersham™ Imager 600, Life Sciences) e a intensidade e
quantificação das bandas serão medidas por densitometria (ImageJ, Bethesda, USA).

● Isolamento de miRNA e RNA total e obtenção de cDNA

Os miRs foram extraídos de amostras do hipotálamo utilizando-se o miRNeasy Mini
Kit, seguindo-se as instruções do fabricante (Qiagen). Foi utilizado o miScript II RT Kit para
produzir os respectivos cDNAs, de acordo com as orientações do fabricante (Qiagen).

● PCR quantitativo
A expressão dos miRs foi realizada utilizando-se o miScript SYBR Green PCR Kit,
de acordo com as orientações do fabricante (Qiagen). A amplificação dos miRs foi
normalizada pelos controles internos SnoRNA-135 e snoRNA-202 (Applied Biosystems).
Foram analisados os seguintes miRs: miR9, Let7c, miR7a, miR7b e miR200a.
 ● Análise Estatística
Os grupos Foram analisados pelo teste ANOVA two-way seguido de pós-teste de
Bonferroni. As análises Foram feitas com o programa GraphPadPrism 5. O nível de
significância adotado para as análises será P< 0,05.

Objetivos gerais
O presente projeto tem como objetivo avaliar a expressão e possível associação dos
miRs miR9, Let7c, miR7a e miR7b sobre a ativação da via JAK-STAT no hipotálamo de
camundongos C57BL/6 treinados e alimentados com dieta hiperlipídica.

Objetivos específicos
Avaliar em camundongos C57BL/6 treinados e alimentados com dieta hiperlipídica:
⦁ Efeito da HFD sobre ganho de peso corporal, tolerância à leptina, insulina e glicose;
⦁ Atividade da via da leptina através da fosforilação de JAK2 e STAT3 no hipotálamo;
⦁ Expressão dos miRs miR9, Let7c e miR7a no hipotálamo;
⦁ Correlacionar a expressão dos miRs avaliados à fosforilação da JAK2 e da STAT3 nos
modelos submetidos à HFD bem como ao treinamento.
Nossos objetivos futuros são inibir a expressão dos miRs que apresentarem alguma
correlação com os tratamentos HFD e treinamento bem como com a sensibilidade à leptina. É
importante ressaltar que este projeto contempla a linha de investigação da qual nosso grupo
faz parte, o CMPO, Centro Multidisciplinar de Pesquisa em Obesidade e Doenças Associadas
(Processo: 2013/07607-8), sob a coordenação do Prof. Dr. Licio Velloso.

Resultado e discussão
O hipotálamo está envolvido no controle da ingestão alimentar e do gasto energético,
através da integração de informações periféricas por intermédio de hormônios e nutrientes
que se ligam à seus receptores, os mais importante são os hormônios leptina e insulina (Silva,
2013; SandeLee, 2012). Esse hormônio expressa principalmente no tecido adiposo e em
menores quantidades em outros, sua secreção diminui com o jejum prolongado e estímulos
β-adrenérgico (Silva, 2013), como o exercício físico, que pode melhorar esses estímulos
(Silva et al, 2010), e aumente em resposta à insulina (Silva, 2013).
 A sinalização da leptina via celular está associada com a proteína JAK2 e STAT3, que
após a sua ligação ao receptor, a JAK2 adquire atividade tirosina quinase, e uma vez ativada,
ela fosforila o receptor induzindo a formação de um sítio de ligação para a proteína STAT3,
que assim é ativada. Em sequência, é translocada para o núcleo e estimula a transcrição de
neurotransmissores importantes para o funcionamento da ingestão alimentar, estimulando ou
inibindo, essa via é chamada de anorexigênica, estando associada ao desenvolvimento de
diversas doenças ligadas à distúrbios alimentares, como a obesidade (Silva, 2013).
A obesidade está relacionada à um processo inflamatório no hipotálamo, resultante da
ativação de vias de sinalização intracelular que diminuem os efeitos biológicos locais da
leptina e insulina, isto é, defeitos pós-receptor, apesar de acreditar que também esteja
envolvido defeitos no transporte desses hormônios. O efeito da HFD sobre a expressão gênica
no hipotálamo de camundongos, reportou um aumento da expressão de proteínas
inflamatórias, como TNF-α, IL-1β e IL-6. Isso resulta em ativação de proteínas quinases
sensíveis à inflamação, como a JNK e IKK, sendo que a JNK ativada catalisa a fosforilação
do IRS, reduzindo a ativação da PI3K/Akt (SandeLee, 2012). Por isso, foi injetado leptina
via IP nos camundongos, para observar a fosforilação da Akt. No gráfico abaixo, podemos
observar que apesar de não ter diferença estatística, o grupo HT tem uma pequena tendência
à melhorar, em relação ao aumento da Akt fosforilada, comparado com o grupo H,
consequentemente melhorando a sinalização da insulina, e também da leptina através do
cross-talk das vias.
Isso pode ser devido à estimulação de citocinas anti-inflamatórias induzidas pelo
exercício físico (Pauli et al, 2009), que melhora o estado de inflamação hipotalâmica. Já os
grupos C e CT não há diferença entres eles, levando em consideração que ambos não
apresentam obesidade.

Gráfico 1. Fosforilação da Akt, observada nos grupos C, H, CT e HT (Teste T)

 Há outro mecanismo que provoca a inflamação hipotalâmica, associando a resistência
à leptina e à insulina, sendo pela indução de proteìnas como a SOCS3 e a PTP1B, que
funcionam como inibidores da sinalização desses hormônios. A SOCS3 liga-se direto nos
receptores ou em suas proteínas sinalizadoras, inibindo-as ou degradando-as, já a PTP1B
inibe a sinalização no hipotálamo da leptina e insulina, por desfosforilar o receptor da
insulina (IR), a JAK2 e consequentemente afetando sequência da STAT3. A expressão dessas
proteínas no hipotálamo aumentam em resposta à dieta hiperlipídica (SandeLee, 2012). Afim
de observar se a HFD afetou a sinalização da leptina e insulina no hipotálamo, quantificamos
a SOSC3 e a PTP1B em hipotálamos de camundongos nos diferentes grupos de estudo,
Assim no gráfico 2 abaixo, podemos ver que, apesar da PTP1B não apresentar resultados
estatísticos significativos, há uma pequena diminuição dos grupos treinados (CT e HT),
comparados com os seus respectivos grupos não treinados (C e H), levando a pensar que o
exercício físico tem um efeito positivo sobre essa proteína. Já no gráfico 3 se observou que a
SOCS3 teve uma melhora em relação ao grupo HT, igualando aos grupos C e CT.
Isso mostra que o exercício físico, através da contração muscular que estimula a
liberação de IL-6, inibindo a produção e ação de mediadores pró-inflamatórios como o
TNF-alfa, promovendo um ambiente anti-inflamatório, impedindo assim a ativação dessas
proteínas inflamatórias (Ribeiro et al, 2013).

Gráfico 2. Quantificação da PTP1B total; Gráfico 3. Quantificação da SOCS3 total (teste

ANOVA two-way, GraphPadPrism, P<0,05)
 Pelo fato da inflamação hipotalâmica prejudicar diretamente a sinalização celular da
leptina no hipotálamo, como já dito e demonstrado acima, foi induzida a fosforilação da
JAK2 e STAT3, através da injeção de leptina via IP em camundongos. E como é mostrado no
Gráfico 4, onde a JAK2 fosforilada é diminuída nos grupos H e HT, em relação aos grupos C
e CT, entretanto o grupo HT tem uma leve tendência a melhora, como se mostra na análise
estatística. Isso mostra mais uma vez que o exercício físico pode ser uma ferramenta
importante para a prevenção e até mesmo um tratamento alternativo para a obesidade. Já no
Gráfico 5, mostra a fosforilação da STAT3, mas não demonstrou diferença entre os grupos de
estudo.

Gráfico 4. Quantificação da JAK2 total; Gráfico 5. Quantificação da STAT3 total (teste ANOVA
two-way, GraphPadPrism, P<0,05)
Por fim, após todos os grupos serem caracterizados e o exercício físico mostrar algum
efeito sobre a sinalização da leptina e insulina no hipotálamo sobre a condição de obesidade,
foi importante investigar a relação dos miRs na sinalização desses hormônios associando o
exercício físico, pois estão associados em várias descobertas recentes sobre a regulações
fisiológicas do metabolismo (Derghal A et al, 2015). Pouco se sabe sobre o mecanismo
desses miRs na ação da leptina e insulina relacionado à obesidade, por isso que através de um
estudo do Amar et al, 2012, que mostrou através da quantificação de um conjunto de 210
genes de miRs no hipotálamo, que os miRs let7, miR7a, miR7b e miR9 correspondem a
quase 50% de todos os miRs expressos. Além de um trabalho publicado ter evidenciado que o
miR 200a estar relacionado com a expressão de receptores de leptina e insulina em
camundongos (Crépina et al, 2014), assim foi analisados a expressão desses cincos miRs
sobre os grupos de estudos, através da indução por injeção de leptina por via IP.
Nos gráficos abaixo, somente o miR Let7c2 (Gráfico 8) demonstrou estar relacionado
à obesidade e mostrou uma diferença estatisticamente significante quando associado ao
exercício físico, sendo que os grupos C, CT e HT tem uma expressão menor e igual desse
miR, já o grupo H tem uma expressão maior quando comparado aos outros. Em todos os
outros miRs (miR 200a, miR Let7a1, miR 7a1 e miR 9-1) apresentaram sua expressão
relacionada a obesidade já que nos grupos H e HT tem o seu aumento, comparados com os
grupos C e CT que tem sua expressão diminuída. Estando respectivamente demonstrados nos
Gráficos (6, 7, 9 e 10).

Gráfico 6. Expressão do miR 200a no hipotálamo de camundongos C57BL/6; Gráfico 7.

Expressão do miR Let7a1 no hipotálamo de camundongos C57BL/6; Gráfico 8. Expressão do
miR Let7c2 no hipotálamo de camundongos C57BL/6; Gráfico 9. Expressão do miR 7a1 no
hipotálamo de camundongos C57BL/6; Gráfico 10. Expressão do miR 9-1 no hipotálamo de
camundongos C57BL/6 (teste ANOVA two-way, GraphPadPrism, P<0,05).

Conclusão
Através dos experimentos realizados e estudos anteriores, observa-se que o exercício
físico é um grande artifício para terapêutica da obesidade, por seu efeito anti-inflamatório no
organismos, resultando no melhoramento da inflamação hipotalâmica, restaurando assim a
via de sinalização da leptina e insulina, ajudando no controle da ingesta e homeostase
energética. Além de, o exercício demonstrou um efeito positivo em um dos miRs associados
a obesidade, o miR Let7c2, havendo uma diminuição do mesmo nos grupos treinados,
realçando a importância de investir em mais pesquisas relacionadas aos miRs na obesidade e
em outras doenças, já que pouco se sabe sobre, visando um possível alvo terapêutico para o
futuro.
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